INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

INGENIERÍA EN SISTEMAS
AMBIENTALES

PRÁCTICA “CINÉTICA ENZIMÁTICA”

INTEGRANTES:

*López Leal Luisa Fernanda

*Sandoval Antonio Cynthia Nathali

PROFESORAS:

*Dra. Doris Neri Cortés

*Dra. Claudia Albany Reséndiz Mora

*M. en C. Karina Martínez Guzmán

GRUPO: 2AM2 EQUIPO: 7

1 de Abril de 2022
 INTRODUCCIÓN

Efecto del pH sobre la velocidad de reacción:

La intensidad máxima de la actividad de la enzima ocurre en el pH óptimo, con

rápida disminución de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad
óptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.

El pH óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la
superficie, o con condiciones óptimas para la fijación de la enzima a su sustrato.
Cuando hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus moléculas
ante un déficit los ceden. Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la
molécula. Como todas las proteínas, las enzimas desempeñan su función por los
residuos de aminoácidos (algunos confieren a su superficie una distribución de
cargas eléctricas.

Cuando la concentración de iones hidrogeno es muy baja en comparación con la

concentración optima, la molécula los cede desapareciendo cargas positivas o
apareciendo cargas negativas en su superficie. Ante una concentración elevada de
iones hidrogeno, algunos se fijan a la molécula desapareciendo cargas (-) o
poniendo cargas (+) que no existían. Así mismo al cambiar las cargas eléctricas en
los residuos de aminoácidos se alteran los lazos de unión dentro de la molécula
variando su acomodo tridimensional con recuperación de la actividad de la enzima.

En una gráfica de actividad enzimática contra pH se pueden observar los siguientes

efectos:
1.- La desnaturalización de la enzima por valores de pH extremos.
2.- Cambios en el estado de ionización de la enzima y del sustrato.
3.- Cambios en el tipo de unión entre la enzima y el cofactor.
4.- Modificación en la afinidad de la enzima por el sustrato.

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción:

La velocidad con la que se produce una transformación química es un aspecto

muy importante desde el punto de vista de su utilidad industrial. Por ello, es
interesante conocer los factores que pueden modificarla.

Ahora cabe preguntarse, ¿Qué influencia tiene la temperatura sobre la velocidad de

reacción? A nivel experimental, es fácilmente deducible que la velocidad de reacción
depende directamente de la temperatura. Así, por ejemplo, los alimentos
perecederos se descomponen más rápidamente a 25ºC que a 4ºC. Por este motivo,
cuando compramos este tipo de alimentos, de inmediato los conservamos en el
frigorífico para que el proceso de descomposición sea más lento. Por lo tanto,
podemos deducir que la velocidad de una reacción es menor si la temperatura es
menor, o, en otras palabras, la velocidad de una reacción aumenta con la
temperatura.
Por otro lado, hay reacciones que siendo espontáneas se producen muy lentamente
por lo que no tienen aplicación industrial. Por ello, cabe plantearse también las
siguientes cuestiones: ¿Qué requisitos deben cumplirse para que al chocar las
moléculas de reactivo se produzca reacción? ¿Qué papel juega la energía de
activación para que se produzca o no una reacción? La respuesta a todo ello nos la
dará la interpretación de la teoría de Arrhenius mediante la teoría de las colisiones
y la del complejo activado.

Efecto de concentración de enzimas sobre la velocidad de reacción:

En cualquier reacción catalizada, el sustrato debe unirse primero con la enzima para
formar el complejo enzima-sustrato. Para una concentración de sustrato particular,
un aumento en la concentración enzimática aumenta la velocidad de la reacción
catalizada.
A concentraciones enzimáticas más altas, más moléculas están disponibles para
unirse al sustrato y catalizar la reacción. Mientras la concentración de sustrato sea
mayor que la concentración de la enzima, hay una relación directa entre la
concentración de la enzima y la actividad enzimática. En muchas reacciones
catalizadas por enzimas, la concentración del sustrato es mucho mayor que la
concentración de la enzima.
Cuando la concentración de enzima se mantiene constante, la adición de más
sustrato aumentará la velocidad de la reacción. Si la concentración del sustrato es
alta, puede saturar todas las moléculas de la enzima. Entonces la velocidad de la
reacción alcanza su máximo y la adición de más sustrato no aumenta más la
velocidad de la reacción.
Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción:
En las reacciones no catalizadas por enzimas la formación de producto depende
linealmente de la concentración de sustrato añadido; mientras que en las reacciones
catalizadas por enzimas, generalmente se obtiene una dependencia hiperbólica de
la velocidad respecto a la concentración de sustrato distinguiéndose 3 partes
distintas en la curva.
A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentración
de sustrato, de tal manera que, si se duplica la concentración, se duplica la
velocidad (reacción de primer orden).
En la segunda parte de la curva, la velocidad se incrementa menos que en la primera
parte con el incremento de la concentración, iniciando alrededor de la ½ de la Vmax.
En la última parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad es
independiente de la concentración de sustrato (reacción de orden cero); así, la
velocidad alcanzada es cercana a la máxima.
Efecto de inhibidores sobre la velocidad de la reacción:
Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de
moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, llamadas inhibidores. Los
inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la
velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que
se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones
enzimáticas.
Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son
inhibidores de enzimas responsables de reacciones vitales para la célula. La
interacción de un inhibidor y una enzima varía dependiendo de la naturaleza química
del inhibidor y de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo
de interacción entre ambas moléculas se determina el efecto del inhibidor en las
constantes cinéticas de la enzima.
Tipos de inhibidores:
*Inhibidor competitivo:
Son moléculas que tienen una similitud estructural y química con el sustrato de la
enzima, por lo que se pueden unir al sitio activo. Sin embargo, debido a que el
inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertirlo en producto
y el inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, porque no es posible que tanto el
inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo dentro de éste. Si se
adiciona más sustrato (y el inhibidor no se une de manera irreversible a la enzima)
se reduce la inhibición.

En un gráfico de dobles recíprocos el intercepto en y es el mismo en ausencia y

presencia del inhibidor, es decir el inhibidor no afecta la Vmax de la enzima, sin
embargo, la pendiente de la curva se incrementa. El incremento en la pendiente
indica la fuerza de unión del inhibidor. De tal manera que el valor de la Km de la
reacción catalizada por la enzima se incrementa a este nuevo valor de Km se le
llama Km aparente.
*Inhibidor incompetitivo o acompetitivo:
Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre sino que sólo se une al
complejo enzima-sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato
expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el sitio activo o fuera de
éste. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de
producto.
El inhibidor incompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima pero no
afecta la pendiente, por lo que las curvas de dobles recíprocos a diferentes
concentraciones de inhibidor son paralelas. Los valores nuevos de las constantes
cinéticas son Km aparente y Vmax aparente.
*Inhibidor no competitivo: El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al
complejo enzima-sustrato. Un inhibidor no competitivo puro es aquel que modifica
tanto la Km de la enzima como la pendiente de la curva de dobles recíprocos, así
las curvas en ausencia y presencia del inhibidor presentan diferencias en ambos
interceptos, 1/Vmax y 1/Km. La mayor parte de los inhibidores no competitivos en
realidad son inhibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino
también la conversión del sustrato a producto.
Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como
el de la Km. Sin embargo, la gráfica de dobles recíprocos muestra que además de
que se afectan ambos interceptos las curvas en ausencia y presencia de inhibidor
se intersectan en el segundo cuadrante.
OBJETIVOS

Efecto del pH sobre la velocidad de reacción:

➢ Determinar el efecto de la variación del pH sobre la velocidad de la reacción

catalizada por la invertasa.

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción:

➢ Demostrar que las reacciones enzimáticas son afectadas por la temperatura.

➢ Calcular el valor de la energía de activación de la reacción catalizada por la
invertasa.

Efecto de concentración de enzimas sobre la velocidad de reacción:

➢ Demostrar que la velocidad de la reacción enzimática es directamente
proporcional a la concentración de enzima.
Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción:
➢ Observar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la
reacción enzimática.
➢ Determinar la constante de Michaelis-Menten por los métodos conocidos, así
como su aplicación.
Efecto de inhibidores sobre la velocidad de la reacción:
➢ Determinar el tipo de inhibición producido por una sustancia (anilina) sobre
la actividad de la invertasa.

METODOLOGÍA
 RESULTADOS

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción:

En base a la ecuación obtenida en la gráfica de “Curva tipo azúcares reductores”

y = 0.058x + 0.0269 sustituimos el valor de “y” con las absorbancias registradas,
obteniendo así:

Azúcar reductor
 0.04+0.0269
T1 = = 0.8964 µmol/ml
0.058
0.234+0.0269
T2 = = 4.1902 µmol/ml
0.058
0.342+0.0269
T3 = = 6.0238 µmol/ml
0.058
0.909+0.0269
T4 = = 15.6508 µmol/ml
0.058
0.042+0.0269
T5 = = 0.9304 µmol/ml
0.058
0+0.0269
T6 = = 0.2173 µmol/ml
0.058

Velocidad
0.8964
Vo1 = = 0.0896 U.I.
10
4.1902
Vo2 = = 0.4190 U.I.
10
6.0238
Vo3 = = 0.6024 U.I.
10
15.6508
Vo4 = = 1.5651 U.I.
10
0.9304
Vo5 = = 0.0930 U.I.
10
0.2173
Vo6 = = 0.0217 U.I.
10

Gráfico 1. Relación de la velocidad de reacción sobre la temperatura

Tabla 1. Resultados obtenidos del efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción
TUBO
1 2 3 4 5 6
Temperatura (°C) 0 25 37 50 75 92
Absorbancia λ = 540 0.04 0.234 0.342 0.909 0.042 0
nm
Azúcar reductor 0.8964 4.1902 6.0238 15.6508 0.9304 0.2173
(µmoles/ml)
Velocidad (unidades 0.0896 0.4190 0.6024 1.5651 0.0930 0.0217
de invertasa)
LnVo -2.4123 -0.8698 -0.5068 0.4479 -2.3751 -3.8304
T (°K) 273.15 298.15 310.15 323.15 348.15 365.15
1/T (°K) 0.0036 0.0033 0.0032 0.0031 0.0028 0.0027

Gráfico 2. Relación de Ln de Vo vs 1/T

ENERGÍA DE ACTIVACIÓN
𝑉𝑜 = (𝐴𝑒 − Ɛ𝑎)/𝑅𝑇
Vo: Velocidad
e: Número de Euler (2.71)
Ɛ𝑎: Energía de activación
R: Constante de los gases (1.9872 cal/mol*K)
T: Temperatura (°C + 273.15K)
y=b+mx
 𝑙𝑜𝑔 𝑉𝑜 = 𝑙𝑜𝑔𝐴 − (Ɛ𝑎/𝑅) − (1/𝑇)
𝑦 = -0.5259 + 0.3043𝑥
𝑚 =− Ɛ𝑎/𝑅 = 0.3043
Ɛ𝑎 =− 𝑚(𝑅) = 0.3043(1. 9872 𝑐𝑎𝑙/𝑚𝑜𝑙 * 𝐾) = |0.6047|

Efecto del pH sobre la velocidad de reacción:

TUBO
Testigo 1 2 3 4
pH 4.5 3.0 4.5 6.0 7.5
Absorbancia λ = 540 0 0 0.0403 0.266 0.235
nm
Azúcar reductor 0.2173 0.2173 1.1586 5.05 4.5155
(µmoles/ml)
Velocidad (unidades 0.0217 0.0217 0.01158 0.505 0.4515
de invertasa)
Tabla 2. Resultados obtenidos del efecto del pH sobre la velocidad de reacción
Azúcar reductor
0+0.0269
TT = = 0.2173 µmol/ml
0.058
0+0.0269
T1 = = 0.2173 µmol/ml
0.058
0.0403+0.0269
T2 = = 1.1586 µmol/ml
0.058
0.266+0.0269
T3 = = 5.05 µmol/ml
0.058
0.235+0.0269
T4 = = 4.5155 µmol/ml
0.058

Velocidad
0.2173
VoT = = 0.0217 U.I.
10
0.2173
Vo1 = = 0.0217 U.I.
10
1.1586
Vo2 = = 0.1158 U.I.
10
5.05
Vo3 = = 0.505 U.I.
10
4.5155
Vo4 = = 0.4515 U.I.
10
Gráfico 3. Relación sobre el pH vs la Absorbancia

Efecto de concentración de enzimas sobre la velocidad de reacción:

Azúcares reductores
0+0.0269
TT = = 0.4637 µmol/ml
0.058
0.077+0.0269
T1 = = 1.7914 µmol/ml
0.058
0.171+0.0269
T2 = = 3.4120 µmol/ml
0.058
0.252+0.0269
T3 = = 4.8086 µmol/ml
0.058
0.324+0.0269
T4 = = 6.05 µmol/ml
0.058
0.407+0.0269
T5 = = 7.4810 µmol/ml
0.058
0.457+0.0269
T6 = = 8.3431 µmol/ml
0.058
Velocidad
0.4637
VoT = = 0.0463 U.I.
10
1.7914
Vo1 = = 0.1791 U.I.
10
3.4120
Vo2 = = 0.3412 U.I.
10
 4.8086
Vo3 = = 0.4808 U.I.
10
6.05
Vo4 = = 0.605 U.I.
10
7.4810
Vo5 = = 0.7481 U.I.
10
8.3431
Vo6 = = 0.8343 U.I.
10
Cálculos de Concentración de sustrato
𝑣 = 𝑘[𝐸]
[𝐸]- Concentración de la enzima
𝑣 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 = 0. 3(0.5) = 0.15
𝑣 1 = 0. 3(0.1) = 0.03
𝑣 2 = 0. 3(0.2) = 0.06
𝑣 3 = 0. 3(0.3) = 0.09
𝑣 4 = 0. 3(0.4) = 0.12
𝑣 5 = 0. 3(0.5) = 0.15
𝑣 6 = 0. 3(0.6) = 0.18

Tabla 3. Resultados obtenidos del efecto de la enzima sobre la velocidad de reacción

TUBO
Testigo 1 2 3 4 5 6
Enzima (ml) 0.5 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Absorbancia λ = 0 0.077 0.171 0.252 0.324 0.407 0.457
540 nm
Azúcar reductor 0.4637 1.7914 3.4120 4.8086 6.05 7.4810 8.3431
(µmoles/ml)
Velocidad 0.0463 0.1791 0.3412 0.4808 0.605 0.7481 0.8343
(unidades de
invertasa)
Concentración de 0.15 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 0.18
sustrato (moles/L
= M)
Gráfico 4. Relación sobre la Absorbancia vs el azúcar reductor

Gráfico 5. Relación de velocidad en unidades de invertasa o internacionales contra

concentración de enzima en microgramos/ mL
 Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción:
TUBO
Testigo 1 2 3 4 5
Sustrato (ml) 0.5 0.05 0.215 0.30 0.50 0.80
Absorbancia λ = 0 0.161 0.304 0.248 0.353 0.325
540 nm
Azúcar reductor 0.4637 3.2396 5.7051 4.7396 6.55 6.0672
(µmoles/ml)
Velocidad 0.0463 0.3239 0.5705 0.4739 0.605 0.6067
(unidades de
invertasa)
Concentración de 0.1075 0.0107 0.0462 0.0645 0.1075 0.172
sustrato (moles/L
= M)
Concentración de 5 5 5 5 5 5
enzimas (µg/L)

Azúcares reductores
0+0.0269
TT = = 0.4637 µmol/ml
0.058
0.161+0.0269
T1 = = 3.2396 µmol/ml
0.058
0.304+0.0269
T2 = = 5.7051 µmol/ml
0.058
0.248+0.0269
T3 = = 4.7396 µmol/ml
0.058
0.353+0.0269
T4 = = 6.55 µmol/ml
0.058
0.325+0.0269
T5 = = 6.0672 µmol/ml
0.058
Velocidad
0.4637
VoT = = 0.0463 U.I.
10
3.2396
Vo1 = = 0.3239 U.I.
10
5.7051
Vo2 = = 0.5705 U.I.
10
4.7396
Vo3 = = 0.4739 U.I.
10
6.55
Vo4 = = 0.605 U.I.
10
 6.0672
Vo5 = = 0.6067 U.I.
10
Cálculos de Concentración de sustrato
𝑣 = 𝑘[𝐸]
[𝐸]- Concentración del sustrato
𝑣 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 = 0.215(0.5) = 0. 1075
𝑣 1 = 0.215(0.05) = 0.0107
𝑣 2 = 0.215(0.215) = 0.0462
𝑣 3 = 0.215(0.30) = 0.0645
𝑣 4 = 0.215(0.50) = 0.1075
𝑣 5 = 0.215(0.80) = 0.172

Gráficos 6 y 7. Gráficas de velocidad en unidades de invertasa o internacionales

contra concentración de sustrato en moles/L.
 Cálculo de la constante de Michaelis-Menten por el procedimiento gráfico de Lineweaver-Burk.
𝑣 = 𝑉𝑚á𝑥[𝑆] / 𝐾𝑚 + [𝑆]
𝑣 = 1.62(0.172) / 0.215+0.172 = 0. 72
En la gráfica la velocidad máxima se registra al valor de , y para la determinación de la constante
de Michaelis-Menten, la mitad de la velocidad máxima es , interpolando en la gráfica da un valor
de

Efecto de inhibidores sobre la velocidad de la reacción:

TUBO
Testigo 1 2 3 4 5
Sustrato (ml) 0.5 0.05 0.215 0.30 0.50 0.80
Absorbancia λ = 0 0.065 0.020 0.004 0.041 0.028
540 nm
Azúcar reductor 0.4637 1.5844 0.8086 0.5327 1.1706 0.9465
(µmoles/ml)
Velocidad 0.0463 0.1584 0.0808 0.0532 0.1170 0.0046
(unidades de
invertasa)
Concentración de 0.15 0.015 0.0645 0.09 0.15 0.24
sustrato (moles/L
= M)
Concentración de 5 5 5 5 5 5
enzimas (µg/L)

Azúcares reductores
0+0.0269
TT = = 0.4637 µmol/ml
0.058
0.065+0.0269
T1 = = 1.5844 µmol/ml
0.058
0.020+0.0269
T2 = = 0.8086 µmol/ml
0.058
0.004+0.0269
T3 = = 0.5327 µmol/ml
0.058
0.41+0.0269
T4 = = 1.1706 µmol/ml
0.058
0.028+0.0269
T5 = = 0.9465 µmol/ml
0.058
Velocidad
0.4637
VoT = = 0.0463 U.I.
10
 1.5844
Vo1 = = 0.1584 U.I.
10
0.8086
Vo2 = = 0.0808 U.I.
10
0.5327
Vo3 = = 0.0532 U.I.
10
1.1706
Vo4 = = 0.1170 U.I.
10
0.0463
Vo5 = = 0.0046 U.I.
10
Cálculos de Concentración de sustrato
𝑣 = 𝑘[𝐸]
[𝐸]- Concentración del sustrato
𝑣 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 = 0. 3(0.5) = 0.15
𝑣 1 = 0. 3(0.05) = 0.015
𝑣 2 = 0. 3(0.215) = 0.0645
𝑣 3 = 0. 3(0.30) = 0.09
𝑣 4 = 0. 3(0.50) = 0.15
𝑣 5 = 0. 3(0.80) = 0.24
DISCUSIÓN
De acuerdo con los resultados, se obtuvo que debido a la absorbancia, los azúcares
reductores determina que la velocidad de reacción en el sustrato afectó de manera
equivalente a la velocidad de reacción hasta llegar al punto máximo en donde la
enzima dejó de reaccionar pasando así al proceso de desnaturalización. Sin
embargo, el inhibidor afectó a la enzima demostrando así la diferencia entre
inhibidor y enzima en competencia, al incrementar la concentración de sustrato
incrementa la inhibición. Debido a que la pendiente es igual a km entre la velocidad
máxima, ambos parámetros disminuyen de forma proporcional, por lo que, si la
velocidad máxima disminuye, disminuye el valor de Km.

CONCLUSIONES
-La concentración en aumento de sustrato determina el límite máximo en la actividad
enzimática.
-En caso del inhibidor, el uso en esta práctica fue en aumento.
-El tipo de inhibición que se obtuvo de las reacciones fue acompetitiva ya que, al
obtener la gráfica, la inversa de la velocidad contra la inversa de la concentración
se obtuvieron dos líneas paralelas, indicando dicha inhibición.
-La relación enzima-sustrato en el caso de la sacarosa y la sacarasa a partir de la
hidrólisis dio como productos fructosa y glucosa.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Localización QP514.2
• Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman
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• Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378.
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temperatura sobre la actividad. (2017, 12 mayo). Issuu. Recuperado 1 de
abril de 2022, de
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_pH_SOBRE_LA_VELOCIDAD_DE_REACCI%C3%93N
• PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS
ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN
INHIBIDOR. (2020).
https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/seccic3b3n3-
sustrato-e-inhibidor-final.pdf
•