UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC

DIVISIÓN QUÍMICO BIOLÓGICAS

Administración del tiempo

PRÁCTICA No. 3 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Presenta:
Martínez López Karelly Lizzet
Navarro Hernández Ana Belen
Pinto de León Rodríguez Aridai
Méndez Cruz Suri Zadai

Grupo:
7IBT3

Asesor académico:
Carlos Adulfo Esquinca Canseco

Séptimo Cuatrimestre
Septiembre – Diciembre 2022
10/11/2022
 INTRODUCCIÓN
“La cromatografía es un procedimiento químico utilizado en todas las ramas de la ciencia, que permite
la separación, identificación, cuantificación, cualificación y determinación de los componentes
químicos individuales de sustancias en mezclas complejas, de acuerdo con la purificación de
compuestos de una manera muy precisa” (CIENTEC, 2019).
El método cromatográfico consiste en inocular una muestra en una fase estacionaria o fase móvil
(dependiendo del tipo de técnica cromatográfica), como se muestra en la Figura 1, se observan las
partes básicas de una cromatografía la fase estacionaria que es el papel filtro y la fase móvil que es el
disolvente, el papel se encontrará en la cámara de corrimiento o también llamada cubeta de vidrio.

Figura 1. Partes de una cromatografía. (https://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm)

Se clasifican de acuerdo con el mecanismo de separación en:

✓ Cromatografía de adsorción: se6 basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa
de los compuestos por el sólido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas
se determinan casi exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más
polar que la fase móvil.
✓ Cromatografía de intercambio iónico: Donde los componentes de la muestra interaccionan por
atracción de cargas eléctricas opuestas en una resina que contiene a un ión intercambiable. Se
divide en resinas aniónicas y catiónicas.
Por el tipo y estructura de la fase estacionaria, la cromatografía se divide en:
✓ Cromatografía Laminar o Plana Es una modalidad de cromatografía líquida caracterizada por el
hecho de que la fase estacionaria está dispuesta en forma de plano o lámina, y la fase móvil
fluye a través de ella por capilaridad o por gravedad.
✓ Cromatografía en columna: La fase estacionaria se encuentra empaquetada en una tubo o
columna hecho de material inerte.
(CIENTEC, 2019).
Para determinar la eficiencia de separación que tiene una columna o una lámina con respecto a los
componentes de una muestra se denota con un término llamado Coeficiente de Distribución “K” y se
define como la relación que describe la cantidad de soluto retenido por la fase estacionaria entre el
acarreado por la fase móvil.
K = Cfe /Cfm
Al efectuar una cromatografía de intercambio iónico el coeficiente se denomina Coeficiente de
Distribución “Kd”.
Kd = Crs/Cfm
Donde:
Crs: Cantidad del ion en la resina/g resina seca.
Cfm: Cantidad del ion en la disolución (o fase móvil) por mL de disolución.
En una cromatografía laminar se conoce como “corrimiento o desarrollo” cromatográfico y el producto
final es un cromatográma revelado. En cambio cuando la alícuota de una muestra recorre la columna,
efectuándose la separación de sus componentes se conoce como elución, obteniéndose al final de la
misma un eluído.

OBJETIVOS

General
• Determinar diferentes cromatografías por medio de diversos tipos de muestras liquidas y de
colorantes para observar el funcionamiento de cada uno de ellos.
Específicos
• Calcular el factor de retención de la safranina y el cristal violeta por cromatografía laminar.
• Realizar una cromatografía de intercambio iónico de una resina catiónica para observar la
interacción por atracción de estas cargas eléctricas
 MARCO TEÓRICO
“La cromatografía describe un procedimiento químico en el que se separa una mezcla en sus
componentes individuales mediante una fase móvil y una fase estacionaria. La fase estacionaria
consta, según el procedimiento, de materia sólida o un líquido, y la fase móvil de un líquido o gas.”
(PCE, 2014)
La cromatografía tiene usos en procedimientos, según sea en el campo de aplicación que se desarrolle
tiene sus ventajas y desventajas. Los procedimientos más importantes son la cromatografía en papel
cromatografía en capa fina, la cromatografía en columna y la cromatografía de gases.
Cromatografía en capa fina (TCL)
“La cromatografía en capa fina (TLC) (figura 2) es un método de afinidad que se utiliza para separar
los compuestos de una mezcla. La TLC es un método de separación muy versátil que se utiliza
ampliamente para el análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras. La TLC puede utilizarse para
analizar prácticamente cualquier clase de sustancia: plaguicidas, esteroides, alcaloides, lípidos,
nucleótidos, glucósidos, carbohidratos y ácidos grasos.” (MERCK, 2016)
En la cromatografía en capa fina, consiste en una capa delgada de un adsorbente como por ejemplo
el gel de sílice, alúmina o celulosa que es depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio,
o una lámina de aluminio o de plástico para así analizar de una mezcla de componentes.

Figura 2. Principio de la cromatografía en capa fina.

https://www.bioted.es/wp-content/uploads/2020/02/PRINCIPIOS-CROMATOGRAFIA-
EN-CAPA-FINA-1.pdf

Cromatografía en papel
“La cromatografía en papel (figura 3) se utiliza para compuestos muy polares o polifuncionales. El uso
más común es para azúcares, aminoácidos y pigmentos naturales. En esta cromatografía se utiliza el
fenómeno de partición en donde la fase estacionaria se halla sobre un soporte activo (el papel) que en
realidad forma parte de la fase estacionaria que es el agua. Las fases móvil y estacionaria estarán en
contacto en una gran interfase, lo que permite una rápida obtención de una distribución de equilibrio
del soluto entre ellas. Si la muestra problema está formada por más de un soluto, éstos se separan
por sus diferentes coeficientes de partición.” (TPN, 2011)
La cromatografía en papel es de la categoría de "Cromatografía de líquidos". La fase estacionaria se
compone de una cinta de papel colocada de manera vertical en un recipiente de cristal y la fase móvil
de un líquido. El movimiento de la fase móvil es provocado debido a la fuerza capilar. Un campo en
donde se utiliza la cromatografía en papel es el análisis de mezclas.

Figura 3. Cromatografía en papel

https://www.educamix.com/educacion/3_eso_
materiales/b_ii/actividades/act_cromatografia.
htm

Cromatografía en columna
“En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el
interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al
exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente
la mezcla orgánica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase
estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema (figura 4).” (Méndez, 2011)
La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para la separación y
purificación de diferentes compuestos orgánicos que estén en estado sólido o en estado líquido.
También es perteneciente a la categoría "Cromatografía de líquidos".

Figura 4. Cromatografía en columna

http://www.academiatesto.com.ar/cms/metodos-
de-medicion-cromatografia-en-columna
Cromatografía de intercambio iónico
“El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico (figura 5) es que las moléculas cargadas
se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser
asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores
iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye
de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del
buffer con el material por los sitios de unión” (Álvarez, 2019)
Un intercambiador iónico es un polímero que tiene grupos cargados unidos, son estables dentro de un
margen de pH determinado ya sea cargados de manera positiva o negativamente. Los
intercambiadores aniónicos son portadores de grupos con cargas positivas que unen aniones de forma
reversible. y el intercambiador catiónico son portadores de grupos con carga negativa que unen
cationes de modo reversible

Figura 5. Cromatografía de intercambio iónico

http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-
Virtual/BQblog/Cromatografia%20de%20intercambio%20ionico.pdf
 EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS

✓ Papel filtro No. 2

✓ Pinzas para bureta
✓ Capilar
✓ Soporte universal
✓ Vaso de precipitados de 100 mL
✓ Mechero o lámpara de alcohol
✓ Matraz erlenmeyer de 125 mL
✓ Probeta de 100 mL
✓ Pipeta de 5 o 10 mL
✓ Tren de tinción de Gram
✓ Fibra de vidrio
✓ Vidrio de reloj
✓ Pizeta con agua destilada
✓ Cámara de corrimiento
✓ Carbón activado
✓ Acetona
✓ Resina de intercambio catiónico
✓ Alcohol al 96%
✓ Negro de Eriocromo T
✓ Bureta de 25 mL
✓ Buffer de amonio para dureza de pH 10
✓ Hidróxido de Sodio 0.5N
✓ Ácido clorhídrico 0.5N
✓ Conductivimetro
✓ Potenciómetro para pH
 METODOLOGÍA y RESULTADOS.
A) Cromatografía Laminar. Cromatografía en papel.
B) Cromatografía en columna. Empaquetamiento.
C) Cromatografía de Adsorción.
D) Cromatografía de Intercambio Catiónico.
 RESULTADOS
a) Cromatografía en papel.
En la primera parte de la practica se selecciono la fase móvil a partir de los eluyentes disponibles,
siendo en este caso el alcohol etilico al 96 y cetona y se agregó a la cámara cromatográfica.
Posteriormente en un pliego de 2cm de ancho de papel filtro se marco un punto en el centro a 1cm de
altura para ahí con ayuda del capilar colocar la muestra, para después dejarla correr dentro de la
cámara por un lapso de tiempo.
La fase móvil utilizada tuvo una respuesta notable, provocando la separación de las dos tintas, esto
se debe porque el alcohol etilico obedece el principio Químico que dice “semejante disuelve a
semejante” , es decir al agregar este eluyente apolar, el adsorbente arrastra los compuestos con el,
de esta manera ciertos componentes de la muestra que son polares se absorben en la fase
estacionaria osea en el lugar de origen, y a medida que se produce la elucion van siendo desplazados
y solubilizados los componentes apolares junto con el disolvente de la fase movil, provocando así la
separación.
El papel filtro es un eluyente polar por lo tanto se queda con la safranina que también es un eluyente
polar y el cristal violeta se queda arriba
Mientras para la resina ocurre una cromatografía de reversa lo cual la resina funge como un eluyente
no polar y jala a los componentes no polares como lo es la safranina y el cristal violeta permanece
FACTOR DE RETENCIÓN
FR=D/DM
PAPEL FILTRO
FR1= 3/7=0.43
FR2=2/7=0.29
RESINA
FR1=1/3=0.33
FR2=2/3=0.66
 b) Cromatografía de adsorción
En esta parte de la practica, la columna contenía carbón activado de forma granulada por este medio
iba a pasar el eluyente es decir la muestra que contenía la mezcla de agua y cristal violeta, que al
verterlo a la columna el carbón activado iba purificando la muestra debido a su gran porosidad, de
esta manera las moléculas o iones de la sustancia quedan retenidas en la superficie, esta característica
lo convierte en un adsorbente extremo.
Por ello el resultado del agua era transparente ya que el carbón activado funciona como un filtro y en
el se quedaban atrapados los componentes del cristal violeta.

c) Cromatografía de intercambio catiónico

En esta parte teníamos una columna con resina de intercambio catiónico que nos permitió separar
los iones y moléculas polares basadas en las propiedades de carga de las moléculas, es decir, al
agregar a la columna el agua destilada y agua de la llave que tiene hidrógeno como catión y oxígeno
como anión, la columna con resina catiónica atrapa a los hidrógenos y suelta a los Sodios saliendo al
final los oxígeno y los sodios.
ANÁLISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES
 CUESTIONARIO.
1.Explique la diferencia de separación de los componentes de una muestra en una
cromatografía de intercambio iónico, exclusión molecular, adsorción y partición.
En la cromatografía de intercambio iónico la separación de componentes de la muestra ocurre en
función del tipo y magnitud de la carga eléctrica.
En la cromatografía de exclusión molecular la separación de componentes de la muestra ocurre en
función del tamaño molecular.
En la cromatografía de repartición la separación de componentes de muestra por diferencia de
afinidades entre fase estacionaria y fase móvil.
2. ¿Cómo se lleva a cabo la adición de la muestra en una cromatografía de frente móvil (análisis
frontal), elusión y desplazamiento?
Adición de la muestra
La muestra se adiciona en la superficie superior del adsorbente contenido en la columna con la ayuda
de una pipeta se adiciona directamente. Para evitar que se deforme la superficie de adsorbente durante
la adición, se puede depositar la muestra en la pared interior de la columna permitiendo que resbale
hasta la superficie del adsorbente.
Finalizada la adición de la muestra se abre la llave de la columna y se eluye hasta que la muestra sea
adsorbida y el nivel del líquido quede aproximadamente 1 mm por encima de la superficie del
adsorbente. Se lavan las paredes internas de la columna (por las que se ha dejado resbalar la muestra)
con un poco de eluyente y se eluye de nuevo hasta que el nivel del líquido vuelva a quedar 1 mm por
encima de la superficie del adsorbente.
Elusión de la columna
Una vez adicionada la muestra, se llena la parte superior libre de la columna con el eluyente y se abre
la llave de la columna estableciendo un flujo continuo de la fase móvil. Se van tomando fracciones
consecutivas del eluyente que serán examinadas posteriormente para determinar su composición.
medida que sea necesario se va adicionando más eluyente a la parte superior de la columna, hasta
que el análisis de las fracciones confirme que la elución de los componentes de la mezcla se ha
completado.
Desplazamiento
Durante el proceso cromatográfico los componentes de la muestra son arrastrados por la fase móvil a
distintas velocidades efectuándose la separación. La velocidad de arrastre de cada componente
depende de su grado de adsorción en la fase estacionaria y de su afinidad por la fase móvil.
3. En la cromatografía laminar ¿Qué significado se le da al factor de Retención Rf?
El análisis Cualitativo y Cuantitativo es la identificación de los analitos por comparación de las
distancias recorridas por los mismos con las de los patrones. Para ello se utiliza un parámetro que es
el RF o factor de retraso.
 Zs
RF =
Zf

Frente de la fase móvil

 El RF es característico de cada analito

Para unas determinadas condiciones
ZZ cromatográficas

Zs Zf

Línea de aplicación

El factor de retardo, también conocido como factor de retención o valor de Rf, representa la tasa
característica de movimiento de un componente en una mezcla a medida que se mueve la fase móvil.
4. ¿Cuál es la función de la saturación de la fase estacionaria en una cromatografía laminar?
En la fase estacionaria se hace una saturación de los compuestos para que la fase móvil ayude a la
separación de estos componentes de una manera mas observable al distinguirse mas los colores ya
que entre mas muestra mas se verá el desplazamiento de los componentes .
5. Defina los siguientes términos: fase estacionaria, soporte, fase móvil y eluído.
Fase estacionaria: material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la
cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee una gran área superficial y puede
ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte.
Soporte: el material sólido inerte que en la cromatografía de reparto sirve para sostener la fase
estacionaria líquida en su sitio.
Fase móvil: es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como portador de
la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y la fase estacionaria.
Elución: adición de la fase móvil provoca desplazamiento de los componentes de la muestra a
diferentes velocidades
 REFERENCIAS
Álvarez, C. (2019). CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO. UFQ. URL:
http://ufq.unq.edu.ar/DocenciaVirtual/BQblog/Cromatografia%20de%20intercambio%20ionico.pdf
CIENTEC. (2019). ¿Qué es Cromatografía?. URL: https://cientecinstrumentos.cl/que-es-
cromatografia/#:~:text=La%20cromatograf%C3%ADa%20es%20un%20procedimiento,compue
stos%20de%20una%20manera%20muy
Méndez, A. (2011). Cromatografía en columna. La Guía. ULR:
https://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna
MERCK. (2016). Cromatografía en capa fina. MERCK. URL:
https://www.sigmaaldrich.com/MX/es/applications/analytical-chemistry/thin-layer-
chromatography
PCE. (2014). Cromatografía. PCE. URL: https://www.pce-iberica.es/instrumentos-de-
medida/instrumentos-laboratorios/cromatografia.htm
Sgariglia, M; Soberón, J; s, D y Vattuone M. (2010). CROMATOGRAFÍA: CONCEPTOS Y
APLICACIONES. Revista Arakuku, 1 (2), 1 – 6. URL:
www.csnat.unt.edu.ar/academica/publicaciones/revista‐arakuku
TPN. (2011). Cromatografía en papel. TPN. URL:
http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2010/08/2011-TP-9-
CROMATOGRAFIA-PAPEL.pdf
UAH. (2020). Cromatografía. URL: https://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm