Tecnicas de Transferencia

TECNICAS DE
TRANSFERENCIA
Biología Molecular
Biotecnología 10° A
Equipo 3
• Ayala Leon Josue
• Aguirre Alanis Sergio
• Lopez Guerrero Alejandro
• Morales Cervantes Diego A.
• Torres Benito Rolando
04 de Octubre del 2016

INTRODUCCION
 Se emplea en estudios de expresión génica, en los cuales el interés es
detectar los genes transcriptos en los diferentes tejidos (expresión espacial) y
/ o diferentes etapas del desarrollo (expresión temporal).
 La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bi-catenarios a

partir de dos mono-catenarios usando la complementariedad de bases, se
trata, por tanto de un proceso de unión de dos cadenas complementarias de
ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido nucleico de
doble cadena, es un método muy versátil que permite estudiar el grado de
relación genética entre dos ácidos nucleicos, también permite la detección de
fragmentos de ADN que son complementarios a fragmentos mono-catenarios
de secuencia conocida (sondas).(Pedro L. Fernández R.)
 Los agentes que intervienen en el proceso Temperatura, pH y Agentes
químicos.
 Factores que influyen sobre la hibridación. Concentración, tamaño de la

sonda, temperatura, tiempo de hibridación.
 Características del medio de la reacción. Fuerza iónica, pH, concentración de

agentes desnaturalizantes y adición de ciertos polímeros.
 Es una técnica empleada en los laboratorios de biología molecular que se usa
para detectar secuencias de ADN específicas a partir de un preparado de
tejido. También se utiliza esta técnica como “prueba del ADN” para detectar
la presencia del ADN de un individuo en un lugar o estudiar mutaciones en el
genoma.
 Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de

separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una
transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la
sonda.
TECNICA SOUTHERN
BLOT
Permite identificar regiones específicas de ADN que han sido fragmentadas
por una enzima de restricción.
PROCEDIMIENTO
1. Digestión del DNA con enzimas de restricción.

2. Separación mediante electroforesis.
3. Transferencia de los fragmentos del gel a un soporte solido.
4. Hibridación del DNA transferido al filtro con una sonda marcada.
5. Detección de los fragmentos hibridados.
TECNICA WESTERN BLOT
¿Que es la técnica de Western Blot?

Es una técnica analítica que se usa para detectar y cuantificar proteínas especificas
en una muestra determinada, una muestra que por norma general tiene una gran
cantidad de proteínas (unas que nos interesarán, y otras que no tienen gran
relevancia.
Básicamente, se puede resumir en una serie de pasos a realizar: una electroforesis
que nos separa las proteínas según un determinado criterio, una transferencia del gel
resultante, a una membrana adsorbente (proceso por el cual átomos, iones o
moléculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material). y
posteriormente, se detecta la proteína de interés , y se estudia la unión antígeno-
anticuerpo, y se observan los resultados, viendo si hay más, si hay menos, si ha
cambiado su configuración
Paso 1. Preparación de la muestra
Debemos coger la muestra, y lo primero que se hace es introducirla en un Buffer de

Extracción. Cuando buscamos purificar y estudiar proteínas, lo primero que se debe
hacer es romper las células , y extraer de el la fracción de proteína. Todo esto con el
buffer de extracción.
- Homogenizar la muestra
- Centrifugar a 13000 rpm por 10 min a
- Decantar el sobrenadante y quedarnos con el “pellet”
Paso 2. Cuantificación de proteínas
tendremos que saber cuanta proteína tenemos, y que los resultados no dependan
de cuanta proteína hemos cargado, si no de las características de la proteína
cargada
Paso 3. Electroforesis en gel.

La función de la electroforesis es separar, basándose en uno o varios criterios,
de las especificaciones de las proteínas. Estos criterios suelen ser: peso
molecular, punto isoeléctrico, y carga eléctrica.
Paso 4. Tinción del gel

Simplemente se coloca el gel, en un “tupper”, con un colorante de proteínas,
(el Azul de Coomassie), que nos dirá, según la intensidad, la cantidad de
proteína existente (de forma cualitativa), o si directamente no existe proteína.
Paso 5. Transferencia.

Paso que permite que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos.
Simplemente, los resultados son mucho mejores y se transfiere a las proteínas desde
el gel de poliacrilamida, a una membrana que, normalmente, es de nitrocelulosa. En
las membranas de nitrocelulosa, las proteínas interaccionan con esta mediante
enlaces no covalentes de naturaleza hidrófoba.

Electro transferencia: La más usada y la más recomendada. Al igual que durante la
realización de la electroforesis, se usa una corriente eléctrica y un tampón (Buffer
de transferencia), que rellena la cubeta de electro transferencia, como resultado se
transfieren las proteínas.
Paso 6. Bloqueo.
Con este paso simplemente se trata de bloquear la unión de proteínas a la
membrana, que puedan unirse a esta en los lugares que hayan quedado libres,
posteriormente a la transferencia. Sin este paso, el anticuerpo, que es de
naturaleza proteica, podría unirse en esos huecos libres (recordemos que la
membrana es afín a las proteínas),
Paso 7. Detección.
Se trata de buscar en la membrana una determinada proteína, y por este
mismo motivo se usa un anticuerpo específico, unido a una enzima, que si
encuentra su sustrato ( la proteína indicada, o más bien su antígeno), se
producirá una reacción y podremos observar a la proteína por diversos métodos.
Paso 8. Análisis
Simplemente, dependiendo del tipo de anticuerpo secundario que hayamos usado,
lo analizaremos de una determinada forma:
- Análisis colorimétrico (La detección colorimétrica depende de la incubación del
Western blot con un sustrato unido al anticuerpo secundario que es una enzima
“reporter” , (una peroxidasa). produciéndose una reacción que acaba en un
cambio de color.
- espectrometría, que nos indicará un determinado valor de longitud de onda,
equivalente a una determinada cantidad.
Paso 9. Resultado
Resultado del Western blot: una membrana con las proteínas separadas en la
electroforesis unidas, de las que sólo se disciernen aquellas contra las se ha añadido
un anticuerpo.
TECNICA NORTHER BLOT
 EL Northern blot es una técnica de búsqueda y separación de secuencias de
ARN, surge como variación del Southern blot, una técnica similar creada
para separar moléculas de ADN.
 Gracias a ella podemos a partir de una muestra biológica, de cualquier
organismo, podemos aislar un ARN en particular si conocemos al menos parte
de su secuencia. Además permite separar los ARN dependiendo de su tamaño.
 La técnica para separar el ARN fue diseñada por James Alwine, David Kemp
y George Stark, a finales de la década de 1970. }
 Este método se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de

expresión génica.
La técnica consiste en extraer el RNA de las células para su posterior separación
por tamaño mediante electroforesis en gel.
Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el
southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada, las bandas en el
gel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda.
Teniendo marcadores de RNA de tamaños adecuados
 Extracción del RNA

Se extrae una muestra de ARN para esto las células y tejidos que contienen
ARN se homogenizan en una solución que contenga inhibidores de ARNasas como
agente enofropico (isotiacianato de guanidinio)
 Electroforesis: se separan los ARN de acuerdo con su tamaño, mediante
electroforesis en gel. Este método utiliza una corriente controlada con la
finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de
una matriz gelatinosa
Transferencia de la membrana: existen 2 tipos de membranas
Nitrocelulosa:
 Baja capacidad de unión de ácidos nucleicos
 Frágil
 Carga negativa
Nylon
 Mayor capacidad de unión
 Mayor resistencia
 Carga neutra o positiva
Es importante inmovilizar el RNA en la membrana y eso se puede conseguir a
través de un horno de vacío tratada por 2 horas a 80°C o por Irradiación de UV,
esto aplicable solo en membranas de nylon.
 Selección de sondas
Las sondas son fragmentos monocatenarios de DNA o NA marcados con una

molécula reportera, que puede ser enzimas, sustratos antigenios, radioisótopos
los que se unen con una alta especificidad para así tener la identificación del
ARN de interés.
Hibridación: este proceso de complementación de pares de bases entre dos

hebras sencillas de ADN y ARN.

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 La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bi-catenarios a

 Factores que influyen sobre la hibridación. Concentración, tamaño de la

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Debemos coger la muestra, y lo primero que se hace es introducirla en un Buffer de

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