Autoclave Shearer modelo 150DC

Este modelo cumple la función de esterilizado y secado gracias a su diseño de doble cámara. Las dimensiones de las cámaras de esterilizado pueden
ajustarse a las necesidades del cliente. Las mismas son construidas en acero inoxidable 316L o cobre electrolítico de máxima pureza.

Este equipo presente válvula de alivio a contrapeso sobre tapa, para trabajar a 121ºC, 128ºC ó 134ºC (para otro valor de esterilización consultar). Posee
manómetro incorporado. Dos alternativas de calefacción: a gas o eléctrica, a elección.

Principales características:

Permite la esterilización por vapor saturado.

Construido con cámaras cilíndricas de cobre o acero inoxidable 316L.
Camisa externa de hierro esmaltado pintado o acero inoxidable.
Doble válvula de alivio a contrapeso.
Manómetro indicador de presión en cámara exterior.
Manómetro indicador de presión y vacío en cámara de esterilización.
Llave esférica de alta temperatura con asiento de teflón.
Trampa de vacío para etapa de secado o bomba de vacío de doble anillo líquido.
Termostato regulador de temperatura del generador de vapor.
Tubo nivel visor, permite visualizar nivel de agua del generador de vapor.
Permite efectuar esterilización sucesivas, sin agregar agua.
 calefacción a gas o eléctrica.

Capacidades disponibles

Medidas internas                          Capacidad en litros

      40 x 60 cm                                             75
      50 x 70 cm                                            135
      60 x 80 cm                                            226

CRIPTOCOCOSIS: DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO Y ESTUDIO DE LA
 SENSIBILIDAD IN VITRO
Estrella Martín-Mazuelos, Anastasio Valverde-Conde
Servicio de Microbiología. Hospital Universitario de Valme. Sevilla

La criptococosis es una micosis sistémica producida por un hongo levaduriforme

encapsulado denominado Cryptococcus neoformans, descubierto hace
aproximadamente cien años por Sanfelice, quien aisló originalmente el microorganismo
de un jugo de melocotón. Es una enfermedad de distribución universal que adquiere
protagonismo con la aparición de la epidemia del sida. Antes era rara y afectaba a
pacientes con alguna enfermedad de base que producía una alteración de la inmunidad
celular (neoplasias, lupus eritematoso sistémico, transplantes de órgano sólido o médula
ósea, tratamiento con corticoides u otra medicación inmunosupresora, diabetes,
sarcoidosis, etc.). Por el contrario, en los pacientes con sida, es la micosis sistémica más
frecuente. Entre el 80-90% de los casos de criptococosis están descritos en este grupo,
aunque la incidencia es variable, según la zona. En EEUU, Europa y Australia se
observa en un 5-10% de los pacientes, mientras que en Sudamérica y África estos
porcentajes aumentan al 10-30%.

Está claro, pues, que el sida es el grupo de riesgo más importante, seguido de los
transplantes. Aunque se conozcan otros múltiples factores de riesgo, se sabe que en más
de la mitad de los casos de criptococosis producidos en otros grupos de pacientes
distintos a los señalados anteriormente, no es posible establecer cuál es el
desencadenante último. Así, la criptococosis es más frecuente en los hombres que en las
mujeres, hecho relacionado tal vez con la mayor exposición de los hombres a este
microorganismo.

ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS, EPIDEMIOLOGÍA Y

MANIFESTACIONES CLÍNICAS

El género Cryptococcus incluye muchas especies, de las que solo C. neoformans se

considera patógeno humano, aunque existen referencias en la literatura de otras especies
(Cryptococcus laurentii y Cryptococcus albidus) que han producido enfermedad en
humanos, especialmente en los inmunodeprimidos.

Los criptococos son levaduras redondas u ovales (3,5-8 µm), que se reproducen por
gemación única, con un cuello estrecho entre la célula madre y la hija.
Excepcionalmente se observa gemación múltiple, formas alargadas y pseudohifas.
Poseen una cápsula de naturaleza polisacaroídica que le confiere virulencia, protegiendo
al hongo de la fagocitosis, y cuyo tamaño varía dependiendo de la cepa y del medio de
cultivo que se utilice para aislar la levadura. Se puede observar por examen en fresco
con tinta china, tinción negativa que tiñe toda la preparación excepto la cápsula.

Crece muy bien en todos los medios de cultivo formando colonias mucosas, aunque con
el tiempo pueden aparecer secas; el color es muy variable (crema, ocre, rosa, amarillo),
virando a tonos más oscuros con la edad. Las cepas que poseen un cápsula muy
pequeña, forman colonias similares a las del género Candida. Tienen metabolismo
aerobio, por lo que no son fermentadoras, producen ureasa y utilizan varios hidratos de
carbono. Las distintas especies de criptococos se diferencian entre sí por una serie de
características: crecimiento a 37º C, asimilación de la sacarosa, lactosa, galactosa,
melobiosa, celobiosa, rafinosa, trealosa y dulcitol, utilización de KNO3 y producción de
ureasa y fenil-oxidasa.

Dentro de C. neoformans, según la composición de la cápsula, se han descrito al menos

cuatro serotipos distintos, denominados A, B, C y D. Los serotipos A y D se identifican
como C. neoformans var. neoformans y los B y C como C. neoformans var. gattii.
Existen diferencias entre las dos variedades, tanto desde el punto de vista patogénico
como de distribución geográfica, de tal forma que C. neoformans var. neoformans se ha
relacionado con la infección en los pacientes inmunodeprimidos, siendo de distribución
mundial, mientras que el C. neoformans var. gattii se ha descrito en infecciones de
pacientes inmunocompetentes y su distribución está más restringida a países tropicales y
subtropicales. También se diferenciaban estas variedades por sus características
bioquímicas: los tipos B y C, asimilan los ácidos 1-málico, fumárico y succínico,
producen pigmento sobre agar niger, de color verde, y sobre agar con L-cavanina-
glicina-azul de bromotimol, y asimilan la glicina como única fuente de carbono. Los
serotipos A y D, por el contrario, no presentan estas reacciones. Existen también
diferencias genéticas por hibridación del DNA. La distribución en la naturaleza es
asimismo diferente: los tipos A y D se asocian con las deyecciones de palomas y otros
pájaros, mientras que los otros dos tipos C se han encontrado en distintas especies de
eucaliptos (Eucaliptus calmadulensis, Eucaliptus rudis, etc.) y en los koalas de
Australia.

En nuestro país se han aislado los serotipos A y D y A/D de pacientes humanos, siendo
el más predominante el A. El serotipo B sólo se ha aislado en animales y en muestras
ambientales. No se ha encontrado ninguna cepa del serotipo C en nuestro medio.

A pesar de que las heces de paloma son la fuente más importante de infección, estos
animales no padecen la enfermedad y la adquisición en el hombre es por vía
respiratoria. No se han descrito casos de transmisión aérea persona a persona, pero sí a
través de los órganos transplantados. Tampoco se conocen casos de transmisión directa
de los animales al hombre.

La infección se adquiere por inhalación de las levaduras desecadas (<3 µm) existentes
en la naturaleza. La patogenicidad viene determinada por la cápsula que impide la
fagocitosis y la actuación del complemento y por la enzima fenil-oxidasa que contribuye
al especial neurotropismo del hongo. Cuando el criptococo llega a los alveolos
pulmonares se desencadena una respuesta de la inmunidad celular y humoral del
huésped, que en condiciones normales es suficiente para controlar la infección. Según
los modelos experimentales, la resistencia a la infección parece que depende de la
activación de los macrófagos y neutrófilos por los linfocitos más sensibilizados, siendo
además necesaria una buena respuesta humoral con anticuerpos opsonizantes. Debido a
que los pacientes más susceptibles a la infección por este hongo presentan una
alteración de la inmunidad celular o humoral, el microorganismo no es eliminado por
los mecanismos de defensa apropiados cuando penetra en las vías respiratorias. Así,
progresa hacia el pulmón y se disemina por vía hematógena hasta el sistema nervioso
central (SNC), siendo ésta la localización más frecuente, produciendo cuadros de
meningitis o meningoencefalitis. Las manifestaciones clínicas variarán en función del
tipo de enfermo. La aparición de la enfermedad suele ser aguda en pacientes con sida,
en tratamiento con corticoides o que sufren neoplasias hematológicas, mientras que en
los restantes suele presentarse de una forma más crónica. La mayoría de los pacientes
presenta signos inespecíficos de fiebre, malestar general y cefalea. Los hallazgos físicos
tampoco aportan mucho, porque los signos meníngeos son poco frecuentes, al igual que
los signos neurológicos focales o las convulsiones. Es importante que el médico
mantenga una alta sospecha de esta enfermedad para poder así llegar al diagnóstico.

Respecto a la localización pulmonar, en los pacientes no inmunodeprimidos la

afectación puede progresar, regresar espontáneamente o permanecer estable durante
largos períodos de tiempo, siendo raro que haya síntomas. Suele aparecer sola, aunque
puede coexistir con otras manifestaciones extrapulmonares. En los pacientes
inmunodeprimidos, la afectación puede ser desde asintomática a grave. Sólo el 5-25%
de los enfermos de sida presenta tos y disnea, y en pocas ocasiones existe dolor pleural
y alteraciones radiológicas. La mortalidad puede llegar al 42% en este tipo de paciente.

La afectación cutánea, que aparece en el 10% de pacientes de sida con criptococosis

diseminada, especialmente en el cuello y la cabeza, pueden producir lesiones similares a
las producidas por el virus del molluscum contagiosum. Se han descrito casos de
endocarditis, endoftalmitis, pielonefritis, artritis, osteomielitis, afectación ganglionar y
prostatitis. Se ha demostrado que la próstata puede ser un reservorio de C. neoformans y
constituir la causa de las recidivas en pacientes aparentemente tratados con éxito con
anfotericina B. Menos del 10% de los enfermos con sida presenta fungemias aisladas y,
en ocasiones, hay pacientes con todos los cultivos negativos y la detección de antígeno
criptocócico positiva. En raras ocasiones, ciertas lesiones extraneurales pueden estar
originadas por la inoculación directa de esta levadura, incluyendo la linfadenitis
esporotricoidea, la queratitis o la peritonitis relacionada con la diálisis peritoneal.

DIAGNÓSTICO

El diagnóstico clínico es difícil, ya que las formas de presentación son

inespecíficas, al igual que las pruebas analíticas habituales, por lo que el
diagnóstico definitivo va a ser el microbiológico. Esto es especialmente cierto
en los casos de meningitis que se producen en los pacientes con sida, en los
que el líquido cefalorraquídeo (LCR) no suele mostrar alteraciones o, caso de
estar presentes, éstas son mínimas. Debe seleccionarse la muestra adecuada
(LCR, sangre, secreciones del tracto respiratorio, piel, etc.), según el foco de
infección.

Tinciones

 Tinción negativa o tinción de tinta china, que tiñe toda la preparación excepto la
cápsula y permite hacer un diagnóstico presuntivo de criptococosis. Se realiza a
partir del sedimento del LCR, orina u otras muestras líquidas, tras
centrifugación, colocando en un portaobjetos una gota de sedimento y otra de
tinta china comercial; se le pone un cubreobjetos y se observa al microscopio
con un objetivo seco. La preparación estará bien hecha si se puede leer a través
de ella. Hay que examinar el porta completo. La sensibilidad de la tinción oscila
entre el 25-50% en los casos de meningitis, aunque en los pacientes con sida
puede ser mayor. Pueden producirse falsos resultados positivos en presencia de
levaduras de los géneros Rhodotorula y Candida, de otras especies de
criptococos, Klebsiella pneumoniae, así como por artefactos. Es importante
 diferenciar bien la célula con doble pared refringente, con su cápsula, y hay que
buscar células en fase de gemación. La técnica requiere personal entrenado y
siempre hay que confirmar este diagnóstico inicial con el cultivo.

 Tinción de la cápsula con mucicarmin de Mayer que colorea la cápsula de rojo

rosáceo.

 Otras tinciones usadas en histopatología, como la de la metenamina-plata o la

del ácido peryódico de Schiff (PAS), que permiten identificar el C. neoformans
por el tamaño y la gemación con base estrecha.

Cultivo e identificación

Establece el diagnóstico definitivo. Se realiza a partir del sedimento del LCR en el caso
de meningitis, y a partir de otras muestras en otro tipo de infecciones. El medio de
cultivo más habitual es el agar Sabouraud sin cicloheximida, en el que crece la levadura
al cabo de 48-72 h de incubación, presentando las características macroscópicas ya
referidas.

En el caso de una criptococemia, que se produce especialmente en pacientes con sida, el

hemocultivo es el método mejor para el diagnóstico, aún a sabiendas de que el 50% de
los casos quedan sin diagnosticar. De todos los sistemas, el de la lisis-centrifugación, se
consideraba hasta hace poco como la técnica de elección para el diagnóstico de las
fungemias. Sin embargo, según datos recientes, no parece que este método ofrezca
grandes ventajas en cuanto a sensibilidad respecto a los hemocultivos habituales.

La identificación se puede hacer por los métodos convencionales de asimilación y

fermentación de azúcares, que requieren hasta 14 días de incubación. Alternativamente
pueden utilizarse sistemas comerciales automáticos o semiautomáticos que, en tan solo
24-48 h, identifican la mayor parte de las levaduras patógenas. Entre estos últimos,
señalamos el Microscan Yeast Identification Panel (Microscan-Dade), Vitek AMS-Yeast
Biochemical Card (bioMérieux), RapID Yeast Plus (Innovative Diagnostic System), etc.

Detección del antígeno capsular

Entre las técnicas basadas en la detección de componentes fúngicos, está la detección

del antígeno capsular del C. neoformans por una técnica de látex, que es útil en las
muestras de suero, LCR, orina e incluso en muestras respiratorias. Es una prueba que
tiene alta sensibilidad y especificidad y está comercializada, pero hay que ser cautos en
su interpretación. Se han descrito resultados falsos positivos debidos a la presencia de
factor reumatoide, Trychophyton beigelii, Capnocytophaga canimorsus, y en el suero de
enfermos con septicemia o neoplasias. Las placas donde se realiza la prueba deben estar
libres de restos de desinfectantes y detergentes. También se conocen falsos negativos, a
veces por el fenómeno de prozona, que se puede corregir diluyendo la muestra o
tratándola con pronasa. La sensibilidad es superior al 90%; en los pacientes con sida es
incluso mayor. Sin embargo, en este tipo de enfermos, se han descrito cepas de C.
neoformans con poca cápsula en los que la concentración de antígeno puede ser
anormalmente baja. La cuantificación del antígeno del C. neoformans es útil para
controlar la evolución de la enfermedad, ya que el título desciende si la respuesta
terapéutica es buena y aumenta días antes de que se produzca una recaída,
especialmente en el LCR.

Diagnóstico molecular

Es una alternativa válida para el diagnóstico de las infecciones fúngicas, especialmente

para aquellas cuyo diagnóstico es difícil con las técnicas convencionales. En el caso de
la criptococosis ya se han mencionado las limitaciones de las técnicas de detección de
antígeno. El cultivo sobre agar Sabouraud dextrosa sin cicloheximida se considera el
método de referencia, aunque requiere al menos 3-4 días de incubación. Las técnicas de
biología molecular podrían obviar algunos de estos inconvenientes y, en este sentido,
hay algunos estudios recientes que refieren una buena sensibilidad y especificidad en
muestras pulmonares y de LCR. Queda aún mucho camino por andar para que estas
técnicas puedan ser utilizadas como métodos habituales en un laboratorio de Micología.

ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIFÚNGICOS

El incremento de las infecciones fúngicas en los últimos años, unido al aumento de la

mortalidad y morbilidad de estas infecciones, así como a la aparición de nuevas especies
patógenas, ha contribuido al uso más generalizado de los antifúngicos. La aparición de
resistencias asociadas a fallos terapéuticos ha hecho necesaria la búsqueda de nuevos
compuestos. Todas estas circunstancias han conducido a que cada vez sea más
importante realizar estudios de sensibilidadin vitro que permitan predecir el resultado
terapéutico. A su vez, el disponer de estas pruebas podrá ser útil para la investigación de
nuevas drogas y para llevar a cabo estudios epidemiológicos.

Los primeros intentos datan del año 1981, cuando micólogos franceses intentan
introducir técnicas similares a las que se utilizaban para las bacterias. Estos estudios
fracasaron. Un año después, el NCCLS creó un subcomité para estudiar los
antifúngicos, pero no se consiguen resultados de estandarización aceptables hasta 1997,
con la publicación del documento NCCLS M27-A. Dicho documento normaliza las
técnicas de macro y microdilución estableciendo puntos de corte para el fluconazol y el
itraconazol en la candidiasis orofaríngea, y para el fluconazol en las candidemias
producidas en pacientes no neutropénicos. También establece puntos de corte para la 5-
fluorocitosina. Por lo que respecta a la anfotericina B, no consigue establecer criterios
firmes, ya que influyen mucho los factores del huésped. Sin embargo, se sabe que
valores de CMI >= 0,8 µg/ml suelen asociarse con fallo clínico.

Respecto al C. neoformans, este documento establece algunas normas:

 Como medio de cultivo, recomienda usar el Yeast Nitrogen Base (YNB) a pH 7,

en lugar del RPMI 1640, debido a la dificultad de crecimiento en este último.
Otros autores recomiendan el mismo medio a pH 5,4.
 Propone usar un inóculo de 104 ufc/ml, en lugar de 0,5-2,5 x 103 ufc/ml.

 La lectura debe realizarse a las 48 h y a 492 nm, con espectrofotómetro.

 Para la detección de las cepas de C. neoformans resistentes a la anfotericina B,

se recomienda el uso del Antibiotic medium nº 3" (AM3), a pH 7, de forma
similar a lo propuesto para el género Candida, aunque existen menos datos al
 respecto. Hay pocos casos descritos de cepas de C. neoformans resistentes a la
anfotericina B, siempre relacionados con un tratamiento previo con esta droga en
pacientes con sida y meningitis. A pesar de todo, la interpretación de los
resultados in vitro está aún por definir.

ALTERNATIVAS AL MÉTODO M27-A DEL NCCLS

Aunque este documento constituye el término de referencia, y es lo más aproximado a

una estandarización, no es útil para ensayar todas las especies de hongos con todos los
antifúngicos. Tampoco es el método ideal para introducir en la práctica habitual de un
laboratorio clínico. Por ello se han buscado distintas alternativas, como las siguientes:

 Métodos cualitativos (difusión en agar). La utilidad de estos métodos para

estudiar los antifúngicos ha estado limitada por la dificultad de difusión de la
mayoría de estos compuestos y por la falta de correlación entre los halos de
inhibición y la respuesta clínica. La excepción son las drogas más hidrosolubles,
como el fluconazol y la 5-fluorocitosina. Así, los halos obtenidos con los discos
de fluconazol de 25 y 50 µg en distintos medios (High Resolution Medium,
Yeast Nitrogen Base, RPMI 1640 con o sin glucosa), se correlacionan bien con
sus respectivos valores de CMI obtenidos por el método de referencia del
NCCLS. En algunos casos, sin embargo, estos métodos no diferencian bien entre
las categorías "Dependiente según dosis" y "Resistente".

 Métodos cuantitativos:

E-test® : Es un método cuantitativo de difusión en agar comercializado (AB

Biodisk), basado en gradientes de concentración. La correlación con el método
del NCCLS es variable (60-100%), según los distinto estudios, y depende de
varios factores. Así, es importante el medio de cultivo, siendo mejor la casitona
y el RPMI 1640 con un 2% de glucosa que el medio RPMI sin glucosa. La
relación entre las distintas levaduras y los diferentes antifúngicos también es un
factor a tener en cuenta. Por ejemplo, no hay buena correlación para C.
neoformans y la anfotericina B. Una tercera variable es el tiempo de incubación,
por lo general mejor si se lee a las 24 h que a las 48 h. Por último, la lectura con
los derivados azólicos puede ser más problemática por la aparición de un doble
halo. En nuestra experiencia, la correlación fue buena con el fluconazol y la 5-
fluorocitosina, pero no con el itraconazol.
Método colorimétrico: Es un método comercial (Sensititre YeastOne) basado
en la técnica de microdilución del NCCLS, con un indicador de crecimiento
(azul Alamar) que nos permite una lectura más objetiva mediante un cambio de
color de éste. La correlación es también variable (43-100%), según los estudios
y las parejas levadura/antifúngico. De nuevo, las lecturas de los azoles siguen
siendo las más dificultosas. Por lo que se refiere a C. neoformans se han
obtenido valores del 94%, incluso superiores para el itraconazol y el
fluconoazol. La lectura de la CMI a las 24 h suele mostrar mejor correlación con
la evolución clínica, excepto para la anfotericina B, en donde se aconseja
efectuar la lectura a las 48 h.

 Otros métodos: una de las alternativas es el método de dilución en agar Yeast

Morphology con distintas concentraciones de fluconazol (desde 0,125 a 256
 µg/ml), inoculadas con una suspensión de C. neoformans. Se incuba a 35ºC y se
lee a las 72 h. La CMI corresponde a la concentración donde se observa una
disminución considerable del tamaño de las colonias. Algunos autores han
observado una buena correlación con el método de referencia del NCCLS, de tal
forma que se podría utilizar como método de cribado alternativo para el
fluconazol. Además, es un método barato, que puede simplicarse más aún
utilizando tres placas con 1, 8 y 32 µg/ml del antifúngico.

Se ha intentado introducir métodos con posibilidad de automatización, aunque sean más

complejos. Así, un método fotométrico, basado en la cuantificación de células fúngicas
mediante la reducción de un sustrato (3-4,5 dimetil 2-tiazol 2,5-difenil 2H bromuro
tetrazolio), efectuando la lectura a las 24 h. En un estudio, se obtuvo una correlación del
94% con el método de referencia NCCLS.

Respecto a la correlación in vivo de los datos in vitro, hay pocas referencias en la

literatura. Por lo que se refiere a C. neoformans y fluconazol, en el trabajo de Witt et al,
observan que la probabilidad de un fallo terapéutico en casos de meningitis criptocócica
era mayor del 80% cuando la CMI era >= 16 µg/ml, siempre que los hemocultivos y los
urocultivos fuesen positivos, los títulos de antígeno en suero y LCR fuesen altos y los
pacientes no estuvieran recibiendo 5-fluorocitosina como antifúngico adicional. Sin
embargo, en un estudio realizado por nosotros, se observaba una correlación del 100%
entre el fallo del tratamiento y valores de CMI >= 16 µg/ml, con independencia de otros
condicionantes. De otro estudio, parece desprenderse que la correlación in vitro e in
vivo es mayor si la lectura de los valores de la CMI se hace a las 48 h en vez de 72 h.

Por lo que se refiere a la anfotericina B, hay pocos estudios al respecto, al igual que lo
que ocurre con el género Candida. Aún a pesar de las limitaciones del método NCCLS
(M27-A), parece que la resistencia clínica está relacionada con valores de CMI >= 0,8
µg/ml. También se ha introducido el medio Antibiotico nº 3 para C neoformans. No hay
datos de correlación con el itraconazol ni con la 5-fluorocitosina.

RESISTENCIA A LOS ANTIFÚNGICOS

No se han descrito casos de resistencia primaria a la anfotericina B en las cepas de C.

neoformans, aunque sí algún caso aislado de resistencia secundaria tras el tratamiento
previo con este antifúngico en pacientes de sida y con meningitis. La resistencia
primaria de C. neoformans a la 5-fluorocitosina es rara (1-4%), no así la secundaria,
especialmente cuando se usa como único fármaco. Por ello se recomienda usarla
asociada a la anfotericina B o al fluconazol. Para este último, la resistencia primaria es
asimismo rara, aunque se hayan descrito casos de resistencia secundaria relacionados
con la administración previa de este fármaco, ya sea con fines profilácticos o como
tratamiento de mantenimiento en los pacientes con sida.

BIBLIOGRAFÍA

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for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast: Approved Standard. NCCLS
document M27-A, Vilanova, 1997.
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En: Murray PR,. Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds). Manual of
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Witt MD, Lewis RJ, Larsen RA, Milefchik EN, Leal MA, Haubrich RH, Richie JA,
Edwards JE, Ghannoum MA. Identification of patients with acute AIDS-associated
meningitis who can be effectively treated with fluconazole: the role of antifungal
susceptib
“DETERMINACIÓN DE CRECIMIENTO DE
MICROORGANISMOS”
OBJETIVO GENERAL:
CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI Y DE LA LEVADURA
CANDIDA.
OBJETIVO ESPECIFICO:
 CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI (UFC) EN CALDO NUTRITIVO
MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETT) CADA 2 HORAS
DURANTE 24 HORAS.
 CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA (COLONIAS) INOCULADO
EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO
KLETTS) CADA 12 HORAS DURANTE 96 HORAS.
 CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI EMPLEANDO LA TECNICA DE
VACIADO EN CAJAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (72 HORAS DESPUES DE SU
INOCULACION) MEDIANTE EL RECUENTO DE UFC.. -
 CUANTIFICAR EL NUMERO DE CELULAS DE LA LEVADURA CANDIDA POR UN
RECUENTO DIRECTO (CON DILUCIONES) EMPLEANDO LA CAMARA DE NEUBAUER.
 CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA MEDIANTE DIFERENCIAS D

INTRODUCCION

Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de tamaño y con el

tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado una población de células vegetativas
no diferenciadas.

La Escherichia coli es una bacteria gram (-) que se encuentra generalmente en los intestinos animales y en
aguas negras. es anaeróbico facultativo; móvil por flagelos perítricos (que rodean su cuerpo); no forma esporas;
se puede inocular en Agar y caldo nutritivo(por poseer todo tipo de nutrientes son excelentes para su uso),Agar
E.M.B, Agar McConkey, etc.; es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa ;y su prueba de IMVIC es ++--.

Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biotecnología molecular porque es

ampliamente conocida su organización, estructura y función. Además, se han modificado E. coli para ser usada
en laboratorio sin riesgos patogénicos. Generalmente las bacterias se reproducen por fisión binaria.

Las levaduras en general son células esféricas a elípticas cuyo diámetro varía de 3-15µm. Si bien unas pocas
levaduras se reproducen por fisión binaria la mayoría se reproduce por brotación o blastoconidios. Después de
la proliferación en un medio con agar durante 1-3 días las levaduras producen colonias pálidas y opacas y en
general alcanzan un diámetro de 0.5 a 3 mm.
Las especies del género Cándida producen levaduras elipsoides o esféricas con brotes que miden alrededor de 3
a 6 µm. De manera habitual se forman múltiples brotes y pseudohifas en medios deficientes de sustratos
fácilmente metabolizables.

Los medios para el recuento de levaduras son:

• Medio sabouraud

• Oxiteclicina, glucosa, agar (O.G.A)

• MEDIO DE PATATA, GLUCOSA AGAR (P.D.A)

• Extracto de levadura, glucosa y agar

• Medio de jugo de uva (para enología) o medio mosto de cerveza ( para cervecerí

INTRODUCCION

Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de tamaño y con el

tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado una población de células vegetativas
no diferenciadas.

La Escherichia coli es una bacteria gram (-) que se encuentra generalmente en los intestinos animales y en
aguas negras. es anaeróbico facultativo; móvil por flagelos perítricos (que rodean su cuerpo); no forma esporas;
se puede inocular en Agar y caldo nutritivo(por poseer todo tipo de nutrientes son excelentes para su uso),Agar
E.M.B, Agar McConkey, etc.; es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa ;y su prueba de IMVIC es ++--.

Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biotecnología molecular porque es

ampliamente conocida su organización, estructura y función. Además, se han modificado E. coli para ser usada
en laboratorio sin riesgos patogénicos. Generalmente las bacterias se reproducen por fisión binaria.

Las levaduras en general son células esféricas a elípticas cuyo diámetro varía de 3-15µm. Si bien unas pocas
levaduras se reproducen por fisión binaria la mayoría se reproduce por brotación o blastoconidios. Después de
la proliferación en un medio con agar durante 1-3 días las levaduras producen colonias pálidas y opacas y en
general alcanzan un diámetro de 0.5 a 3 mm.

Las especies del género Cándida producen levaduras elipsoides o esféricas con brotes que miden alrededor de 3
a 6 µm. De manera habitual se forman múltiples brotes y pseudohifas en medios deficientes de sustratos
fácilmente metabolizables.

Los medios para el recuento de levaduras son:

• Medio sabouraud

• Oxiteclicina, glucosa, agar (O.G.A)

• MEDIO DE PATATA, GLUCOSA AGAR (P.D.A)

• Extracto de levadura, glucosa y agar

• Medio de jugo de uva (para enología) o medio mosto de cerveza ( para cervecería)

Estos medios se hacen selectivos frente a numerosas bacterias por la acidificación a pH

4-3.5.
Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano:
Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero que

pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc.).Ello es posible porque
durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la
velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de
estos parámetros. Entre los métodos indirectos se encuentran:

Θ Determinación del peso seco (bacterias y levaduras). Se trata de medir la masa celular

presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta. Este método, aunque lleva tiempo, es útil
como referencia en el trabajo de aislamiento y purificación de otros métodos.

Θ Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteico del cultivo.

Θ Determinación del DNA

Θ Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo:

consumo de oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la
concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material radiactivo, etc.

Θ Medida de la turbidez del cultivo (bacterias y levaduras). Se basa en la capacidad de las

células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece
turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es proporcional al número de
células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro.

El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no
dispersada, es el método mas difundido para la estimación de la biomasa total en suspensión.

Las técnicas turbidimétricas son totalmente útiles para determinar tanto la masa de células durante el
desarrollo, como para evaluar los efectos antimicrobianos en bacterias.

Una aplicación directa de turbidimetría es la realización de una curva patrón en la que se relaciona la medida de
la absorbancia con el número de células viables del cultivo. Simultáneamente a las medidas de absorbancia se
realizan recuentos en placa (bacterias).

Frecuentemente las muestras naturales tienen un numero muy elevado de microorganismos (bacterias), por lo
que se requiere diluirlas de forma seriadas que posteriormente se siembra en placas con el medio de cultivo
adecuados. Esta técnica de recuento por diluciones seriadas nos permite conocer el número de
microorganismos viables en una determinada muestra.

La inoculación de la placa con la muestra que contiene los microorganismos pueden realizarse: a) directamente
sobre el medio ya solidificado en la placa (método de extensión sobre placa); b) mezclándolo previamente con
el medio fundido y temperado, para verterlo después sobre la caja petri vacía (método en vertido en placa o
siembra en profundidad). Es el método más habitual para la determinación de células viables se basa en contar
el número de colonias UFC.

La viabilidad en microbiología se define como la capacidad del microorganismo para dividirse y dar lugar a
una descendencia. El método más habitual para la determinación de células viables se basa en contar el número
de colonias UFC.

Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen
conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos:
Θ Recuento directo del nº de células al microscopio(levaduras). Se utilizan portas

especialmente diseñados para el recuento celular y son denominados cámaras de recuento en donde un volumen
conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitómetros, cámaras de
Petroff-Hauser, Neubauer o de Helber) estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan
el recuento por unidad de superficie y de volumen. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia
entre células viables y no viables. Es poco preciso.

Θ Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa
Lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica permiten medir la distribución
de tamaños y el número de células en las suspensiones bacterianas pero son muy costosos.

Cuando en un medio adecuado se inocula con bacterias o levaduras y se toman muestras pequeñas a intervalos
regulares, la representación grafica de los datos dará una curva de crecimiento característico.

La curva de crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases: fase de latencia, fase del
crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de declinación.
Θ Fase de latencia: durante esta fase hay un aumento de los componentes
macromoleculares, de la actividad metabólica y de la susceptibilidad a los agentes
químicos y físicos.
Θ Fase de crecimiento exponencial: en esta fase las células se encuentran es un estado

equilibrado .Durante este periodo la masa ye l volumen de las células aumentan por el mismo factor y de tal
manera que la composición promedio de las células y las concentraciones relativas de los metabolitos se
mantienen constantes.

Θ Fase estacionaria: en esta fase hay productos de desecho, agotamiento de nutrientes,

la variación del pH y otros factores que ejercen un efecto nocivo sobre el cultivo, lo
que produce una disminución de la velocidad de crecimiento.
Θ Fase de muerte celular. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se

originan debido al agotamiento total de la nutriente y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. A
veces la muerte va acompañada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo.

MARCO TEORICO

El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células, es decir, se refiere al crecimiento

de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división
celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como:

1. El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas E. Coli tiene un ciclo de
vida de 15-20 minutos por que en una población joven el número de bacterias muertas es
mínimo.
2. La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio

mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de
la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa
(Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal).Por ejemplo el crecimiento de las bacterias sobre un
medio de cultivo liquido es claramente exponencial.

3. Las condiciones de incubación. La temperatura de incubación, la concentración de CO2 en

la atmósfera de cultivo, la agitación, etc. son factores importantes. Por ejemplo para las bacterias patógenas el
óptimo de crecimiento se consigue a los 37ºC y para las levaduras y otros hogos, a 25ºC.

4. La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará dependiendo

de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase
un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.
En general, los hongos se desarrollan mejor a la temperatura de la habitación (20 a 25ºC) o a 37ºC,
comúnmente en un medio de pH 5.5 a 6.5. La mayoría de los hongos son aerobios. Para el aislamiento se usa
con más frecuencia el medio de ensayo o de conservación de Sabouraud y el medio de Pensilvania.

En la mayor parte de los medios de especies del género Cándida no pueden identificarse sobre la base del
aspecto de sus colonias. En 24 – 48 horas producen colonias sobreelevadas, de color crema y opacas, a
aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro. Después de varios días en un medio con agar es posible observar
hifas que penetran en el agar.

El proceso de crecimiento del microorganismo (levadura) se desarrollara en condiciones asépticas y a

temperatura ambiente, la homogenización y aire reacción del medio de cultivo se realizara en forma manual
cada doce horas por 7 días. El medio de caldo de maltosa Sabouraud esta especificado para el desarrollo de
levaduras, mohos y bacterias así como la investigación en las pruebas de esterilidad. En este medio de
crecimiento de mohos se parece a esferas de algodón más o menos grande. Se modifican y adoptan la forma de
capas membranosas mientras que el crecimiento de levaduras o bacterias se manifiesta por turbidez homogénea
que se reconoce por investigación microscópica.

En contraste, las bacterias se reproducen por fisión binaria a un ritmo máximo promedio de
cada 20 min, pero este ritmo se mantiene solo por un corto periodo.
 METODOLOGIA
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO (E. Coli)

1.- Preparación del medio de cultivo; Caldo nutritivo (150 ml, 3 matraces nefelométricos con 50 ml) y agar
nutritivo para la técnica de vaciado en cajas (por duplicado).

2.- Toma de muestra de una cepa pura cultivada en el cepario del laboratorio de
microbiología del ITTG.
3.- Inoculación

Matraz 1: Colocar 2 ml de la muestra (cepa pura) en un matraz nefelométrico que contiene 50 ml de caldo
nutritivo, previamente esterilizado. Poner en agitación el matraz una vez inoculado a 110 revoluciones
/minuto. Hacer lecturas en el turbidímetro Klett cada 2 horas.

Matraz 2: Inocular 2 ml de muestra a un matraz con 50 ml de caldo nutritivo estéril, agitar y posteriormente
hacer diluciones 1:9 para inocular en cajas petri, con la técnica de vaciado por duplicado. Cada dos horas
tomar las lecturas de densidad óptica (Klett), hacer las diluciones y la inoculación en cajas para estudiar
su crecimiento.
Para comprobar el efecto antimicrobiano de un producto comercial y estudiando el crecimiento de la
bacteria. Utilizamos el jabón “Escudo”. Colocando en dos cajas petri una pequeña proporción de solución
del jabón preparada con agua, sobre determinadas áreas y en estas inocular por la técnica de estría masiva.

Matraz 3: Blanco, servirá de referencia para verificar el crecimiento (turbidez) de la

bacteria comparándolo con éste

LEVADURA
1.- Preparación del medio de cultivo: Caldo YM para el cultivo de la levadura
Cándida. Preparar matraces con 50 ml de caldo YM. Esterilizar.
2.- Inoculación:

Tomar 2 ml de muestra, inocular en un matraz nefelométrico con caldo estéril, agitar y leer su contenido
de células en la cámara de Neubauer. Posteriormente filtrar el contenido del matraz con ayuda de una
bomba de vacío, el papel filtro debe estar a peso constante, para determinar su biomasa.

…………………………………………………………………………………………………..Filtración:

Para determinar su biomasa: diferencia de pesos.

P1 = peso del papel filtro a peso constante.
P2= peso del papel con la muestra (levadura)

P2 – p1= peso neto total de levadura.

Repetir este paso cada 12 horas durante 4 días.
En un segundo matraz inocular 2 ml de muestra en 50 ml de caldo YM, someter a agitación
(110 rpm) durante 12 horas, posteriormente leer su densidad óptica en el equipo Klett
Imagen 1: conteo en placa---------------------------------------------Imagen 2: equipo Klett (turbidez, lectura)
Crecimiento de e. coli en caja petri:
-------------Imagen 3: agar nutritivo inoculado con e. coli
Levadura (Cándida)
Se realizaron 6 lecturas, cada 12 horas durante 4 días, midiendo dos tres datos:
a)Turbidimetría (Klett)
b)Conteo de microorganismo (cámara de Neubauer)
c)Biomasa (diferencias de peso en papel filtro)
Los datos obtenidos se muestran a continuación
Para obtener la grafica que muestre el crecimiento de la levadura, se graficaron dos
datos, la lectura en el Klett y el conteo en la cámara de Neubaue

Para obtener la grafica que muestre el crecimiento de la levadura, se graficaron dos

datos, la lectura en el Klett y el conteo en la cámara de Neubauer.
……..Grafica 2: Conteo de microorganismos en Neubauer vs tiempos de lecturas.
Conteos en cámara de Neubauer:--------------------------------Conteo en placa:
Imagen 4: Conteo en cámara de Neubauer---------------Imagen 5: conteo en placa de levaduras
CALCULO DE LA BIOMASA DE LA LEVADURA (DIFERENCIA DE PESOS)

P2-P1 = PESO NETO TOTAL DE LEVADURA. P1= Peso del papel filtro a peso constante P2=Peso del
papel filtro con muestra.

Tabla 3: Muestra los pesos de los papeles filtro a peso constante y con muestra biológica (levadura filtrada, por vacio), obteniendo la

diferencia de ambos se tiene la biomasa. Graficando dicho dato vs las

0
0.18
0.25
0.31
0.3
0.33
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0
10
20
30
40
50
60
70
GRAMOSDELEV
ADURA
TIEMPO (HORAS)
CURVA BIOMÁSICA
Graficando “Horas de lecturav s Biomasa”, se obtiene la siguiente grafic

0
0.18
0.25
0.31
0.3
0.33
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0
10
20
30
40
50
60
70
GRAMOSDELEV
ADURA
TIEMPO (HORAS)
CURVA BIOMÁSICA
Graficando “Horas de lecturav s Biomasa”, se obtiene la siguiente grafica
----------Grafica 3: muestra los gramos de levadura vs los tiempos de lectura hechos.
------Dicha grafica muestra, que conforme las horas de agitación pasaban, la levadura creció de

una manera impresionante, pesando incluso gramos de organismo. La levadura (hongos), en

general son los microorganismos que pueden pesarse. Se muestra un grafica normal de
crecimiento de microorganismo.

DISCUSION DE RESULTADOS
La cepa utilizada de E. Coli para la inoculación fue una reserva que llevaba días, dando como
resultado un crecimiento no muy óptimo.

Otro factor importante que provoco un desajuste en los resultados en la segunda lectura de UFC/ml fue
provocado por la contaminación de una caja inoculada, esto ocurrió por una mala esterilización del área de
trabajo. Otro factor prescindible en los resultados de la misma lectura fue el calentamiento excesivo de la
pipeta con la que se inoculo causando la muerte de las bacterias y dando un resultado muy pequeño.

El resultado total del conteo de UFC/ml se realizo a las 48 después de las inoculaciones
hechas y no a las 24 horas que era lo correcto.
Las últimas dos lecturas En equipo Klett se obtuvo un resultado aproximado debido a que el
rango de lectura del equipo no fue suficiente para el conteo de las levaduras.
Los datos en el cálculo de la biomasa, así como los datos de los pesos de los papeles filtro, no
CONCLUSIÓN
Según los resultados obtenidos en la tabla de E. coli, nos muestra una curva normal de
crecimiento, demostrando así que el crecimiento bacteriano fue casi ideal y continuo.

En el caso de la inoculación utilizando un producto comercial antimicrobiano (jabón “Escudo”), se estudio el

efecto de dicho producto, cual función fue pésima, ya que no hubo inhibición de ningún tipo, las colonias
fueron notorias en el medio inoculado. Las UFC crecieron alrededor del agente. Comprobando así la mala
función de este.

El crecimiento bacteriano fue de mayor rapidez en comparación del crecimiento de la

levadura, pero su biomasa fue mayor en esta última
Bibliografía
Bacteriología principios y practicas, Bryan h. Arthur, México D.F. 1983, editorial
continental S.a. de C.V., 8ª ed.
Dicit ; Bacterias y levaduras ;jueves 16 de octubre de 2008

http://dicitblog.blogspot.com/search/label/Divulgaci%C3%B3n%20cient%C3%ADfica

Microbiología, Zinsser; Argentina 1994, Editorial Medica panamericana, 20ª ed.

Microbiología alimentaria, Bourgeois, Zucca, Mescle; Editorial Acribia S.A

NTRODUCCION

La esterilización implica la destrucción de todos los microorganismos, incluyendo los

esporos. La desinfección supone la destrucción de los microorganismos vegetativos que
pueden causar enfermedades o en el contexto de las industrias de alimentos, los que
pueden producir alteraciones. La desinfección no mata necesariamente a los esporos.

Ambos términos no son sinónimos.

 ESTERILIZACION

Los métodos utilizados corrientemente en los laboratorios microbiológicos son:

 Calor al rojo (flameado).

  Calor seco (aire caliente).

 Vapor a presión (esterilización al autoclave).

 Vapor fluente (tyndallización).

 Filtración.

La incineración es también un método de esterilización, pero se aplica fuera del

laboratorio para la eliminación final de los desechos producidos en él y se considera por
separado.

 CALOR AL ROJO

Los instrumentos tales como las asas y alambres de siembra y varillas secas se
esterilizan calentándolas en la llama de un mechero bunsen hasta que se ponen al rojo.
Los microincineradores se recomiendan para esterilizar asas de inoculación
contaminadas con material muy infeccioso (espulos tuberculosos) para evitar el riesgo
de chisporrotear partículas contaminadas sobre las zonas de alrededor.

 CALOR SECO

Se aplica en un horno calentado eléctricamente que se controla mediante termostatos y

que está provisto de un gran ventilador circulante que asegura la uniformidad de la
temperatura en todas las partes del contenido. Los equipos modernos disponen de
controles electrónicos que pueden llevar la temperatura al nivel requerido, mantenerla
en ese punto durante un tiempo establecido previamente y desconectar seguidamente la
corriente. En algunos modelos se incorpora una cerradura solenoide para impedir que la
estufa sea abierta antes de que se complete el ciclo. Este dispositivo salvaguarda y
protege al personal de quemaduras accidentales.

El material que puede esterilizarse por este método incluye placas de petri, matraces y
pipetas de vidrio y objetos de metal. Pueden adquiriese de diversos proveedores cajas y
cilindros metálicos que almacenan convenientemente el material de vidrio durante la
esterilización y lo conservan estéril hasta su utilización.

 CARGA

El aire no es un buen conductor del calor, por lo que las estufas deben cargarse sin
apretar el contenido, de forma que queden abundantes espacios para permitir que circule
el aire caliente.

 TIEMPOS Y TEMPERATURAS DE CARGA

Cuando se calculan los tiempos de funcionamiento para el equipo de esterilización por

aire caliente, deben considerarse tres períodos:

 El período de ascenso de la temperatura, que es el tiempo necesario para que

toda la carga alcance la temperatura de esterilización; puede llevar alrededor de
1 hora.
  Los períodos de mantenimiento a las diferentes temperaturas de esterilización
recomendadas por el Medical Rescarch Councill que son 160ºC durante 45
minutos, 170ºC durante 18 minutos, 180ºC durante 7 1/2 minutos y 190ºC
durante 1 1/2 minutos.

 El período de enfriamiento, que se realiza gradualmente para prevenir la rotura

del material de vidrio como consecuencia de un descenso demasiado rápido de la
temperatura. Este período puede llevar 2 horas.

 CONTROL DE LOS ESTERILIZADORES DE AIRE CALIENTE

Los ensayos para los hornos de funcionamiento eléctrico provistos de ventilador se

describen en la Norma Británica 34212.

El equipo de esterilización por aire caliente, debe calibrarse con termopares cuando el
aparato se instala y comprobarse con termopares posteriormente cuando se considere
necesario.

El control de rutina ordinario puede efectuarse sencillamente con la ayuda de tubos de

Browne. Los tubos de Browne de Tipo 3 (punto verde) se utilizan para estufas provistas
de ventilador.

 VAPOR A PRESION

Se realiza Mediante la esterilización en autoclave. Las bacterias se matan más

fácilmente por el calor húmedo (vapor saturado) que por el calor seco. El vapor mata las
bacterias por desnaturalización de sus proteínas. Una condición de seguridad convenida
para la esterilización es utilizar vapor a 121ºC durante 15 minutos. Esta temperatura es
adecuada para medios de cultivo, soluciones acuosas, tratamiento de cultivos y muestras
desechadas, etc.

El aire tiene una influencia importante en la eficacia de la esterilización al vapor de

agua, porque su presencia modifica la relación presión/temperatura. Por ejemplo: la
temperatura del vapor saturado a 1,054 kg/cm es 121ºC, siempre que se haya extraído
todo el aire de la vasija, Si sólo se ha eliminado la mitad del aire, la temperatura de la
mezcla aire-vapor que resulta es de solamente 112ºC a la misma presión. Además, la
existencia de bolsas de aire impedirá la penetración del vapor.

Debe eliminarse primero todo el aire que rodea y penetra en la carga a antes de que
pueda comenzar la esterilización por vapor.

 CARGA DEL AUTOCLAVE

Una buena esterilización por autoclave depende de la eliminación de todo el aire de la
cámara y de la carga, y los materiales que van a esterilizarse deben colocarse sin
apretar. Los artículos limpios pueden ponerse en cestillos de alambre, pero el material
contaminado (cultivos desechados) deben estar en recipientes de fondo sólido en una
altura no mayor de 8 cm. Deben dejarse grandes espacios de aire alrededor de cada
recipiente y ninguno debe estar cerrado.

 TIPOS DE AUTOCLAVE

Unicamente deben usarse autoclaves diseñados para trabajo de laboratorio y que puedan
recibir carga mixta. Los autoclaves de carga porosa y los esterilizadores de líquidos
embotellados son raramente satisfactorios para el trabajo de laboratorio. Existen dos
variedades de autoclave de laboratorio:

 El tipo de olla a presión.

 Los modelos de desplazamiento de la gravedad con descarga automática de aire

y vapor condensado.

 OLLA A PRESION

Se utilizan todavía en muchas partes del mundo. El tipo más común es un aparato para
agua hirviendo a presión. Tiene una cámara vertical de metal provista de una tapa
metálica fuerte que se aprieta y cierra herméticamente mediante un aro de goma. Se
disponen en la tapa una espita para la salida del aire y del vapor, un indicador de presión
y una válvula de seguridad. El agua del fondo del autoclave se calienta mediante
mecheros de gas exteriores, un calentador eléctrico de inmersión o un serpentín de
vapor.

INSTRUCCIONES PARA EL FUNCIONAMIENTO

Debe haber agua suficiente dentro de la cámara. Se carga el autoclave y se aprieta la

tapa manteniendo la espita de descarga abierta. Se ajusta seguidamente la válvula de
seguridad a la temperatura requerida y se conecta la fuente de calor.

Cuando el agua hierva, fluirá vapor por la espita de descarga, arrastrando con él el aire
existente en la cámara. Se deja que salgan libremente el aire y el vapor hasta que se
haya eliminado todo el aire. Puede comprobarse que se ha eliminado fijando un extremo
de un trozo de tubo de goma a la espita de descarga e introduciendo el otro extremo en
un cubo u otro recipiente similar que contenga agua. El vapor se condensa en el agua y
las burbujas de aire salen a la superficie; cuando se ha eliminado todo el aire de la
cámara, cesa el burbujeo en el cubo. Cuando se ha alcanzado esta fase, se cierra la
espita de descarga de aire vapor y se quita el tubo de goma. La presión del vapor se
eleva en la cámara hasta que la presión deseada, generalmente 1,054 kg/cm2, se alcanza
y fluye vapor por la válvula de seguridad.

Cuando la carga ha alcanzado la temperatura requerida, se mantiene la presión durante

15 minutos. Al término del período de esterilización, se apaga el calentador y se deja
que el autoclave se enfríe. Se abre la espita de descarga de aire vapor muy lentamente
una vez que el indicador de presión ha llegado a cero (presión atmosférica). Si la espita
se abre demasiado pronto, cuando el autoclave está todavía bajo presión, cualquier
líquido que haya en su interior (medios de cultivo líquidos, etc.), hervirá de forma
explosiva e incluso pueden explosionar las botellas que contengan líquidos. Se deja que
el contenido se enfríe. Según la naturaleza de los materiales que se están esterilizando,
el período de enfriamiento necesario puede ser de varias horas para que los grandes
frascos de agar se enfríen hasta 80ºC y puedan cogerse con la mano sin riesgo.

 AUTOCLAVES CON ELIMINACION DEL AIRE POR DESPLAZAMIENTO

DE LA GRAVEDAD

Estos autoclaves están por lo general dispuestos horizontalmente y son de forma

rectangular, permitiendo que la cámara se cargue más fácilmente. Puede utilizarse un
sistema de bandejas y carretilla.

El dibujo situado más abajo presenta en forma esquemática un tipo de autoclave de

desplazamiento de gravedad, revestido de una camisa. Autoclaves similares pueden
construirse sin camisa. La puerta debe tener un mecanismo de seguridad que impida
pueda ser abierta mientras la cámara está bajo presión.

La camisa que rodea al autoclave está compuesta de una pared externa que encierra un
espacio estrecho alrededor de la cámara, que se llena con vapor a presión para mantener
la pared de la cámara templada. El vapor penetra en la camisa desde la fuente principal
que se halla a alta presión, a través de una válvula que reduce la presión hasta el nivel
de funcionamiento. La presión de funcionamiento se mide en un indicador de presión
independiente fijado a la camisa. Esta camisa tiene un drenaje independiente para
eliminar el aire y la condensación.

El vapor penetra en la cámara de la misma fuente que suministra el vapor a la camisa.

Se introduce de forma tal que es desviado hacia arriba y llena la cámara desde la parte
superior hacia la inferior, impulsando así al aire y al condensado a fluir en el fondo de la
cámara por el desplazamiento de la gravedad. El desagüe está provisto de filtros para
impedir que se obture por residuos. El desagüe lleva generalmente un termómetro para
registrar la temperatura del vapor que fluye. La temperatura registrada por el
termómetro del desagüe es generalmente inferior a la de la cámara. La diferencia debe
determinarse mediante ensayos con termopares. También cuenta con una válvula
sensible al vapor.

La válvula automática de vapor o «sensible al vapor» está diseñada para asegurar que
únicamente se retiene dentro de la cámara vapor saturado y que el aire y el líquido
condensado, se eliminan automáticamente. Recibe el nombre de near-to-steam sensible
al vapor porque se abre si la temperatura desciende unos 2ºC por debajo de la del vapor
saturado y se cierra alrededor de los 2ºC por encima de la temperatura del vapor
saturado. El sifón funciona por expansión y contracción de un fuelle metálico que abre y
cierra una válvula. El desagüe descarga en un embudo, de tal forma que hay una
separación entre el desagüe y el embudo. Esta disposición asegura que no retrocederá
agua contaminada desde la tubería a la cámara.

INSTRUCCIONES PARA EL FUNCIONAMIENTO

Si el autoclave está provisto de camisa, esta camisa debe llevarse a la temperatura de

funcionamiento en primer lugar. Se carga la cámara, se cierra la puerta y se abre la
válvula de vapor, dejando que la corriente de vapor entre la parte superior de la cámara.
El aire y el agua de condensación fluyen a través del desagüe del fondo. Cuando el
termómetro del desagüe llegue a la temperatura requerida, debe dejarse un tiempo
adicional para que la carga alcance dicha temperatura. Este tiempo debe determinarse
inicialmente y periódicamente para cada autoclave, como ya se indicará más adelante.
Salvo que se haga esto, es poco probable que la carga se esterilice. Se prosigue el ciclo
del autoclave para el tiempo de mantenimiento. Cuando se ha completado, se cierran las
válvulas de vapor y se deja que el autoclave se enfríe hasta que el indicador de
temperatura señala 80ºC. No debe abrirse el autoclave hasta este momento. Al principió
sé «entreabrirá» o abrirá muy ligeramente y se mantendrá en esa posición durante varios
minutos para permitir que salga el vapor y se enfríe posteriormente la carga.

 PRUEBAS DE EFICACIA DEL AUTOCLAVE

Los esterilizadores de vapor deben comprobarse cuando se adquieren y después a

intervalos regulares, mediante termopares. La medida de las temperaturas se realiza
mediante termopares, colocados en el interior del autoclave. Son alambres de cobre-
constantan recubiertos de PTFE y pueden colocarse en la carga. Son suficientemente
delgados para no impedir el cierre de la puerta. Los extremos posteriores se conectan
aun registro digital o gráfico (Comark). Generalmente son suficientes cuatro canales
para comprobar los autoclaves de laboratorio. Deben comprobarse los autoclaves en las
condiciones de peor carga. En la mayoría de los laboratorios podría ser un recipiente
lleno de frascos de 5 mi de tapón a rosca. Se colocará en el centro del autoclave y, si se
dispone de espacio, se colocan otros recipientes cargados alrededor de él. Un termopar
debe ponerse dentro de una botella en el centro de la carga. Otros termopares se
distribuyen en otros puntos del autoclave. Se inicia el ciclo de esterilización y se mide el
tiempo. Se anota el tiempo requerido para que la temperatura del desagüe de la cámara
alcance 121ºC y después el que se necesita para que el termopar de la carga registre
dicha temperatura. En este momento comienza el tiempo de esterilización. Después de
que transcurran no menos de 15 minutos puede desconectarse el vapor, comenzando el
tiempo de enfriamiento. Hay así cuatro períodos:

 Calentamiento, hasta que el termómetro de¡ desagüe de la cámara alcanza

121ºC.

 Penetración del vapor en la carga, hasta que el centro de la carga alcance 121ºC.

 Esterilización, durante el que la carga se mantiene a 12 ºC, generalmente 15

minutos.
  Tiempo de enfriamiento, hasta que la temperatura de la carga descienda a 80ºC,
momento en que puede retirarse.

Como no es practicable utilizar un termopar para cada carga salvo que se ponga un
sensor dentro de la cámara, es importante anotar estos tiempos para el funcionamiento
normal. El período de exposición después de que la temperatura en el desagüe alcance
121ºC es por tanto de 2+3 minutos. Deben mortificarse de acuerdo con esto los
autoclaves de ciclo automático, que dependen de la temperatura en el desagüe.

En algunos autoclaves la puerta no puede abrirse hasta que la temperatura en el desagüe

descienda a 80ºC. Esto no implica que la temperatura en la carga haya descendido
también al mismo nivel. En los grandes frascos herméticamente cerrados, puede estar
todavía por encima de 100ºC, momento. En el que su contenido estará a presión
elevada. Un enfriamiento brusco puede determinar que el frasco explosione. Por tanto,
el autoclave no debe abrirse hasta que la temperatura de la carga haya bajado a 80ºC o
más. Puede ser necesario un tiempo muy largo y en algunos autoclaves hay cerraduras
que permiten que la puerta se abra tan sólo fraccionalmente, para que la carga se enfríe
más antes de que quede libre finalmente. En otros, se utilizan dispositivos de
enfriamiento complicados con ráfagas de aire y pulverizaciones de agua fría.

 PROTECCION PERSONAL

La única forma digna de confianza de comprobar la eficiencia del autoclave es mediante

instrumentos, aunque pueden utilizarse los tubos de Browne, tipo 2 (punto amarillo),
para temperaturas superiores a 126ºC. Los tubos de Browne deben conservarse en un
lugar frío (por debajo de 20ºC) para impedir se deterioren.

Bennet ha elaborado otra clase de indicador de esterilización. Para algunas cargas, por
ejemplo material de vidrio y medios de cultivo, es útil la cinta de autoclave, utilizada en
los hospitales (3M).

En determinadas circunstancias puede ser deseable comprobar se han muerto los

esporos bacterianos durante el ciclo del autoclave. Se emplean esporos de Bacillus
stearothermophilus. La resistencia de los esporos al calor depende de muchos factores,
incluyendo entre ellos el medio en el que se han cultivado, de forma que es preferible
usar preparados comerciales cuya calidad ha sido controlada. Oxoid prepara cinta de
esporos, como también sirven 3NI (Atiest) y 13BL (Killit).

Tras la exposición al ciclo del autoclave, se retiran las cintas de su estuche y se ponen
en el medio de recuperación caldo triptona glucosado y se incuban a 55-60º para
comprobar su viabilidad.

Graves accidentes, que incluyen quemaduras escaldaduras en la cara y manos, se han

producido cuando se han abierto los autoclaves, incluso cuando el indicador de
temperatura se hallaba por debajo de 80 ºC y la puerta se había abierto una grieta. Los
líquidos de los frascos pueden estar todavía a temperatura superior a los 100 ºC y bajo
considerable presión. Los frascos pueden explosionar al contacto con el aire a la
temperatura ambiente. Cuando los autoclaves se descargan, los operarios deben llevar
viseras protectoras de toda la cara del tipo que recubra la piel de la barbilla y de la
garganta. También deben usar guantes de protección térmica.
 TYNDALLIZACION

Este proceso, designado así después de que el científico Tyndall utilizara un

vaporizador de Koch (o de Arnold), que es una caja metálica en el fondo de la cual el
agua hierve mediante un mechero de gas, una resistencia eléctrica o un serpentín de
vapor. El material que va a tratarse permanece en una bandeja perforada,
inmediatamente por encima del nivel del agua. La tapa es cónica, de manera que el agua
de condensación resbala por los laterales en vez de gotear sobre el contenido. Un
pequeño orificio en la parte superior de la tapa permite que salgan el aire y el vapor. Se
utiliza este método para esterilizar medios de cultivo que puede alterarse por exposición
a temperaturas más elevadas, por ejemplo medios que contienen carbohidratos
fácilmente hidrolizables o gelatina. Estos medios se vaporizan durante 30-45 minutos al
día durante tres días consecutivos. La primera vez se matan las bacterias vegetativas;
cualquier esporo que sobreviva germinará en el medio nutritivo durante la noche, dando
lugar a formas vegetativas que serán muertas durante la segunda y tercera
vaporizaciones.

 FILTRACION

Las bacterias pueden eliminarse de los líquidos haciéndolos pasar a través de filtros con
poros muy pequeños que impiden el paso de las bacterias pero, en general, no de los
mycoplasmas ni virus. Se emplea este método parra esterilizar el suero para su uso en el
laboratorio, las soluciones de antibióticos y los medios de cultivo especiales que se
alteran por el calor. Se utiliza también para separar los productos solubles del
crecimiento bacteriano (toxinas) de los medios de cultivo líquidos.

 TIPOS DE FILTROS

Los siguientes tipos de filtros tienen un interés histórico principalmente:

 Bujías de barro de loza tales como los tipos de Berkefeld y Mandier, que están
hechas de Kieseighur y el filtro de Chamberland de porcelana no vidriada.

 Filtros de asbesto (filtros Seitz).

 Filtros de vidrio incrustado, que se construyen con vidrio finamente pulverizado,

fundido lo suficiente para hacer que los gránulos de vidrio se adhieran entre si.

Las desventajas de las bujías de barro de loza y de los Filtros de asbesto son las de que
son muy absorbentes y tienen una velocidad de filtración comparativamente baja. Los
filtros de vidrio incrustado tienen la ventaja de su poca absorción, pero la velocidad de
filtración es comparativamente lenta.

FILTROS DE MEMBRANA

Estos filtros se fabrican de ésteres de celulosa (acetato de celulosa, nitrato de celulosa,

colodión, etc.). Tienen muchas ventajas sobre los primeros tipos de filtros
bacteriológicos, ya que son mucho menos absorbentes y tienen una velocidad de
filtración elevada. Se fabrican con una gran variedad de tamaño de poro y algunas
membranas pueden emplearse para separar partículas de virus, mediante el uso de
diferentes gradaciones de tamaño de poro. Los filtros bacterianos tienen un tamaño de
poro menor de 0,75 umas. Las membranas pueden esterilizarse al autoclave.

Para su empleo, la membrana se monta sobre una plataforma soporte, generalmente de

acero inoxidable, que queda encerrada herméticamente entre los embudos superior e
inferior. La filtración se obtiene aplicando presión positiva al lado de entrada o negativa
en la salida. Existen pequeñas unidades filtrantes para filtrar pequeños volúmenes de
líquido (1-5 mi), come, los filtros Hemmings (Beaumaris, Colab). El líquido se impulsa
a través de un filtro pequeño mediante una jeringa. Filtros de membrana y portafiltros
adecuados a distintos fines pueden obtenerse de BBL, Gelman, Millipore y Oxoid,
publicando cada una de estas firmas útiles manuales o folletos a cerca de sus productos.

 DESINFECCION

Pueden utilizarse una gran variedad de sustancias químicas y todas ellas reciben el
nombre común de desinfectantes o biocidas. El primero de estos términos es el que se
va a usar en este libro. Algunos de ellos son reactivos ordinarios, otros son
formulaciones especiales, registradas con nombres comerciales. Los microbiólogos y
gerentes de laboratorio se ven con frecuencia presionados por los vendedores para que
adquieran sus productos, para los que hacen extravagantes propagandas. Generalmente
hay diferencias marcadas entre la actividad de algunos desinfectantes cuando se ensayan
en condiciones óptimas por la técnica de Rideal-Walker u otras menos acreditadas y
cuando se utilizan en la práctica. Los efectos del tiempo, temperatura, pH y la
naturaleza química y física del artículo que se va a desinfectar y la materia orgánica
presente, no son a menudo totalmente consideradas.

2.1 TIPOS DE DESINFECTANTES Y USOS EN EL LABORATORIO

Existe un espectro aproximado de sensibilidad de los microorganismos a los

desinfectantes. Los más sensibles son las bacterias vegetativas, los hongos y los virus
que contienen lípidos. Las mycobacterias y los virus que no contienen lípidos son
menos sensibles y los esporos son por lo general resistente.

En la elección de los desinfectantes, deben tenerse en cuenta algunas consideraciones a

cerca de su toxicidad y de los efectos perjudiciales que pueden tener sobre la piel, ojos y
vías respiratorias. Unicamente se tratan aquí aquellos desinfectantes que tienen
aplicación en el laboratorio.

Los desinfectantes utilizados más corrientemente en los trabajos de laboratorio son los
fenoles líquidos y los hipocloritos. Los aldehídos tienen una aplicación limitada y el
alcohol y las mezclas de alcoholes son menos populares, aunque merecen mayor
atención. Los compuestos yodóforos y de amonio cuaternario son más populares en los
EE.UU que en Gran Bretaña, mientras que los compuestos mercuriales son los menos
utilizados. Las propiedades de estos desinfectantes se resumen en una tabla más abajo.
Otras sustancias tales como el óxido de etileno y la propiolactona se usan
comercialmente en la preparación de material de equipo estéril para hospitales y
laboratorios, pero no se emplean en la descontaminación de desechos de laboratorio y
en otras actividades mencionadas antes. Se excluyen por ello de esta exposición.

2.1.1 FENOLES LIQUIDOS

Estos compuestos son eficaces contra las bacterias vegetativas (incluso Mycobacterias)
y hongos. Son inactivas contra esporos y virus que no contienen lípidos. La mayoría de
los compuestos fenólicos son activos en presencia de cantidades considerables de
proteína, aunque se inactivan en parte por la goma, madera y plásticos. No son
compatibles con los detergentes catiónicos. Los usos en el laboratorio incluyen las
vasijas de desechos y la desinfección de superficies. Los fenoles líquidos deben
emplearse a la concentración más alta que recomiendan los fabricantes para
«situaciones sucias», es decir, cuando puedan encontrar grandes cantidades de materia
orgánica. Generalmente esta concentración es la de 2-5%. Las soluciones deben
prepararse diariamente y los fenólicos diluidos no deben guardarse más de 24 horas para
utilizarlos en el laboratorio, aunque muchos fenoles líquidos diluidos pueden ser
eficaces durante más de siete días.

Deben protegerse la piel y los ojos.

2.1.2 HIPOCLORITOS

La actividad se debe al cloro, el que es muy eficaz contra las bacterias vegetativas
(incluso mycobacterias) esporos y hongos. Los hipocloritos son inactivados
considerablemente por las proteínas y en cierto grado por los materiales naturales no
proteicos y por los plásticos y no son compatibles con los detergentes canónicos. Se
emplean en vasijas de desecho y desinfección de superficies, aunque es necesario tener
cuidado porque corroen los metales. No deben emplearse en partes metálicas de
centrífugas y otros aparatos que se debilitan con su uso. Con fines generales y para las
vasijas para pipe-tas y de desechos se recomienda una concentración de cloro de 2.500
ppm en lugar de 1.000 ppms, aunque para sangre derramada y vasijas de desechos que
pueden contener gran cantidad de proteína se recomienda una concentración de 10.000
ppms. Los hipocloritos que se venden para uso industrial y aplicaciones de laboratorio
en Gran Bretaña contienen 100.000 ppm de cloro disponible y deben diluirse para su
empleo al 1:40 ó 1:10. Algunos hipocloritos domésticos (los que se usan en la limpieza
de biberones) contienen 10.000 ppm y deben diluirse para su empleo al 1:4. Las lejías
de uso doméstico de Gran Bretaña y EE.UU. contienen 50.000 ppm de cloro disponible
y son apropiadas las diluciones de 1:20 y 1:5. Los productos preparados sólidos,
incluyendo los que contienen hipocloritos, usados en la desinfección doméstica y los
isocianuros clorados, utilizados en piscinas, pueden tener aplicaciones en el laboratorio.

Los hipocloritos se deterioran rápidamente con el uso, aunque los pro-ductos tal como
se suministran son estables. Las soluciones diluidas deben sustituirse después de 24
horas. La sustancia colorante que se añade a algunos hipocloritos comerciales trata de
identificarlos: no es un indicador de la actividad.

Los hipocloritos pueden producir irritación de la piel, ojos y pulmones.

2.1.3 ALDHEIDOS

El formaldehído (gas) y el glutaraldehido (líquido) son buenos desinfectantes. Son

activos frente a bacterias vegetativas (incluso mycobacterias), esporos y hongos. Son
activas en presencia de proteína y no se inactivan mucho por los materiales naturales o
artificiales ni por los detergentes.
El formaldehído no es muy activo a temperaturas inferiores a 20ºC y requiere una
humedad relativa de al menos 70%. No se suministra como gas, sino como un polímero
sólido, para formar aldehído y como un líquido, formalina o formol comercial, que
contiene 37-40 % de formaldehído. Ambas formas se calientan para liberar el gas, que
se utiliza para desinfectar espacios cerrados como cabinas de seguridad y habitaciones.
La formalina diluída al 1:10 para dar una solución que contiene 4 % de formaldehido, se
emplea en la desinfección de superficies y en algunos casos, de cultivos. Se hallan
actualmente en el comercio compuestos sólidos que liberan formaldehído y dichos
productos pueden tener aplicaciones en el laboratorio, aunque todavía no se han
valorado para este fin. El formaldehído se usa principalmente para la descontaminación
de cabinas de seguridad y en habitaciones.

El glutaraldehído necesita generalmente un activador, tal como el bicarbonato de sodio,

que se suministra con el líquido a granel. La mayoría de los activadores contienen un
colorante, para que el usuario pueda tener seguridad de que el desinfectante ha sido
activado. La eficacia y la estabilidad tras la activación batían con el producto y debe
consultarse la literatura suministrada por los fabricantes. Kelsey et al, hallaron que la
actividad esporocida de una marca disminuía a la mitad en siete días y Coates sugirió
que si se utilizaba glutaraldehído activado de esa edad, debería doblarse el tiempo de
exposición. Pueden emplearse en vasijas para desechos (aunque es caro) y son
particularmente útiles para la desinfección de las superficies metálicas, puesto que no
son corrosivos.

Los aldelhídos son tóxicos. El formaldehído es particularmente molesto porque afecta a

los ojos y produce dificultades respiratorias. Se requieren precauciones especiales. El
glutaldehído es menos nocivo, pero debe evitarse el contacto con la piel y los ojos.

2.1.4 ALCOHOL Y MEZCLAS DE ALCOHOLES

El etanol y el propanol, a concentraciones de alrededor de 70-80 % en agua, son

eficaces, aunque lentamente, contra las bacterias vegetativas. No son activos frente a
esporos y hongos. No se inactivan de manera especial por la proteína y otros materiales
ni por los detergentes.

La efectividad se favorece por la adición de formaldehído, por ejemplo una mezcla de

formalina al 10 % en alcohol de 70 %2 o hipoclorito en solución que tenga 2.000 ppm
de cloro disponible. Los alcoholes y las mezclas de alcoholes son útiles para desinfectar
superficies y exceptuando las mezclas de alcohol-hipoclorito, para equilibrar los
portatubos de las centrífugas.

Son relativamente inofensivas para la piel, pero pueden producir irritación de los ojos.

2.1.5 COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO

Son detergentes cati6nicos eficaces contra bacterias vegetativas y algunos hongos,

aunque no contra las mycobacterias o esporos. Son inactivos por la proteína y por una
diversidad de materiales naturales y plásticos, por los detergentes no iónicos y por el
jabón. Su utilización en el laboratorio es por tanto limitada, aunque tienen la clara
ventaja de ser estables y de no corroer los metales. Se emplean generalmente a
diluciones de 1-2% para la limpieza de superficie, pero son muy comunes en los
laboratorios de higiene de los alimentos como consecuencia de su naturaleza detergente.

Los compuestos de amonio cuaternario no son tóxicos y son inofensivos para la piel y
los ojos.

2.1.6 IODOFOROS

Como 105 compuestos de cloro, estos yoduros son efectivos contra bacterias vegetativas
(incluidas mycobacterias), esporos, hongos y ambos tipos de virus conteniendo o no
lípidos. Son inactivos rápidamente por la proteína y, en cierto grado, por sustancias
naturales y plásticas y no son compatibles con los detergentes aniónicos. Para su empleo
en vasijas de desecho y para desinfección de superficies deben usarse diluídos para
obtener 75-150 ppm de iodo, pero para la desinfección de las manos o como esporocida
diluidos en alcohol de 50% para dar una concentración de 1600 ppm. En los preparados
comerciales a la venta, los yodóforos suelen contener un detergente y llevar un
indicador: son activos en tanto aparecen de color pardo o amarillo. Tiñen la piel y las
superficies, pero el colorante puede eliminarse con solución de tiosulfato sódico.

Los yodóforos son relativamente inofensivos para la piel, pero puede apreciarse cierta
irritación en los ojos.

2.1.7 COMPUESTOS MERCURIALES

La actividad contra las bacterias vegetativas es mala y son inefectivos contra los
esporos. Tienen cierta acción sobre los virus a concentraciones de 1:500 a 1:1.000 y un
uso limitado, como soluciones saturadas en el manejo inocuo de preparaciones
microscópicas de mycobacterias.

Su limitada utilidad y su naturaleza muy venenosa convierten a los mercuriales en

inadecuados para su uso general en el laboratorio.

 PRECAUCIONES CON EL USO DE DESINFECTANTES

Como se indicaba anteriormente, los desinfectantes tienen efectos indeseables sobre la

piel, ojos y vías respiratorias. Deben utilizar guantes de un solo uso y lentes protectores,
gafas o un visor quienes estén manejando desinfectantes fuertes, por ejemplo, cuando
preparan diluciones para su empleo.

 LA COMPROBACIÓN DE LOS DESINFECTANTES EN EL

LABORATORIO

Se exponen seguidamente las Principales pruebas que se han propuesto para la

comprobación de la eficacia de los desinfectantes.

 ENSAYOS DE LOS FABRICANTES

Se utilizan estas pruebas en el control de calidad de los lotes durante la producción. Las
pruebas de Rideal-Walker y de Chick-Martin se diseñaron originalmente para
comprobar la eficacia de los desinfectantes de tipo fenólico frente a un patrón de fenol
puro. La prueba de Rideal-Walker compara la acción de un desinfectante con la del
fenol y los resultados se calculan como índice fenol y se expresa por un número seguido
de las letras RW. Cuanto más alto es el número, mejor es la acción desinfectante.
Algunos años después de haberse descrito la prueba de Rideal-Walder, Chick y Martin
publicaron su nuevo método de la prueba del cociente fenol. Es de un esquema similar a
la prueba de Rideal-Walker en muchos aspectos, pero se hace en presencia de materia
orgánica. Puesto que la mayoría de los desinfectantes son inactivos por la materia
orgánica, el índice de Chick-Martin (CM) es, por tanto, un número más bajo que el
índice RW.

Las pruebas de Rideal-Walker y de Chick-Martin son ensayos de los fabricantes para

los desinfectantes fenólicos, pero los desinfectantes no fenólicos introducidos más
recientemente tienen propiedades muy diferentes y muy variadas y no son adecuados
para las pruebas de Rideal-Walker ni de Chick-Martin.

Otras pruebas comprenden las de AOAC, Sociedad Alemana de Higiene y

Microbiología (DGHM), Comisión de Fitofarmacia (holandesa) y de Keisey-Sykes. Se
ha escrito mucho sobre estas pruebas que no precisa revisarse en este libro, remitiéndose
al lector al trabajo de Croslia W.

No parece existir justificación alguna en la actualidad para hacer cualquiera de ellas en

los laboratorios de microbiología clínica y de investigación. Es preferible queden para
los laboratorios de referencia y para establecimientos especializados. Los resultados de
pruebas aisladas pueden ser inseguros, salvo en manos muy adiestradas. Las pruebas
pueden ser de principios erróneos, cuando no se comparan los mismos hechos y un error
común los métodos de neutralización pueden ser inadecuado o aplicado
incorrectamente.

Existen asimismo otras buenas razones para que algunas de estas pruebas no se realicen
en los laboratorios clínicos o docentes. La mayoría de ellas mantienen Salmonella
typhi como germen de prueba, aunque hay una gran cantidad de objeciones científicas y
de sentido común para utilizar este germen. Se argumenta diciendo que las cepas del
bacilo del tifus que se exigen, por ejemplo, S. typhi NCTC 786 no son virulentas porque
carecen del antígeno Vi, una presunción que algunos bacteriólogos cuestionan
actualmente.

Una objeción más grave observada por nosotros mismos, es que los laboratorios clínicos
y docentes han utilizado para estas pruebas cepas de S. typhi aisladas recientemente de
casos de fiebre tifoidea. Esta observación, hecha al comienzo de una reunión de trabajo
oficial, contribuyó a la prohibición de utilizar S. typhi para los ensayos de
desinfectantes en los laboratorios clínicos de Gran Bretaña.

Para satisfacer una necesidad creciente de ensayos más prácticos para el empleo en
hospitales, el Public Health Laboratory Service (PHLS) ha sido responsabilizado del
desarrollo de las pruebas de dilución de empleo. Se utilizan estas pruebas para
recomendar una dilución de empleo práctica para un desinfectante que va a ser utilizado
en condiciones de hospitales o de laboratorios, por ejemplo, para la descontaminación
de instrumentos contaminados, limpieza de las paredes en los hospitales y carretillas de
quirófano y en los laboratorios de bacteriología para usos tales como las vasijas de
desecho de laboratorio. Tales pruebas son:
  Prueba de capacidad.

 Prueba de estabilidad.

 Prueba de utilización (descrita con detalle más adelante).

Las pruebas de capacidad y de estabilidad se llevan a cabo principalmente en los

laboratorios de los fabricantes y en los de referencia. Las pruebas de utilización deben
realizarse por los usuarios de los desinfectantes para comprobar la eficacia real de los
desinfectantes utilizados en los hospitales y laboratorios propios. Esta prueba es fácil de
realizar y es muy recomendada para ensayos rutinarios.

 PRUEBA DE CAPACIDAD DE KESLEY-SYKES

La prueba de capacidad de Keisey-Sykes se emplea para estimar la concentración de

desinfectantes que puede recomendarse para el uso en hospitales en condiciones
«limpias» y «sucias», es decir, en ausencia de materia orgánica o en presencia de ella.
Es adecuada para ensayar todos los tipos de desinfectantes.

El término condición limpia implica una situación en la qué la materia orgánica está
ausente, tales como las superficies de preparación de alimentos y partes superiores de
las carretillas, las que primero se lavan con agua caliente y detergente antes de aplicar el
desinfectante. El término «condición sucia» se aplica a aquellas situaciones en las que
hay presente materia orgánica, por ejemplo, superficies de sillas de enfermos y vasijas
de desecho de laboratorio y es necesaria una elevada concentración de desinfectante
para neutralizar la acción inactivante de la materia orgánica y asegurar aun la
desinfección.

Básicamente, la prueba consiste en la adición de un volumen conocido de una

suspensión de un germen de prueba en una serie de intervalos a un volumen estándar de
la concentración particular del desinfectante ensayado, con o sin adición de materia
orgánica. La materia orgánica que se añade es, generalmente, levadura. A intervalos de
tiempo regulares después de la adición de cada uno de los tres volúmenes de la
suspensión de prueba, se toma una cantidad estándar de la mezcla en ensayo y se añade
a cinco tubos de medio de recuperación.

Durante el desarrollo de la prueba, el desinfectante se diluye paulatinamente, pero es la

concentración determinada al comienzo de la prueba la que se dice que pasa o falla el
ensayo.

Una concentración inicial que, tras la segunda adición de suspensión de gérmenes, no

permite el crecimiento en al menos dos de los cinco tubos de medio de recuperación, se
dice que pasa la prueba y puede recomendarse para su empleo en condiciones limpias o
en condiciones sucias si se ha añadido levadura en el ensayo.

La prueba no se pretende se realice por quienes están empleados en los hospitales, sino
por los laboratorios oficiales o por los fabricantes, como orientación para la
recomendación de las concentraciones de desinfectantes que deben utilizarse en
hospitales, establecimientos de preparación de alimentos, etc.
2.3.3 LA PRUEBA DE ESTABILIDAD

Es una prueba simplificada ideada para comprobar la estabilidad y la eficacia a largo

plazo de los desinfectantes, en concentraciones recomendadas por los fabricantes para
su empleo en situaciones limpias y sucias. La prueba se utiliza como suplemento de la
información dada por la prueba de capacidad de Keisey-Sykes y es adecuada
únicamente para laboratorios especializados. Una lectura del trabajo de Maurer presenta
datos que evidencian que las bacterias no sólo sobreviven, sino que también se
multiplican en algunas soluciones desinfectantes.

 LA PRUEBA DE UTILIZACION

Se toman muestras de desinfectantes líquidos de fuentes tales como las vasijas de

desechos de laboratorio, cubos de fregar el suelo, estropajos, líquidos desinfectantes en
los que se guardan materiales de limpieza o cepillos de taza de retrete, desinfectantes en
Departamentos centrales de materiales estériles, recipientes de instrumentos usados y
soluciones madres de desinfectantes diluidos. El fin es determinar si los líquidos
contienen bacterias vivas y en qué número. Se describe en este libro este método
detalladamente para que pueda utilizarse en cualquier laboratorio, ya que pueden
obtenerse resultados significativos únicamente a la luz de condiciones locales.

2.3.4.1 METODO

Método (según la descripción de Maurer):

 Fase 1: se toma un volumen de 1 mi del desinfectante utilizado de cada tarro o

cubo, con una pipeta estéril para cada uno.

 Fase 2: se añaden a la muestra de 1 ml, 9 mi de diluyente en un recipiente

universal estéril o en un frasco de tapón a rosca de 25 ml también estéril. Debe
escogerse el diluyente de acuerdo con el grupo al que pertenece el desinfectante.

 Fase3: el frasco de diluyente se vuelve a llevar al laboratorio en el plazo de 1

hora desde la adición del desinfectante. Individualmente, se utiliza una pipeta
Pasteur o una pipeta de 50 gotas, estériles, para retirar un pequeño volumen de la
mezcla desinfectante/diluyente y se ponen diez gotas, por separado, sobre la
superficie de cada uno de dos pocillos en placas de agar nutritivo desecado.

 Fase 4: se incuban las dos placas de la siguiente forma:

 Se incuba una de las placas durante 3 días a 32 ó 37ºC, lo que se estime más
conveniente. La temperatura óptima para la mayoría de las bacterias patógenas
es de 37ºC, pero las que han sido dañadas por los desinfectantes se recuperan
más fácilmente a 32ºC.

 La segunda placa se incuba durante 7 días a temperatura del laboratorio.

 Fase 5: tras la incubación, se examinan las placas y se anota el crecimiento

bacteriano.
2.3.4.2 RESULTADOS

A pesar de las dudas expresadas antes y las de otros autores en relación con el empleo
de S. typhi en los ensayos de desinfectantes, están claro que los fabricantes desean que
persista su práctica. No puede culpárseles por completo por Esto, ya que su negocio es
la venta de desinfectantes y sus clientes exigen «índices fenol», incluso aunque no los
comprendan. Se ha hecho en el pasado demasiado poco por educar al comprador.

La British Association of Chemical Specialities publicó un Código Práctico que

formulaba apropiadas precauciones de seguridad. Este Código fue oportuno y necesario,
como consecuencia de la aplicación defectuosa, en ciertas áreas, del Código de Práctica
(Howie) para laboratorios no clínicos e industriales. El Código de Howie, como ya se ha
dicho antes, prohibe el empleo de S. lyphi para los ensayos de desinfectantes en los
laboratorios clínicos. Sitúa asimismo a S. typhi en la categoría B. Se especifican
instalaciones especiales y condiciones de contención para manejar los microorganismos
de la categoría B, entre las que se incluye las cabinas de seguridad bacteriológica. Esto
produce alguna confusión ya que el Código de Howie no indica qué organismos de la
Categoría B producen infecciones a través del aire y por ello requieren se manejen en
cabinas de seguridad, ya que S. typhi infecta (generalmente) por vía alimentarla y puede
manejarse en la bancada normal, aunque separado de las actividades principales del
laboratorio.

El Código de Práctica BACS, que está aprobado oficialmente, clarifica más este punto y
este Código y no el de Howie el que debe observarse en los laboratorios clínicos en los
que se realicen ensayos con desinfectantes.

 EL USO DE LOS DESINFECTANTES EN HOSPITALES

Es aconsejable que los hospitales elaboren un código de práctica detallado sobre el uso
de los desinfectantes y antisépticos que emplean para sus circunstancias particulares. Se
han publicado orientaciones para estos fines por el Public Health Laboratory Service en
su Monografía N' 2 y asimismo en una reunión de trabajo de la South Western Regional
Health Authority.

Para una mayor información acerca de desinfección y esterilización, véase el libro de

Russel et al.

 TRATAMIENTO Y ELIMINACION DE LOS MATERIALES INFECTADOS

Es una regla fundamental que ningún material afectado debe salir del laboratorio.

En el contexto del tratamiento. Y eliminación de los desechos de laboratorio

contaminados (incluyendo entre ellos los que están contenidos en artículos
recuperables), este sencillo precepto no ofrece problemas a laboratorios adecuadamente
equipados y bien dirigidos.

Está clara la responsabilidad de la dirección del laboratorio para asegurar que ningún
desecho que contenga organismos vivos salga de las instalaciones del laboratorio. Por
desgracia, no se resuelve el problema haciendo recaer con firmeza esta responsabilidad
en la dirección del laboratorio. En algunos establecimientos hay ideas muy
fragmentarias en cuanto a las fugas de material con organismos vivos. Hay acto de fe en
el poder de los desinfectantes a diferentes concentraciones y edades indefinidas para
matar a los microbios sumergidos en ellos o incluso puestos cerca de ellos.

Hemos creído siempre que la desinfección es una primera línea de defensa y para
desechar el material de trabajo contaminado es una medida temporal, que debe ir
seguida, tan pronto como sea posible, por el esterilizado en el autoclave o la
incineración. Los desinfectantes no deben utilizarse como método exclusivo de
tratamiento de los cultivos bacterianos, incluso aún cuando se sumerjan totalmente y se
eliminen todas las burbujas.

3.1 RECIPIENTES PARA MATERIAL INFECTADO DESECHADO

Debe haber en el laboratorio cuatro tipos importantes de recipientes para productos

infectados desechados:

 Cestos o bolsas de un solo uso para recibir cultivos y muestras.

 Vasijas de un solo uso para recibir portaobjetos, pipetas Pasteur y pequeños

artículos a desechar.

 Pipeceros para pipetas graduadas (recuperables).

 Bolsas de plástico para materiales combustibles tales como cajas para muestras y
envoltorios que puedan estar contaminados.

Todos estos recipientes deben ir a la cocina para el tratamiento final y eliminación.

3.2 CESTOS Y BOLSAS DE UN SOLO USO

Los cestos de un solo uso tendrán fondos macizos para que no goteen; en caso contrario
se diseminará material contaminado. Para superar los problemas de penetración de
vapor, estos recipientes deben ser bajos, de no más de 8 cm de altura y con la anchura
conveniente para que puedan ponerse en el autoclave sin apretar. Nunca deben llenarse
por completo. Se hallan en el comercio recipiente adecuados de plástico (polipropileno),
aunque no están especialmente diseñados para este fin (WCB, Xion).

Son comunes las bolsas de plástico, pero solamente deben utilizarse las fabricadas
especialmente para este fin. Deben mantenerse en cubos o en cestos de un solo uso.
Incluso las más firmes pueden romperse si se manejan con brusquedad (Jencons,
Sterilin).

Para llevarlos con seguridad a la cocina los cestos deben llevar tapa y las bolsas pueden
cerrarse fuertemente con tiras de alambre.

Las cestas y bolsas de un solo uso deben tener colores codificados, es decir, deben ir
marcados de distinta forma para que todos los operarios los reconozcan como que
contienen material infeccioso.

 VASIJAS DE DESECHO
Las vasijas o tarros de desechos con desinfectante que se sitúan en la bancada del
laboratorio y dentro de los cuales se sumergen los portaobjetos, pipetas pasteur y otros
desechos usados, tienen una larga historia de olvidos y abusos. En un gran número de
laboratorios estas vasijas se rellenan con escasa frecuencia, con diluciones de
desinfectantes desconocidas, están sobrecargadas de proteína y materiales que flotan y
rara vez se vacían. Muy pocas veces está desinfectado su contenido.

 ELECCIÓN DEL RECIPIENTE

Los recipientes viejos de mermelada y de café instantáneo no son adecuados. Estos

recipientes se rompen con facilidad y los vidrios rotos son un riesgo innecesario en un
laboratorio, especialmente si están contaminados. Las vasijas de desechos deben ser
fuertes y esterilizables por autoclave y los recipientes más adecuados son los bocales de
1 litro de polipropileno o los tarros del mismo material con tapa a rosca. Son
suficientemente profundos para mantener sumergidas la mayoría de las cosas que es
probable se desechen, son irrompibles y resisten muchas esterilizaciones por autoclave.
Se obscurecen con el tiempo, pero esto no afecta su uso. Son mejores los tarros de
polipropileno con tapa a rosca, ya que pueden cerrarse después de su uso, invertirse para
asegurar que el desinfectante moja completamente el contenido y eliminar las burbujas
de aire que pueden impedir que el desinfectante moje totalmente a los objetos.

 DILUCION CORRECTA

Un recipiente de desecho de 1 litro debe contener 750 mi de desinfectante diluido,

dejando espacio para que ascienda el nivel sin que se derrame ni que gotee cuando se
traslade. Debe hacerse una señal en cada vasija en la capacidad de 750 mi,
preferiblemente con pintura (el lápiz graso y los rotuladores son menos permanentes).
El volumen correcto de desinfectante nuevo que debe añadirse al agua para hacer este
volumen, adecuado para «situaciones sacias», se calculará teniendo en cuenta las
recomendaciones del fabricante. Este volumen se marcará seguidamente en una pequeña
probeta graduada, por ejemplo de hierro esmaltado o sé Fija un dispensador de plástico
que la vierta desde un recipiente a granel. Se echa el desinfectante en la vasija y se
añade agua hasta la señal de 750 ml.

 USO RAZONABLE

Los supervisores de laboratorio deben asegurarse de que no se ponen en las vasijas de

desecho cosas inapropiadas. Hay un límite razonable entre la cantidad de papel o de
tohallitas de papel que dichas vasijas pueden contener y los artículos que flotan no son
adecuados para las vasijas de desecho, a menos que éstas puedan cerrarse e invertirse de
vez en cuando para mojar todo el contenido.

Nunca deben añadirse grandes volúmenes de líquido a los desinfectantes diluidos.

Líquidos tales como los sobrenadantes de la centrifugación, deben verterse en vasijas de
desecho, que contienen el volumen usual de desinfectante puro, a través de un embudo
adaptado en la parte superior de la boca. Esta disposición impide se derramen gotas y se
formen aerosoles. Al final del día puede añadirse agua hasta la señal de 750 rnl y dejar
la mezcla durante toda la noche. No debe agregarse a los desinfectantes artículos que
contengan grandes cantidades de proteína, sino que deben desinfectarse en el autoclave
o incinerarse.
 VACIADO REGULAR

Ningún material debe dejarse en el desinfectante de la vasija de desecho durante más de

24 horas, ya que en caso contrario se desarrollarán las bacterias supervivientes. Por
tanto, todas las vasijas deben vaciarse una vez al día, aunque es una cuestión particular
sí se Yacían al final del día o a la mañana siguiente. Deben vaciarse incluso las vasijas
que hayan recibido poco o ningún material al llegar ese momento.

 VASIJAS DE DESECHO SECAS

En lugar de vasijas conteniendo desinfectante, en algunos laboratorios se disponen

recipientes rígidos de cartón o recipientes metálicos corno los utilizados en los
hospitales para desechar las jeringas y agujas de un solo uso, por ejemplo, Cin Bins
(Labco). Estos recipientes pueden recibir pipetas pasteur, portaobjetos, etc. pueden ser
esterilizados al autoclave o incinerados.

 PIPETEROS

Las vasijas para las pipetas recuperables deben estar hechas de polipropieno o de goma.
Son de mayor seguridad que el vidrio. Las vasijas deben ser suficientemente altas para
permitir que las pipetas se sumerjan totalmente sin que se derrame el desinfectante.
Debe añadirse al desinfectante un detergente compatible para facilitar la limpieza de las
pipetas en la fase final. Las vasijas altas no son convenientes para personas de baja
estatura, que tienden a porteras en el suelo. Esto es peligroso. Las vasijas de goma de
base rectangular (Camlab) pueden inclinarse dentro de una caja o de un bastidor, lo que
es mucho más conveniente y de mayor seguridad.

 BOLSAS DE PLASTICO PARA MATERIALES COMBUSTIBLES

Estas bolsas se hallan en todos los hospitales y tienen colores codificados. Los
laboratorios clínicos deben seguir el código local. En otro caso, deben introducir uno,
por ejemplo, las bolsas rojas pueden designarse para este fin y no para otros.

 METODOS DE TRATAMIENTO Y ELIMINACIÓN

Existen tres métodos prácticos para el tratamiento de los materiales de laboratorio

desechados y de los desechos contaminados:

 La esterilización por autoclave.

 La incineración.

 La desinfección química.

La elección se realiza atendiendo a la naturaleza de los materiales; si es desechable o

recuperable y, en este último caso, si se ve afectado por el calor. Con ciertas
excepciones, ninguno de estos métodos excluye a los demás. Puede verse en la más
abajo que la incineración sola únicamente puede aconsejarse si el incinerador se halla
bajo el control del personal del laboratorio. La desinfección sola es aconsejable
únicamente para las pipetas graduadas recuperables.
 MATERIAL INFECTADO

DESECHABLES RECUPERABLES

DESINFECTAR AUTOCLAVE DESINFECTAR AUTOCLAVE

INCINERAR LAVAR

BASURERO

Práctica normal.

Incinerador bajo control del laboratorio.

 ORGANIZACION DEL TRATAMIENTO

Los diseños de una cocina para tratar los materiales de laboratorio desechados deben
incluir autoclaves, un trituradora, una unidad de eliminación de basura conectada por
tubería de plomo al alcantarillado público, fregaderos hondos, máquinas para lavar
material de vidrio, estufas de desecación, estufas de esterilización y grandes bancadas.

Estas habitaciones deben tener disposición adecuada para evitar cualquier posible
mezcla de materiales contaminados y descontaminados. Los arquitectos deben trabajar
por tanto, sobre un diagrama de flujo o un plano de vías críticas, proporcionado por un
microbiólogo profesional.

Un plano de este tipo se presenta más abajo. El material contaminado llega en sus
recipientes de color codificado a una bancada o una zona designada y utilizada
únicamente para este fin. Se separan seguidamente de acuerdo con su color y se envían
al incinerador o se cargan en el autoclave. No hay ningún cruce en esta zona. Tras la
esterilización en el autoclave, los contenedores se llevan a la bancada de separación, en
donde el contenido se separa en:

 Desechos para incineración, que se ponen en bolsas de color codificado.

 Desechos para la basura, que se ponen asimismo en bolsas de color codificado.

 Desechos adecuados para la esclusa o unidad de eliminación de desperdicios.

 Material recuperable que pasa a la sección o habitación siguiente para su lavado

y esterilización.

Esta sección o habitación debe tener un autoclave independiente. No deben esterilizarse

en el mismo autoclave el material de desecho contaminado y el que va a volver a
utilizarse o recuperarse.

UNIDAD DE DEPOSITO FINAL DE

INCINERADOR DE DESPERDICIOS DESECHOS

L

A AREA DE

B RECEPCION AUTOCLAVE ZONA DE SALIDA

O DE DESPERDICIOS

R VOLVER A USAR ESTERILIZAR LAVAR

Solo si el incinerador está bajo control del laboratorio.

 PROCEDERES PARA DIVERSOS ARTICULOS

Antes de ser esterilizado al autoclave, deben quitarse las tapas desechables y después
incluidas en la carga del autoclave de manera que no dificulten la penetración del vapor.
Deben quitarse las ligaduras de las bolsas de plástico y abrir por completo las bolsas en
las cestas o cubos que las mantienen.

 MATERIAL DE VIDRIO CONTAMINADO

Después de esterilizarlos al autoclave, los medios de cultivo pueden verterse o extraerse

y los tubos, frascos, etc., se lavan a mano o mecánicamente con un detergente adecuado.
El tipo de líquido o polvos de lavado que se utilice dependerá de la dureza del agua
suministrada y del método de lavado. Deben tenerse en cuenta las recomendaciones de
varios fabricantes de detergentes de laboratorio.

Los laboratorios con mucho trabajo precisan máquinas de lavado de material de vidrio.
Antes de adquirir una de estas máquinas es preferible estudiar varias de ellas y
preguntar a otros laboratorios cuáles son los modelos de que disponen que consideran
satisfactorios. No todas las máquinas de lavado de material de vidrio son tan buenas
como proclaman sus fabricantes. Un requisito previo es un buen aporte de agua
destilada o desionizada.

Si se realiza el lavado a mano, son necesarias piletas dobles, para el lavado y para el
aclarado posterior y además, cuencos de plástico o de acero inoxidable para el aclarado
final en agua destilada o desionizada. El agua destilada de alambiques no revestidos,
independiente de la conducción de vapor, es raro sea satisfactoria para el trabajo
bacteriológico.

Los revestimientos de goma de los tapones a rosca deben separarse y lavarse por
separado los revestimientos y los tapones y unirlos después. Son útiles para esto los
coladores o tamices fabricados de polipropileno.

El material de vidrio nuevo, excepto el fabricado de borosilicato o material similar,

puede requerir neutralización. Cuando se esterilizan al autoclave líquidos en tubos o
frascos de vidrio sódico puede liberarse álcali y alterar el pH. La inmersión durante
varias horas en ácido clorhídrico al 2-3% es por lo general suficiente, aunque es
conveniente comprobar una muestra llenándolos de agua destilada neutra más unas
gotas de un indicador apropiado y esterilizándolos en el autoclave.

 VASIJAS DE DESECHO

Después de dejarlas toda la noche para permitir que actúe el desinfectante, debe verterse
cuidadosamente el contenido de las vasijas a través de un colador de polipropileno. El
colador y su contenido se ponen en un cesto desechable y se esteriliza al autoclave.

Deben utilizarse guantes de goma para estas operaciones. Las vasijas de desecho vacías
se esterilizan al autoclave antes de volver al laboratorio para su uso posterior. Pueden
tener contaminación residual.

3.7.2.3. PIPETAS REUTILIZABLES

Tras sumergirlas totalmente en desinfectante y detergente durante toda la noche, deben

retirarse las pipetas con las manos enguantadas.

Antes de lavar las pipetas, deben retirarse los tapones de algodón hidrófilo. Esto se
puede hacer insertando su punta en un tubo de goma fijado al grifo de agua corriente.
Los tapones que presenten dificultades para retirarlos pueden quitarse con un ganchillo.
Se fabrican diversas excelentes máquinas lavapipetas que se fundan en la presión del
agua y/o en la acción de sifón, aunque el lavado final debe hacerse en agua destilada o
desionizada.

 MUESTRAS DE ORINA DE 24 HORAS

Aunque es raro en los laboratorios de microbiología, otros departamentos de patología

pueden enviarlas para su eliminación sobre la base de que pueden contener organismos
patógenos. De manera ideal, deben procesarse en el departamento correspondiente de la
manera siguiente.

Debe añadirse a la orina la cantidad suficiente de desinfectante por ejemplo, hipoclorito,

para que de la dilución de uso. Tras dejarla toda la noche, la orina debe verterse
cuidadosamente en el fondo de la pila o sumidero para que se reúna con productos
similares del alcantarillado público. Los recipientes, que generalmente son de plástico,
pueden ponerse en bolsas de color codificado para la incineración.

 INCINERACION
Los problemas con este método de eliminación son asegurarse de que los desechos
llegan realmente al incinerador y que son totalmente esterilizados, es decir que nada
queda sin esterilizar, ya sea como material incombustible o que escape por la chimenea.
Es raro que el incinerador esté controlado por el personal de laboratorio. En ocasiones
ni siquiera bajo el control del personal del hospital o de la institución, sino a cierta
distancia fuera del establecimiento y el material contaminado e infeccioso debe enviarse
a él por vías públicas. Puede ser que no llegue nunca o que no se incinere.

Los incineradores no siempre son eficientes. Ninguno de ellos está controlado. Pueden
hallarse entre las cenizas materiales incombustibles y de su aparición puede dudarse si
habrán sido suficientemente calentados para matar a los microorganismos. Hemos
recogido restos de animales sin quemar, incluso pieles y plumas y vísceras en un
incinerador de laboratorio. El tiro de aire puede arrastrar microorganismos por la
chimenea a la atmósfera, si está demasiado cargado o la carga mal distribuida. Darlow
(comunicación personal) ha recuperado gérmenes en placas expuestas sobre una
chimenea. Recomienda que los incineradores utilizados para material infeccioso
dispongan de retroquemadores, de manera que quemen su propio humo y conviertan sus
emanaciones en inocuas. Esta recomendación está recogida en el Código de Práctica
(DHSS, 1978) que exige también una supervisión adecuada de la incineración de
desechos de laboratorio infectados9.

Ala vista de los problemas e incertidumbres asociadas con la incineración, parece

aconsejable utilizar este método únicamente para materiales que se han esterilizado al
autoclave o se han desinfectado y que, por razones estéticas u otras causas, no puedan
echarse a la basura. Puede haber excepciones, naturalmente, y es un ejemplo de ello los
recipientes para muestras de orina de 24 horas. Debe tenerse cuidado cuando se
incineran los plásticos. Puede producirse un humo fuertemente tóxico y se recomienda
generalmente que los materiales plásticos no sobrepasen el 20 % de la carga.

Autoclave de laboratorio
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Este artículo trata sobre autoclave de laboratorio. Para otros usos de este término,
véase autoclave.
Autoclave de laboratorio.

Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de

laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura, evitando con las altas
presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento del
autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y
temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunas formas acelulares,
tal como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave.

Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero

restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca
que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de
esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Los autoclaves más
modernos permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones, con ciclos
estándares a 134 °C a 200 kPa durante 5 min para esterilizar material metálico; llegando
incluso a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material esterilizado.

El hecho de contener fluido a alta presión implica que las autoclaves deben ser de
manufactura sólida, usualmente en metal, y que se procure construirlas totalmente
herméticas.

Las autoclaves son ampliamente utilizadas en laboratorios, como una medida elemental
de esterilización de material. Aunque cabe notar que debido a que el proceso involucra
vapor de agua a alta temperatura, ciertos materiales no pueden ser esterilizados en
autoclave, como el papel y muchos plásticos (a excepción del polipropileno).

Este producto es de uso general en laboratorio y no es un producto sanitario por tanto no

lleva marcado CE según la directiva 93/42/EEC ni le es de aplicación esta legislación.
Cuando el autoclave esta destinado a la esterilización de productos sanitarios tiene unos
requisitos especiales.

[editar] Funcionamiento
Debido a que el material a esterilizar es muy probablemente de uso grabable, se requiere
de métodos de testificación de la calidad de dicha esterilización, esto quiere decir que la
presión y temperatura aplicadas serán distintas para cada uno de los productos
autoclavados.

Las autoclaves suelen estar provistas de medidores de presión y temperatura, que

permiten verificar el funcionamiento del aparato. Aunque en el mercado existen
métodos testigo anexos, por ejemplo, testigos químicos que cambian de color cuando
cierta temperatura es alcanzada, o bien testigos mecánicos que se deforman ante las
altas temperaturas. Por este medio es posible esterilizar todo tipo de materiales a
excepción de materiales volátiles, por lo que se debe tener gran precaución.

[editar] Véase también

 Autoclave de uso médico

OBJETIVOS DE LA ESTERILIZACIÓN:

No se puede hablar de esterilización sin considerar el concepto de microorganismo. Un

microorganismo es un agente microscópico vivo e imperceptible a los sentidos que
generalmente está agrupado en colonias, aunque bien puede estar como una unidad
formadora de colonias (U.F.C.), la que se desarrolla en un medio apropiado para formar
colonias perceptibles. Los microorganismos pueden ser patógenos (productores de
ciertas enfermedades) o banales (los habitualmente hallados en los alimentos, el aire, el
polvillo ambiental, que no perjudican al hombre.

El hecho de que existan distintos tipos de gérmenes en el medio ambiente, crea grandes
dificultades en los estudios bacteriológicos, cuando es necesario obtener las especies
microbianas en estado de pureza, ya que tanto el instrumental como los medios de
cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del medio ambiente.

Con el fin de subsanar éstos inconvenientes se practica la esterilización, procedimiento

que consiste en destruir todos los gérmenes vivos que existan sobre los objetos o
sustancias que se desean libre de ellos (asépticos).

Los Microorganismos pueden clasificarse en criorresistentes, que son los resistentes al

frío y termorresistentes o resistentes a las altas temperaturas, aunque la clasificación
más común es por la temperatura a la que se reproducen. Así se los puede clasificar en
Criófilos (-5 a 14 °C); Mesófilos (25 a 47 °C) y Termófilos (50 hasta 113 °C). Por
ejemplo, muchos hongos se destruyen con la temperatura, pero sus esporas aún son
viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en nutrientes y humedad, se
reproducen. Por tal motivo la tecnología para su destrucción debe considerar éstas
variables.

LA ESTERILIZACIÓN

Esta operación comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos, que
se emplean para destruir, inactivar o retener gérmenes en general y patógenos en
particular. A través de esta, los materiales de laboratorio para determinados diagnósticos
y los elementos quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección
que evita la contaminación operatoria.

CAPÍTULO 2

2. MÉTODOS FÍSICOS:

Calor
La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de
exposición y la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El
calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las
membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

2.1 Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero

de Bunsen el objeto que se desea esterilizar. Cuando éste es de metal se deja permanecer
en el área de reducción de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas
agujas, etc) . Si es de vidrio se deja un tiempo prudencial, procurando que la llama
llegue a todos lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar
en un sitio aséptico. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los
objetos y si son de gran volumen, la esterilización nunca es perfecta.

2.2 Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula, esto es tóxico por niveles
elevados de electrolitos y fusión de membranas, residuos que quedan adheridos al
objeto estéril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a
los microorganismos que están en contacto con éstos.

Aún así se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilización
de placas de petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojar pipetas para la siembra
de sustancias líquidas).

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos componentes o nutrientes de los
microorganismos, requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la
actividad de agua del medio es baja.

2.3 Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire caliente es necesario colocar los
objetos

en aparatos especiales llamados ESTUFAS. Y llevar el aire interior a una temperatura

entre 150 y 190 °C. Uno de los primeros aparatos utilizados para este fin fué el horno de
Pasteur, que luego se sustituyó por estufas de aire caliente. Estas constan de una doble
cámara, el aire caliente generado por una resistencia eléctrica circula por la cavidad
principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas vatriables, siendo la más
aconsejadas 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los
tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal
denominados de par bimetálico, consistente en dos metales de distinto coeficiente de
dilatación. Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de
éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentación de la
resistencia calefactora.
UN AVANCE EN EL CONTROL DE TEMPERATURA: En la actualidad la
mayoría de las estufas de esterilización o de cultivo se termorregulan por medio de un
termostato hidráulico que consiste en una ampolla metálica con gas en su interior,
hermética, unida por medio de un capilar de metal a un tambor que varía su volumen
cuando aumenta la temperatura. Este tambor está en contacto con una llave interruptora,
de manera que si el gas interior del tambor se dilata por el calor, la llave a la que está
unido interrumpe el fluido eléctrico a la resistencia, manteniendo así la temperatura de
la cámara.

MODERNIZACIÓN EN EL DISPOSITIVO DE CONTROL DE

TEMPERATURA: Se ha logrado controlar la temperatura mediante un circuito
electrónico que utiliza el microprocesador 555, utilizando como sensor una
termorresistencia. Esta baja la resistencia a la corriente al aumentar la temperatura y la
señal es enviada al procesador, el que corta un relé que alimenta la corriente de la
resistencia de calefacción. Tanto éste como otros dispositivos electrónicos ofrecen
extrema sensibilidad de control, ya apto mas para estufas de cultivo que para
esterilización.

Ventajas del calor seco:


 No es corrosivo para metales e instrumentos.
 Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias
viscosas no volátiles.

Desventajas:

*Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja

penetración del calor.

CAPÍTULO 3

Calor Húmedo:
El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se
deben principalmente a dos razones:
*El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son
producidas por reacciones que eliminan agua.
*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado
que el aire.

Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de Papin en 1681, semejante a una

olla a presión que permitía mantener el agua por encima de los 100° C.

En 1830 William Henry, médico de Manchester; trataba ropa y otros utensilios

provenientes de personas infectadas exponiéndolos en una vasija a vapor recalentado y
aire caliente obteniendo el material libre de infección.
Pasteur en 1876, Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentos de la esterilización
por calor seco y calor húmedo: 30 minutos a 110° - 120° C de exposición al vapor eran
equivalentes a una hora de calor seco a 130° - 150° C.

En 1884 aparece en París con el nombre de Chamberland un equipo para usar en

laboratorio, el que luego se masificaría en todos los laboratorios biológicos.

AUTOCLAVE
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de
Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja
el material durante 20 a 30 minutos.
Equipo:
Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la
parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica.

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones,
mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para
el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una
válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento y método para esterilizar adecuadamente en Autoclave:

Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se
disponen sobre una rejilla o canasta de metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los
bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se
desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A

partir de allí se cuenta el tiempo de esterilización, luego del cual se debe esperar al
descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave
nuevamente.

Atmósferas Grados Centígrados

0 100

1/2 112

1 120

1 1/2 128

2 135

Este proceso de esterilización es el que mejor resultados dá en microbiología. El vapor

de agua a fuerte presión actúa a mayores temperaturas:
Tiempos de esterilización en autoclave:

Del tiempo, temperatura y presión usados en la esterilización depende el éxito

alcanzado. Generalmente los datos presión y temperatura son fijados, y el único factor
que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilización
dependiendo de su textura, porosidad, y otras características propias de cada material.
Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal
quirúrgico necesitan más. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura
de esterilización de 250ºF (121ºC) a 15-20 PSI.

• Guantes de Caucho (Hule) 15 minutos

• Sondas (base tejida) 15 minutos

• Sondas (látex) 15 minutos

• Frascos de Vidrio, Cristalería en General 20 minutos

• Agua en frascos 20 minutos

• Jeringas de Vidrio 20 minutos

• Bandeja 30 minutos

• Equipo de transfusión 30 minutos

• Paquetes de maternidad 30 minutos

• Ropa 30 minutos

• Torundas 30 minutos

• Paquete quirúrgico 45 minutos

• Instrumental de acero inoxidable 45 minutos

*Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados, para que
haya

buena penetración de vapor en el material.

No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización.
Ej. : Lencería y Vidrio.

El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el mantenimiento de

las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.

Como Cargar el Autoclave

a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulación
de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).

b) Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de

material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rápido contacto del
vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. También facilita el secado.

c) Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.

d) Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse con los recipientes destapados.

e) La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales

(nunca con la boca hacia arriba).

CAPÍTULO 4

Tyndalización:
Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de
Tyndall Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas
condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos
separados y en varias sesiones.
Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de
escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas
más bajas, 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las
temperaturas elevadas.

Ventajas del calor húmedo:

 Rápido calentamiento y penetración

 Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
 No deja residuos tóxicos
 Hay un bajo deterioro del material expuesto
 Económico

Desventajas:

 No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

 Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

Ebullición: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirúrgicos

o jeringas hipodérmicas para esterilizarlas. El agua a 100 °C no garantiza una adecuada
esterilización, no obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los
microorganismos y destruir aquellos que son susceptibles a ésta temperatura.

Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos años para esterilizar
jeringas de vidrio y agujas hipodérmicas de níquel con embocadura de bronce ó en el
mejor de los casos, platino, hirviéndolos en agua.
FILTRACIÓN: Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases,
especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir, sin
descomponerse , la acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede
efectuarse mediante presión o aspiración.

Se basa en el pasaje de líquidos a través de sustancias porosas que detienen a los

microbios. Los antiguos filtros se fabricaban en forma de bujías que son cilindros
huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra, de paredes de espesor variable.

La filtración se reconoció como técnica de esterilización a partir de las observaciones de

Koch en 1893, con la epidemia de cólera y la presencia del vibrión en el agua. Esta
observación fue ilustrada en la epidemia Hamburgo-Altona en 1892. El agua del río
Elba, que contenía Vibrio comma pasaba a las cañerías de agua de Hamburgo. Solo
aparecieron unos pocos casos de cólera en el suburbio de Altona, donde el agua del Elba
era filtrada por arenas (nótese el plural, refiriéndose tal vez a varios grados de arena),
antes de su distribución.

Los filtros de porcelana se llaman "de Chamberland" y los de tierras infusorias

calcinadas se denominan "Berkefield"

En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El

tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se
utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación
según el diámetro de poro que se utilice. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas
o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas,
soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos,
medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

Existen tres tipos básicos de filtros:

a- Filtros profundos o Filtros de profundidad:
Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado
dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retención de las partículas se
produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz.

b- Membranas filtrantes:
Tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la
partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriza del
filtro debido a efectos electrostáticos.

La firma Millipore ha desarrollado membranas de 0,45  y 14 cm de diámetro, con un

soporte de papel siliconado para su protección debido a la fragilidad de la misma, la ue
debe ser monada en un soporte estéril y que permita el ingreso del líquido a esterilizar a
presión.

c- Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo):

Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento
conjunto con radiación y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares
que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso
de toda partícula con un tamaño mayor al del poro.
CAPÍTULO 5

MÉTODOS QUÍMICOS:

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

En comparación con los procedimientos físicos, éstos métodos tienen una importancia
secundaria. Los antisépticos son considerados venenos protoplasmáticos que, al actuar
sobre los gérmenes, los destruyen. Algunos de ellos ejercen su acción nociva sobre
todas las células, por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario otros
actúan sobre algunas especies bacterianas, mostrándose como venenos específicos. Este
método es óptimo para la antisepsia de las manos del operador, de locales, de mesas de
trabajo, de jaulas de animales, y para destruir gérmenes que puedan caer en lugares de
trabajo.

AGENTES QUÍMICOS

La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o

Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antisépticos útiles para desinfectar manos y
superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito
de Sodio (agua lavandina).

ESTUFAS DE ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO

Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos, incluso esporas y virus.
Esteriliza sin deterioro artículos de goma, plástico, metal, madera, lana, piel, papel,
productos farmacéuticos.
Esterilización con embalajes: a este gas son permeables sustancias como polietileno,
nylon, celofán, etc.
En 1928, autores americanos: Bac, Cotton y Ellington; Schrader y Bossert y Autores
alemanes: Gassner y Hase, descubrieron las propiedades del óxido de etileno.
En 1933 fueron certificadas las propiedades del óxido de etileno en un laboratorio de La
Sorbona y en 1939 se estudió en un laboratorio de investigación del Ejercito de U.S.A.
El óxido de etileno era bactericida, esporicida, con gran poder de penetración, efectivo a
bajas temperaturas y penetra sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto
potencial inflamable se mezcló con CO2 en una proporción de 7,15 veces el volumen de
óxido de etileno.
Trabajo de Phillips y Kaye.
El tiempo de esterilización que requiere el material depende de múltiples variables, el
vacío que se produce, la humedad, la concentración del gas expresado en gs./l y la
temperatura, es decir que reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposición
requerido.
El gas se adquiere en botellas metálicas o cartuchos que se vaporizan, cambian de
líquido a gas a 10º C.
Todos los artículos deberán airearse por 6 hs. después de una esterilización.
El Oxido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos
lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica.
Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material
termosensibles como el descartable (goma, plastico, papel, etc.), equipos electrónicos,
bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y
explosivo, y además cancerigeno.

Con aldehídos
Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación
irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen
las esporas.

Glutaraldehído:
Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de
20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.
Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío.
Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.

Alcoholes
Iodo
Antisépticos Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros
Organo Mercuriales
Colorantes
Cloro y Compuestos clorados
Aldehídos
Desinfectantes y/o Esterilizantes Oxido de Etileno
Compuestos Fenólicos
Acidos y Alcalis

Formaldehído:
Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo
de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser expuesta al calor para
un rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden ser usadas en
Estufas de Formol, llamadas también de formalina, que son cajas de doble fondo, en
cuya base se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar
materiales de látex, goma, plásticos, etc.
Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.

CAPÍTULO 6

RADIACIÓN:
Su acción depende de:

 El tipo de radiación
 El tiempo de exposición
 La dosis
Radiaciones Ionizantes:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos,
estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los
microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles
(termosensibles) como jeringas

descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.

Rayos Ultravioleta:
Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes
y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilización en quirófanos.

Rayos Gamma:
Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica. Este tipo de
esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el
campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc.

Control de calidad: La correcta esterilización se puede controlar mediante dos

métodos, siendo el segundo el más seguro.
Indicadores: Cintas comerciales que se colocan en el paquete o caja a esterilizar, que
viran de color, cuando se alcanzan las temperaturas adecuadas para la esterilización.

Se describe la composición de los llamados "testigos de esterilización" preparadas por

sustancias químicas.

1- Mezcla de Demande:

Safranina............... 0,01 g.

Benzonaftol........... 100,00 g.

Ésta mezcla se colorea de rojo cuando sufre una temperatura de 110 °C.

2- Mezcla de Gérard:

Fucsina................ 1 g.

Benzonaftol...........250 g.

Esta mezcla toma un color rojo rubí a 110 °C.

3. Mezcla de Gérard
4. Verde Brillante......... 1 g.

Acetanilida............100 g.

Esta mezcla es azul a la temperatura ordinaria, a 115 °C toma un color verde

oscuro)
 5. Mezcla de Gérard

Metil Violeta...........1 g.

Hidrato de Terpina....100 g.

Mezcla violeta pálido que a 117 °C se vuelve violeta oscuro.

Las mezclas se colocan en ampollas y se cierran a la lámpara, colocándose junto con el

material a esterilizar.

Pruebas de cultivo:

También pueden colocarse gérmenes vivos, especialmente esporulados y los que

presentan mayor resistencia como el bacilus subtilis o el b. Mesentericus de la papa
(también responsable de la filamentación en el pan), esterilizándose conjuntamente con
el material para luego sembrar una suspensión de los gérmenes para observarse en agar
nutritivo a las 24 Hs. Si existe o nó desarrollo de colonias.

Bibliografía:

1-Carlos M. Barzizza – Microbiología – Tomo 1 y 2– Librería Hachette, Bs. As, 1960.

2-Microbiología de ZINSSER. Revisada por Smith y Martín. UTHEA, 1970.

3-Catálogo Cole – Parmer 2002.

4-Catálogo Sigma, 2002.

5-Téchnique de Sterilisation. (texto en Francés) Ern. Gérard, Paris, Vigot fréres, 1950.

6- A manual of Bacteriology – H. Williams- Blakiston’s son & Co, 1919.-

7- Catálogo Cat-Lab. Editorial Elefantre, 2003-2005.

8- Deutsche Gesellchaft fur thechnische. Proyecto de mantenimiento hospitalario. S.

Salvador, Marzo de 1997.-

9- Material publicado en internet.

9-Notas, experiencias y material personales.

Ricardo Botta

Técnico en Electromedicina – Químico.

2004.
ricardobotta[arroba]uolsinectis.com.ar

ricardobotta[arroba]hotmail.com

Comentarios

Miercoles, 28 de Octubre de 2009 a las 03:08  |  0       

juan neguib daher

La informacion que brindan es buena, pero creo que hace falta

informacion necesaria acerca de esterilizacion local de organismos
pluricelulares, algun metodo util que ni hiniba actividad celular o
destruya esporas, ya que es importante para la realizacion de cepas de
pleurotus ostreatus mantener al individuo intacto, y unicamente eliminar
bacterias sin dañar la espora, para asi obtener buena reproduccion
miceliar

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página, avanzadas formulas matemáticas, esquemas o tablas complejas, etc.). Recuerde que para ver el
trabajo en su versión original completa, puede descargarlo desde el menú superior.

Material de laboratorio
1. Materiales de uso en el laboratorio: plástico, vidrio, metal...
 Nos encontramos en el laboratorio con distintos tipos de
materiales: vidrio, plástico, porcelana... pero ninguno de ellos cumple las
exigencias del laboratorio.

Se tendrá que elegir en cada momento el material según el uso

que le queramos dar, ningún utensilio es perfecto.
Vidrio: Se caracteriza porque tiene mucha resistencia

química (frente a ácidos, frente a bases...), tiene mayor

resistencia que el plástico, es muy estable, se
caracteriza por su transparencia.
Todos los vidrios no son perfectos para todas las
técnicas, a veces se necesitan vidrios con resistencia
técnica, con resistencia mecánica. Según el uso que le
queramos dar aparecen vidrios especiales. La mayoría
de los utilizados son vidrios borosilicatados, los cuales
ofrecen gran resistencia térmica (vidrio pirex, quimax).
Cuando se emplea el material de vidrio hay que tomar
unas precauciones:

• No los podemos someter a cambios

bruscos de temperatura (se provocan
tensiones que pueden romper el cristal).
• Hay que colocar la estufa de secado o esterilización en
frío, ir calentándolo después, y cuando acaba el tiempo
de secado dejar enfriar el material
• No se debe aplicar fuerza sobre llaves, tapones de vidrio
• No se debe someter a variaciones bruscas de presión
•

No se debe conservar soluciones concentradas de bases

en material de vidrio de borosilicato, porque son
substancias muy cáusticas que pueden destruir la
calibración del aparato.

Plástico: Los materiales de plástico pueden ser de uso

múltiple, p ej. Las probetas, matraces, vasos de precipitados, las placas

de
petri...
El plástico ofrece algunas ventajas frente al vidrio, es resistente a la
rotura,
tienen un peso bajo. Los utensilios de plástico de laboratorio son
monómeros orgánicos polimerolarizadas. Hay gran variedad de
plásticos,
van a tener distintas propiedades físicas y químicas (por ejemplo,
poliestireno, PVC, polipropileno...).
Cuando se utiliza un plástico hay que tener en cuenta el tipo de plástico
que
se emplea porque algunos plásticos pueden ser atacados por disolventes
 calibrado
para que sea utilizado de una manera determinada y a una temperatura
estándar, que normalmente es de 20ºC, esto tiene que ser así porque el
volumen que ocupa una determinada masa de un líquido varía con la
temperatura.
Hay instrumentos volumétricos con distinto tipo de calibración, hay 2
tipos:

• Instrumentos calibrados para verter (VERT) o (EX) o (TD)

• Instrumentos calibrados para contener (CONT) o (IN) o (TC)
p. ej. matraz aforado
La cantidad de líquido que se vierte está reducida por la que permanece

herida a la pared. En este tipo de material volumétrico hay que tener en

cuenta el error de paralaje (el error que se produce al
enrasar) es el desplazamiento aparente de un objeto
cuando se observa desde diferentes puntos, al leer el
ojo debe estar a la altura del menisco.

Matraz aforado: Se caracteriza por tener

forma dicen que de pera, con el fondo plano o

ligeramente convexo, un cuello largo y estrecho, el
extremo del matraz está cerrado por un tapón
hermético, el cuello lleva una marca, que es una
línea muy delgada llamada línea de aforo, indica
también la temperatura a la que debe de usarse,
generalmente están calibrados para contener
líquidos, muy pocos se utilizan para verte. Los
matraces utilizados para verter llevan dos líneas de
 aforo o una escala graduada. Se utilizan para preparar disoluciones de
concentración conocida, o para diluir muestras. Para preparar una
disolución a partir de un producto sólido, primero se debe pesar los
gramos
de soluto, se traslada el soluto a un vaso de precipitados y se disuelve
con
un pequeño volumen de disolvente, lavando varias veces el agua con el
disolvente, se trasvasa al matraz aforado, asegurándose de que se
trasvasa
toda la disolución, y se llena el matraz con disolvente hasta llegar al
aforo,
de manera que el disolvente resbala por las paredes del matraz.

Pipetas: se utilizan para transferir líquidos, y las puede haber

de distintas capacidades, al igual que los matraces, llevan gravadas en sus

probetas la temperatura y la capacidad a la que se debe
utilizar, en la parte posterior lleva un código para el
volumen, para la precisión que tengan, y además hay
distintos tipos de pipetas según su función.

Hay pipetas manuales, hay pipetas aforadas o

volumétricas (diseñadas para medir un solo volumen)
que tienen un ensanchamiento en su zona central
siendo un tubo estrecho, donde se indica la temperatura
de uso y la capacidad.

Las pipetas de doble aforo se caracterizan porque

además de tener el aforo en la parte superior también
tienen una línea de aforo en la inferior y en ese caso la
capacidad de la pipeta coincide con el volumen entre
los dos aforos.
Hay otro tipo que son las pipetas graduadas, son
pipetas menos exactas que las aforadas, son tubos de
vidrio que terminan en una punta fina y en la pared

tienen gravada una graduación, que divide el volumen total en dl., ml.,
0,1
ml... en algunos casos, en la parte de arriba, llevan como un
ensanchamiento para impedir que el líquido llegue a la boca.

A parte de las pipetas manuales hay las llamadas micropipetas,

pipetas automáticas o pipetas de tipo Eppendorf, son
pipetas que se utilizan para transferir cantidades muy
pequeñas (1- 500 μl) se les conoce como pipetas de

tipo landa= microlitro)

El tipo más frecuente de

micropipetas utilizadas ahora son
las de tipo Eppendorf porque:

• Proporcionan mayor
precisión
•

Facilita el trabajo,
sobre todo en tareas

en las que hay muestreo, sobre todo en inmunoanálisis, a la

hora de hacer diluciones.

Estas pipetas funcionan mediante un pistón y llevan puntas desechables
de
plástico para evitar contaminaciones y las puede haber:

• Volumen fijo
• volumen variable

Algunas de estas pipetas tienen acoplado un dispositivo que permite

expulsar la punta, en el caso de que trabajemos con materiales que
ataquen al plástico hay pipetas que tienen la punta de vidrio.

Buretas: Son muy utilizadas en el análisis volumétrico, se

utilizan sobre todo para valorar disoluciones cuya concentración no

conocemos. Son tubos de vidrio más largo que las pipetas y pueden
contener un volumen de líquido variable, y están graduadas en ml. y 0,1
ml,
a veces también se emplean microburetas para medir volúmenes muy
pequeños, también hay buretas digitales, (el volumen, en este caso, viene
indicado por una escala digital) son muy precisas y proporcionan rapidez
en el trabajo, su uso es fácil.

La bureta de vidrio, en la parte

inferior, tiene una llave (plástico o vidrio) que
nos permite dispensar distintos volúmenes del
líquido esta llave se maneja con la llave
izquierda siempre, porque la derecha se tiene
que dejar libre para agitar el recipiente en el que
se está haciendo la valoración, y su manejo
debe ser cuando la bureta este limpia y seca,
hay que sujetar la bureta a un soporte vertical
adecuado, la llave debe estar cerrada y con la
ayuda de un embudo en la parte posterior,
procedemos a llenar la bureta pasando por
encima de la graduación, a continuación se abre
la llave y se deja salir unas gotas hasta que se
expulse el aire que está contenido, y a
continuación dejar caer gota a gota hasta que el
menisco coincida con el 0 de la graduación. La
parte inferior se coloca un recipiente sujetado
con la mano derecha y con la izquierda la
bureta, y se deja caer gota a gota la disolución,
y cuando se acerca el final de la reacción vamos
haciendo más lenta la adicción.

Probetas: son recipientes graduados,

cilíndricos, con una base para la sujeción en la

parte de abajo, se utiliza para medir volúmenes que
precisan poca precisión. Se utilizan para dispensar,
tienen un pico en la parte de arriba para facilitar su
vertido. A veces se utilizan para contener y suelen
llevar tapón.

Dispensadores automáticos:se

utilizan para añadir un volumen

determinado de un reactivo o de un diluyente a una solución. Se
compone de un émbolo de válvula y un extremo por donde sale
el líquido. Facilita el trabajo de determinados volúmenes
cuando los tienes que repetir muchas veces.

3. Utensilios básicos de laboratorio:

Vasos de precipitados: Los vasos de

precipitados son recipientes no calibrados, son anchos,

las paredes son rectas, y llevan un pico para verter
fácilmente los líquidos, se utilizan para preparar
disoluciones, para preparar reactivos o para contener
sustancias.

Matraz Erlenmeyer: Es un recipiente no

calibrado, son vasijas de fondo plano con un

cuello corto, se utilizan para evitar que se

pierda material cuando hay reacciones de
efervescencia porque la parte alta del matraz actúa como un
condensador de los vapores y se retarda la evaporación. Se
utiliza también para contener las disoluciones para su

valoración.
Embudo: Se utiliza para la separación

completa de un sólido y un líquido que están mezclados, se

utiliza para transferir líquidos o sólidos, podríamos
distinguir también los embudos de separación o ampollas
de separación, tienen una llave en el extremo inferior y un
tapón en la superior, y se utilizan para hacer separaciones
líquido- líquido.

Tubos de ensayo: son unos vasos tubulares que sirven para

calentar, hacer reacciones en ellos, y los puede haber de muchas formas
con/sin tapón, con/sin graduación, múltiple uso/desechables,
vidrio/plástico... Usaremos vidrio/plástico dependiendo de la utilización
que le queramos dar.

Tubos de centrífuga: soportan grandes tensiones de

material, suelen ser cónicos o en punta, su
calidad depende del material y de las
irregularidades en el espesor de la pared, también
depende de la configuración del fondo.

Frascos lavadores:contienen

agua destilada, suelen ser de plástico

flexible y terminan en un tubo flexible que permiten dirigir
el chorro.

Varillas de vidrio: se les llama también

agitadoras, se utilizan para agitar las soluciones, los
precipitados
Gradillas: son soportes de tubos, pueden ser de
distintos materiales y de distintas formas
Escobillones: para lavar el material de vidrio
4. Material específico de laboratorio:
Portaobjetos: son láminas de vidrio

rectangulares, donde se coloca la muestra para poder verla

al microscopio, existen portaobjetos con cavidades
semiesféricas que pueden ser de distinto diámetro y
profundidad, se utilizan para técnicas de laboratorio en las
que se hacen observaciones en vivo.

Cubreobjetos: Son laminas

muy finas de vidrio, con las que se

cubren las muestras que quiero ver al microscopio.
Pueden ser de distintos tamaños.

Placas de Petri: Recipiente de vidrio o de

plástico cilíndrico, con una base ancha pero de poca
altura, se utiliza para hacer cultivos en microbiología.
Actualmente se emplean de plástico desechables.
Cubetas: Son recipientes que se utilizan para

contener muestras en disolución, y se emplean en

técnicas de espectrofotometría, se caracterizan porque
se deben de ser transparentes en la región de la longitud
de onda en la que se realiza la determinación, tienen
forma prismática con caras paralelas, pueden ser de
cuarzo o de sílice para lecturas que se hagan en el
ultravioleta y de vidrio o de cuarzo para la región
visible, y de CaF2 para el infrarrojo.

Pipetas Pasteur: se utilizan cuando se

quieren coger cantidades pequeñas de un líquido d

forma fácil, pueden ser de plástico, que tienen una

pera de plástico, estas pipetas están esterilizadas
con gas o radiaciones gamma, otras veces pueden
ser de vidrio, las cuales son desechables, hay que
utilizarlas con un auxiliar de pipeteo, existen
también pipetas cuentagotas que se utilizan para
toma de muestras o manipular líquidos que son
infecciosos o tóxicos y pueden ser de plástico o de vidrio, si son de
vidrio
llevan una tetina de goma.

Asas de siembra: se utilizan para

inoculación o transferencia de cultivos, pueden ser
un alambre de platino, recto en forma de asa, un
extremo de ese alambre se interna en un mando
cilíndrico que permite su manejo. Actualmente se
utilizan mayoritariamente las asas de siembra de
plástico que además de estar calibradas, y pueden
tener una aguja incorporada cuando se quiere hacer
forma fácil, pueden ser de plástico, que tienen una
pera de plástico, estas pipetas están esterilizadas
con gas o radiaciones gamma, otras veces pueden
ser de vidrio, las cuales son desechables, hay que
utilizarlas con un auxiliar de pipeteo, existen
también pipetas cuentagotas que se utilizan para
toma de muestras o manipular líquidos que son
infecciosos o tóxicos y pueden ser de plástico o de vidrio, si son de
vidrio
llevan una tetina de goma.

Asas de siembra: se utilizan para

inoculación o transferencia de cultivos, pueden ser

un alambre de platino, recto en forma de asa, un
extremo de ese alambre se interna en un mando
cilíndrico que permite su manejo. Actualmente se
utilizan mayoritariamente las asas de siembra de
plástico que además de estar calibradas, y pueden
tener una aguja incorporada cuando se quiere hacer
siembras en profundidad, y que son desechables.
Las asas de plástico tienen una ventaja frente a las

de metal, flameadas después de cada uso, con las cual se evita que se
produzcan aerosoles que provocan contaminación.
Cámaras de recuento: Se utilizan para calcular mediante un

microscopio el número de partículas, hematíes, leucocitos,

plaquetas...contados por unidad de volumen. La cámara está formada por
una placa de vidrio, una base de vidrio, un vidrio especial de un tamaño
como el del portaobjetos, cuya parte central de la cámara lleva unas
ranuras, en el centro de la cámara se encuentran unas cuadrículas
llamadas
cuadrículas de recuento. Se necesita un cubreobjetos para cubrir la
cámara,
la distancia que deja entre el cubre y la cámara es de 0,1 mm. y eso hay
que
tenerlo en cuenta para hacer los cálculos y contar los números de
partículas.

Cámara de Neubauer: En el centro hay un cuadrado grande

que tiene 16 cuadrados medianos, que tienen 0,5 mm, esos 16 cuadrados
se
vuelven a dividir en 16
cuadrados más pequeños que
tienen 0,05 mm. de lado.
Según las partículas que
queramos contar debemos de
contar en uno u otro
cuadrado.
7
5. Limpieza del material:
Limpieza a mano o frotado: mecánicamente se arrastra la

suciedad con un cepillo o escobillón, con agua y detergente. El material

se lava con ese jabón, agua del grifo, y hay que enjuagarlo bien, y bien
hecho habría que pasarle agua destilada. El material de vidrio se limpia
más fácilmente una vez acabado de utilizar. Finalmente una vez que está
lavado se coloca en la estufa 30 minutos. El plástico no va a la estufa.

Limpieza por inmersión: se colocan los

utensilios en una solución de limpieza cubiertos

por ella durante 30 minutos, y después de ese
tiempo se seca sin necesidad de frotar, se puede
aumentar la acción elevando la temperatura del
baño. Después habría que enjuagarlo con agua
del grifo, y luego se debería pasar por agua
destilada, así podemos limpiar utensilios de
vidrio y también de plástico. A veces en esta inmersión se utilizan
ultrasonidos, un baño por ultrasonidos.
Limpieza a máquina: Se utilizan máquinas lavadoras que

están construidas especialmente para utilizar con material de

laboratorio, sería el mejor método, pero esta forma de limpieza no
resultada adecuada para material de poliestireno (lavado a mano).

Limpieza analítica de trazas: Se usan ácidos y bases para la

limpieza. La destrucción de estas trazas de metales se consigue

metiendo el material en ácido nítrico 1N, durante más o menos 1 hora, y
luego se aclara con agua destilada, otras veces para la destrucción de
trazas orgánicas, se limpia con lejías o con disolventes como alcohol,
cloroformo, a continuación habría que meterlo en una concentración de
HCl 1 N, y luego limpiarlo con agua destilada. Para eliminar la grasa i
otras impurezas frecuentemente se utiliza mezcla crómica, que destruye
por oxidación toda la materia orgánica que este presente. La mezcla
crómica es una mezcla de dicromato
de potasio (Kr2 Cr2 O7 ) y ácido
sulfúrico.

Desinfección y
esterilización: el material que haya

estado en contacto con productos

infecciosos tiene que desinfectarse
antes de volver a ser usado, y para
ello se utilizan detergentes
desinfectantes. En algunos casos, los
materiales tienen que ser estériles, con
lo cual habría que optar por algún
8

método de esterilización (autoclavado). Un material desinfectado no

tiene formas vegetativas pero si de resistencia. Un material esterilizado
no tiene ninguna forma de vida.
•

Desinfectante: se emplea sobre los tejidos, (agua

oxigenada, betadine...) antiséptico
•
No todos los desinfectantes son antisépticos (lejía)
Control de calidad de lavado sobre el material de vidrio:El

laboratorio puede hacer un control diario, al azar se elige un material de

vidrio limpio y seco,
examinamos si hay manchas de
agua, si es así el material no
está bien lavado. Todo el
material lavado ese día tiene
que ser lavado y secado y eso
quedaría reflejado en un
documento llamado hoja de
control de calidad. Otra forma
sería el control semanal, se
miraría otra vez si hay manchas
de agua que indica un enjuague
insuficiente, escurrido con agua
desionizada, para reconocer si
el recipiente está limpio nos
fijaríamos si al llenarlo con
agua sus paredes se humedecen formando como una partícula uniforme,
al escurrirlo y sacarle el agua hay que fijarse que el agua discurre
perfectamente, si hay suciedad, hay gotitas de agua que quedan
retenidas. Otras veces se prepara una mezcla de detergente y se le añade
una solución de bromosulftadeína sódica, enjuagamos el recipiente con
esa mezcla, si observamos que aparece una coloración rosa es indicativo
de suciedad.

6.. Agua empleada en el laboratorio:

El agua se utiliza como medio de reacciones, para la

limpieza, para reactivos... El agua del grifo no suele valer para medios
de laboratorio porque tiene muchas impurezas, orgánicas e inorgánicas,
que nos podrían falsear los resultados. Tenemos la necesidad de utilizar
agua pura, esto implica que tenemos que eliminar del agua el material
en suspensión y disuelto, todo lo que no sea H 2O. Actualmente la
cantidad de H2O se indica con grados reactivos que son 1, 2, 3,4... Por
ejemplo el H2O del tipo 1 se utiliza en procedimientos de laboratorio
cuantitativo, para medir cantidades, también se utiliza para preparar
controles, patrones... el agua de tipo 2 se utiliza en técnicas de
microbiología, inmunología, hematología... la del tipo 3 se emplea
como9
 base para obtener agua del tipo 1 y 2, también se utiliza para el lavado
del material aunque luego lo enjuaguemos con otros tipos de H 2O.
Hay distintos métodos que pueden producir la purificación del agua:
Destilación: Es el procedimiento clásico para obtener H2O
puro, consiste en un proceso en el cual se calienta agua hasta la
evaporación (100ºC) y luego se condensa y de esta manera se puede

e substancias extrañas (materia orgánica,

bacterias, impurezas
inorgánicas) esa
agua obtenida tiene
una característica
que es que tiene muy
poca conductividad.
Para conseguir la
destilación se
emplean los
destiladores, de
acero inoxidable o
de vidrio. A partir de
esta agua destilada

se puede obtener
agua bidestilada, se obtiene a partir de una segunda destilación en
presencia de un agente oxidante (KMnO4) que destruye la materia
orgánica. Este proceso de destilación tiene algunos tipos de
inconvenientes:
•

No se eliminan algunas substancias como NH3, CO2, Cl2

y algunos compuestos orgánicos.
• En el destilador se pueden ir acumulando materiales que
no son volátiles y eso implica que hay que hacer una
limpieza del destilador.
Mediante la destilación se puede conseguir agua del tipo 1 y del tipo 2.
Desionización: Es un método de

purificación del agua en el cual se hace pasar esta

agua a través de una columna en cuyo interior hay
unas substancias llamadas resinas de intercambio
iónico que pueden ser ácidas o básicas, y puede
haber una mezcla de las dos. Estas resinas son
capaces de eliminar impurezas que están cargadas
positivamente o negativamente. La duración de esta columna es
limitada, pero tiene una ventaja, que es que las resinas pueden ser
regeneradas-
Pero también tiene algunos inconvenientes:
método de esterilización (autoclavado). Un material desinfectado no
tiene formas vegetativas pero si de resistencia. Un material esterilizado
no tiene ninguna forma de vida.
•

Desinfectante: se emplea sobre los tejidos, (agua

oxigenada, betadine...) antiséptico
•

No todos los desinfectantes son antisépticos (lejía)

Control de calidad de lavado sobre el material de vidrio:El

laboratorio puede hacer un control diario, al azar se elige un material de

vidrio limpio y seco,
examinamos si hay manchas de
agua, si es así el material no
está bien lavado. Todo el
material lavado ese día tiene
que ser lavado y secado y eso
quedaría reflejado en un
documento llamado hoja de
control de calidad. Otra forma
sería el control semanal, se
miraría otra vez si hay manchas
de agua que indica un enjuague
insuficiente, escurrido con agua
desionizada, para reconocer si
el recipiente está limpio nos
fijaríamos si al llenarlo con
agua sus paredes se humedecen formando como una partícula uniforme,
al escurrirlo y sacarle el agua hay que fijarse que el agua discurre
perfectamente, si hay suciedad, hay gotitas de agua que quedan
retenidas. Otras veces se prepara una mezcla de detergente y se le añade
una solución de bromosulftadeína sódica, enjuagamos el recipiente con
esa mezcla, si observamos que aparece una coloración rosa es indicativo
de suciedad.

6.. Agua empleada en el laboratorio:

El agua se utiliza como medio de reacciones, para la

limpieza, para reactivos... El agua del grifo no suele valer para medios
de laboratorio porque tiene muchas impurezas, orgánicas e inorgánicas,
que nos podrían falsear los resultados. Tenemos la necesidad de utilizar
agua pura, esto implica que tenemos que eliminar del agua el material
en suspensión y disuelto, todo lo que no sea H 2O. Actualmente la
cantidad de H2O se indica con grados reactivos que son 1, 2, 3,4... Por
ejemplo el H2O del tipo 1 se utiliza en procedimientos de laboratorio
cuantitativo, para medir cantidades, también se utiliza para preparar
controles, patrones... el agua de tipo 2 se utiliza en técnicas de
microbiología, inmunología, hematología... la del tipo 3 se emplea como
 1. cción
2. Esterilización
3. Desinfectantes y antisépticos
4. Bibliografía

1. Introducción:

Desde hace mucho tiempo es un reto el control de enfermedades infecciosas por

destrucción, disminución de su número o inhibición de microorganismos.

Se puede llevar a cabo con diferentes métodos en función del lugar a aplicar y el grado
de erradicación microbiana que se pretende conseguir.

Por esto es conveniente definir algunos conceptos:

 Esterilización: proceso físico o químico que destruye toda forma de vida de vida
microbiana, incluidas las esporas.
 Desinfección: tiene por objeto la destrucción de microorganismos mediante
agentes de naturaleza química (desinfectantes), con el fin de disminuir el número
de formas vegetativas a niveles mínimos.
 Desinfectante: es la sustancia química que inhibe o destruye microorganismos al
aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente.
 Asepcia: término que se aplica a los procedimientos utilizados para prevenir que
los microorganismos progresen en un medio determinado (quirófano,
laboratorio. etc.)
 Antisépticos: son agentes desinfectantes que se utilizan sobre superficies
corporales con el fin de reducir la cantidad de flora normal y de contaminantes
microbianos de carácter patógeno. Tienen un menor grado de toxicidad que los
desinfectantes y generalmente menor grado de actividad. Determinados
preparados pueden utilizarse como antisépticos o como desinfectantes
indistintamente, pero a diferentes concentraciones en cada caso.
 Antimicrobianos: son sustancias químicas producidas por microorganismos o
sintetizadas químicamente que a bajas concentraciones son capaces de inhibir e
incluso de destruir microorganismos sin producir efectos tóxico en el huésped.

Control Antimicrobiano:

Esterilización Agtes. Físicos

Calor seco

Flameado

Incineración

Estufa

Calor húmedo

Autoclave
Tindalización

Filtración

Radiaciones

U.V

Rayos X

Agtes. Químicos

Óxido de etileno

Formol o formaldehído

Glutaraldehído

Desinfección Compuestos inorgánicos

Nitrato de plata y derivados argéncos

Derivados mercuriales

Agua oxigenada

Permanganato de potasio

Derivados clorados

Derivados yodados

Compuestos orgánicos

Alcoholes y fenoles

Clorohexidina

Detergentes aniónicos y catiónicos

1.
1.
1. Calor Seco
2. Agentes Físicos
2. Esterilización.

Los métodos más importantes son:

 a. Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposición de un
objeto a efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esteriliza de esta forma, p.
ej. ansas de cultivo de siembra.
b. Incineración: es el mejor sistema para esterilizar todas aquellos productos en los
que no importe su destrucción, p. ej. material biológico
c. Estufa: calor seco a alta temperatura, 20 minutos durate 180º, 60 minutos a 160º,
siendo suficiente la esterilización durante 60 minutos a 100-140º, se lo utiliza
para esterilizar material de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc.

1. Calor Húmedo.

La esterilización con calor húmedo (vapor d agua) es mucho más rápida y eficaz que el
calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma
irreversible mediante rotura de los uniones H entre los grupos peptídicos a temperaturas
relativamente bajas.

a. Autoclave: horno a presión, consiste en una cámara en la que el aire puede ser
sustituído por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. de
presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas
vegetativas y esporas. Se lo utiliza para esterilizar todo material resistente a esa
temperatura y es muy utilizado para la esterilización de medios de cultivos
b. Tindalización: (esterilización intermitente) consiste en someter el producto a
calentamientos intermitentes entre 56 y 100ºC durante 30 minutos con lo que se
asegura destruir las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a
temperatura ambiente o a 37ºC, las esporas germinan y las bacterias resultantes
se hacen más sensibles al calentamiento posterior.

1. Radiaciones

a. Luz UV: es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por ácidos
nucleicos causando daños genéticos alterando las bases. Se la utiliza en la
preparación de vacunas, cabinas de seguridad biológica, lugares de trabajo como
mesadas de laboratorios, est.
b. Radiaciones ionizantes: actúan lesionando ácidos nucleicos. Se la utiliza sobre
todo en procesos industriales para esterilizar dispositivos quirúrgicos, guantes,
jeringas, etc.

2.2. Agentes Químicos.

Los agentes químicos como el óxido e etileno, formaldehído o glutaraldehído

reaccionan con gran facilidad con diferentes grupos funcionales de los ácidos nucleicos
y proteínas alquilando estos radicales esenciales.

a) Óxido de etileno.

Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante que incativa

microorganismos sustituyendo átomos de hidrógeno lábiles por otros grupos como
hidroxilos, carboxilos, etc.
El material se expone a esterilizar a un 5-10% de óxido de etileno en dióxido de carbono
a 50-60º en condiciones de humedad controlada durante 4 a 6 horas. Es necesario
someterlo después a un período de aireación debido a su carácter mutegénico. Es un
agente efectivo en la esterilización de material termolábil como pró tesis, catéteres, etc.

b) Formol o formaldehído.

Es un gas fácilmente soluble en agua que se utiliza al 40% (formalina). Usado en forma
gaseosa y en cámara cerrada se emplea en la esterilización hospitalaria y en la industria
farmacéutica. También es muy utilizado como desinfectante ambiental de salas
altamente contaminadas que una vez tratadas deben airearse.

c) Glutaraldehído.

S emplea sumergiendo el material limpio en una solución al 2%, se emplea sobre todo
en la esterilización de instrumentos ópticos y los utilizados en terapia respiratoria.

1.
1. Compuestos inorgánicos.
2. Desinfectantes y antisépticos.

La actividad de los compuestos derivados de metales pesados (como plata, mercurio,

etc.,) se debe a la formación de sales que se disocian con dificultad de los grupos
sulfidrilos de las proteínas.

a. Son buenos bactericidas. El nitrato de plata se ha utilizado en el tratamiento de

quemaduras en soluciones al 0,5% y en la profilaxis de la oftalmia neonatorum
por Neisseria gonorrhoeae.
b. Nitrato de plata y derivados agénticos

El más utilizado como desinfectante de la piel es el mercuriocromo, no es tóxico

y sigue siendo activo en presencia de materia orgánica.

c. Derivados mercuriales

Es un agente oxidante de efecto fugaz por ser descompuesto por las catalasas de
los tejidos.

d. Agua oxigenada (peróxido de hidrógeno)

Agente oxidante que se inactiva en presencia de materia orgánica. Es poco

utilizado. En dermatología es utilizado por su propiedad antifúngica.

e. Permanganato de potasio

Se inactivan en presencia de materia orgánica. El cloro y derivados son agentes

oxidantes muy usados en la potabilización del agua en forma de cloro gaseoso
en grandes establecimientos, y en forma de hipoclorito es utilizado para
descartar material biológico (sangre, suero, etc.)
 La cloramina es un antiséptico menos potente que el hipoclorito, de acción más
lenta pero mejor tolerada en la aplicación tópica.

f. Derivados clorados.
g. Derivados yodados.

Son agentes oxidantes que se usan en forma de solución acuosa, combinándolos con
detergentes o sustancias orgánicas. Los yodoformos son compuestos que se liberan
progresivamente. El Yodo se encuentra en la polivinilpirrolidona (povidona yodada).
Existen también soluciones alcohólicas.

1. Compuestos orgánicos.

a. Actúan desnaturalizando proteínas. Su acción es rápida pero se evaporan con

facilidad. El alcohol etílico se utiliza en antisepcia a una concentración del 70%,
a esta concentración se reduce más la tensión superficial de la célula bacteriana
facilitando el proceso de desnaturalización.
b. Alcoholes.

Actúan precipitando proteínas. El hexaclorofeno y el fenol no se emplean por su

toxicidad. Otros derivados fenólicos son los cresoles, los que unidos a jabones
originan compuestos estables.

c. Fenoles.

Es un derivado fenólico que actúa alterando la permeabilidad de la membrana

celular bacteriana. Tiene inactivación rápida y es bien tolerado por la piel. Se
emplea mucho en hospitales en el lavado de la superficie cutánea en forma de
solución (acuosa o alcohólica) o asociada a detergentes no iónicos.

d. Clorohexidina.

Actúan desorganizando las membranas citoplasmáticas. Tienen escaso poder

bacteriostático. Se pueden mejorar combinándolos con desinfectantes u otras
sustancias tensoactivas como laurilsulfato.

e. Detergentes anionicos.

Tienen acción antiséptica, se inactivan en contacto con jabón, algodón y materia

orgánica. Son poco usados.

f. Detergentes cationicos.
g. Glicoles.

Propilenglicol y Etilenglicol, se aplican por medio de unos aparatos llamados glicosatos

o en forma de aerosoles para desinfección ambiental.

1. Bibliografía
  J. A. García Rodríguez y otros. "Microbiología Clínica". Ed. Haurcourt Brace.
Barcelona. 1999.
 Royer Stanier y otros. "Microbiología" Ed. Reverté. Barcelona. 1996.

Germán L. Puigdomenech

Técnico Superior en Microbiología y Biotecnología

base para obtener agua del tipo 1 y 2, también se utiliza para el lavado
del material aunque luego lo enjuaguemos con otros tipos de H 2O.
Hay distintos métodos que pueden producir la purificación del agua:
Destilación: Es el procedimiento clásico para obtener H2O
puro, consiste en un proceso en el cual se calienta agua hasta la
evaporación (100ºC) y luego se condensa y de esta manera se puede
e substancias extrañas (materia orgánica,
bacterias, impurezas
inorgánicas) esa
agua obtenida tiene
una característica
que es que tiene muy
poca conductividad.
Para conseguir la
destilación se
emplean los
destiladores, de
acero inoxidable o

de vidrio. A partir de
esta agua destilada

se puede obtener
agua bidestilada, se obtiene a partir de una segunda destilación en
presencia de un agente oxidante (KMnO4) que destruye la materia
orgánica. Este proceso de destilación tiene algunos tipos de
inconvenientes:
•

No se eliminan algunas substancias como NH3, CO2, Cl2

y algunos compuestos orgánicos.
• En el destilador se pueden ir acumulando materiales que
no son volátiles y eso implica que hay que hacer una
limpieza del destilador.
Mediante la destilación se puede conseguir agua del tipo 1 y del tipo 2.
Desionización: Es un método de

purificación del agua en el cual se hace pasar esta

agua a través de una columna en cuyo interior hay
unas substancias llamadas resinas de intercambio
iónico que pueden ser ácidas o básicas, y puede
haber una mezcla de las dos. Estas resinas son
capaces de eliminar impurezas que están cargadas
positivamente o negativamente. La duración de esta columna es
limitada, pero tiene una ventaja, que es que las resinas pueden ser
regeneradas-
Pero también tiene algunos inconvenientes:
10
• No elimina microorganismos
• No elimina muchos componentes orgánicos
Por eso es conveniente antes de hacer pasar el agua por la columna
hacer un tratamiento previo antes.
Filtración: Se hace pasar el
agua a través de unas membranas
semipermeables, la calidad de la
filtración depende del tamaño del
pozo del filtro, cuanto menor es el
tamaño de los agujeros mayor es su
pureza.

Ósmosis inversa:Con siste

en hacer
pasar el agua bajo presión a través de una
membrana semipermeable y se detienen así
tanto partículas orgánicas como inorgánicas,
con este método se obtiene agua del tipo 3, no
es un método ideal para conseguir agua del
laboratorio, es un sistema preliminar de
tratamiento del agua, y luego se podría aplicar
desionización.

Adsorción: Se utilizan agentes

absorbentes que pueden ser carbón vegetal,

arcillas, silicatos...
así conseguimos que
se separen las
substancias
orgánicas, pero
actualmente para
purificar el agua se
tiende a combinar
distintos métodos, se
puede realizar un
proceso de ósmosis
inversa para hacer
una purificación
primaria, luego se
podría pasar a través

del carbón vegetal para eliminar materiales orgánicos, luego una

desionización para eliminar material inorgánico, y por último una
filtración para eliminar partículas disueltas, bacterias...
11
En el mercado existen unidades que purifican el agua y que combinan
distintos métodos.
12

Material de laboratorio
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