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    Guia Electroforesis

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    Este documento proporciona instrucciones para realizar electroforesis de ADN en geles de agarosa. Explica que la electroforesis permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño aplicando un campo eléctrico, y que el ADN puede visualizarse utilizando un colorante fluorescente como SafeView bajo luz ultravioleta. También describe los materiales necesarios como fuente de poder, cámara, buffer TBE y agarosa, y los pasos del procedimiento que incluyen cargar las muestras en el gel, aplicar el volta

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    3. Guia Electroforesis (1)

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    Este documento proporciona instrucciones para realizar electroforesis de ADN en geles de agarosa. Explica que la electroforesis permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño aplicando un campo eléctrico, y que el ADN puede visualizarse utilizando un colorante fluorescente como SafeView bajo luz ultravioleta. También describe los materiales necesarios como fuente de poder, cámara, buffer TBE y agarosa, y los pasos del procedimiento que incluyen cargar las muestras en el gel, aplicar el volta

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    Código FLA-23 v.

    00
    Guía Unificada de Laboratorios
    Página 1 de 1

    Electroforesis de ADN

    2. Objetivo

    Conocer los principios básicos de la electroforesis horizontal en geles de agarosa


    y aplicarlo para la separación de DNA humano.

    3. Marco Teórico

    La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías


    más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos
    nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN
    en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta
    forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una
    estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del
    gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en
    diferentes aplicaciones.

    La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia


    primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería
    genética. La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para
    analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto
    de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60 del pasado siglo estaba
    interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de
    partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una combinación
    de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en
    función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN.

    Éste es exactamente el principio en que se basa la electroforesis de ácidos


    nucleicos, separar moléculas cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las
    moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el polo negativo y las
    cargadas negativamente hacia el polo positivo. Uno de los factores que afecta la
    separación de las moléculas en una electroforesis es su carga. Para el caso del
    DNA, los grupos fosfato le dan la carga a la molécula. Los grupos fosfato son
    grupos ácidos con pK bajos, esto significa que a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos
    hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan cargados negativamente. Por lo
    anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son moléculas cargadas
    negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético se desplazarán hacia el
    polo positivo.

    Para visualizar el DNA utilizamos técnicas de coloración como el SafeView


    es una sustancia que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA y al
    excitarlo con luz ultravioleta emite luz visible, es decir, es una sustancia
    fluorescente.

    La electroforesis se hace con la finalidad de evaluar el resultado de un proceso de


    extracción de DNA, comparando un DNA de concentración y tamaño conocidos se
    puede estimar el tamaño y cantidad de otro.

    4. Materiales, Equipos e Insumos

    Fuente de poder
    Cámara de electroforesis
    Micropipeta graduable P20

    5. Reactivos

    Buffer TBE 1 X
    Agua desionizada
    Agarosa
    DNA
    Buffer de carga

    6. Procedimiento

    1. Agregue buffer a la cámara, TAE o TBE 1 X, hasta cubrir completamente el gel 1


    o 2 mm.

    2. Agregue a las muestras de DNA ¼ de buffer de carga.

    3. Siembre 10 µl de cada muestra de DNA en pozos separados del gel, utilice la


    micropipeta P20 con las puntas correspondientes. Una de las muestras de DNA
    corresponde a marcador de ADN con buffer de carga.
    4. Tape la cámara. Conectar la cámara a la fuente. Encienda la fuente. Coloque en
    voltaje constante. Colocar en 10 voltios/cm, según la distancia entre los electrodos
    de la cámara. Iniciar la separación o corrida.

    5. Deje la electroforesis 30 minutos. Pare la corrida. Apague la fuente.

    6. Observar al transiluminador

    7. Nivel de Riesgo

    8. Bibliografía

    J. Sambrook; E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual


    CSHL press 2001.

    • Contreras J, Pinilla G, Beltrán R, Wasserman M, Rojas M O Manual de Técnicas


    Básicas. Primer Curso Institucional sobre Biología Molecular ISBN 958-13-0083-X
    .1 ed. Bogotá : Instituto Nacional de Salud, 1991, v.1. p.30.

    • Concepción Puerta y Claudia Urueña. Prácticas de Biología Molecular. Editorial


    Pontificia Universidad Javeriana, 2005

    9. Anexos

    + En el informe entregue un soporte de los resultados obtenidos.


    + Que factores afectan la velocidad de migración del ADN.
    +Por que se utiliza luz UV para visualizar el ADN.
    +Cómo funciona el SafeView en la visualización de ácidos
    nucleicos.

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