Wuolah Free 2 PARCIAL APUNTES

farmaa10
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5810
2-PARCIAL-APUNTES.pdf
Parte Microbiología 2ndo Parcial
3º Biotecnología
Grado en Farmacia
Facultad de Farmacia
Universidad de Granada
Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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TEMA 13: CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN BIOTECNOLOGÍA
BIOTECNOLOGÍA: tecnología aplicada a la biología, es decir, la biología con un desarrolllo

tecnológico. Especialmente usada en medicina, salud, farmacia y también en la industria,
agricultura...La biotecnología es el empleo o la manipulación de organismos vivos para la
obtención de un bien o servicio útil para el hombre. Según la OECD*: es la actividad
multidisciplinar que aplica principios de biología e ingeniería para el procesamiento de materiales
por agentes biológicos para la obtención de bienes y servicios.
Esta definición surge como mezcla de estas dos:
·Biotecnología clásica: empleo de organismos para la obtención de un producto útil para la

industria.
·Biotecnología moderna: es la que emplea las técnicas de ingeniería genética.
Los agentes biológicos son células microbianas, virus, animales, vegetales...
Los bienes pueden ser cualquier producto industrial, alimento, químicos, enzimas,
medicamentos..,
Los servicios son aquellos relacionados con industrias, biorremediación...
ÁREAS DE INTERÉS: APLICACIÓN DE MICROORGANISMOS Y SISTEMAS O PROCESOS

BIOLÓGICOS EN LAS INDUSTRIAS:
Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
·DNA recombinante: sustancias químicas, vacunas, enzimas, hormonas, anticuerpos...
·Enzimas y biocatalizadores: elboración de alimentos, equipo de diagnóstico, quimioterapia,

biosensores...
·Ingeniería de procesos: filtración, extracción de productos...
·Interferones y anticuerpos monoclonales
·Fermentaciones tradicionales: alcohol, antibióticos...
AGRUPACIÓN POR COLORES SEGÚN LAS APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
·BIOTECNOLOGÍA ROJA: relacionada con la medicina.
Obtención de vacunas y antibióticos, de nuevos fármacos.
Técnicas moleculares y de diagnóstico.
Las terapias regenerativas.
Terapia génica: cura enfermedades a través de la manipulación genética.
·BIOTECNOLOGÍA BLANCA: industrial.
Al diseño de procesos y productos.
Producción de productos químicos y textiles, biocombustibles, productos biodegradables..
·BIOTECNOLOGÍA VERDE: agrícola.
Creación de nuevas variedades de plantas resistentes.
La producción de biofertilizantes y biopesticidas y el cultivo in vitro y clonación de vegetales.
·BIOTECNOLOGÍA GRIS: del medio ambiente.
Mantenimiento de la biodiversidad y eliminación de contaminantes.
·BIOTECNOLOGÍA AZUL: marina y acuática.
Explotación de los recursos del mar para la generación de productos y aplicaciones de interés
industrial. Sus aplicaciones son prometedoras para la agricultura, cuidados sanitarios, cosmética
y productos alimentarios.
2.MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN BIOTECNOLOGÍA
·Biotecnología clásica: hongos y bacterias.
·Biotecnología moderna: hongos, bacterias, virus, arqueas.
Dentro de los microorganismos procariotas: bacterias y arqueas (son de ambientes extremos).
Dentro de los microorganismos eucariotas: levaduras (hongos unicelulares) y mohos (hongos

filamentosos).
Dentro de los microorganismos acelulares con estructura molecular encontramos a los virus,
organismos muy pequeños con información genética y sin estructura celular. Son parásitos
celulares estrictos.
CARACTERÍSTICAS QUE HACEN ATRACTIVOS A LOS MICROORG. EN BIOTECNOLOGÍA
·Crecen rápidamente: pequeño tamaño y alta relación superficie/volumen.
·La biodiversidad microbiana es gigantesca: fuente inagotable de productos variados.
·Presentan una gran variedad de metabolismo: pueden adaptarse a diferentes condiciones

ambientales, distintos sustratos y la versatilidad permite la utilización de nutrientes baratos.
·Fáciles de manipular: factorías de producción.
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CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS RELACIONADAS CON LA SÍNTESIS DEL

PRODUCTO BIOTECNOLÓGICO DE INTERÉS.
1.Producir la sustancia de interés.
2.Crecer rápidamente en un medio de cultivo barato.
3.Desarrollarse en cultivo puro y en gran escala.
4.Tener una ruta biosintética bien caracterizada.
5.Fabricar el producto en un período corto.
6.Tener requisitos de crecimiento que dificulten las contaminaciones.
7.Ser estable genéticamente pero susceptible de manipulación genética.
8.Facilidad para inocular en grandes fermentadores.
9.Ser seguro, no patógeno y no producir agentes tóxicos (a no ser que sea el producto buscado).
10.Posibilidad de retirar fácilmente las células del cultivo.
MICROORGANISMOS MODELO: ¿QUÉ SON?
Son organismos similares biológicamente, fáciles de manipular y de estudiar. Presentan una serie
de ventajas: rápido desarrollo, ciclos de vida cortos, tamaño pequeño, disponibles, fáciles de
obtener. De ellos se puede obtener una gran cantidad y valiosa información para el análisis del
desarrollo humano, regulación genética, enfermedades y procesos de evolución.
·Modelos bacterianos:
Modelo: E.coli es el mejor conocido en el ámbito científico.
Su genoma fue secuenciado en 1997y es una enterobacteria: habitante de la microbiota

intestinal. Su estudio nos ha proporcionado algunos de los fundamentos de la biología moderna:
de recobinación genética de las bacterias, de transcripción del ARN, de replicación del ADN y de
la regulación génica.
·Modelos eucariotas:
Levaduras. Modelo: Saccharomyces cerevisiae.
Eucariota más utilizado en ingeniería genética. Se conoce su pequeño genoma completo.
Sistemas de hospedador y vector muy establecidos. Mecanismos de expresión génica

semejantes a células humanas. Es un potente modelo biológico de organismos eucariotas. Su
genoma completo fue secuenciado en 1996 por un grupo europeo.
·Modelos acelulares:
Virus. Modelo de vectores: Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus.
Son los virus más utilizados en ingeniería genética para aplicaciones de terapia génica. Se
conoce su genoma completo y su ciclo de vida, así como sus sistemas de infección de células
hospedadoras. Son virus cuyas estructuras son conocidas y genomas han sido secuenciados.
3.AISLAMIENTO DE NUEVOS MICROORGANISMOS DE USO BIOTECNOLÓGICO:

“SCRRENING”
Tenemos 2 posibilidades:
·Aislarlos de la naturaleza de orígenes variados: el material puede ser el suelo, fondos marinos,
tracto gastrointestinal...
·Obtenerlos a partir de colecciones privadas o públicas de cultivo.
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE LA NATURALEZA
Estrategias:
1.Para promover y seleccionar: medios de enriquecimiento y medios selectivos.
2.Para el proceso de búsqueda: métodos acelerados de selección.
3.Estrategias para microorganismos no cultivables: cultivo y metagenómica.
1.PARA PROMOVER Y SELECCIONAR: MODIFICACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
·medios de enriquecimiento: medio líquido
Utilizar para aislar las bacterias: ph extremo si queremos aislar bacterias acidófilas o alcalófilas; o
alta concentración de sal si queremos aislar bacterias halófilas.
Condiciones de cultivo: baja temperatura si queremos aislar psicrófilos y altas temperaturas si

queremos aislar termófilos.
·medios selectivos: medios sólidos, con inhibidores del crecimiento de bacterias, sólo las
resistentes sobreviven.

2.PARA ACELERAR EL PROCESO DE

BÚSQUEDA: MÉTODOS ACELERADOS DE
SELECCIÓN (tabla)
3.ESTRATEGIAS PARA MICROORGANISMOS NO

CULTIVABLES
<1% de especies microbianas en la naturaleza son

cultivables.
·nuevos enfoques en las técnicas basadas en el

cultivo: muy diversos intentos.
Modificación del medio de cultivo: incluye cambios

en la composición, adición de sustancias específicas y dilución del medio...
Modificación de las condiciones de crecimiento: para imitar las condiciones naturales...
Cultivos comunitarios: mezcla de bacterias para cultivar aquellas no cultivables que requieren de
la cooperación.
La microencapsulación de células permite la difusión de nutrientes y la comunicación microbiana

lo que minimiza el sobrecrecimiento de competidores de crecimiento más rápido.
·utilización de la metagenómica o Genómica ambiental: aislamiento in situ de su ADN
TECNOLOGÍAS “ÓMICAS”
·Genómica
·Metagenómica: estudio del genoma, del material genético.
·Transcriptómica
·Proteómica
·Integrómica
OBTENCIÓN DESDE LAS COLECCIONES DE CULTIVO PÚBLICAS
·ATCC: American Type Culture Collection
·DSMZ: Deutsche Samsung von Microorganismen
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo (Valencia)
COLECCIONES DE CULTIVO (OJO: diferentes especies)
1.En todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos tipo
o puros.
2.Se consideran organismos nacionales acreditados para su función de ser garantes del depósito
de nuevas cepas bacterianas descritas como especies nuevas.
3.Se rigen por un código para el depósito de las cepas y para la dispensación de las mismas a
los distintos demandantes.
Guardan convenientemente cepas ce microorganismos, células superiores o diversos materiales

biológicos y los suministran, previa petición, a laboratorios microbiológicos.
Se llaman colecciones de cultivo tipo porque elijo la cepa más representativa de la especie.
BANCOS DE CEPAS DE UNA MISMA ESPECIE BACTERIANA
Son las mismas especies y diferentes genotipos o fenotipos. Necesito esta variabilidad para
poder hacer un producto específico. Son diferentes cepas.
Se especializan los bancos de cepas en aquellas especies consideradas como biofábricas.
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS DE USO BIOTECNOLÓGICO
·Almacenamiento a baja temperatura: por subcultivos:
Tiene elevados costes.
Riesgo de contaminación y mutación.
Pérdida de productividad.
·Crioconservación: (los microorganismos quedan en estado latente y pueden volver a proliferar)
Suave: -18ºC.
Fuerte: -80ºC.
Ultracongelación: -196ºC

CONSERVACIÓN DEL MICROORGANISMO
1.Por congelación a temperaturas muy inferiores a 0ºC:
Paralización del metabolismo celular por la disminución del agua disponible. Utilización de crio
protectores que minimizan daños durante la congelación. Necesitamos críoconservadores para
evitar la formación de agujas en el citoplasma y evitar así la lisis de la célula. Se utilizan: glicerol,
dmso, etc...todo lo que permita el intercambio iónico en la membrana.
2.Por liofolización: paso de liquido a sólido y tengo la estructura de la bacteria desecada pero
perfectamente viable. En medio liquido se recupera. Este es el preferido para mantener las celulas
en los repositorios.
La liofilización consiste en la paralización del metabolismo celular por falta de agua: congelación
y sublimación.
Ventajas de la liofilización: largo tiempo de conservación, reducción de la variabilidad del

microorganismo.
Inconvenientes: no todo el mundo tiene el equipo necesario, alto coste, preparación incorrecta de
los distintos lotes.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS DE USO BIOTECNOLÓGICO: GENERALIDADES
·Elementos esenciales de un cultivo de microorganismos: células, sustratos, energía y productos.
Los microorganismos requieren sustratos para 3 funciones principales:
+Sintetizar nuevo material celular.
+Sintetizar productos extracelulares.
+Producir la energía necesaria para reacciones sintéticas,

mantener dentro de las células sustancias diferentes de
las del ambiente y para dirigir las reacciones de
reciclamiento dentro de las células.
·Metabolismo aerobio: respiración.
·Metabolismo anaerobio: fermentación.
Elijo la célula, le pongo el sustrato necesario (barato), le

pongo las condiciones necesarias para que lleve a cabo
su metabolismo (mejor en aerobiosis). Así se sigue el
patrón del microorganismo. Utilizo un sistema abierto
porque tengo un aporte continuo de nutrientes y una
salida de productos y de desecho. Mi producción masiva
no se para.
En la fase exponencial quiero que se mantenga la mayor parte del tiempo para producir más.
¿Qué productos voy a obtener?
·Productos de tipo 1: de la fosforilación oxidativa. Como etanol, ácido láctico, cítrico, que serán
excretados por la célula.
·Productos de tipo 2: productos extracelulares como exoenzimas, polisacáridos...
·Productos de tipo 2: de almacenamiento de energía. Son productos resultantes de un exceso de

substrato carbonado o limitaciones de N o Mg.
CULTIVOS CERRADOS: en los sistemas cerrados, no existe aporte continuo de nutrientes, ni

drenaje de células ni de sustancias de desecho. El microorganismo crecerá hasta que se agota un
nutriente esencial o se acumulan productos tóxicos.
CRECIMIENTO EXPONENCIAL NO RESTRINGIDO para diseñar el sustrato y fermentador asi

como las condiciones para mantenerme en el mayor tiempo posible en la fase exponencial. Eligiré
la cepa de mayor coeficiente exponencial de crecimiento que será la más eficaz.
Permanentemente busco prolongar la fase de crecimiento balanceado (estar más tiempo en la

exponencial).
El quimiostato nos permite controlar el sistema y los nutrientes así como la turbidez del medio.
Busco un equilibrio dinámico. El quimiostato mide un nutriente relevante a las células.
El coeficiente exponencial de crecimiento es característico para cada cepa bacteriana en cada

medio determinado.
PROCESO BIOTECNOLÓGICO (esto si es importante)
Es una secuencia de operaciones o etapas que resulta en la obtención de un producto.
BIOPROCESOS: procesos mediante los cuales determinados sustratos son transformados por
acción biológica (microorganismos, células, tejidos) en biomasa y productos diversos.
Secuencias en el desarrollo de un producto BIOTECNOLÓGICO (hay que aprendérselo):
1.Identificación del producto: obtener el mejor catalizador biológico para una función o proceso.
En esta fase interviene la investigación y desarrollo. Se identifican células vivas, sobre todo
microorganismos. Manejo de los microorganismos.
2.Fabricación a pequeña escala y gran escala: obtener el mejor ambiente para la función de ese
catalizador biológico, mediante una serie de diseños técnicos en los que es fundamental la
ingeniería química. A la pequeña intervienen los investigadores. Primer entorno de laboratorio,
despúes industrial (biorreactores o fermentadores) y eliminación del material biológico.
3.Procesamiento del material: separar y eventualmente purificar el material biológico producido.
Recuperación eficiente del producto buscado.
4.Evaluación de la seguridad del producto: controles rigurosos según normativas nacionales o

internacionales.
Estos 4 pasos son muy importantes!!!!!!!!!
TEMA 14: PRINCIPALES CEPAS BACTERIANAS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
Bioproceso: metodología específica que utiliza alguna entidad biológica particular que genera
como producto alguna sustancia de interés. (seguridad)
Bacterias biotecnológicas:
1.Bacterias como herramientas biotecnológicas: biofábricas.
2.Bacterias productoras de bioproductos de interés biotecnológico.
3.Bacterias con genes-proteínas de interés biotecnológico.
BACTERIAS COMO HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS
Se usan como herramientas biotecnológicas por sus características de tamaño, nutrición y

ubicuidad. Además de su capacidad de adaptación a diversos nichos ecológicos. Pero
PRINCIPALMENTE por la capacidad de algunas bacterias de adquirir la capacidad de
competencia para transformación.
·Transformación bacteriana: captación y asimilación de ADN libre (desnudo), a partir del medio,
por parte de una célula receptora.
Esta transformación se puede dar de forma natural, por choque térmico, por reacción química o
por electroporación.
·Choque térmico: se generan poros instantáneos que permiten la entrada del DNA. Esta técnica
degrada mucho los lípidos de las membranas celulares.
Se hacen lavados sucesivos en una solución fría a 4ºC de Cl2Ca, tras la cual la mezcla de células
y ADN se someten a unos 1-2 min a 42ºC. Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo la
membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN.
·Electroporación: se abre y se cierra un poro que se crea en la membrana celular. Es más eficiente
que el choque térmico porque se hace más rápido y se carga menos la membrana. Se utiliza un
electroporador y cubetas de electroporación. Se preparan células competentes y el plásmido que
va a ser utilizado como vector del gen recombinante.
·Transformación química: transformación de E.coli con la proteína GFP. Sustancias químicas

permiten la formación de poros y la entrada del ADN exógeno al interior de la célula.
Bacterias recombinantes biofábricas:
E.coli (bacteria gram negativa)
Bacillus subtilis (bacteria gram positiva)

ESCHERICHIA COLI
Es la bacteria más utilizada en ingeniería genética. Banco de cepa ( 1 sola especie ).
Es una gamma-proteobacteria, gram negativa y enterobacteria.
CEPAS (SABÉRSELO, IMP):
·E.coli K12, están clasificadas desde el punto de vista de la bioseguridad, como el vehículo más
seguro para la clonación eficiente y la expresión de proteínas recombinantes.
·E.coli XL1-Blue
·E.coli DH5-alpha
Debemos conocer el fenotipo y el genotipo de cada cepa.
Se utilizan cepas diferenciales para usar la bacteria perfectamente necesaria para mantener
viables los plásmidos que hay que usar. IMP. Hay múltiples tipos de cepas que podríamos usar
para nuestra investigación biotecnológica.
(Leer este párrafo siguiente)
La cepa bacteriana XL-1 BLUE ha sido modificada genéticamente y es deficiente en la expresión

de enzimas que canalizan el arreglo y deleción de estructuras secundarias y terciarias que
ocurren frecuentemente en el ADN. Es decir, en endonucleasas (endA) y enzimas de
recombinación (recA). Y presenta la mutación en el gen hsdR, la cual previene el corte del ADN
clonado por el sistema endonucleasa EcoK, lo que asegura la correcta y eficiente amplificación
de los vectores.
BACILLUS SUBTILIS (otro modelo de producción en biotecnología)
BACTERIAS PRODUCTORAS DE BIOPRODUCTOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
Enzimas: celulasas producidas por E.coli; proteasas y amilasa producidas por Bacillus.
Ácidos y alcoholes: Bacterias GRAS.
Biotecnología clásica: Cepas bacterianas:
MICROORGANISMO GRAS = Generally Recognized As Safe. (IMP SABÉRSELO)
MICROORGANISMO QPS = Qualified Presumtion of Safety : cualificado presuntamente
como seguro. BAL: bacterias del ácido láctico. Bifidobacterias y Lactobacilos.
BACILLUS SP. (IMPORTANTE LO SUBRAYADO)
·Bacillus licheniformis: produce Subtilisina, una proteasa que puede usarse como
biodetergente, actúa contra las manchas de proteínas.
·Bacillus sp.: produce Alpha-Amilasas (para tratamiento de almidón en alimentos).
Degrada almidón+glucoamilasa: creación de glucosa pura;
Cocción del pan; Industria textil ; “Baker”
Estas Alpha-Amilasas pueden ser naturales, modificadas y de otros microorganismos insertados

en otros.
Comité FDA : “GRAS”
Comité EFSA : “QPS”
Comité EMA
Son comités que deciden is un producto biotecnológico cumple condiciones de ser GRAS y QPS.
Estos productos biotecnológicos no se pueden tolerar como productos 100% seguros porque
proceden de microorganismos, ya que no se puede asegurar 100% que no contienen sustancias
trazas que puedan ser alérgicas o dañinas.
APROVECHAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Han sido seleccionados y todos los microorganismos de esta lista se meten dentro de GRAS y
QPS por designación de los comités, salvo Aspergillus que no se considera seguro y no entra en
la clasificación QPS.
·Yogur: Streptococcus thermophilus ; Lactobacillus delbrueki
·Kefir: Lactococcus lactis ; Lactobacillus delbrueki
·Kumis: Lactobacillus delbrueki, leichmannii, Candida kefir
·Viili: Geotrichium candidum; bacterias lácticas
·Camembert: Penicilium camemberti
·Roquefort: Penicilium roqueforti
·Salsa de soja: Aspergillus oryzae o Aspergillus soyae ****** NO EN QPS.

BACTERIAS CON GENES-PROTEÍNAS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
·Genes con localización en plásmidos y megaplásmidos / con localización en cromosoma.
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Tiene el plásmido Ti (Variedades de plantas transgénicas)(Tumor inducing) que es de gran
tamaño. Es capaz de insertar DNA en cromosomas vegetales.
BACILLUS THURINGIENSIS
Contribución a la formación de organismos géneticos modificados.
·Gen Cry: proteína Cry con efecto insecticida para la pirálide del maíz.
·Gen Del : glifosato, efecto insecticida de otro microorganismo del género Bacillus.
Insecticida = producto de control biológico.
THERMUS AQUATICUS (EXAMEN)
Soporta 90-95ºC, vive en aguas termales (termófilo). Microorganismo productor de la Taq-

polimerasa, enzima termoestable útil para la PCR.
PSEUDOMONAS SYRINGAE
Estimula la formación de cristales de hielo por simbiosis con plantas. Efecto “antiescarcha”.
STREPTOCOCCUS MUTANS
Cepa recombinante que reduce las caries patológicas. No puede metabolizar los azúcares para
producir ácido láctico. Aprobada por la FDA para sustituir la microbiota normal.
BACTERIAS PRODUCTORAS DE ANTIBIÓTICOS:
·Bacillus (bacitracina, polimixina, gramicidina).
·Actinomicetos: Nocardia, Microspora, Streptomyces, Actinopolyspora.
TEMA 16: CARACTERÍSTICAS DE LOS PRINCIPALES EUCARIOTAS DE INTERÉS

BIOTECNOLÓGICO
Los eucariotas son hongos levaduriformes y hongos filamentosos.
Los primeros son unicelulares de forma redondeada y con reproducción por gemación. Los
segundos son multicelulares, forman hifas y crecen por ramificación.
Los mejores para producción biotenológica serían las levaduras ya que su extracción es más fácil
ya que son unicelulares. Pero ambos son útiles en biotecnología.
Levaduras (nos tiene que sonar)
Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe
Pichia pastoris Hansenula polymorpha
Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica
Hongos (filamentosos)
Aspergllus niger Aspergillus oryzae
Aspergillus glaucus Aspergillus sojae
Penicillium notatum Geotrichum spp.
LEVADURAS
Saccharomyces cerevisiae, modelo por antonomasia de las levaduras. Cuando intuimos el

potencial BIOTECNOLÓGICO de un microorganismo se hace la secuenciación de su genoma.
Tiene 16 cromosomas, organizado como un eucariota. Su tamaño es de 14,1 Mb (megabases).
4x10^6 = 4 Mb.
Modelo de microorganismo eucariota:
·tiempo de generación corto y fácilmente cultivable.
Puede ser transformada y realizar recombinaciones homologas.
Eucariota pero con. Muchos menos intrones.
Microorganismo GRAS probiotico. IMP. TODAS LAS LEVADURAS GENERALMENTE SON GRAS.
Aprobado por la FDA/EMA.
Económico.

En biotecnología clásica esta levadura ha sido muy usada en producción de bebidas y comidas.
La producción de enzimas: quimosina fue el salto al uso de esta levadura como recombinante.
Esta enzima sirve en empresas de quesos a modo de cuajo.
CEPAS DE S.CEREVISIAE (sabérselo )
AH109
PJ69-4alpha
Y187
Schizosaccharomyces pombe
Tiene características mejoradas que la anterior y se usa para obtener un mayor rendimiento.
Su genoma es del mismo tamaño que el anterior pero se secuenció 6 años después. Presenta 3
cromosomas.
Tiene más o menos el mismo número de genes codificantes y no codificantes.
Presenta RNAinterferente en eucariotas superiores.
Centrómeros repetitivos.
Mecanismos moleculares de síntesis de proteínas, plegamiento y glicosilación similar a

mamíferos. Pero parece que estos procesos son mejores en esta bacteria que en la anterior.
Pichia pastoris o Komagataella pastoris.
Su genoma es menor 9.35 Mb.
Es metilotrofa : capaz de usar el metanol como única fuente de energía.
Su genoma fue secuenciado en 2009. Presenta características similares a la primera (modelo)
Es un buen sistema de expresión para la producción de proteínas: eritropoyetina, proteínas

terapéuticas.
Alta tasa de crecimiento y es capaz de crecer en un medio simple y barato.
IMPORTANTE: Tiene dos genes de la alcohol oxidasa AOX1 y AOX2 que tienen un promotor
inducible fuertemente.
Con glucosa la producción se apaga, con metanol, la producción se masifica. Es un interruptor

de producción masiva o de ralentización de la producción de la proteína, ej eritropoyetina.
Utiliza metanol como fuente de carbono y energía. Los promotores AOX son inducidos por
metanol y son reprimidos por ej, glucosa.
La proteína sea secretada al medio de crecimiento.
Hay plásmidos comercialmente: el vector pPICZalfa
Hansenula polymorpha
Es metilotrofa (crece en diferentes sustratos adicionando metanol)
Crece a 50ºC
Productora de glicoproteínas.
Cepas: CBS4732
DL-1
NCYC495
Esta bacteria se utiliza para productos viscosos y con densidad menor.
Excelente para la producción tecnológica de genes de proteínas de productos farmacéuticos:

insulina para el tratamiento de la diabetes, vacunas de hepatitis B y IF Nalpha 2a para el
tratamiento de la hepatitis C.
Microorganismo que puede cultivarse en fermentadores grandes a altas densidades de células

dentro de un corto período de tiempo. Es un organismo seguro que no contiene pirógenos,
patógenos o inclusiones víricas. Se puede liberar compuestos en un medio de cultivo, ya que
tiene todos los componentes necesarios para la secreción.
Cumple requisitos que la hacen óptima en un determinado momento.
Kluyveromyces lactis. (Nos tenemos que acordar de que se relaciona con ambiente láctico)
Genoma secuenciado en 2004.Capacidad para utilizar la lactosa y producir ácido láctico.
Útil en la industria alimentaria (beta-galactosa dada y renina)
Produce quimosina.
Promotor LAC4
Kit comercial NEB
Yarrowia lipolytica
Con sistema de expresión de proteínas heterólogas:
·Secreta proteínas de alto peso molecular mediante un mecanismo de Co-traslación
·Alta tasa de crecimiento en Fermentación
·GRAS aprobado por FDA.
Candida spp. (chicle) : productora de xilitol.
HONGOS FILAMENTOSOS
ASPERGILLUS NÍGER
Producción de ácido cítrico.!!!!!!!!!!! Moho

con esporangios negros en forma de
regadera.
ASPERGILLUS ORYZAE
Su genoma tiene 37Mb. 8 cromosomas.
Producción de Reverastrol (antioxidante)
Produce amilasa, carboxipeptidasas,
pectinasas.
Tiene muchos más genes codificantes.
Tabla producción de enzimas por hongos

filamentosos-r saber los subrayados.
Producen productos de interés pero
tambien son procesos de producción.
ASPERGILLUS GLAUCUS
Especie encontrada en la Antártida
Fuente de enzimas que actúan a bajas temperaturas.
Productores de pigmentos (la Antártida recibe más impacto UV y estos hongos se protegen
produciendo pigmentos)
Degradadores de polisacáridos.
ASPERGILLUS SOYAE
Especie fermentadora.
Se utiliza para fabricar la salsa de sopa (koji) y en condimentos japoneses (mirin).
PENICILLIUM NOTATUM productor de penicilina, primer hongo.´
GEOTRICHUM SPP.
Productor de lipasa y control de plagas fitopatógenas.
TEMA 15 PRINCIPALES VIRUS DE INTERÉS EN BIOTECNOLOGÍA
Todos los virus necesitan parasitar o infectar una célula para sobrevivir, de modo que son
parásitos obligados.
CARACTERÍSTICAS DE LOS VIRUS
Son estructuras acelulares, sin membrana pero con cápside. Son extremadamente pequeños y
constituidos con ácidos nucleicos ADN o ARN. Cada tipo de virus muestra una gran especificidad
celular y presentan tropismo por un tipo celular para parasitarlo.
Fuera del hospedador, los virus no pueden considerarse como seres vivos autónomos. Todos
provocan enfermedad, son patógenos de animales, vegetales, bacterias, hongos...
No se afectan por antibióticos y se tratan mediante antivirales.
Nuestro organismo produce interferón que nos ayuda a prevenir la infección viral.
Se utilizan para manipular e investigar funciones celulares. En replicación, transcripción y

además, procesamiento del ARN.
Retrovirus: modelos de investigación biológica: síntesis de ADN a partir de ARN.
Se utilizan para el desarrollo de expresión celulares.

De sus características externas y capacidad de interacción, aprenderemos como usarlos como

herramientas. Los genomas víricos pueden ser de cadena doble de DNA y RNA, simple... Hay
virus desnudos y envueltos.
Nucleocápside: ácido nucleico (DNA o RNA)+cubierta proteica.
Cubierta proteica: cápside (geométrica con simetría helicoidal o icosaédrica).
Protómero/capsómero: unidad proteica repetitiva.
Envoltura: membrana flexible de lípidos y proteínas.
Cuando el RNA es de cadena lineal, puede presentar:
·polaridad +: actúa directamente como RNAm dentro de la célula hospedadora.
·polaridad-: se duplica en la célula hospedadora formando una cadena complementaria, que

actúa como RNAm.
IMP GENOMAS VIRALES.
El estudio de genomas virales es importante en la actualidad para aprender cómo los virus
causan enfermedades y a desarrollar nuevos y eficaces medicamentos antivirales:
·proteína específica vital para el virus
·medicamento que inhiba de forma específica dicha proteína.
VIRUS SINTÉTICOS
Se han conseguido sintetizar virus de forma artificial (biología sintética). Ej: virus de la polio.
La biología sintética sintetiza de Novo un ente biológico que funciona mientras que la clonación
hace el mimeting de un gen para sobreproduzco (son diferentes).
El peligro de esta parte de la biotecnología es el bioterrorismo (uso negligente de estas técnicas).
VIRUS BACTERIANOS: FAGOS
Tienen tropismo exclusivo por especies bacterianas. Simplifican el estudio de la genética

bacteriana y han ayudado a nuestro conocimiento de los mecanismos básicos de la genética
molecular.
Son especialistas en la destrucción de bacterias. Son las partículas biológicas más abundantes
en la naturaleza.
La presencia de fagos es primordial para la estabilidad de los ecosistemas. Mantienen los niveles
de bacterias en su justo porcentaje conforme se va instaurando la microbiota como ecosistema
(por ejemplo). Si hay un desajuste en estos fagos, las comunidades de bacterias se verían
incrementados o disminuidos y se ocasionarían problemas en el ecosistema.
Los fagos también son muy importantes en la evolución de las bacterias.
Estos virus también están presentes en la microbiota de los organismos vivos.
Los fagos sólo infectan bacterias. Sus estructuras externas sólo les permiten reconocer un tipo
específico, por lo que es imposible que provoquen daños a otras formas de
vida.
ESTRUCTURA DE LOS BACTERIOFÁGOS (dibujo)
Cabeza: proteica que contiene el genoma
Genoma de ADN que codifica las enzimas y proteínas necesarias para la

replicación
Tallo: por donde se transporta el DNA desde la cabeza del fago.
Fibras: ayuda a la unión del fago a las membranas.
Presenta ciclo lítico (no hay integración del material genético, el fago lisa a la
bacteria) y ciclo lisogénico. Necesitaríamos aprovechar el ciclo litico para usar
los fagos como potencial agente terapéutico. A través de las proteínas
codificadas por los fagos que inhiben el metabolismo de las células parasitadas.
·Aplicación de fagos específicos frente a bacterias patógenas.
·Reconocimiento y destrucción (ciclo de vida del fago).
·Recuperación del paciente u organismo infectado.
IMP diapositiva tabla:
Los ensayos clínicos con fagos como terapia son los siguientes:
Se ha tratado la disentería bacilar producida por Shigella, busco el fago específico de la shigella
que produce esta enfermedad.
Se han tratado infecciones de la piel y mucosa nasal producida por Klebsiella con el fago
específico de la Klebsiella que lleva a cabo esta infección.

Todos estos patógenos son los

conocidos como patógenos
nosocomiales. La fagoterapia
(cocktail de bacteriófagos líticos) se
utiliza para el tratamiento de
enfermedades nosocomiales
EXAMEN.
Los individuos inmunodeprimidos son

los susceptibles a este tipo de
enfermedades.
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE
LA TERAPIA FÁGICA FRENTE A LA
ANTIBIOTERAPIA
Bacteriófagos Antibióticos Comentarios
Muy específicos No específicos Requieren identificación previa

del microorganismo
Se replican en la infección No se concentran en el sitio de Se requieren menos dosis con los
infección fagos
No efectos secundarios Si efectos secundarios Pueden provocar efecto por

liberación de LPS/GP
La aparición de resistencias es Resistencia a patógenos y no Los antibióticos seleccionan a los

infrecuente patógenos resistentes
La selección de nuevos Siempre habrá fagos frente a

antibióticos es compleja bacterias multirresistentes
Fueron puestos estos cocktails de fagos en mercado clínico la compañía LÒréal y la Eli Lilly
(USA).
IMPORTANCIA DE LA TERAPIA CON FAGOS
Para hacer frente al aumento de la resistencia de muchas bacterias patógenas comunes como
SAMR o EVR.
Buena en infecciones de la mucosa intestinal y piel (donde hay rápida multiplicación fágica).
No útil en infecciones donde hay dificultad de multiplicación fágica por nº excesivo de células
(abscesos).
LIMITACIONES DE LA TERAPIA CON FAGOS
1.Aparición de cepas bacterianas resistentes a fagos particulares. Se observan cepas mutantes

resistentes a fagos por lo que podría ser un problema potencial de la terapia fágica.
2.Desarrollo de anticuerpos neutralizantes de fagos. No es un problema durante los

tratamientos iniciales o de corta duración.
DESCUBRIMIENTO DE ANTIBIÓTICOS MEDIANTE FAGOS
Aprovechar la información génica de los fagos. Sus proteínas afectan a las células hospedadoras.
Utilizar fagos como fuente de información sobre dianas bacterianas para la búsqueda d e nuevos
antibióticos.
Identificación de las proteínas “particularmente sensibles”.
Búsqueda de un fármaco que mimético el efecto producido por las proteínas fágica. Ej: S.aureus.

IMP ENZIBIÓTICOS : ENZIMAS LÍTICAS FÁGICAS COMO ANTIBIÓTICOS
Denominaciones: Lisinas=virolisina =enzibiótico
Son enzimas líticas (lisinas) codificadas por fagos ADNbc. Efecto bactericida por hidrolizar
enlaces covalentes del peptidoglucano.
Alta actividad bacteriana. Tiene efecto en segundos.
Se pueden usar junto a antibióticos y provocan efecto sinérgico.
·CINCO TIPOS POR SUS

ACTIVIDADES IMP
Amidasas
Endopeptidasas
Muramidasas
Glucaminidasas
Transglucosidasas
Toda la malla de peptidoglicano será

lisada y destruida por creación de
poros para provocar la muerte celular
por salida del contenido
citoplasmático. Existen como preparado comercialmente (terapéutico).
ESTO CAE SEGURÍSIMO: PHAGE DISPLAY: expresión en fagos para la selección de variantes
de proteínas. Relacionada con la biotecnología roja.
Definición breve: técnica de selección de proteínas in vitro. Desarrollado x George P.Smith, 1985.
A través de la expresión en fagos para la

selección de variantes proteicas.
La clonación se va haciendo en distintos

fagos.
Expone polipéptidos extraños en la

superficie de un fago (con capacidades
terapéuticas). Puedo hacer tantas
variantes como necesite.
Se produce mediante la fusión de un gen

que codifica dicho péptido en un gen que
codifica una proteína estructúralo de la
cápsida, para poder ser reconocido este
péptido.
E.coli puede ser infectada por un gran

numero de bacteriófagos.
Con el phage display genero una colección

de fagos diferenciales = fagoteca con
proteínas diferenciales expresadas en su parte externa.
Con facilidad se pueden crear numerosos clones de fagos que muestran diferentes péptidos.
Esta colección de fagos se les llama librería o biblioteca de péptidos.
Los fagos filamentosos de E.coli f1, M13 o fd.
FASES DEL PHAGE DISPLAY (5) SABERSELO
1.Producción del vector/es viral/es
Se producen n fagos, tantos como posibilidades recombinantes de proteínas quiera tener.
2.Unión/selección.
Unión de la proteína terapéutica expresada como proteína del fago y selección de la colección de
fagos diferentes para quedarnos con el fago que contenga la proteína con actividad terapéutica.
3.Lavado
Por un sistema de lavado y los que se quedan unidos en la diana no los perdemos porque son los
que necesitamos, los que no presenten actividad terapéutica se lavan del sistema.
4.Elución
Para rescatar aquellos válidos.
5.Amplificación
Con los seleccionados finalmente llevo a cabo circuitos de amplificación y análisis final de cual es
la proteína final que es valida como proteína terapéutica.
1.PRODUCCIÓN DEL VECTOR VIRAL (CAE)
*****IMP: el gen recombinante ocupa una parte del gen bastante importante y necesita un fago
helper para que el fago recombinante sobreviva y pueda proliferar.
Tecnología de ADN recombinante para incorporar el cDNA de interés en el DNA viral. Fusión al
gen para proteína de cápsida y así el péptido se expondrá en la superficie de las partículas
fágicas.
Los genes vienen de un RNA que convertimos en cDNA de interés y luego se producen todas las
variantes. Los cDNAs se clonan y tendré una serie de modificaciones en función de los distintos
fragmentos de RNA de los cuales hemos partido.
Voy clonando los cDNAs en cada fago de forma independiente.
Diferentes genes se insertan en los genomas de los fagos. Cada fago sólo mostrará un
determinado péptido. El conjunto de estos fagos son las librerías de péptidos.
Las salas blancas evitan el contagio del operario del virus así como la contaminación de la
muestra.
Un fago no es viable porque le hemos quitado una parte de su genoma y queda deficiente de
proteinas para su empaquetamiento, el fago helper será el responsable de que el fago inicial
pueda ser viable. El fago helper no tiene el gen de replicación ni los orígenes de replicación,
tampoco tiene señal de empaquetamiento; el helper dona al fago inicial todas las estructuras que
servirán como enzimas que harán al fago inicial viable y estructuras propias al fago recombinante
para darle la posibilidad de empaquetarse sin problema al haberle quitado el gen que se ha
retirado al principio del todo.
FAGO HELPER (diapositivas)
Los fagémidos se diseñan para expresar proteínas recombinantes de difusión bajo condiciones
controladas pero no codifican ninguna proteína viral. Los fagémidos combinan propiedades de
los plásmidos (resistencia a antibióticos y replicación de ADNbc) con los de vectores fágicos
(producción y empaqueta miento de ADNmc en viriones).
Sólo por la coinfección de la bacteria con un fago helper puede el fagémido replicar ADNmc y
empaquetarlo.
IMP: el fago helper es defectivo en su origen de replicación o señal de empaquetamiento lo que

asegura el empaquetamiento preferencial de los fagémidos.
2.UNIÓN/SELECCIÓN (también se llama panning o biopanning)
Mediante la unión a una diana por técnicas de afinidad.
La diana tiene que tener cierta afinidad a la proteína expuesta en la superficie del fago.
Paso de la solución de fagos a través de un soporte sólido con los receptores (que contiene
receptores dianas).
Si existe afinidad entre la proteína expuesta y la diana, el fago se une al soporte.
3.LAVADO
Para eliminar los fagos que no tiene afinidad por los receptores de las dianas. Los fagos no
unidos se retiran por lavados solo quedan unidos al soporte los que presentan afinidad por los
receptores.
4.ELUCIÓN (imp)
Separación de los fagos unidos por rotura de la interacción.
Cuando quiero recuperar estos fagos, he de romper enlaces covalentes que se han unido entre
ellos y los receptores. Usando urea puedo desnaturalizar las proteínas, así como usando
proteasas, ph ácidos o alcalinos, etc. Además, se puede pasar por la columna la bacteria porque
los fagos se unirían directamente de forma selectiva a la bacteria y saldrían.
Se usan agentes que rompen los enlaces covalentes y son los que permiten eluir los fagos que se
habían unido de forma más fuerte mediante enlaces receptor-ligando (imp).
·Tampones ácidos o alcalinos, urea, adición de ligandos solubles para el receptor, proteasas.
·Se puede también añadir células hospedadoras para la infección.

5.AMPLIFICACIÓN Y ANÁLISIS
Los fagos eludidos que muestran especificidad se utilizan para infectar nuevas células y
amplificar en E.coli.
El ciclo se repite 2-3 veces para seleccionar la mejor secuencia de unión y seleccionar la proteína
más activa frente a la diana terapéutica que necesito.
Caracterización de los fagos por secuenciación de ADN.
CICLO DEL PHAGE DISPLAY ESQUEMA
Producción del vector, unión, lavado, elución y amplificación.
Se genera la fagoteca, se pasa por diferentes modelos de selección/unión. Se unen mejor un

determinado número y con el lavado, se quedan unidas a lo mejor un número menor del que
teníamos. Con la elución se rompen los enlaces covalentes y obtengo los fagos y llevo a cabo la
amplificación de los que he obtenido. Si ahora necesito volver a hacer el ciclo, se repite de nuevo.
VENTAJAS DEL PHAGE DISPLAY
Es un fácil cribado de alto número de clones >10^9.
Fácil amplificación de los fagos recombinantes de E.coli.
Los procesos de selección son fáciles y variados, si el diseño está correcto desde el principio.
Pueden crear variaciones de las librerías (fagotecas) por la inducción de mutaciones por PCR
propensa a error, etc...
INCONVENIENTES DEL PHAGE DISPLAY
Poca longitud del péptido, el fago tiene un genoma reducido. Esto impide el plegado.
Pérdida de fagos si los pasos de unión y lavados son demasiado rigurosos. Si la columna no está
bien diseñada o se añade un disolvente más astringente de la cuenta, pierdo los fagos que tienen
capacidad de reconocer las dianas, que son los que necesito.
Los métodos de unión o afinidad para la selección pueden no funcionar in vivo. Cuando meto el
fago en un animal vivo, no se produce la interacción y aunque todo el proceso esté correcto,
fracasa in vivo. Esto se debe a que las interacciones in vivo son mucho más complejas que las in
vitro.
APLICACIONES DEL PHAGE-DISPLAY (IMP TAMBIÉN PUEDE CAER: PARA QUE SIRVE)
Mapeo de epítopos: porción específica de un antígeno macro molecular al cual se une un

anticuerpo.
Mapeo de interacciones proteína-proteína.
Identificación de nuevos receptores y ligandos no peptídicos.
Identificación de peptidos activos.
Identificación de proteínas intracelulares.
Descubrimiento de medicamentos.
Desarrollo de nuevas vacunas (epitopos).
Producción de anticuerpos (fagotecas)

Diagnóstico clínico.
SELECCIÓN DE ANTICUERPOS A TRAVÉS DE PHAGE-

DISPLEY
Presentación de fragmentos de anticuerpos en superficie de un

fago recombinante. La proteína recombinante se expresa en
las colas de los extremos, en el exterior del fago para que
funcione el sistema de unión/selección.
Tecnología de producción de anticuerpos mediante Phage-

Display (dibujo).
SELECCIÓN DE ANTICUERPOS A TRAVÉS DE PHAGE-DISPLAY
Tipo de fragmentos de anticuerpos recombinantes obtenido mediante Phage-Display: fragmentos

de regiones variables de anticuerpos.
IMP: BIBLIOTECA DE ANTICUERPOS:
·Biblioteca Inume: a partir de linfocitos B de individuos inmunizados.
·Biblioteca Naive: a partir de linfocitos B de individuos no inmunizados.

·Biblioteca semisintética: construcciones artificiales por ingeniería genética de secuencias de

genes V y secuencias de oligonucleótidos artificiales de regiones CDRs (determinantes de
complementariedad).
·Biblioteca sintética: artificialmente construida mediante ingeniería genética de oligonucleótidos

sintéticos de las regiones variables.
CICLO DEL PHAGE-DISPLAY PARA LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
En la unión/selección, usaré el antígeno si trabajo con anticuerpos.
·Los clones específicos se seleccionan por unión al antígeno (columna de afinidad).
·Lavado de los clones no unidos.
·Elución de los clones unidos con proteasas.
·Amplificación por infección y crecimiento de los fagos entre las diferentes rondas de selección.
Selección:
·Tras las rondas de replicación, los fagos se depositan en los pocillos de ELISA.
·Los clones específicos para el antígeno se detecta con conjugados anti-fagos en combinación
con un sustrato colorimétrico.
APLICACIÓN DE LOS VIRUS EN LA TERAPIA
TERAPIA GÉNICA: transferencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN) con fines terapéuticos.
·Incorporar genes nuevos (transgénesis): suplementación génica.
·Modificar genes propios de la célula : corregir una mutación.
·Interferir con la expresión de los genes: inhibición de la expresión.
VECTORES EN TERAPIA GÉNICA
·Vectores virales: virus recombinantes y defectivos (carecen de alguna función necesaria para su
propio ciclo replicativo).
·Vectores no virales: complejos ADN-liposomas o cromosomas artificiales humanos,
Los vectores más usados en terapia génica con los Adenovirus y los Retrovirus.
¿POR QUÉ SE USAN VECTORES VIRALES?
Los virus son parásitos intracelulares obligados, muy eficaces en transferir DNA viral a las células.
Alta especificidad celular: dependiente de las proteínas virales de unión.
Reemplazamiento génico: se retiran genes no esenciales y se insertan genes exógenos.
·Administración: iMP CONCEPTOS IN VIVO/EX VIVO
ex vivo: la administración del vector se realiza fuera del cuerpo y se re-introducen en el
paciente.
in vivo: el vector terapéutico se administra directamente al individuo enfermo.
CARACTERÍSTICAS DEL VECTOR IDEAL DE TERAPIA GÉNICA
·Fácil de producir a altos títulos.
·Estable que no sufra mutación.
·Que acepte uno o más genes.
·Capacidad de funcionar tanto en células en división como quiescentes.
·Fácilmente dirigible a distintas células diana.
·Con persistencia en períodos prolongados.

·Que produzca suficiente proteína para provocar un efecto.
·Con elementos reguladores de transcripción.
·Que no sea reconocido inmunitariamente.

·Que no provoque efectos sobre la fisiología celular.
·Que sea seguro para el paciente y el entorno.
DEFECTOS GENÉTICOS QUE SE TRATAN CON TERAPIA GÉNICA
(Generalmente se tratan las monogenéticas, porque las poligénicas son más complicadas).
·Inmunodeficiencia severa combinada es una enfermedad
que presenta un defecto en la adenosina aminasa (ADA).
Ejemplo bebés burbuja.
·Hemofilia A y B
·Hipercolesterolemia familias
·Enfermedad de Gaucher
Las monogenéticas se corrigen con terapia génica pero

las multigenéticas todavía no se pueden corregir.
1ªutilización de terapia génica para la inmunodeficiencia

combinada grave. Este ejemplo es ex vivo: Transplante
de médula ósea en ADA: retrovirus inutilizado
genéticamente + bacteria que lleva en sus plásmidos el
gen humano clonado de la desaminasa de adenosina= el
gen clonado se traslada al virus. Células de la médula
ósea obtenidas del paciente se infectan con el retrovirus y
el gen se traslada a esas células. Después de comprobar ese paso y de asegurarse de que el gen
sigue activo, se reimplantan las células de la médula ósea.
El paciente de forma autónoma genera la proteína convirtiéndose en un bebé normal.
PRINCIPALES VECTORES VIRALES UTILIZADOS EN TERAPIA GÉNICA
·Vectores integrativos (se va dentro de una zona especifica del genoma, a veces al azar y otras de
forma específica). Tiene riesgo de la tasa de mutación insercional.
Retrovirus
Lentivirus
·Vectores episomales (quedan en el núcleo pero no se integran en el genoma). Menos peligroso.
Adenovirus (los más usados)
Virus adeno-asociados virus (AAV)
Herpes simplex (HSV) : menos utilizado
RETROVIRUS (imp)
Son virus con genoma de ARN monocatenario. Se replican a ADNbc intermediario. Éste es el que
se inserta en el genoma para permitir la produccion de la proteina terapéutica.
Su reversotranscripticón se hace con RT.
La integración en el genoma se hace por la integrada en cualquier sitio del genoma.
Tiene 3 genes gal, pol y env (nucleoproteínas y proteínas de envoltura)
Como ADN extremos LTR para su inserción en el ADN celular.
VECTORES RETROVIRALES
Tenemos muy poco espacio (gal, Pol, env) pero éste se suple por los genes terapéuticos.
Las estructuras o virus helper permiten que existan de forma estructural todo lo que necesito
para empaquetar el genoma terapéutico.
Éstas proteinas constituyen el vector retro viral para que lleguen al cromosoma celular. (Esquema
bien grande).
VENTAJAS DE LOS VECTORES RETROVIRALES
·Buena infectividad
·Tropismo amplio
·Pueden ser desarrollados en cantidades relativamente grandes
·La integración en el cromosoma y expresión a largo plazo
·No respuesta inmune
INCONVENIENTES DE LOS VECTORES RETROVIRALES
·no infectan céuullaus quiescentes
·Pequeño tamaño de ADN terapéutico
·Bastante lábiles (difícil purificación)
·Sólo terapia ex vivo
·Inactivados en el torrente circulatorio
IMP ·Riesgo de mutagénesis insercional: activación de oncogenes e inhibición de genes

superiores de tumores.
LENTIVIRUS (Familia Retroviridae=genoma RNA) / (lento desarrollo signos de sus infecciones)
Tiene un periodo de incubación muy largo. Los signos y síntomas de las infecciones que
producen se desarrollan con lentitud. A veces se usan como vectores integrativos que requieren
tiempos más largos de incubación. Infectan células en división y no mitóticas.
VECTORES LENTIVIRALES
Se usan porque tienen un genoma mucho más largo, son retrovirus que pueden infectar células
en división y quiescentes.
Son más complicados que los retrovirus pues contienen además proteínas extra, tat, rev...
Con poca respuesta inmune (apto para terapia in vivo) y expresión por 6 meses.
Riesgo de MUTAGÉNESIS insercional (se acomoda dentro de genomas específicos).
ADENOVIRUS (episomal) / (virus de ADNbc lineal desnudos)
Son virus de ANDbc lineal desnudo.
No se integra en el genoma celular. Se quedan fuera del genoma per dentro del núcleo porque
necesita las estructuras metabólicas y enzimas del núcleo para replicarse.
Se replica como un elemento episomal en el núcleo.
Provocan muy diversas infecciones humanas: respiratorias, intestinales, oculares...
Los serotipos 2 y 5 son los más utilizados como vectores.
¿CÓMO HACE LA REPLICACIÓN EPISOMAL ESTE ADENOVIRUS?
Con él hay menos mutaciones insercionales.
De un clon se coge el gen terapéutico y se construyen partículas inefectivas con éste y se

insertan en la célula, viaja hasta el núcleo.
Esta terapia hay que inyectarla muchas más veces.
VECTORES ADENOVIRALES
VENTAJAS:
Producción de altos títulos. Alta eficacia de transfección in vivo
Infecta células vivas y quiescentes. Terapia ex vivo y in vivo
Infecta una amplia variedad de células. IMP no mutagénesis insercional
INCONVENIENTES
IMP expresión transitoria y limitada, se expone al individuo a una terapia repetida
Toxicidad a altas dosis. Muy inmunógeno (a nivel celular y humoral)
VIRUS ADENO-ASOCIADOS (AAV) no es muy importante
Virus ADNmc simples no patógenos que dependen de virus helper (adenovirus) para replicar.
Con dos genes cap (cápsida) y rep (proteínas de replicación e integración)
Infecta a diferentes tipos de células y puede integrarse en el ADN celular.
Dibujo
VENTAJAS
Extremadamente simples
Buena inefectividad a células en división y quiescentes
Integración y expresión persistente en células quiescentes.
Alta seguridad: no patógenos.
Aplicaciones in vivo
No genera antígenos poca respuesta inmunológica.

INCONVENIENTES
Tamaño pequeño y difíciles de producir.
Producción a bajos títulos. Falta de células empaquetadoras eficaces.
Si no se proporciona la proteína rep en cis, el AAV no se integra en un lugar definido del

cromosoma.
TEMA 17: PRODUCCIÓN DE POLÍMEROS MICROBIANOS: BIOPOLÍMEROS.
Polímeros microbianos (polisacáridos y poli-beta-hidroxi-alcanoatos) para su uso como

excipientes en medicamentos. Manipulación de las condiciones de cultivo para producir nuevos
poliésteres bacterianos. Ingeniería genética de microorganismos para producir polisacáridos
(xantano) y poli-Beta-hidróxido-alcanoatos.
POLÍMEROS MICROBIANOS: todos son biodegradables. Hay dos grandes bloques:
·polisacáridos
·bioplásticos (poli-hidroxi-alcanoatos)
Los polímero se clasifican en homo y heteropolímeros.
RESUMEN DE APLICACIONES BIOFARMACÉUTICAS
Los exopolisacáridos están en :
·elaboración de formulas farmacéuticas
·encapsulación
·utilidad como moduladores de la respuesta biológica (se inyectan para incrementar la respuesta
inmune)
Los polihidroxi-alcanoatos (PHAs):
·envase de productos farmacéuticos, por su interés como mecanismo de liberación controlada de

determinados principios activos (microcapsulas)
·utilidad en ingeniería tisular como plásticos médicos.
POLISACÁRIDOS
Los microorganismos producen polisacáridos de 3 tipos distintos: extracelulares, estructurales y

formas intracelulares de almacenamiento.
Clasificación de los polisacáridos:
·Homopolisacáridos: levano, dextrano ·Heterpolisacáridos
·Solubles en agua/Insolubles en agua ·Iónicos, neutros...
Los EPS son los exopolisacáridos: son polisacáridos de alto peso molecular, pudiendo
encontrarse bajo dos formas:
·como cápsula
·disociados totalmente de la célula y que se acumulan en grandes cantidades fuera de la pared

celular y que se acumulan en grandes cantidades fuera de la pared celular y se difunden en el
medio de crecimiento (mayor utilidad en procesos biotecnológicos).
IMP: Los EPS pueden ser producidos por un amplio numero de microorganismos
·Arqueas, Bacterias, Algas unicelulares
·Levaduras, Hongos
Xantano viene de Xanthomonas campestris (cursiva) CAEEEEEE
Dextrano viene de Leuconostoc mesenteroides
Gelano viene de Pseudomonas elodea
Pululando viene de Aureobasidium pullulans (hongo)
Alginato viene de Azotobacter vinelandii
Escleroglucano viene de Sclerotium sp. (es de los más pequeños)
XANTHOMONAS CAMPESTRIS es una colonia que en placa es amarillenta y la extracción del

polimero xantano tiene también color amarillento (polvo). Presenta patogenicidad en plantas y por
eso se llama campestris. Es un bacilo gram negativo aeróbico, que produce el exopolisacarido
XANTANO que es un HETEROPOLISACARIDO DE GLUCOSA, MANOSA Y ÁCIDO
HIALURONICO.
Tiene una serie de estructuras adicionales de acido hialuronico que proporciona las
características físico químicas utiles. Si añadimos sustancias adicionales realizamos un make up.

ESTRUCTURA QUÍMICA DE LOS EPS (sabérselo)
Primaria: secuencia de monosacáridos.
Secundaria: orientación relativa de los monosacáridos en el espacio
Terciaria: producto de interacciones energéticamente favorables entre cadenas.
FUNCION NATURAL DEL EPS EN EL MICROORGANISMO (ventaja evolutiva)
Compuestos de almacenamiento
Compuestos estructurales
Protección a los microorganismos frente a la desecación
Barrera física de union a virus, anticuerpos.
Acomplejar y neutralizar toxinas o iones metálicos.
Fuente de carbono y energía.
Convertir el exceso de sustrato en masa espumosa menos metabolizable
Interactuar con células de animales/plantas en relaciones especificas simbióticas o patogénicas.
APLICACIONES INDUSTRIALES DEL EPS
·CARACTERISTICAS tales como su biocompatibilidad, biodegrada ion, hidrofilicidad y no-

toxicidad, así como nuevas y mejores propiedades físico-químicas.
·Se han descrito alrededor de 20 EPS diferentes con mercado potencial, pero la mayor parte
corresponde al xantano, con una produccion aprox de 20.000 toneladas por año.
·Búsqueda de nuevos EPS, con nuevas o mejores características físico-químicas.
BIOSÍNTESIS DE HOMOPOLISACARIDOS
DEXTRANO: homopolímero de glucosa con uniones alfa 1-6. La actividad necesaria para su
biosíntesis es la glucosiltransferasa (IMP), que permite la union consecutiva de glucosas. Si el
microorganismo carece de esta encima, no va a producir este polisacarido.
El polímero muestra un variable grado de ramificaciones y contiene enlaces alfa 1-3 y alfa 1-6.
ETAPAS DE BIOSINTESIS DEL POLISACARIDO:
1.Captación de substrato: entrada en el microorganismo por difusión facilitada, transporte ácido o

translocación de grupo.
2.Metabolismo intermediario: fosforilación del sustrato transformándose en un precursor activado

donador de grupos glicosilo (hexoquinasas).
3.Formacion de exopolisacarido: por la transferencia secuenciar de los grupos glucosilo a partir

del precursor activado a un portador intermediario (lípido isoprenoide alcohol fosfato)
GLICOSILTRANSFERASAS.
4.Modificacion del EPS: acetilación, carboxietilación. Aquí está la etapa de make up.
5.Liberación del EPS formado.
La glicosiltransferasa engloba a la glucosiltransferasa, manosiltransferasa, galactosiltransferasa y

todas las demás enzimas. Éstas enzimas no son las mismas que las glucosiltransferasa porque
ésta ultima solo actúa con las glucosas, las glicosiltransferasas hacen otro tipo de polímeros. IMP
Los genes de biosíntesis del exopolisacarido tienen localización cromosómica, plasmídica y

megaplasmídica. La mayoría están en cromosómicos, les confiere ventaja evolutiva.
GENES DE EPSs (imp)
La agrupación de genes EPS son transcritos como una unica unidad transcripción al= unidad
policistrónica. Están conservados.
·Cuatro regiones que codifican el EPS: (hay que sabérselo)
Una región central con genes que muestran homologa con glicosiltransferasas.
Dos regiones que flanquean la región central que muestran homología a enzimas que determinan
la longitud de la cadenas, procesos de polimerización y exportación-transporte.
Una región situada hacia el extraño 5’ con función reguladora.
GENES DE EPSs
·Las regiones más conservadas son las que codificaban para glicosiltransferasas, el resto son
variables: podemos encontrar pseudo-genes, cuando contienen cambios en el ORF o codones
de terminación. También existen los genes mosaicos que tienen una alta divergencia con
secuencias relacionadas.

PROCESO DE PRODUCCIÓN DE POLÍMEROS MICROBIANOS
·Fermentación:
Económica y alta velocidad de cultivo: máxima concentración celular. Control de la velocidad

específica de formación del exopolisacárido.
·Recuperación:
Separación de las células: precipitación (etanol, acetona, metanol), separación de sólidos,

deshidratación mecánica y secado.
Según su utilización posterior, el grado de pureza del polímero viene regulado por su proceso de
extracción (FDA gomas solubles: uso cosmético, alimentario, farmacéutico).
Proveedores de Xantano: Goma Xantana. Ej: Baux Chemical.
POLI-BETA-HIDROXI-ALCANOATOS
Los gránulos de poli-beta-hidroxibutírico son acúmulos de hidroxiácidos esterilizados (beta-

hidroxibutírico), rodeados de una envuelta proteica y que al igual que en el caso anterior, se
producen en ciertas bacterias como reserva osmóticamente inerte de carbono en
condiciones de falta de nitrógeno. El PHB tiene una aplicación práctica interesante: utilización
como plásticos biodegradables.
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL PHA: (imp)
Estructura: polímeros derivados de acetil-coa. Que

pueden diversificarse en productos finales.
Le confiere un plus de supervivencia a la bacteria

en ambientes cambiantes:
·como fuente de carbono y energía en condiciones

de escasez de nutrientes,
·como fuente de carbono y energía para el

enquistamiento y la esporulación,
·para la degradación de compuestos tóxicos y
·como fuente de poder reductor.
BACTERIAS PRODUCTORAS DE PHA
Azotobacter sp. FA8

Bacillus megaterium
Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) Pseudomonas oleovorans
Bacillus cereus
IMP BIOSINTESIS DEL PHA (genes implicados en la biosíntesis de este polimero)
Los genes son phaA que es el gen central que sintetiza la beta cetotiolasa.
El gen phaB sintetiza la reductasa acetoacetil coa.
El gen phaC es quien sintetiza la PHB polimerasa o sintasa.
Se generan 3 enzimas:
·La enzima phaA, una beta cetotiolasa para condensar dos moléculas de acetil-coa para formar
acetoacetil-coa.
·La enzima PhaB es una acetoacetil-coA reductasa que convierte este compuesto en 3-
hidroxibutiril-coa introduciendo el grupo hidróxilo.
·La enzima PhaC es una polimerasa/sintasa, que polimeriza los monómeros.
ESTO HAY QUE SABÉRSELO
·PHA SINTASAS: 4 TIPOS
Dependiendo del tipo de microorganismo, también se llaman PHA polimerasas. Permite en ultimo
termino generar polímeros o bioplásticos diferentes. Encargada de dar el polímero diferencial.
ORGANIZACIÓN GENÉTICA DE PHA
Los genes que sintetizan la monocapa de proteínas suelen estar flanqueando los genes phaA,
phaB y phaC. Los genes flanqueantes dan la consolidación del saco.
Necesita D polimerasas para romper el saco y liberar el carbono inerte que constituye el PHA.
La estructura polimerica del PHA está dentro del saco recubierta de una pequeña capa de
fosfolipidos y proteínas ademas de polimerasas para poder liberar el carbono necesario. No
tenemos una unidad policistrónica, no todo se sintetiza al mismo tiempo.
·Organización genética especifica de la región pha de Azotobacter sp. FA8: las flechas indican el
sentido de la transcripción.
Cada cosa requiere su promotor independiente.
PRODUCCIÓN RECOMBINANTES DE PHA EN CAPEAS DE E.COLI Y PSEUDOMONAS PUTIDA.
Para lograr una buena acumulación del polímero en E.coli recombinante es necesario utilizar
vectores de expresión estables con un alto numero de copias: la expresión estable y sostenida de
los genes pha.
A pesar de tener los mismos genes, los procesos downstream son diferentes en función de los
microorganismos que se utilizan, así obtendré por ejemplo unos productos más opacos y otros
menos. EL BIOPLÁSTICO NO SE LIBERA AL SOBRENADANTE, ESTÁ DENTRO DE LA CÉLULA
NECESITO ROMPER LA CÉLULA PARA LIBERARLO.
PRODUCCIÓN DE PHA EN MICROORGANISMOS.
Para poder desarrollar un proceso de producción de PHAs mediante fermentación utilizando

microorganismos es necesario:
·Optimizar el rendimiento.
·Facilitar la purificación del polímero.
·Abaratar el costo de los sustratos utilizados para su obtención.
TEMA 18: PRODUCCIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS.
Un metabolito primario es producido por el microorganismo de forma paralela a su crecimiento.

Es esencial, se sintetiza en paralelo a las necesidades de proliferación del microorganismo,
por tanto le es totalmente necesario al microorganismo para su vida.
·Producción de aminoácidos:
L-GLUTÁMICO L-LISINA L-ASPÁRTICO L-TRIPTÓFANO
·Producción de ácidos orgánicos:
Cítrico, glucónico, itacónico, ...Sobretodo producción de ácido cítrico y láctico.
·Producción de etanol
METABOLITOS PRIMARIOS
Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular. Son productos finales o
intermediarios de las rutas metabólicas. Son producidos durante la fase de crecimiento del
microorganismo.
Pueden ser resultado del metabolismo anabólico: proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos...
O productos del catabolismo con importancia industrial: productos de fermentaciones como

etanol, acetona, butanol, ácido acético...
IMP CARACTERISTICAS DE LOS METABOLITOS PRIMARIOS
1.Son necesarios para el crecimiento de microorganismo
2.Se producen como productos únicos
3.Son producidos por todos los microorganismos (universales

= comunes a todos los microorganismos)
4.La producción no puede perderse fácilmente por mutación

espontánea.
ESENCIAL NECESARIO CONSTITUTIVO UNIVERSAL ÚNICO
Si cae: dibujar la gráfica y poner todas esas palabras.

El resultado mas patente del metabolismo primario es el aumento de biomasa del

microorganismo, que puede ser en sí misma un producto industrial de interés.
PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS
Corynebacterium glutamicum , principal productor de L-glutámico.
Suponía antes un método caro de obtención de un producto útil y ahora se obtiene de forma
fácil. Japón líder mundial en fermentaciones industriales.
USOS INDUSTRIALES DE LOS AMINOÁCIDOS
·En la industria alimentaria: mejora del sabor y conservación de alimentos
Glutamato sódico
Aspartato sódico y D,L-alanina: en zumos vegetales
Glicina: se añade en alimentos edulcorados
·En la industria farmacéutica:
Como ingredientes de infusiones intravenosas (nutrición parenteral para pacientes
post-operatorios) y en alimentos para dietas especiales.
·En la industria química como material de partida para la síntesis de otras sustancias: polímeros
de polialanina y resinas de isocianato de Lisina...
·Aminoácidos no obtenidos por microorganismos:
Se extraen a partir de hidrolizados de proteínas (y posterior purificación)y se sintetizan de forma

química, pero no las formas L.
PRODUCCIÓN MICROBIANA DE AMINOÁCIDOS
Estrategias:
·Fermentación directa usando diferentes fuentes de carbono. Obtenemos el metabolito primario

poniendo un medio de cultivo y el microorganismo, necesito añadir todo lo que necesita el
microorganismo para crecer y producir el metabolito primario.
·Biotransformación de intermediarios baratos. Ponemos el microorganismo en una etapa

específica de la síntesis, es decir, con un sustrato determinado. Se absorbe al microorganismo,
se la adiciona el sustrato especifico, el microorganismo libera la enzima especifica que transforma
el metabolito inicial en el final.
·Síntesis enzimática mediante enzimas. Es el más barato de todos. Extraemos previamente la

enzima de los microorganismos y en un matraz (por ej) para obtener el producto que
necesitamos.
REGULACIONES GENÉTICAS NEGATIVAS EN BACTERIAS
Control negativo: los genes estructurales se expresan hasta que se inhibe por la acción de un
represor. Lo asociamos con el principio de economía de las bacterias. Tipos:
B) control negativo con efectos represores (operón trp): el represor per se es inactivo, pero en
presencia del correpresor se activa (adquiere su capacidad funcional) y se reprime al operón
estructural.
Todos los metabolitos primarios atienden a este control primario: si no está el metabolito en el
medio, lo produce; si está en el medio, no lo va a producir. Se autorregula la producción del
metabolito primario.
Ejemplo: el operón trp de E.coli está compuesto por:
Cinco genes estructurales en la secuencia trpEDCBA, que codifican 5 polipéptidos que a su vez
constituyen 3 enzimas implicadas en el paso de corísmico a triptófeno. (Saberse los genes)
Promotor.
Operador (superpuesto al promotor).
REGULACIÓN Y SECRECIÓN DE AMINOÁCIDOS
Los MO producen AA para utilizarlos en sus vías metabólicas por los eu la producción está
altamente regulada.
Para la producción industrial de un aa, se necesita:
·eludir los mecanismos regulatorios,
·obtener una cepa súper productora y así producir el aa en forma económica.

**otro punto importante en relación con la producción industrial de aa es la secreción. En general

los organismos no excretan metabolitos esenciales como los aminoácidos. Se ha de modificar el
principio de economía y el principio de secreción de la bacteria.
Modificando la excreción, las elevadas concentraciones que podrían producir inhibición o

represión, incluso en mutantes resistentes, generalmente no se producen dentro de las células.
La excreción se debe estimular por varios métodos, como ejemplo el caso del ácido glutámico.
OBTENCIÓN DE CEPAS SUPERPRODUCTORAS
·Desarrollo clásico de cepas: distintas rondas de:
mutagénesis no dirigida
selección para un fenotipo específico
selección del mejor mutante
Todo ello para acumular mutaciones no ventajosas.
Técnicas Genómica: comparación de genomas de productora y silvestre y mutagénesis dirigida.
PRODUCCIÓN DE L-GLUTÁMICO (EJEMPLO IMPORTANTE)
Producto: ácido glutámico
Uso: potenciador de aromas
Microorganismo: Corynebacterium glutamicum
Características de las cepas superproductoras de glutamato: auxotrofa para biotina y deficiente

en alfa-KG DH.
IMP: para potenciar la liberación de acido glutámico al medio de fermentación, para conseguir
una cepa súper productora de este producto, he de tener una cepa auxotrofa para la biotina(si
no pongo biotina en el medio, la cepa no crece y no se produce glutamato) y deficiente en alfa-
KG DH (porque quiero desviar una ruta metabólica para derivarla a la producción de L-glutámico).
Así mejoramos la secreción y el rendimiento de la producción de glutamato. Esto hay que

aprendérselo.
El aumento de la producción puede conseguirse por:
·aumento de la permeabilidad de la membrana celular (biotina, papel fundamental)
·por cepas mutantes con diferentes mecanismos reguladores (deficiente en le enzima anterior)
·por ingeniería metabólica, poniendo las condiciones necesarias en el medio para desviar la ruta
de los ácidos carboxílicos hacia la producción de glutamato.
La carencia de biotina produce la carencia de glutámico (salida del mismo) porque ella es
necesaria para la síntesis de ácidos grasos. Si no hay biotina, no se generan ácidos grasos y no
hay fosfolípidos, componente estructural primario de las membranas celulares. Se hacen éstas
mucho más laxas, con mas poros y una mayor posibilidad de excretar glutámico al exterior
celular.: salida del glutámico.
Necesito la cepa auxotrofa de biotina porque así sirve de interruptor para que cuando la
producción de glutámico este al 100% en el citoplasma, se disminuya la biotina y pueda liberarse
el glutámico al exterior celular para poder obtenerlo.
Si falta la enzima deshidrogenasa, el ciclo de Krebs no está completo y la cepa es deficiente en

esta enzima, responsable de cerrar el ciclo. Así se acumula alfa cetoglutarato y podemos obtener
glutámico si añadimos amoniaco. Así facilitamos la acumulación del sustrato que va a generar el
glutamato.
Se pone una cantidad intermedia de oxígeno para así permitir que siendo una cepa deficiente en
la enzima, toda la derivación del producto sea hacia el glutamato.
IMPLICACIÓN DE UN CICLO DE KREBS INCOMPLETO EN LA SUPERPRODUCCIÓN DE

GLUTÁMICO:
·Con oxígeno, las moléculas se oxidan por el ciclo del glioxalato, no se forma ni alfaKG ni
glutamato.
·Sin oxígeno, hay glucólisis y no hay glutamato.
¿Por qué entonces se produce mucho glutámico? El crecimiento en fermentador gran masa
celular que mantiene unos niveles intermedios de oxígeno y así no hay eoxidción completa a CO2
y agua y se acumula además alfaKG y por tanto glutamato.

La súperproductora la consigo haciéndola auxotrofa en biotina (auxotrofía para la biotina),

deficiente en la enzima y suministrándole una cantidad intermedia de oxigeno para que el
ciclo se desvíe hacia la formación de alfa cero glutamato por ingeniería metabólica.
EXAMEN CAE
Los tres responden al concepto de máxima producción de metabolitos primarios.
CONDICIONES DEL PROCESO INDUSTRIAL
1.Fuente de carbono: monosacáridos, productos baratos como melazas, remolacha azucarera..
Para administración parenteral usamos glucosa.
2.Fuente de nitrógeno: sales de amonio y permite el control del pH
3.Factores de crecimiento. (En el glutámico, era la biotina)
4.Suministro de oxígeno: que no debe ser ni muy alto ni muy bajo
El medio utilizado para la producción comercial de ácido glutámico debe contener, suficiente
biotina para obtener un buen crecimiento, después del cual se impone una deficiencia de bioteina
y el ácido glutámico es excretado.
TEMA 19: PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS ANTIBIÓTICOS Y NO

ANTIBIÓTICOS.
Una bacteria producirá un metabolito secundario cuando tiene que competir con otros
microorganismos. Necesita sobrevivir y para ello genera el metabolito primario, pero cuando
empieza a haber competencia por los nutrientes, se comenzarán a producir metabolitos
secundarios en función de la competencia por los nutrientes presentes en su nicho ecológico.
Este metabolito sirve como reserva, competencia, como molécula hormonal, etc.
No va unido a la curva de crecimiento.
Metabolito secundario: no es universal, no es único, le permite colonizar de forma preferente el

medio en el que habita.
Se sintetiza cuando el microorganismo necesita estar en competitividad con el resto de

microorganismos que habitan su nicho ecológico, para desplazarlos (produciéndose la
bacteriocina, el antibiótico, el antitumoral..).
Metabolitos secundarios con actividades antibióticas, antitumorales, inhibidores de la síntesis de

colesterol e inmunosupresores como señal de su tipo de colonización en su nicho ecológico.
DEFINICIÓN
Los metabolitos secundarios son productos naturales con bajo peso molecular, no son esenciales
y su producción depende de las condiciones ambientales. Se pueden generar en plantas,
animales y microorganismos.
Son muy diversos con gran actividad biológica, con centros quirales, SAR.
·Inconvenientes: extracto crudo-purificación más difícil, bajas concentraciones, hay que aumentar
la escala de fermentación.
SEMINARIO FUNDACIÓN MEDINA: es un descubrimiento de compuestos o extractos activos en

la naturaleza. Las plataformas de la fundación Medina verifica que sus extractos tienen el mínimo
éxito en la obtención de nuevos antibióticos.
Productos naturales vs. productos de química combinatorial: se valora la búsqueda de

metabolitos activos con actividades biológicas de extractos naturales.
Teixobactin es una nueva clase de antibióticos de origen natural.
MUESTREO DE PRODUCTOS NATURALES (método de búsqueda de metabolitos

secundarios)IMP
Medios: tierras, marinas, excrementos, etc.
Fases de la identificación de extractos en Módulos (A, B, C,D, E, F, G, H)
1.Aislar: Agar en placas de 96 pocillos, es metodología de alto rendimiento. 1 ml en pocillos: 24

pocillos-4ml; 10 ml.
2.Desreplicar (quitar los duplicados): microscopía, quimiotaxonomía, molecular 16S,

caracterización química: UPLC, HPLC, MS, RMN, metabolómica, plataforma ADME.
3.Coleccionar los extractos de interés para escalar la fermentación a diferentes condiciones que
promuevan diferentes estreses mediante medios de cultivo variados.
Aquí se pueden usar botellas de co-cultivo de dos especies distintas. En una se pone el
microorganismo que se cree que produce el metabolito que queremos, con el objetivo de
producir un intercambio que nos haga obtener el metabolito de interés.
También se hacen extracciones.
4.Screening-CRIBADO DE ALTO RENDIMIENTO:
Permite hace una selección en medio solido, liquido, en ensayos de sensibilidad, en ensayos de
gen reportero...Ya vamos detectando qué actividad específica tiene ese metabolito secundario
mediante este screening.
Este cribado puede ser:
·Extracelular: orientadas a las dianas-targets y tipos de ensayos
·Intraceular: phenotype biological system based ensayos. Ensayo en Medio Sólido (antibiograma),
Ensayo con Gen Reportero, selecciona la acción antibiótica con un marcador (LacZ).
5.Fraccionamiento/Identificación de la actividad y de la bacteria que presenta ese metabolito

secundario con la actividad de interés.
6. Elucidación estructural.
ESTO DE ARRIBA ES LA PARTE ESENCIAL DE ESTE TEMA
Necesitamos diana-ensayo o phenotype-ensayo para buscar cual es el uso que le vamos a dar a
ese metabolito secundario, por tanto, necesitamos ademas las condiciones de cultivo. Se
prueban muchos medios de cultivo hasta encontrar aquel en el que se produce el metabolito de
interés con mayor rendimiento. Así podemos encontrar una única molécula que sea activa frente
al microorganismo. (Diapositiva de círculos resumen) saber además, los 6 pasos.
ENSAYOS DE SENSIBILIDAD DIFERENCIAL
Se expone a un extracto y se mide el halo de inhibición.
·Filipimicina: Actinoplanes philipinensis.
·13 moléculas patentadas en diferentes fases de ensayo.
·Platensimicina y Platencin
·CESPOFUNGIN molécula activa frente a cándida que fue aislada de un río de Madrid.
·Kocurin.
METABOLITOS SECUNDARIOS. MICROORGANISMOS CON POTENCIAL FARMACÉUTICO.
·Quimioterapéuticos: Taxol de hongos endofíticos.
METABOLITOS SECUNDARIOS. HONGOS CON POTENCIAL TÓXICO.
Efectos tóxicos de los metabolitos secundarios.
Ejemplo: Micotoxinas, son metabolitos secundarios que producen Micotoxicoxis. Son las
aflatoxinas, cortao toxina, fumonisina...
TEMA 20: VACUNAS RECOMBINANTES Y DE ADN
Vacuna: sustancia generalmente fabricada a partir de

microorganismos patógenos para los seres vivos, que
al ser administrada producen inmunidad frente a una
enfermedad concreta.
Las suspensiones de microorganismos patógenos

pueden estar vivos, muertos, modificados o de
fracciones específicas aisladas.
El patógeno como estructura completa tiene ambos

factores, tanto de virulencia como inmunogénicos.
Cuando la línea es muy fina, se han de mejorar las
vacunas.

En aquellos en los que están separados ambos factores, se generan vacunas 100% inocuas.
Pero cuando no están tan bien separados, se generan vacunas que pueden dar reacción a cierta
parte de la población porque en la vacuna quedan ciertos elementos estructurales que dan
reacción.
Requisitos de una vacuna ideal:
·inocuidad
·estabilidad física y genética
·posible inmunización simultánea contra múltiples componentes protectores de diversos

patógenos.
·protección de larga duración con una sola dosis
·inducción de la inmunidad en máximo de 2 semanas
·estimulación de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistémico
·precio competitivo
Como las zonas endémicas se han ido modificando y la prevalencia de las enfermedades va
cambiando. Por tanto el calendario de vacunas es diferente en cada país e incluso dentro de
distintas comunidades dentro de un país. En el 86 aparece la primera vacuna recombinante.
VACUNAS RECOMBINANTES
·Vivas atenuadas: consiste en eliminar la virulencia del patógeno pero manteniendo los productos
que crean la respuesta inmune. Ej: la gripe.
·Vivas polivalentes: en las cuales un mismo microorganismo puede conferir inmunidad para dos
enfermedades diferentes: Virus recombinante vivo que ofrece protección frente a la preste aviar
como a la enfermedad de Newcastle.
CARACTERÍSTICAS
Las técnicas con DNA recombinante pueden facilitar la modificación de un patógeno porque las
técnicas genéticas in vitro suelen ser más precisas y más potentes que las técnicas tradicionales,
se eliminan simplemente los genes implicados en la virulencia, dejan los que tiene productos que
crean una respuesta inmunitaria, lo que da lugar a una vacuna recombinante viva atenuada.
OBTENCIÓN DE VACUNAS POR INGENIERÍA GENÉTICA
Se extrae el DNA del microorganismo y se inserta en un vector, se inyecta el antígeno y se

obtienen anticuerpos para preparar la vacuna.
PRODUCCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES: pura ingeniería genética. (Leer párrafo)
Un vector utilizado para preparar vacunas recombinantes vivas atenuadas es el virus de la

vacuna. La clonación en este virus se realiza usando un plásmido de E.coli que contiene un
fragmento dl gen de la tímida a quinasa del virus de la vacuna. Se inserta un DNA foráneo
apropiado en este vector recombinante que se transforma en una célula hospedadora, cuya
propia timidina quinasa está inactiva, pero que se ha infectado previamente con un virus de la
vacuna del tipo silvestre.
VENTAJAS DE LAS VACUNAS TRANSGÉNICAS (esto hay que sabérselo)
Son más seguras que las vacunas normales atenuadas o las muertas.
Son más reproducibles porque su construcción genética puede controlarse minuciosamente.
Pueden administrarse altas dosis sin riesgo de efectos secundarios.
Se fabrican mucho más rápido que las que se producen mediante métodos más tradicionales.
Suelen ser más baratas que las producidas por otros métodos.
VACUNAS DE SUBUNIDAD: PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS (imp)
Son vacunas que contienen solo una o varias proteínas del agente patógeno. Utilizan los factores
inmunogenicos que me permiten generar el antígeno para obtener el anticuerpo, clonarlo, incluirlo
en estructuras y producir la vacuna.
Ej: en el caso de los virus se suelen utilizar proteínas de la cubierta, puesto que son altamente
inmunogénicas.
Ventajas: al no estar formadas por la totalidad de la estructura del agente infeccioso, es posible
diferenciar serológicamente a los animales vacunados de los animales enfermos.

PREPARACIÓN DE VACUNAS DE SUBUNIDAD
Fragmentación de ADN vírico mediante encimas de restricción.
Clonación de los genes de la proteína de cubierta del virus dentro de un vector adecuado.
Creación de promotores, cambios de lectura y sitios de unión de los ribosomas adecuados.
Reinserción y expresión de los genes víricos en un microorganismo.
VACUNAS DE SUBUNIDAD: específica de una parte del organismo patógeno (IMP)
La elección del hospedador de la clonación es un paso muy importante ya que de él depende

que se pueda dar la respuesta inmunogénica.
Si se elige como hospedador E.coli, las vacunas suelen ser muy poco inmunógenas (no
consiguen proteger a los animales de infecciones posteriores) porque las proteínas
recombinantes no están glicosiladas.
Si se opta por un hospedador eucariótico, las vacunas tienen gran capacidad inmunogénica y
esto es debido a que las proteínas recombinantes sí están glicosiladas.
Las proteínas glicosiladas actúan a nivel de la postraduccion impidiendo la modificación de

las proteínas de la cubierta del virus, que son las responsables de la acción inmunogénica.
HEPATITIS B (sabérselo de memoria!!!!!) IMP
La primera vacuna aprobada en uso humano se fabricó utilizando levaduras, fue clonado y
expresado en levaduras.
El antigeno HBsAg es el antigeno aislado del virus que se usa actualmente en la actual vacuna
de la hepatitis B, producido por ingeniería genética en levaduras. La glicosilacoin le da un plus
de capacidad inmunogénica desencadenando una mayor respuesta inmunogenica.El
antigeno se produce a altos niveles en grandes fermentadores de modo seguro.
VACUNAS DE DNA =nano o microniddles
Se basan en la inyección directa en el huésped de dna plasmídico (parte inmunogenica) que

codifica para un antigeno de un patógeno, en lugar del antigeno proteico o del patógeno
atenuado o muerto. Nuestras propias células son la biofabrica de la vacuna, el organismo
que recibe la inyección.
VACUNAS DNA O VACUNAS GENÉTICAS (es lo mismo)
Son conocidas como “vacunas genéticas”, son utilizadas en tratamientos de enfermedades como
el sida o la malaria. Éstas vacunas utilizan el material genético del patógeno en cuestión para
conseguir la inmunización.
El material genético puede encontrarse en forma de fragmentos definidos del genoma del
patógeno, o en forma de genes del patógeno clonado en un plásmido o en un vector virico.
Últimamente se están incluso utilizando el dna desnudo (o el RNA) como vacuna.
Se protege con nanoparticulas y micro partículas, sellando los extremos libres.
IMP: inducen una respuesta inmune completa y duradera que incluye anticuerpos así como
una activación fuerte y duradera de células T cooperadoras y citotoxicas.
IMP: cuando se inyecta el plásmido en el músculo o en la piel, éste penetrante dentro de la celula
y llega al núcleo, para desencadenar la producción de los antígenos del patógeno contra el que
se quiere obtener inmunidad. De esta forma lo que se hace es trasladar la fábrica de la vacuna a
los tejidos de la misma persona, lo que se hacía en grandes plantas industriales pasa a hacerse
en las propias células de la persona vacunada, y con gran eficiencia.
¿Por que no todas las vacunas son de DNA?
Porque no conocemos el gen específico que desencadena la respuesta inmune. Solo para los
patógenos que conocemos el gen que desencadena la inmunología son los candidatos perfectos
para generar esa inmunidad. Con los demás, se previene no inyectando todo el dna. la
especificidad de cada micoorganismo es lo que nos falta por identificar en los patógenos no
susceptibles de crear vacunas.
VENTAJAS DE LAS VACUNAS DNA
Explican el gran interés generado por las vacunas de DNA, las cuales se han probado con éxito
contra un número creciente de enfermedades.
Propiedades inmunogenicas previamente comentadas.
Estimulan la respuesta inmune humoral y celular.

No crea respuesta inmune hacia el vector, por lo que pueden administrarse repetidas veces.
Fácil producción. Bajo coste. Muy estable. Fácil almacenaje y distribución. Segura.
Embarazadas e individuos inunnocomprometidos no corren riesgo.
Como la cantidad de antigeno que tenemos que tener disponible no se ha generado

adaecuadamente en cada núcleo celular, la vacuna se debería de inyectar repetidamente.
ESTRUCTURA DE VACUNAS DE DNA.
El vector plasmídico debe estar compuesto por:
·Una única unidad transcripcional que incluye un promotor, un intrón, un cDNA que codifica para
el antígeno y una secuencia de terminación de la transcripción.
·Un esqueleto plasmídico que contiene el origen de replicación, un sitio de clonación múltiple que
facilita la inserción del gen, un gen de resistencia a antibióticos y las secuencias CpG que son
inmunoestimulatorias que funcionan como un adyuvante interno en la misma vacuna,
dando un plus en el desencadenamiento de la respuesta inmune.
Este make up final es un adyuvante.
VACUNAS DE M.O. VIVOS ATENUADOS (menos importancia)
·Bacterianas: antituberculosa , anticolérica oral y antitifoidea oral.
·Vírales: varicela, PVO y triple vírica: sarampión, rubéola, peperas.
VACUNAS M.O. INACTIVADOS
·Bacterianas: anticolérica y antitifoidea inyectables las dos.
·Víricas: PVI, antigripal a virus completo, antihepatitis A y antirrábica.
VACUNAS DE SUBUNIDADES (imp, aprender)
·Bacterianas:
Neisseria meningitidis Bordetella pertusis
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenza
La parte de la bacteria útil sería la que hace el primer contacto con la célula eucariota y que
genera la capacidad infecciosa, es decir, de la cápsula, la subunidad es ésta propia cápsula.
La vacuna de subunidad se hace con la cápsula de la bacteria y por eso también se llaman
vacunas de subunidades.
·Vírales: antihepatitis B.
VACUNAS TOXOIDES
Se obtienen a partir de las toxinas bacterianas. Necesitamos recuerdos de éstas vacunas.
Clostridium tetani: antitetánica
Corynebacterium diphtheriae: antidiftérica
VACUNAS DEL FUTURO (imp)
Mediante biotecnología actualmente los científicos ensayan la modificación del genoma de

algunas plantas comestibles como la patata o la banana, por ejemplo, para que produzcan
ciertas proteínas que, al ser ingeridas por el ser humano, confieran inmunidad.
La ventaja de esta forma de inmunización, aún en experimentación, es que las vacunas

comestibles serían estables a temperatura ambiente, económicas y de administración oral.
VACUNAS TERAPÉUTICAS (Imp)
Este tipo de alternativa, llamada vacuna terapéutica, ayudaría por lo menos a reducir el número
de muertos y sujetos en situación de enfermedad crónica grave que el sida produce en estos
momentos. La estrategia de los métodos que se están evaluando es estimular el sistema
inmunológico de los enfermos para identificar y matar a las células del organismo en las
que se esconde el agente patógeno.
¿VACUNA CONTRA EL SIDA?
Ninguna de las investigaciones está dirigida a prevenir la enfermedad sino a estimular las
defensas de los pacientes ya infectados, por eso es vacuna terapéutica. No demostró proteger
contra la enfermedad, sino que mantiene la carga antigénica constante y dar calidad de vida al
paciente.
VÍAS DE ADMINISTRACIÓN
Vía oral, la perseguida por las vías de investigación. Sería la óptima.
Vía parenteral, la actual.
Vía intradermica: poco liquido y liberación lenta
Vía subcutánea.
Vía intramuscular.
IMP TEMA 20: Ventajas recombinantes. Vacunas de dna. vacunas de subunidades. Microniddles.
TEMA 21: PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS DE INTERES FARMACÉUTICO EN

MICROORGANISMOS
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES (Desarrollo) Ej: la insulina o cualquier otra

proteína recombinante se puede producir por:
E.coli; transformación sintética de insulina de cerdo (AlaxTre); levaduras; células; en animales

transgénicos; por terapia génica.
INSULINA
Proteína importantísima para la regulación del metabolismo de los carbohidratos. Es producida
en el páncreas y su función en el organismo es incrementar la producción de glucosa y su
posterior degradación, controlando su nivel en sangre. Su ausencia/alteración provoca diabetes.
Las hormonas implicadas en mantener los niveles de glucosa en sangre son la insulina y el
glucagón.
El salto a la biotecnología se produjo de forma espectacular y abaratando los costes de

producción de insulina. Las insulinas porcinas o bovinas, que constituían la fuente principal de
insulina para diabéticos antes de la llegada de la biotecnología. La insulina humana biosintética
es idéntica en todos los aspectos a la insulina purificada del páncreas humano. La insulina
producida por métodos de ingeniería genética en producción por microorganismos es más
barata. Un fermentador actúa igual que cien mil cerdos para obtener las mismas cantidades de
insulina.
CREAR UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE (EXAMEN)
Ej. insulina. Tiene dos cadenas, dos polipéptidos en su forma activa: A y B; unidos por un puente
disulfuro, codificados por partes separadas del gen de insulina. Además este gen también
codifica la preproinsulina y un polipéptido de unión de los polipéptidos A y B.
Las dos cadenas se pueden generar cada una en un E.coli o todo con un solo E.coli al que se le
hayan insertado los genes de codificación de ambas cadenas. La hipótesis de diseño es conocer
perfectamente la estructura final de la proteína y conocer los aminoácidos de la cadena primaria
de la proteína terapéutica y cuales son los elementos secundarios necesarios para que la proteína
esté activa.
La insulina recombinante nos permitió hacer insulina rápida con aminoácidos Humalog y también
insulina lenta con aminoácidos Lantus. La diferencia entre la insulina d e humanos y la bovina y
porcina se diferencia solo en unos aminoácidos Humanos ya que la mayoría de los aminoácidos
de la estructura de la insulina es igual para vertebrados, bovinos y porcinos, ya que contienen los
mismos aminoácidos y en gran proporción en la Constitución de la proteína.
Primero tenemos que ver al estructura de la proteína recombinante que vamos a hacer. Si hay un
ejercicio que nos pide obtener una proteína desde cero en un vial, tenemos que empezar a
diseñar sabiendo el tipo de aminoácidos que componen la proteína que vamos a sintetizar de
forma recombinante.
En caso de la insulina tenemos una cadena alfa y una cadena beta. Se codificaran genes que
codifiquen al péptido A, se meterán en un E.coli y en un matriz tendremos e.coli transformado
con el plásmido que porta el gen que codifica el polipéptido A. En otro clon ponemos el gen que
codifica el polipéptido B. Lo introduciremos transformando un e.coli para obtener un e.coli
transformado con el gen B que nos va a dar el polipéptido B.
El polipéptido A y b se purifican de ese cultivo y se le ponen las condiciones óptimas para que se
genere finalmente la insulina con los puentes disulfuro intra e intercatenarios que unen ambos
polipéptidos para formar la insulina.

La insulina en su forma activa esta formada por 2 polipéptidos A y B, unidos por un enlace
disulfuro, codificados por partes separadas del gen de insulina. Además, este gen también
codifica la preproinsulina y un polipéptido de union de los polipéptidos A y B.
La siguiente forma de síntesis es usando solo un vector que se introduce en un único e.coli y que
genera preproinsulina de nuevo, conteniendo la proteína a y la b más la parte de fusión. De modo
que podemos generar dos cadenas independientes, con 2 e.coli codificados de forma
independiente o bien podemos usar gen A y gen B que se insertan en e.coli unidos mediante una
proteína de fusión en un único e.coli donde finalmente se elimina la proteína de fusión. Sin
embargo, lo mas importante en ambos casos es conocer la secuencia de aminoácidos principal
que codifica la proteína recombinante que queremos obtener.
MÉTODOS PARA LA SÍNTESIS DE INSULINA HUMANA EN BACTERIAS.
·Producción de proinsulina y conversión en. Insulina mediante métodos químicos (biocatálisis).
·Recombinantes: producción de los polipéptidos A y B en dos cultivos bacterianos

independientes. Modificación de la estructura final de las insulinas para controlar su liberación.
MODIFICACIÓN DE INSULINA DE CERDO: INSULINA HUMANA
Compañía Novo Nordisk.
Ideo la biotransformación de un aminoácido de ala niña por treonina para humanizar la insulina de
cerdo. (Esto es importante). Así consiguieron que fuese lo más parecida posible a la humana. De
aquí hay que saberse el nombre de la compañía farmacéutica, que consiste en una modificación
enzimática de una alanina por una treonina, y que fue una biotransformación.
INSULINA RECOMBINANTE (IMP)
En 1982 con la puesta en el mercado de la insulina humana recombinante (Andersen y Krummen,

2002). Eli Lilly produjo las dos cadenas alfa y beta de la insulina humana en E.coli (obtuvo la
primera recombinante).
INSULINA RECOMBINANTE PASOS A SEGUIR (descritos)
Utilizando dos cepas recombinante de E.coli:
1.En ingeniería genética, los científicos utilizan enzimas de restricción para aislar un segmento
de ADN que contiene un gen de interés, por ejemplo: el gen que regula la producción de insulina.
2.Un plásmido extraído de su bacteria y tratado con la misma enzima de restricción puede
formar un híbrido con estos extremos de ADN complementario.
3.El plásmido híbrido se reincorpora a la célula bacteriana, donde se replica como parte de DNA
celular.
4.Se pueden cultivar un gran número de células hijas y obtener sus productos genéticos para el
uso humano.
La segunda posibilidad es generar insulina directamente en un único plásmido. Cada cadena de

la insulina se produce en forma de productos de fusión con la beta-galactosidasa de E.coli
utilizando:
·dos fragmentos de ADN sintéticos codificantes de ambas cadenas.
·Cada cadena de la insulina se separaba de la proteína de fusión mediante una hidrólisis con
BrCN.
·La formación posterior de los puentes disulfuro.
Obtendríamos la insulina con sus dos cadenas y la proteína de fusión cortada. Perseguimos
producir con un único E.coli transformado las dos cadenas de la insulina, por eso se llama
preproinsulina porque no obtenemos directamente nunca la insulina, tenemos que llevar a cabo
una serie de pasos para obtener finalmente la insulina activa. Las posibilidades de obtención es
variable pero depende de la estructura secundaria de ambas cadenas, así como de la secuencia
de aminoácidos de ambas.
INSULINAS MODIFICADAS
Las insulinas modificadas buscan una mayor eficacia terapéutica: las moléculas de insulina
tienden a dimerizar y hexamerizar (u oligomerización, entonces su acción hormonal se ve
limitada, ya que precipita y entonces ya no actúa adecuadamente) cuando se almacenan y a las
dosis terapéuticas lo que retrasa el efecto de la insulina porque retarda su absorción en el
torrente circulatorio por vía subcutánea o intramuscular.

(Aprender:)
La oligomerización de la insulina se debe a las interacciones que se producen entre los

aminoácidos de las posiciones B23-B28 de la cadena beta y, por lo tanto, la modificación de
estos aminoácidos puede reducirla oligomerización y modificar así la actividad de la insulina
haciendo su acción biológica más rápida o más lenta.
·Las insulina Humalog y Liprolog de Eli Lilly tienen la Pro28 y la Lys29 de la cadena invertidas en
su posición con lo que se consigue una insulina de acción más rápida.
·De forma parecida la insulina NovoRapid de Novo Nordisk tiene sustituida la Pro28 por ácido
aspártico para conseguir el mismo efecto que las anteriores insulina de Eli Lilly.
·La insulina Lantus de Aventis tiene sustituido el Asp21 de la cadena (por glicina y además tiene
2 argininas adicionales en la posición C-terminal, con lo que se consigue una insulina de acción
más lenta.
(Cuadro FUNDAMENTAL y OBLIGATORIO) INSULINAS COMERCIALES
Humulina: insulina idéntica a la humana producida por Lilly producida en E.coli y fue la primera
recombinante.
Novolina: insulina producida por Novo
Nordisk, es idéntica a la humana y la
produjo 10 años despues casi, en
S.cerevisiae.
·Novo Nordisk: S.cerevisiae.
·Lilly y Aventis: E.coli
Humalog y Liprolog son dos

modalidades de insulina humana rápidas
producidas por Lilly, en E.coli ambas.
Novarapid es una insulina de acción

rápida de Novo Nordisk producida en
S.cerevisiae.
Lantus es una insulina de acción lenta

producida por Aventis en E.coli ya en el
2000.
Todas se utilizan para la diabetes. Todas son idénticas a la humana y hay que aprenderse solo las
bacterias, las compañías y el año. El sistema de producción es la biofábrica, es decir, la bacteria
o la célula en la que se va a producir la proteína, en nuestro caso: la insulina.
TERAPIA GÉNICA: INSULINA
Consiste en que las propias células del individuo generasen la insulina que necesita el individuo.
HORMONA DEL CRECIMIENTO: HGHr.
Lo primero que tenemos que saber es cómo es la naturaleza de la proteína recombinante que
queremos obtener.
La extracción de la HGHr es a partir de animales y era muy costosa y difícil, pero puede ser
obtenida de forma recombinante con 9 litros de producción bacteriana en cultivo de un clon
transgénico que contenga los genes específicos.
Esta hormona se puede obtener a partir de animales transgénicos. Se coge el gen de la hormona
del crecimiento se mete en un embrión de un ternero y se introduce en una vaca. De modo que el
ternero que nace cuando ya es vaca produce leche en
la cual obtenemos la proteína.
Así, la somatotropina bovina es utilizada para aumentar

la producción de leche en el ganado, además este
ganado es mucho más productor.
CUADRO RESUMEN IMPORTANTE:
En e.coli (primera biofábrica) se obtuvo Protropin de

Genentech. La utilidad terapéutica es la deficiencia en
niños.
Posteriormente, otras patentes se han producido en

líneas celulares. No saber las demás.

ERITROPOYETINA: EPO Hr
(recombinante)
Es la proteína recombinante más

vendida en el mundo (doping). El riñón
es el principal productor de EPO
natural. Esta proteína regula y estimula
el crecimiento de las celulas rojas de la
sangre.
·Utilización terapéutica para la anemia
·Empleo como dopante en el deporte de
élite (mayor rendimiento).
La eritropoyetina es el medicamento
recombinante más vendido en todo el mundo. Necesitamos saber su secuencia de
aminoácidos(165)para sintetizarla a nivel recombinante. La ponemos en un clon, elegimos un
vector y la producimos.
Una vez obtenido los genes, se ha de elegir muy bien el hospedador porque para ser activa, la
EPO ha de estar glicosilada. Es importante señalar que la EPO recombinante ha de producirse en
células de mamífero, ya que para ser activa tiene que estar adecuadamente glicosilada.
·Esta glicosilación es esencial, a veces de forma diferencial. No hay EPO recombinante activa si o
está glicosilada y ésta ha de ser específica, por eso se mete en células de mamíferos (elección
adecuada de la biofábrica es decir del tipo celular).
·pl de la EPO varía en función de su glicosilación.
CUADRO RESUMEN: EPOGEN, PROCRIT y NEORECORMO para tratamiento de la anemia. El

sistema de producción de todos es en células CHO, posteriormente surgieron modificaciones de
la EPO.
TEMA 22: FERMENTACIONES INDUSTRIALES
BIORREACTORES
Son equipos de alta complejidad técnica,

según su función, en los que se lleva a cabo
un proceso biológico que puede ir desde el
cultivo de un microorganismos hasta el
desarrollo de una reacción de
biotransformación (biocatálisis). El diseño del
biorreactor se realiza a la carta en función del
microorganismo que necesitemos obtener.
También puesto que el ingeniero trata de
optimizar el proceso acoplándolo a las
características del microorganismo o la
enzima.
PROCESOS UPSTREAM
·Aspectos relacionados con el microorganismo:
Aislamiento inicial y screening.
Mejora genética hasta lograr la cepa productora deseada.
Mantenimiento de la pureza de la cepa.
Conservación de la cepa.
Desarrollo del inóculo que ha de ser apropiado para el biorreactor y ha de estar
perfectamente catalogado.
·Diseño de medios de fermentación, incluyendo su adaptación para la escala industrial.
·Diseño del bioproceso y del sistema de biorreactor.
PROCESOS DOWNSTREAM
·Llamados en general “procesamiento”, engloban todas las fases requeridas para recuperar los
productos útiles del bioproceso industrial. Son tan importantes como los anteriores.
Su objetivo es recuperar el producto buscado (con su actividad biológica y pureza deseada)de

modo eficiente, reproducible y seguro, con los máximos rendimientos y los mínimos costes
posibles. Estos procesos downstream van diseñados a la purificación del producto, para que este
tenga el mayor rendimiento, calidad y garantía.
MOLÉCULAS RECOMBINANTES
·Moléculas intracelulares, periplásmicas y/o secretadas (que se encuentran en el medio de

cultivo).
CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE FERMENTACIÓN SEGÚN LA RELACIÓN DEL

PRODUCTO CON EL METABOLISMO ENERGÉTICO
·Fermentación de tipo I: el producto deriva directamente del metabolismo primario de producción

de energía.
El producto puede ser la misma biomasa. En este tipo de fermentación el crecimiento, la

degradación del carbohidrato y la formación del producto corren prácticamente en paralelo.
·Fermentación de tipo II: son fermentaciones discontinuas con un rango de separación de

tiempo, nutrientes, etc, para favorecer el producto final. Con gran consumo del sustrato y poca o
nula formación del producto. Luego, el crecimiento se endentece y empieza la formación del
producto, con gran consumo del sustrato.
·Fermentación de tipo III: el producto no deriva del catabolismo de la fuente de carbono. En la

primera fase, se dan el consumo De la Fuente energética y el crecimiento, mientras que en la
segunda se genera el producto, en reacciones procedentes del metabolismo intermediario.
PARÁMETROS FERMENTACIONES INDUSTRIALES (imp)
·PRODUCTIVIDAD
La productividad de una fermentación

se define como la razón entre la
concentración del producto y el tiempo
de fermentación, y se suele expresar en
unidades de producto·h-1. (Coste y
efectividad)
·CONSTANTE DE RENDIMIENTO
Se calcula dividiendo la biomasa formada entre

la cantidad de sustrato consumido. Nos
interesa que sea lo mayor posible porque eso
implica una mayor producción del producto
final. Esta constante va ligada al tipo de
microorganismo, hay que elegir el
microorganismo mejor adaptado a la fuente de
sustrato que tenemos.
·PRODUCCIÓN DE CALOR
Para obtener los rendimientos óptimos, las fermentaciones deben darse a temperatura constante.
Para ello, la tasa de producción de calor debida a la agitación mecánica y a la actividad

metabólica, deben equilibrarse con las pérdidas de calor por evaporación y radiación, además de
las debidas a los sistemas de enfriamiento acoplados al fermentador.
PROCESOS DE ESCALADO DE FERMENTACIÓN (es obligatorio aprendérselo: volumen, nombre)
·Los microorganismos se cultivan en primer lugar en un tubo de ensayo como cultivo de reserva
o “stock” (5-10ml), y como “cultivos de trabajo”.
·Ese primer cultivo se inocula en un matraz con 200-1000ml (cultivo en agitación para
crecimiento del inóculo).
·Posteriormente se pasa a un pequeño fermentador (10-100L): se trata del cultivo fermentador
de semilla (starters).
·Finalmente se pasa al gran fermentador de producción
(1 000-100 000L).
(Dibujar esquema) idéntica proporción de parámetros

controlables en tubo de ensayo y en el biorreactor. Si no se
hace bien el escalado, el producto final no sirve para nada.

PARÁMETROS IMPORTANTES DURANTE

LA FERMENTACIÓN
·Temperatura: debe escogerse aquella que

permite la máxima tasa posible de
crecimiento y que al mismo tiempo permita
la mejor tasa de formación de producto.
·Aireación: suele ser de entre 0.25-1,0 v/va

(volumen de aire/volumen de
líquido·minuto). La tasa de aireación se
ajusta a la cantidad de oxígeno requerida.
·Agitación: a continuación se muestra en

tabla velocidades de agitación típicas en
función del volumen.
SENSORES
Es conveniente recurrir a sensores capaces de medir una serie de parámetros físicos, químicos y
biológicos.
·Lo ideal es que los sensores estén conectados al fermentador y sean automáticos (sensores on-
line, nos dan medidas digitales directas de lo que está pasando en el fermentador).
A su vez, los sensores on-line se pueden dividir en:
·sensores in situ (sondas dentro del mismo medio del fermentador).
·sensores ex situ (en una derivación o salida del fermentador, de modo que el volumen de
muestra que usamos para la medida se pierde, al no volver al fermentador). El sensor en
este caso está fuera de la cuba del fermentador.
·Algunos parámetros aún deben medirse “a mano” en el laboratorio a partir de una muestra
extraída de la cuba del fermentador (sensores oﬀ-line, se analiza una muestra del fermentador,
se da una medida indirecta porque no es en tiempo real).
TIPOS DE BIORREACTORES (sabérselo)
·Biorreactores con agitación mecánica.
·Biorreactores con columnas de burbujas.
·Biorreactores de elevación de aire (airlift).
En el biorreactor buscamos distribuir biomasa,

nutrientes, oxigeno, ph igual, etc en todo el
biorreactor por agitación mecánica, con
columnas de burbujas y con airlift. Esto es lo
que nos lleva a los 3 tipos de biorreactores.
Dibujo de PARTES DE UN BIORREACTOR CAE

SIN LAS LETRAS!!!!!!!!!!! Aprendérselo!
Si se cumplen los parámetros físicos, químicos

y biológicos (buena homogeneización a todo el
nivel del biorreactor) aseguramos la
bioproductividad y la constante de rendimiento del organismo.
·Motor: distribuye de forma homogénea a través su agitación mecánica todo el medio de cultivo y
toda la biomasa.

·todos los sellos del biofermentador tienen que estar estériles bloqueando la entrada de otros
microorganismo que no sean el propio del inoculo
·sonda.
·posibilidad de inyectar o sacar material de desecho dentro del biorreactor. Se usan filtros que
permiten la entrada o que bloquean la salida, son filtros de 0.22 micras porque este tamaño de
poro deja pasar aire y otras sustancias pero no deja pasar los microorganismos, permitiendo la
esterilidad.
·sensor de ph unido a un dispositivo que vierta acido o base dependiendo de como vaya el
crecimiento del microorganismo. Si es un microorganismo general, el ph 7 seria el optimo. De
modo que la sonda de ph tiene que estar midiendo constantemente el ph para añadir acido o
base en función de este. Por eso necesitamos un sensor de ph adicionado a dos válvulas: una
que adicione base y otra que adicione acido.
·salida de agua de enfriamiento: de la camisa o chaqueta de refrigeración que permite mantener

le medio de cultivo a una temperatura constante y de forma homogénea en todo el biorreactor.
Esto se mantiene constante con la camisa de calentamiento o de enfriamiento.
·Salida de agua: totalmente exterior, que no contacta directamente con el medio de cultivo
·medio de cultivo: aporta los nutrientes y la base del crecimiento de microorganismo productor
del producto BIOTECNOLÓGICO
·distribuidor de burbujas de aire
·aire estéril para distribuir perfectamente todo el oxigeno en todo el tanque del biofermentador
·entrada de vapor, necesario para el autoclavado, para la esterilización. Este vapor permanece
unos minutos de rigor y luego sale. Permite el autoclavado del medio de cultivo.
El biofermentador es un método combinado de burbujas de aireación y agitación mecánica. Esto

es lo que nos permite la distribución homogénea del medio de cultivo.
EJEMPLOS: PROCESO DE PRODUCCIÓN DE PENICILINA (ejemplo de escalado)
Partimos de un liófilo inicial y pasamos a un fermentador hasta llegar al starter.
Todos los componentes necesarios para la producción de penicilina están en los cuadritos++
······Definir upstream, downstream y elementos esenciales en el biorreactor.
EJEMPLO: VINIFICACIONES DE VINOS BLANCOS
Es importante controlar la homogeneidad del tanque. Esto se hace con un control a diferentes
niveles dentro del biofermentador. Con la ayuda de ventanas nos permite controlar lo que ocurre
a los distintos niveles de biofermentadores, permitiendo una monitorización de lo que está
pasando a todos los niveles. Esto se hace con un sistema de sensores a los diferentes niveles del
biorreactor porque basta con que uno de los niveles no funcione para que se arruine todo.
MEDIOS DE CULTIVO
Son la base de la producción biotecnológica en biorreactores.
·Acondicionamiento del medio de cultivo:
El acondicionamiento del caldo de cultivo se emplea para el crecimiento óptimo del

microorganismo y para mejorar la ulterior separación por sedimentación o centrifugación, etc.
Consiste en alterar alguna propiedad del microorganismo u otro material en suspensión, para
facilitar su separación: floculación y eventual precipitación.
SUSTRATOS Y MEDIOS DE CULTIVO (quedar claro)
1.Sustratos ricos en fuentes de carbono
No es habitual que se emplee en la industria carbohidratos puros (como glucosa o sacarosa),

aunque algunas veces se recurre a ellos cuando hay que controlar bien las condiciones de
crecimiento. Las melazas de caña de azúcar o de remolacha, subproductos de la industria
alimentaria son fuentes baratas de azucares, aportando ademas las moléculas nitrogenadas,
vitaminas y minerales. Se trata de unos jarabes viscosos y oscuros, que contienen 50-60% (p/v)
de carbohidratos.
El extracto de malta.
El almidón y las dextrinas pueden ser usadas por los microorganismos amilolíticos.
2.Sustratos ricos en fuentes de nitrógeno: extracto de levadura, extracto de carne, peptonas.

PARÁMETROS DE INTERÉS PARA LOS BIORREACTORES (clave)
·Agitación
·Evitar la formación de espumas
·Transferencia de calor
·Aireación y transferencia de oxigeno
·Control de pH
·Control de parámetros en el escalado industrial
·Esterilización de las soluciones y los gases que se vayan a inyectar
Agitadores: los hay de disco y de turbina.
Tienden a hacer más efectivo el proceso, se diseñan las mejoras posibles en función de una
mejor homogeneización. A menor viscosidad, mejor separación de células.
ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS
·Esterilización por lotes (discontinua): se recurre a la inyección directa de vapor o al calentamiento

directo:
-Inyección directa de vapor: los fermentadores industriales pueden venir preparados con las
tuberías y las válvulas necesarias para la esterilización de la vasija y de las tuberías asociadas.
-Calentamiento indirecto: se pasa vapor de agua a través de la camisa que rodea externamente al
fermentador, o a traviestan de los serpentines internos. Este tipo de procedimiento es menos
eficiente que la inyección directa de vapor. Ej: esterilización UHT: 150 grados durante 2 o 3
segundos, se genera el autoclavado durante pocos segundos y es indirecto porque no toca
directamente el medio de cultivo.
·Esterilización por flujo continuo: presenta varias ventajas, ahorra espacio, mayor ahorro de
energía, daña menos el medio de cultivo. Los procesos de tratamiento en continuo se diseñan
para lograr 3 etapas sucesivas: inyección directa de vapor y calentamiento indirecto.
ESTERILIZACIÓN DE LOS GASES: se utilizan filtros profundos y filtros de pantalla.
REPASO: tipos de fermentadores, escalado, condiciones, biorreactor.
TEMA 23: CONTROL DE LOS PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS Y BIOSEGURIDAD.
Los microorganismos pueden ser GRAS y QPS pero nadie dirá que son 100% seguros.
BIOSEGURIDAD
Seguridad: calidad de seguro, libre y exento de todo daño o peligro. 100% seguro no va a ser
nunca en ningún caso en la producción.
Bioseguridad es igual a protección. Los niveles de bioseguridad se van a definir en función de ese
daño o peligro. ¿Protección para quién o de qué? Población general, medio ambiente, personal
manipulador, el propio producto terapéutico y al usuario (paciente). En este sentido se ha
evolucionado muchísimo con tratados de diferentes áreas para controlar los impactos que tiene la
manipulación de los microorganismos.
Bioseguridad es una disciplina “preventiva e integral”.
En cada institución ha un comité de riesgos laborales y un comité de bioseguridad.
En hospitales hay especialistas en microbiología.
PRECAUCIONES UNIVERSALES PARA LABORATORIOS (leer)
Acceso limitado, no beber, no comer. Utilizar guantes, ropas protectoras como bata, calzado
cerrado, cabello recogido. No pipetear con la boca, no oler los reactivos y materiales. Etc.
CLASIFICACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS (aprendérselo)
1. No producen enfermedad
2. Asociados con enfermedad leve, no transmitidos por aerosoles
3. Asociados con enfermedad grave, transmitidos por aerosoles
4. Muy peligrosos (producen alto riesgo de mortalidad y son de fácil contagio)
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Combinación de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones

específicas, que constituyen las condiciones bajo las cuales puede trabajarse de forma segura
con agentes de riesgo biológicos. Se controlan:
·características del material biológico
·tipo de trabajo que se realizará
·vías de exposición
NIVEL DE BIOSEGURIDAD 1
·Laboratorio a universitarios y laboratorios que trabajan con cepas de microorganismos viables,

que no sean generadores de enfermedades en humanos adultos sanos o animales.
·Mesas de laboratorio abiertas.
·No requiere equipamiento de contención ni diseño especial de infraestructuras.
·Trabajos con agentes de riesgo potencial moderado para el personal y el medio ambiente; puede
causar enfermedades graves, pero solo se transmite por vía sanguínea, no inhalatoria.
·Personal tiene capacitación específica en la manipulación de estos agentes.
·Acceso limitado al personal autorizado.
·Precauciones extremas con elementos cortantes contaminados.
·Procedimientos que pueden generar aerosoles o gotitas infecciosas se llevan a cabo en
gabinetes de seguridad biológica o en otros equipos de contención física.
·Instalaciones clínicas, diagnóstico, enseñanza, investigación o producción, que trabajen con

agentes indígenas o exóticos que pueden producir una enfermedad grave o potencialmente letal
como resultado de la exposición por vía de inhalación.
·Todo procedimiento con estos materiales infecciosos se realizan en gabinetes de bioseguridad u

otros dispositivos de contención física, o por personal que lleva ropa y equipo protector
adecuado.
·Características de diseño e ingeniería especiales para la contención.
·Instalaciones e infraestructuras muy complejas para trabajar con agentes peligrosos y exóticos
que poseen un riesgo individual alto de producir infecciones letales, transmitidas por aerosoles y
para las que actualmente no se cuenta con vacunas ni tratamiento.
·El acceso al laboratorio es controlado estrictamente.
·El laboratorio está aislado de otras áreas.
·Todas las actividades se restringen a los gabinetes de seguridad biológica.
CUIDADO NO CONFUNDIR EN EL EXAMEN: CLASIFICACION AGENTES INFECCIOSOS con los

niveles de bioseguridad. Están relacionados pero no son lo mismo.
Por ejemplo: si en el examen nos pregunta en que consiste el nivel de bioseguridad 2 pues se
utiliza cuando hay un riesgo potencial moderado de infección con ese microorganismo,siempre
por transmisión sanguínea y no por aerosoles.
De modo que está relacionado con la clasificación de los microorganismos tipo 2 pero no es lo
mismo ya que ene este caso hablamos de prevenciones que tomamos para no coger la infección.
Esquema de las salas que se usan en el nivel de bioseguridad 4 y en el 3 que éste último es
cuando trabajamos con agentes indígenas o exógenos,es decir, con microorganismos que no
están tipificados es decir, que no sabemos qué va a producir ese microorganismo. En el 4 es
cuando son muy peligrosos, exóticos, etc.
ESQUEMA. (4)

Hay 3 salas y se va pasando a distintas salas cada vez más aisladas:
·Sala tipo D: sala normal,contacto con el exterior. Ej: la clase sería una sala tipo D.
Entre una sala y otra, normalmente el personal se esteriliza con un lavado: lluvia con agua o
gases esterilizantes. De una sala a otra, el personal se va poniendo una ropa de protección.
Es decir, en la sala C ya te pondrías más ropa de protección que en la sala D porque no hay tanto
contacto con el exterior como en la sala D.
·Sala tipo C.
·Sala B: en esta sala estaríamos muy cubiertos, el personal usa trajes que cubren todo el cuerpo
tipo buzo.
·Ailslador A: con guantes y no acceso al aislador. No es una sala en sí sino que es un aislador en
el que nosotros no estamos en contacto con el microorganismo sino que nos ponemos unos
guantes y trabajamos desde los guantes. Nosotros no estamos dentro del aislador, no tenemos
acceso al aislador.
Cuando salimos hacia fuera, el personal se va quitando la ropa estéril que se ha ido poniendo
para protegerse.
CONTROL DE CALIDAD EN LA INDUSTRIA BIOFARMACÉUTICA
·Almacenamiento
·Recepción de materias primas/reactivos
·Muestreo
·Ensayos
·Especificaciones del producto
·Alicuoteado
·Validación de técnicas analíticas
Se controla desde el almacenamiento del material de partida hasta la validación de los ensayos.
El producto que va a al mercado se controla en los últimos lotes, haciendo un muestreo al azar en
ellos para verificar que no tiene particular microbianas, que no esta contaminado, que contiene
las unidades que dice. Se hace un recorrido y se revisa el producto a todos los efectos para
comprobar que lo que se pone en el mercado tiene ausencia de riesgos mayores o cero.
En todos los pasos ha de haber una persona responsable que garantice que se están haciendo
de forma adecuada.
CONTROL DE CALIDAD (definición)
Es la parte de las Normas de Correcta Fabricación que se refiere al muestreo, especificaciones y

ensayos, y a los procedimientos de organización, documentación y aprobación que garantizan la
ejecución real de los ensayos necesarios y pertinentes y por el que los materiales no quedan
aprobados para su uso ni los productos aprobados para su distribución y venta, hasta que su
calidad haya sido considerada satisfactoria.
TRAZABILIDAD EN LA ELABORACIÓN DE MEDICAMENTOS
La posibilidad de rastrear cada uno de los procesos o pasos que se van dando para la
produccion del producto final es en lo que consiste el control de calidad.
La trazabilidad en la elaboración de medicamentos es el conjunto de medidas, acciones y

procedimientos que permiten registrar e identificar un determinado producto desde su nacimiento
hasta su destino final.
NORMATIVA-MÉTODOS (leer)
Serie de Guías ISO 30-35.
Guía ISO-IEC 17025 sobre Sistema de Calidad en Laboratorios.
Serie de Informes Técnicos No. 800 (Anexo 4) de la Organización Mundial de la Salud.
Boletines de la Farmacopea Eurpea (Pharmaeuropa Bio).
Normativa Nacional.
Revistas Internacionales de la Editorial Elsevier.
EL RESPONSABLE DE CONTROL DE CALIDAD DEBE
·Aprobar o rechazar, según proceda, los materiales de partida, los materiales de

acondicionamiento y los productos intermedios, a granel y terminados;
·Evaluar los protocolos de cada lote;
·Garantizar que se realicen todas las pruebas de validación necesarias;

·Aprobar las especificaciones, instrucciones de muestreo, método de ensayo y demás

procedimientos de control de calidad;
·Aprobar y controlar los análisis por contrato;
·Garantizar que s realizan las validaciones necesarias;
·Se conservan suficiente muestras de referencia de los materiales de partida y de los productos
para posibilitar el futuro examen.
MATERIALES DE REFERENCIA EN LA INDUSTRIA BIOFARMACÉUTICA
·En la industria biofarmacéutica los MR aseguran la precisión y veracidad de los métodos de

medición utilizados para el control de calidad de sus producciones.
·La OMS publicó en 1978 las recomendaciones para la preparación, caracterización y

establecimiento de MRI biológicos.
·Según ISO el proceso para la fabricación de un MR consta de múltiples etapas.
FARMACOPEA
La farmacopea es el código de especificaciones que han de satisfacer los medicamentos y

sus materias primas. Constituye por tanto, un texto oficial de la máxima importancia para
garantizar la fabricación y circulación de medicamentos de buena calidad y proteger así la salud
de los consumidores.
REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA
Es un código que deberá respetarse para asegurar la uniformidad de la naturaleza, calidad,

composición y riqueza de las sustancias medicinales y excipientes.
La farmacopea incluirá monografías, exigencias mínimas de obligado cumplimiento, sobre:
1.Carácter de la sustancia medicinal.
2.Excipientes.
3.Métodos de ensayo y análisis.
4.Procedimientos de separación, esterilización, conservación y condicionamiento.
ESTÉRIL/ESTERILIDAD
Esterilidad es ausencia de microorganismos viables.
La esterilidad NO puede garantizarse por análisis, esto quiere decir que siempre cabe la
posibilidad de que quede algún resto de partícula que provengan del microorganismo.
La esterilidad es lo que nos importa del producto final que ponemos a la venta.
NORMAS DE CORRECTA FABRICACIÓN. PRINCIPIO: la fabricación de medicamentos estériles

debe seguir estrictamente los procesos de preparación.
ESTÉRIL/ESTERILIDAD
Libre de microorganismos vivos.
Libre de microorganismos viables.
Libre de contaminantes biológicos.
RAE. Libre de gérmenes patógenos.
Esterilidad: debe diferenciarse de otros métodos de destruir o eliminar microorganismos.

Desinfectado, sanitizado, pasteurizado, descontaminado no son sinónimos de estéril. El número
de técnicas capaces de cumplir los criterios de esterilidad sin afectar al producto son pocas.
TEST BIOLÓGICOS DE ESTERILIDAD 01/2008: 20601
La prueba se aplica a substancias, preparaciones o artículos que según la Farmacopea han de

ser estériles. El propósito de la prueba es proporcionar un control independiente para verificar
que un determinado producto satisface los requerimientos de la Farmacopea Europea.
Pero sí puede contener unas trazas mínimas de microorganismo que no genere daño en el
hospedador (esto para entender).
MÉTODOS ALTERNATIVOS CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLOGÍA.
1.detección crecimiento.
2.detección directa.
3.determinación componentes celulares.
4.caracteristicas genotipicas

Serie de pruebas que garantiza la ausencia de microorganismos o gérmenes o viables, pueden

estar allí pero pueden estar muertos o puede haber trazas del mismo en la producción pero
nunca puede quedar un microorganismo viable.
TEST BIOLÓGICOS (saber)
Medios de cultivo y temperatura de incubación:
·Tioglicolato: principalmente anaerobios a 30-35 grados.
·Caldo de sosa e hidrolizado caseína: si quiero buscar aerobios u hongos a 20-25 grados.
Esto depende de la base inicial del producto final.
La prueba debe realizarse en condiciones asépticas utilizando una cabina de flujo laminar clase A
situada en entorno B o en un aislador.
(ESQUEMA DIBUJO de clase antes)
AISLADORES
·Con presión negativa: aisladores para manejar material peligroso.
·Con presión positiva: aisladores que proporcionan un entorno controlado microbiológicamente

para realizar operaciones asépticas:
para preparar medicamentos en condiciones asépticas
para realizar pruebas de esterilidad
No quiero que haya contaminación ninguna con el operario para que nada del operario contamine
la terapia: presión necesaria es hacia fuera, es por tanto: negativas
Proteger al producto: presiones negativas
Proteger al individuo: presiones positivas
ENSAYO DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO DE MICROOGANISMOS
Ha de validarse la especificidad (ausencia de falsos positivos), sensibilidad (limite de detección) y

reproducibilidad.
Se realiza contaminado el producto deliberadamente con los siguientes microorganismos,

escogidos por posibilidad de contaminación y requerimientos de crecieminto, para garantizar que
sea cual sea la contaminación del producto final, este pudiese crecer y salir bien.
Se hace un abanico de microorganismos con+++ leer
CONTROL DE VIRUS EN MEDICAMENTOS
Virus presentes en:
Productos medicinales derivados de líneas celulares
Medicamentos de terapia celular
Vacunas víricas
DNA recombinante
Terapias génica (con retrovirus)
Anticuerpos
Interferón
Se hace una serie de ensayos para detectar si tengo una contaminación vírica.
FUENTES POTENCIALES DE CONTAMINACIÓN VÍRICA
·Material de partida. Línea celular.
Infección persistente (Herpesvirus) o endógenas (Retrovirus).
Sangre o plasma humano (VHB, VHC, VIH, Parvovirus)
·Adventicios (contaminantes): reactivos, excipientes biológicos contaminados, proceso de

producción (manipulación de cultivos, personal).
CONTROL DE VIRUS EN MEDICAMENTOS (cómo los detectamos)
·Método de detección de virus:
Cultivo de virus
Microscopía electrónica
Detección GENÓMICA
Detección de antígenos víricos por immunofluorescencia y enzimoinmunoensayo.
FIN PARTE MICROBIOLOGÍA— BIOTECNOLOGÍA.
EXAMEN 16 ENERO 2020.

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TEMA 13: CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN BIOTECNOLOGÍA

BIOTECNOLOGÍA: tecnología aplicada a la biología, es decir, la biología con un desarrolllo

Esta definición surge como mezcla de estas dos:

·Biotecnología clásica: empleo de organismos para la obtención de un producto útil para la

·Biotecnología moderna: es la que emplea las técnicas de ingeniería genética.

Los agentes biológicos son células microbianas, virus, animales, vegetales...

Los servicios son aquellos relacionados con industrias, biorremediación...

ÁREAS DE INTERÉS: APLICACIÓN DE MICROORGANISMOS Y SISTEMAS O PROCESOS

·Enzimas y biocatalizadores: elboración de alimentos, equipo de diagnóstico, quimioterapia,

·Ingeniería de procesos: filtración, extracción de productos...

·Interferones y anticuerpos monoclonales

·Fermentaciones tradicionales: alcohol, antibióticos...

AGRUPACIÓN POR COLORES SEGÚN LAS APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA

·BIOTECNOLOGÍA ROJA: relacionada con la medicina.

Obtención de vacunas y antibióticos, de nuevos fármacos.

Técnicas moleculares y de diagnóstico.

Las terapias regenerativas.

Terapia génica: cura enfermedades a través de la manipulación genética.

·BIOTECNOLOGÍA BLANCA: industrial.

Al diseño de procesos y productos.

Producción de productos químicos y textiles, biocombustibles, productos biodegradables..

·BIOTECNOLOGÍA VERDE: agrícola.

Creación de nuevas variedades de plantas resistentes.

La producción de biofertilizantes y biopesticidas y el cultivo in vitro y clonación de vegetales.

·BIOTECNOLOGÍA GRIS: del medio ambiente.

Mantenimiento de la biodiversidad y eliminación de contaminantes.

·BIOTECNOLOGÍA AZUL: marina y acuática.

2.MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN BIOTECNOLOGÍA

·Biotecnología clásica: hongos y bacterias.

·Biotecnología moderna: hongos, bacterias, virus, arqueas.

Dentro de los microorganismos procariotas: bacterias y arqueas (son de ambientes extremos).

Dentro de los microorganismos eucariotas: levaduras (hongos unicelulares) y mohos (hongos

CARACTERÍSTICAS QUE HACEN ATRACTIVOS A LOS MICROORG. EN BIOTECNOLOGÍA

·Crecen rápidamente: pequeño tamaño y alta relación superficie/volumen.

·La biodiversidad microbiana es gigantesca: fuente inagotable de productos variados.

·Presentan una gran variedad de metabolismo: pueden adaptarse a diferentes condiciones

·Fáciles de manipular: factorías de producción.

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CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS RELACIONADAS CON LA SÍNTESIS DEL

1.Producir la sustancia de interés.

2.Crecer rápidamente en un medio de cultivo barato.

3.Desarrollarse en cultivo puro y en gran escala.

4.Tener una ruta biosintética bien caracterizada.

5.Fabricar el producto en un período corto.

6.Tener requisitos de crecimiento que dificulten las contaminaciones.

7.Ser estable genéticamente pero susceptible de manipulación genética.

8.Facilidad para inocular en grandes fermentadores.

10.Posibilidad de retirar fácilmente las células del cultivo.

MICROORGANISMOS MODELO: ¿QUÉ SON?

Modelo: E.coli es el mejor conocido en el ámbito científico.

Su genoma fue secuenciado en 1997y es una enterobacteria: habitante de la microbiota

Levaduras. Modelo: Saccharomyces cerevisiae.

Eucariota más utilizado en ingeniería genética. Se conoce su pequeño genoma completo.

Sistemas de hospedador y vector muy establecidos. Mecanismos de expresión génica

Virus. Modelo de vectores: Adenovirus, Retrovirus, Lentivirus.

3.AISLAMIENTO DE NUEVOS MICROORGANISMOS DE USO BIOTECNOLÓGICO:

·Obtenerlos a partir de colecciones privadas o públicas de cultivo.

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE LA NATURALEZA