Manual de Practicas Hematología 2013
Manual de Practicas Hematología 2013
Manual de Practicas Hematología 2013
1. Entrar al laboratorio con bata puesta y abotonada solo podrán quitársela al salir de
este “Alumno que no traiga bata no podrá realizar la práctica”.
2. Se impartirá una sesión por semana a cada grupo, pasando asistencia en cada
una de ellas.
3. Existirá una tolerancia de 15 minutos para entrar al laboratorio si es a la primera
hora y de 5 minutos a la segunda hora.
4. La puerta se mantendrá cerrada durante el desarrollo de la práctica y no podrá ser
abierta a amenos que el profesor lo autorice.
5. Si el alumno abandona el laboratorio sin autorización del profesor aunque la
práctica se haya terminado se considerara como falta.
6. Se anotaran las inasistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán
retardos después de la tolerancia.
7. Las faltas al laboratorio se calificaran con cero ya que si no se realiza una práctica
no se puede evaluar y la justificación de inasistencia no implica que la práctica se
pueda evaluar.
8. La entrega del reporte de la práctica se hará en la siguiente sesión de laboratorio y
por motivo razón o circunstancia no se recibirá dicho reporte posterior al día
indicado (a menos que se consensé el hecho de restar dos puntos por día de
retraso).
9. Colocar mochila y todos los objetos personales (MP3, Laptop, iPOD, PSP y
celulares) en los anaqueles, dejando fuera solo lo que van a utilizar para su
práctica.
10. Cada alumno deberá durante todo el curso en el equipo y mesa de trabajo que
sea asignada al inicio del curso.
11. Aquel equipo que no revise su material y lo entregue en mal estado o incompleto
lo repondrá dentro de los primeros 15 días posteriores a la práctica en caso
contrario no tendrán derecho a examen práctico.
12. Es obligación de los alumnos guardar el orden, disciplina y atención durante su
estancia en el laboratorio; con el fin de prevenir accidentes y daños al equipo.
2
13. Queda estrictamente prohibido comer, fumar o beber dentro del laboratorio.
QUIEN NO CUMPLA CON ESTAS DOS ULTIMAS DISPOSICIONES TENDRA
QUE ABANDONAR EL LABORATORIO ANULANDOSE LA PRÁCTICA.
14. Mantener siempre limpia su área de trabajo colocando la basura en los cestos
que se encuentran en cada mesa y no en las tarjas cónicas de las mismas.
15. Cando todo el grupo deje de asistir a alguna práctica y no existe causa justificada
oficialmente esta se dará por visita y será tema de cualquier examen.
16. Colocar los bancos sobre la mesa al terminar la sesión.
17. Manejar adecuadamente los RPBI.
18. La evaluación del laboratorio será de la siguiente manera:
EVALUACIÓN PORCENTAJE
EXAMÉN PRÁCTICO
REPORTE DE PRÁCTICA
EVALUACIÓN FORMATIVA
3
INDICE
Página
Introducción
PRACTICA No. 1 Toma de muestra sanguínea y preparación de frotis 7
sanguíneo.
PRACTICA No. 2 Toma de muestra sanguínea con diferentes 17
anticoagulantes.
PRACTICA No. 3 Toma de muestra sanguínea capilar y arterial. 21
PRACTICA No. 4 Características morfológicas de glóbulos rojos a partir 25
de un frotis sanguíneo.
PRACTICA No. 5 Determinación de la concentración de Hemoglobina 28
(Hb).
PRACTICA No. 6 Determinación de Hematócrito e Índices Hemáticos. 32
PRACTICA No. 7 Velocidad de Sedimentación Globular (VSG). 38
PRACTICA No. 8 Recuento de Reticulocitos. 41
4
INTRODUCCIÓN
5
PRACTICA No. 1
TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA VENOSA Y PREPARACIÓN DE FROTIS
SANGUÍNEO
1. COMPETENCIA
Realiza la toma de muestra sanguínea por vía venosa y en base a las condiciones
del paciente y a los estudios solicitados, aprende a preparar hacer un frotis
sanguíneo.
2. INTRODUCCIÓN
La sangre utilizada en las pruebas de laboratorio puede ser capilar o periférica y
venosa. Una y otra tienen sus ventajas y desventajas. Para la mayoría de los estudios
de laboratorio, es preferible tomar la sangre de una vena. Una buena venopunción
depende de tres factores; el técnico (flebotomista), el paciente y sus venas y el
material.
El técnico debe tener presente la frase “No dañar”; ya que los hematomas son
testimonio de la torpeza o de la falta de sentido común del operador. Comúnmente el
daño es transitorio; sin embargo puede llegar a ser permanente. El técnico debe
demostrar confianza y seguridad en sí mismo
El paciente debe recibir trato amable y respetuoso para que esté se sienta tranquilo y
cómodo; con el brazo en posición adecuada y así facilitar la venopunción.
Las venas del paciente deben ser examinadas. Si son profundas y no se palpan bien;
no se debe intentar puncionar, ya que es actuar a ciegas. Un torniquete, permite que
las venas sean palpables y orientar al técnico en la elección de la vena más adecuada.
En los adultos; las venas de la flexura del codo (Fig. 1), vena cefálica, media cefálica y
basílica, del dorso de la muñeca o del tobillo proporcionan una buena cantidad de
sangre. Sin embargo en los lactantes, la vena yugular externa y la vena femoral son
las de elección para volúmenes de sangre mayores (se requiere de personal con
experiencia).
Los materiales utilizados en la venopunción van a depender de factores como son: la
edad del paciente, la cantidad de muestra requerida, el tipo de estudios a realizar.
6
Actualmente existen en el mercado una serie de dispositivos que están diseñados
para facilitar la toma de muestras, identificación y transporte, minimizando el error
humano. Uno de ellos es el Sistema de tubos múltiples (vacutainer) al vacío que
asegura la esterilidad de los materiales, la proporción adecuada sangre-
anticoagulante, evita la hemólisis causada por tomas con jeringa, entre otras
ventajas.
La punción venosa con jeringa es también una opción, cuando las venas del paciente
son muy delgadas y no se desea someter a la succión de los tubos al vacío, etc. La
longitud y calibre de la aguja tanto del Sistema Vacutainer como de la jeringa datos
importantes a considerar.
El adecuado lavado de manos, el uso de guantes y el uso de yodopovidona 10%,
alcohol a 70% o tintura de yodo a 2% son las mejores medidas para la preparación de
la piel previa a una punción.
Preparación de un frotis sanguíneo
Las técnicas hematológicas se enfocan en los elementos celulares de la sangre y los
trastornos estructurales o bioquímicos que pueden causar una enfermedad. Por lo
que la información que se obtiene de un frotis sanguíneo puede orientar a un
diagnóstico y tratamiento, así como los efectos nocivos de la quimioterapia y la
radioterapia. La confiabilidad de la información depende de la calidad de las
extensiones. El estudio de los elemento formes de la sangre requiere una extensión
muy fina tanto que a lo largo de la extensión; los eritrocitos se observen en una sola
capa próximos entre si pero no sobrepuestos.
Los frotis pueden prepararse en portaobjetos o en cubreobjetos. Los frotis en
cubreobjetos son fáciles de realizar pero su fragilidad dificulta su manejo; sin embargo
los frotis en portaobjetos son más fáciles de manipular, son menos frágiles y se
pueden rotular fácilmente; además no requieren montaje y pueden archivarse de
inmediato.
7
Fig. 1 Venas del antebrazo adecuadas para la punción venosa
8
3. MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS
Material de laboratorio
2 Tubos de ensaye de 13X100 mm Equipo
1 Pipeta Pasteur con bulbo Microscopio
Equipo vacutainer
10 Portaobjetos
Lanceta desechable
Ligadura o tubo látex
Torundas de algodón con alcohol al 70%
Gradilla
Franela
Escobillón chico
9
4. PROCEDIMIENTO
10
adaptador. Si se requiere mayor volumen de sangre, se retira el tubo y se inserta
otro nuevo.
14. Colocar una torunda de algodón seco en el sitio de la punción; puede también
colocar un parche.
15. Pedir al paciente que presione firmemente el algodón durante 5 minutos, con el
brazo extendido o doblado.
16. En el caso de la extracción con jeringa, separar la aguja y la jeringa. Descargar la
sangre por las paredes del tubo para evitar hemólisis y formación de espuma.
Figura 8.
17. Separar las agujas de la jeringa o adaptador con precaución para evitar picarse
accidentalmente.
18. Depositar las agujas en el contenedor de punzocortantes. Figura 9.
11
Figura 4.Asepsia Figura 5. Punción venosa
12
4.2 Preparación de frotis sanguíneo por método del portaobjetos
1. Homogeneizar la muestra de sangre en forma manual (invertir el tubo de 6 a 8
veces) con agitador mecánico dos minutos aproximadamente.
2. Con una pipeta Pasteur o con el tapón del tubo, colocar una pequeña gota de
sangre (aproximadamente 2 mm de diámetro) sobre un portaobjetos limpio y seco
a 1 cm de uno de sus extremos.
3. El extremo opuesto se sujeta con los dedos índice y pulgar de la mano izquierda.
4. Con la mano derecha se toma un segundo portaobjetos y se apoya en el primer
portaobjetos por delante de la gota de sangre; formando un ángulo de 30º a 45°;
por capilaridad extender la gota de sangre por todo el borde del portaobjetos.
5. Deslizar el segundo portaobjetos suavemente y a velocidad moderada sobre el
primer portaobjetos en sentido longitudinal (adelante o hacia atrás), hasta que la
gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos.
Figura 10-12. El grosor del frotis sanguíneo depende del ángulo entre los dos
portaobjetos. Si el ángulo es mayor a 45º, la extensión será gruesa y corta y si el
ángulo es menor a 45º será larga y fina.
6. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente y en posición horizontal.
Figura 10
Figura 12
13
4.2 Preparación de frotis sanguíneo por el método de los cubreobjetos
Figura 13
14
5. CUESTIONARIO
1. ¿Porque deben ser estériles las agujas y las jeringas utilizadas en la extracción de
sangre venosa?
2. ¿Qué recomendaciones se deben hacer al paciente antes de la extracción de la
muestra?
3. ¿Dónde se efectúa la punción venosa en los niños?
4. ¿Porque al poner la sangre en el tubo con anticoagulante debe quitarse la aguja?
5. Mencione los factores que intervienen para una punción venosa adecuada.
6. ¿Qué función tienen los tubos al vacio con tapón azul, morado, amarillo, rojo y
tapón rojo con gel?
7. ¿Qué ventajas tiene la extracción de sangre con tubos al vacio con respecto a la
extracción con jeringas?
15
PRACTICA No. 2
TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA CON DIFERENTES ANTICOAGULANTES
1. COMPETENCIA
Realiza la punción venosa para su estudio hematológico y selecciona los
anticoagulantes apropiados de acuerdo a las pruebas que se deban realizar a la
muestra.
2. INTRODUCCIÓN
Los anticoagulantes utilizados en Hematología deben cumplir con las siguientes
características:
> No alterar el tamaño de los hematíes.
> No producir hemólisis.
> Evitar al máximo la agregación plaquetaria.
> No alterar la morfología de los leucocitos.
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible. El tiempo
máximo entre la extracción de la sangre y su proceso depende del coagulante de
elección y no debe ser más de 4 horas, a excepción del anticoagulante EDTA
(etilendiaminotetracético) que puede ser hasta 24 horas conservando la muestra en
refrigeración (4 a 8ºC).
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma sólida o líquida. Los primeros están
indicados para la determinación de los parámetros hematológicos, ya que no
producen, como los anticoagulantes líquidos, dilución de la sangre.
16
HEPARINA SÓDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiológico que actúa
impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un
mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas
con heparina producen en las tinciones un color azulado y una pseudovacuolización
celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-
20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.
CITRATO TRISÓDICO, C6H5O7Na3, actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando
así la coagulación. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una
proporción sangre: anticoagulante 9:1; así como para la velocidad de
eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. El citrato sódico se
utiliza a una concentración de 0.106 mol/L (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O).
EL CITRATO SÓDICO AL 3.8%. Es el anticoagulante de elección para los estudios de
coagulación. Se utiliza a una concentración de un parte de citrato sódico 0.11 M por
nueve partes de sangre total. Es totalmente necesario e imprescindible mantener la
relación anticoagulante/ sangre para realizar las pruebas de coagulación, los valores
obtenidos sin esta relación no tienen ningún valor diagnóstico. Ejemplo: para conseguir
un volumen total de muestra de 3 cc se deben poner en la jeringa 0,3 cc de citrato y
extraer 2,7 cc de sangre (0,3 x 9).
17
3. MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS
Material de laboratorio
4 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm Escobillón chico
Gradilla Franela
1 Pipeta Pasteur con bulbo Torundas con alcohol al 70%
Equipo vacutainer
Ligadura o tubo látex Equipo
Tubos al vacío con diferentes Centrífuga
anticoagulantes.
4. PROCEDIMIENTO
4.1 Toma de muestras sanguíneas con los anticoagulantes más comunes
1. Antes de proceder a la toma de muestra, observar las características que presenta
cada uno de los tubos con anticoagulante (Tapón morado o lila, tapón verde y
tapón azul).
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5. CUESTIONARIO
1. ¿Qué otros tipos de anticoagulantes existen?
2. ¿De los anticoagulantes antes mencionados, cual es el que más se utiliza en
Hematología?
3. ¿Por qué la cantidad de anticoagulante debe ser proporcional a la cantidad
de sangre?
4. ¿Cómo se preparan los anticoagulantes antes mencionados?
5. ¿Cuál es la diferencia entre suero y plasma?
19
PRACTICA No. 3
TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA CAPILAR Y ARTERIAL
1. COMPETENCIA
Lleva a cabo la punción capilar de acuerdo a la metodología establecida, a las
condiciones del paciente y al tipo de estudios a realizar.
2. INTRODUCCIÓN
La dermopunción permite colectar la sangre capilar que llega de las arteriolas,
vénulas y capilares, mediante una herida en la epidermis practicada con una aguja o
lanceta. La composición de esta sangre es más parecida a la arterial que a la
venosa.
Aunque parece una técnica fácil, se pueden cometer grandes errores que provoquen
problemas como; infección de la herida, abscesos y en algún caso osteomielitis, por
lo que se requiere de personal capacitado, un equipo de extracción adecuado según
las necesidades de cada paciente, así como un área destinada para tal fin. Al
identificar la muestra se debe indicar la forma de obtención de la muestra;
considerando que los resultados de algunas determinaciones varían con el tipo de
extracción de la sangre.
En los pacientes adultos la punción capilar es útil para obtener un volumen de sangre
pequeño y la punción puede ser en el lóbulo de la oreja, en el extremo o parte lateral
de la falange distal del tercer o cuarto dedo de la mano (anular o meñique).
Para los niños recién nacidos, la punción capilar se acostumbra en el talón o dedo
gordo del pie. Figura1. Con esta técnica se evitan extracciones venosas o arteriales
continuas, disminuyendo el riesgo de anemia y se reservan las vías periféricas para
otras necesidades o tratamientos. En caso estrictamente necesario, se podrá realizar
una extracción arterial.
De acuerdo al tipo de análisis solicitado, edad del paciente, y al volumen de sangre
requerido, el técnico elegirá el método más apropiado para la obtención de la
muestra.
20
Figura 1. Sitio de elección para la punción capilar.
4. PROCEDIMIENTO
4.1 Punción capilar
21
5. Una vez concluida la extracción; con una torunda, ejercer una ligera presión en el
lugar de la punción hasta que cese la hemorragia.
Figuras 2, 3 y 4
Figuras 5, 6, 7
Figura 8
22
En cuanto a la punción arterial, es un procedimiento que consiste en extraer sangre
arterial o canalizar una arteria a través de una punción en la piel, directa al lumen de
la arteria elegida, con fines diagnósticos (gasometría arterial, pH, etc.) o de
monitoreo.
5. CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las diferencias entre una punción capilar y una venosa?
2. Menciona los sitios de punción capilar en adultos y niños.
3. Menciona las precauciones que se deben tomar en cuenta en una punción capilar.
3. ¿Cuáles serían las ventajas y desventajas entre una punción capilar y una
venosa?
4. Investigar el procedimiento para la toma de muestra arterial en adultos y niños.
23
PRACTICA No. 4
MORFOLOGIA Y ALTERACIONES DE LOS GLÓBULOS ROJOS A PARTIR
DE UN FROTIS SANGUÍNEO
1. COMPETENCIA
Identifica la morfología normal de los glóbulos rojos y sus alternaciones a partir de un
frotis sanguíneo.
2. INTRODUCCIÓN
El eritrocito normal tiene forma de disco bicóncavo, con un diámetro promedio entre 6
y 8 micrometros, el cual disminuye discretamente con el envejecimiento. Su
flexibilidad le permite una deformidad que hace a la célula capaz de atravesar
capilares de hasta 2.8micros. El glóbulo normal se tiñe de color rojo-amorronado con
Wrigth y rosa con Giemsa. El tercio central de la célula es más pálido que la periferia
En caso de enfermedad se observan anormalidades morfológicas y se clasifican en 4
categorías:
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+ Células en Diana o tiro al blanco
+ Rouleaux
c) Variación en el color: Los eritrocitos normales tienen un HCM de
aproximadamente 30 pg. En frotis teñidos, el eritrocito tiene un área central de
palidez de más o menos la tercera parte del diámetro de la célula. En ciertos
trastornos las células llegan a contener menos hemoglobina de lo normal. El único
eritrocito que dispone de más hemoglobina de lo normal en relación con su
volumen es el esferocito.
+ Hipocromía
+ Hipercromía
+ Policromatofilia
+ Anisocromía
d) Inclusiones anormales en los eritrocitos: que son
+ Punteado Basófilo
+ Anillos de Cabot
+ Cuerpos de Howell-Jolly
+ Cuerpos de Pappenheimer
+ Siderocitos
3. FUNDAMENTO
Las células progenitoras de la serie roja que normalmente se encuentra en la médula
ósea, pero cuando éstas pasan a sangre periférica antes de su maduración en
normocitos o hematíes pueden sufrir ciertos cambios en su morfología, provocadas
por ciertas patologías como leucemias, anemias u otras alteraciones celulares.
25
10 Portaobjetos Agua destilada
Puente de tinción
Torundas con alcohol al 70%
Ligadura o tubo látex
1 Vaso de precipitado de 50mL
Franela
Escobillón chico
4. PROCEDIMIENTO
5.1 Morfología normal de los glóbulos y sus alteraciones
1. Realizar un frotis sanguíneo.
2. Realizar tinción del frotis con la técnica de Wright.
3. Observar el frotis al microscopio a 10X, 40X y 100X.
4. Identificar la morfología normal del eritrocito y sus alteraciones.
6. CUESTIONARIO
1. Explica en que patologías se presenta cada una de las alteraciones de los
glóbulos rojos antes mencionadas.
2. Realiza un esquema de cada una de las alteraciones morfológicas revisadas en
esta práctica.
3. Investiga que otras alteraciones en los glóbulos rojos existen.
4. Menciona otras causas no patológicas que provoquen este tipo de alteraciones.
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PRACTICA No. 5
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA POR EL MÉTODO DE LA
CIANOMETAHEMOGLOBINA
1. COMPETENCIA
Determinación de la hemoglobina por el método de la cianometahemoglobina a partir
de una muestra de sangre.
2. INTRODUCCIÓN
La hemoglobina es un pigmento de la sangre contenida en los eritrocitos y encargada
de transportar oxigeno de los pulmones a los tejidos. Es una proteína conjugada o
cromoproteína (96 por 100) por una proteína incolora (globina) que lleva en su
superficie cuatro grupos prostéticos hemo (formados a su vez por protoporfirina III y
un átomo de hierro, bivalente o ferroso), que confieren a la hemoglobina su color rojo
característico.
Aproximadamente el 33 por 100 del glóbulo es de proteína conjugada llamada
hemoglobina. Se dice que es proteína conjugada porque está formada por la proteína
globina unida al pigmento hemo. Su combinación con la globina unida constituye un
cuerpo químico (hemoglobina) coloreado; por lo tanto, se admite que la hemoglobina
es un pigmento.
La hemoglobina fetal en la sangre periférica disminuye después del nacimiento en
aproximadamente un 3 a 4% por semana de suerte que a los 6 meses de edad es
generalmente inferior a 2 a 3% de la hemoglobina total.
La hemoglobina forma una unidad de compuestos que se halla en el cuerpo y por lo
general, se reconocen por su espectro de absorción.
1. Hemoglobina reducida
2. Oxihemoglobina
3. Carboxihemoglobina
4. Metahemoglobina
5. Sulfohemoglobina
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3. FUNDAMENTO
La hemoglobina de los glóbulos rojos reacciona con el Ferricianuro de potasio
(reactivo de Drabkin). El ferricianuro oxida al hierro de la hemoglobina de ferroso (++)
a férrico (+++) para formar la metahemoglobina, la cual se combina con cianuro
potásico resultando un pigmento estable; la cianometahemoglobina (color rojizo). La
intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina
presente en la muestra.
Franela
Gradilla
Equipo vacutainer
Torundas con alcohol al 70%
Ligadura o tubo látex
Lancetas desechables estériles
5. PROCEDIMIENTO 5.1
Curva de calibración
1. Rotular una serie de tubos de ensaye o cubetas, como sigue; B (blanco de
reactivos), 5, 10, 15 y 20 g/dL de hemoglobina.
2. Pipetear los siguientes volúmenes de la solución estándar de
cianometahemoglobina y del reactivo de Drabkin, de acuerdo a la siguiente tabla.
1
No. Tubo 2 3 4 5
BLANCO
Solución estándar de
cianometahemoglobina 0.0 1.25 2.5 3.75 5.0
mL
Reactivo de Drabkin
5.0 3.75 2.5 1.25 0.0
mL
Concentración de
cianometahemoglobina 0 5 10 15 20
g/dL
29
8. Interpolar la lectura de absorbancia del problema en la curva de calibración para
conocer la concentración de la hemoglobina. La concentración del problema
también puede conocerse mediante el uso de la fórmula siguiente:
VALORES DE REFERENCIA:
Hombres: 13 a 18 g/dL
Mujeres: 11 a 16 g/dL
Niños: 12 a 14 g/dL
Recién nacidos: 16 a 22 g/dL
5. CUESTIONARIO
1. ,Cuál es la utilidad de la hemoglobina en el diagnóstico clínico?
2. La hemoglobina se combina con el oxígeno para formar oxihemoglobina ,Es ésta
reacción fácilmente reversible?
3. Menciona la composición química del reactivo de Drabkin?
4. Mencione las ventajas y desventajas de la técnica de la hemoglobina.
5. Menciona la función de la hemoglobina.
30
PRACTICA No. 6
DETERMINACIÓN DE HEMATOCRITO (MACRO Y MICRO) E ÍNDICES
HEMÁTICOS
1. COMPETENCIA
Realiza el hematocrito por la macro y micro técnica y lo utiliza para determinar el
número de eritrocitos. Además calcula los índices hemáticos a partir de la
concentración de hemoglobina, número de eritrocitos y el hematocrito aplicando las
fórmulas establecidas.
2. INTRODUCCIÓN
El hematocrito, es el volumen que ocupan los glóbulos rojos en 100 mL. Los hematíes
son las células que constituyen casi todo el volumen, mientras que los leucocitos y las
plaquetas ocupan una mínima parte de este volumen.
El hematocrito se determina centrifugando sangre con EDTA o heparinizada en
condiciones estandarizadas para evitar errores en la determinación, ya que el grado
de apilamiento de los glóbulos rojos depende del radio de la centrífuga, de la altura de
la columna de la sangre, del tiempo de centrifugación, etc.
El método de Wintrobe (macrométodo) para medida del hematocrito utiliza un tubo de
11.0 a 11.5mm de longitud y de 2.5 a 3.0mm de diámetro interno, con fondo plano. El
tubo tiene una doble escala de 0 a 10 cm. Dividido en mm. Por la derecha y de 10 a 0
por la izquierda.
En la actualidad existen los métodos automatizados que permiten realizar la
determinación con más rapidez y exactitud.
Si se utiliza sangre obtenida por punción capilar con una lanceta, se llenan
directamente los capilares heparinizados (longitud 70mm, diámetro 1mm).
ÍNDICES HEMÁTICOS
Se denominan índices hemáticos, corpusculares o índices de Wintrobe a los valores
que se calculan a partir de los datos del hematocrito, concentración de hemoglobina y
número de glóbulos rojos.
Estos índices proporcionan información sobre el tamaño y la concentración de
hemoglobina en los hematíes, permitiendo una primera orientación en el diagnóstico
de las anemias o cualquier otro tipo de alteración eritrocitaria. Son principalmente tres
y se calculan a partir de las siguientes fórmulas:
31
3. FUNDAMENTO
Cuando la sangre con anticoagulante es centrifugada por un tiempo establecido, los
eritrocitos sedimentan formando un paquete globular, mientras que en la parte
superior queda el plasma; líquido claro y ligeramente amarillento. EL cociente entre
el volumen de elementos formes y el volumen de sangre total es lo que se denomina
hematocrito.
4. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Material de laboratorio Equipo
2 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm Microcentrífuga
Gradilla Centrífuga eléctrica
1 Pipeta Pasteur de 9”con bulbo Cronómetro
Equipo vacutainer Lector de microhematocrito
2 Tubos de Wintrobe
Torundas con alcohol al 70%
2 Pipetas de Sahli
Ligadura o tubo látex
2 Tubos capilares
Cánula metálica
Mechero o lámpara de alcohol
Escobillón chico
Franela
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Hematocrito por macrométodo:
1. Obtener sangre venosa con anticoagulante. No olvidar homogeneizar el tubo de la
muestra.
2. Con una cánula metálica conectada a una jeringa o con una pipeta Pasteur;
aspirar sangre completa del tubo de muestra.
3. Llenar el tubo de Wintrobe comenzando desde el fondo, conforme se llena el tubo
se va sacando la cánula, hasta la marca de 0 – 10 (evitar la formación de burbujas
durante el llenado).
4. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 30 minutos.
32
5. Realizar la lectura del hematocrito (columna de glóbulos rojos), la franja blanca es
de leucocitos y no se toma en cuenta. Con la escala de abajo hacia arriba se
determina el % de hematocrito; cada subdivisión en mm equivales a 1%; por lo
tanto 10 cm equivale a un 100%. Figura 1.
Figura 1 Figura 2
33
2. La línea blanca (glóbulos blancos) debe coincidir con la línea marcada a la mitad
del canal escavado.
3. Girar el disco con el ángulo de 90º hasta que la línea de la izquierda coincida con el
inicio del paquete globular y la línea derecha coincida con el límite del plasma.
4. Leer el porcentaje de hematocrito ubicado en la línea media de la escala (0 a
100%). Figura 3.
Línea media en el
Canal
escavado
Punto de
Escala 0 a
Disco con un
Figura 3
VALORES DE REFERENCIA:
Hombres 40 a 54 % con promedio de 47%.
Mujeres 37 a 47% con promedio de 42%.
34
Donde: No eritrocitos/mm3= millones de eritrocitos/1 000 000.
Por ejemplo 5 500 000 eritrocitos/ 1 000 000. = 5.5
VALORES DE REFERENCIA:
Adultos 81 a 100 fL
Ancianos 90.5 a 105 fL
Recién nacidos 96 a 108 fL
Mayor 82 a 91 fL
VALORES DE REFERENCIA:
Adultos 27 a 35 pg
Ancianos 28 a 32 pg
Recién nacidos 32 a 34 pg
Mayor 27 a 31 pg
Valores por arriba de 32 pg indican hipercromia y por debajo de 26 pg Hipocromia.
VALORES DE REFERENCIA:
32 a 35 %
6. CUESTIONARIO
1. En la determinación del hematocrito, mencione las ventajas y desventajas del
macrométodo con respecto al micrométodo.
2. En la determinación del hematocrito; mencione ventajas y desventajas de los que
métodos automatizados con respecto al método que utilizaste.
3. De los dispositivos para calcular el % de hematocrito, ¿Cuál consideras que sea
el más confiable y por qué?
4. ¿Qué importancia tiene el hematocrito en el diagnóstico clínico?
5. Calcular el número de glóbulos rojos de acuerdo hematocrito obtenido por el
macro y por el micrométodo.
36
PRACTICA No. 7
VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)
1. COMPETENCIA
Determina la Velocidad de Sedimentación Globular pro macro y micrométodo, así
como la importancia que tiene en el diagnóstico clínico.
2. INTRODUCCIÓN
Cuando se deja reposar sangre que tiene anticoagulante, los eritrocitos se aglutinan
formando cilindros de células llamadas pilas, y luego se sedimentan. La velocidad con
la que ocurre ésta se llama Velocidad de Sedimentación Globular. La velocidad de
este proceso depende de varios factores, los más importantes son la velocidad a la
cual se forman las pilas y su tamaño; este a su vez depende del fibrinógeno
plasmático y las globulinas. No todas las muestras de sangre sedimentan con la
misma velocidad y en este determinismo intervienen otros factores, como por ejemplo
la viscosidad, la carga iónica de los hematíes, elementos lipídicos, etc.
Las muestras de sangre que sedimentan con rapidez presentan conglomerados de
hematíes en forma de pilas de monedas que se unen luego a otros conglomerados
semejantes. En cambio, la sangres que se sedimentan con lentitud presentan algunos
conglomerados semejantes, pero la mayor parte de los glóbulos rojos permanecen
formando paquetes aislados e irregulares.
De acuerdo con Barcells-Gorina, el valor diagnóstico de la eritrosedimentación reside
en los siguientes fundamentos:
a) Índice de la intensidad de un proceso patológico.
b) Aporta datos útiles: el color de la columna de plasma puede demostrar la
existencia de una hiperbilirrubinemia cuando aún la ictericia no es manifiesta.
c) El aspecto lechoso permite detectar una hiperlipemia. Desde luego, la
eritrosedimentación presenta limitaciones porque es inespecífica, tiene un carácter
en general tardío y es inconstante.
Existen sistemas para la medida de la VSG con aspiración neumática de la sangre y
cierres herméticos de la parte inferior y superior.
Los métodos más empleados para la determinación de la VSG son el de Wintrobe, el
de Westergen y el micrométodo.
37
3. FUNDAMENTO.
La velocidad de sedimentación globular (VSG) mide el tiempo necesario para que los
eritrocitos de la muestra de sangre completa se sedimenten en el fondo de un tubo
vertical. Los glóbulos rojos en el tubo desplazan el mismo volumen de plasma en
sentido ascendente. La VSG es una prueba sensible pero inespecífica que aporta
datos de enfermedad cuando otros signos y síntomas aun no se manifiestan.
38
VALORES DE REFERENCIA:
Hombres 0 a 7 mm/hora
Mujeres 0 a 15 mm/hora Niños
0 a 15 mm/hora
6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué importancia tiene la determinación de la VSG para el diagnóstico clínico.
2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el método utilizado con otros métodos?
3. Mencione los factores que puedan alterar los resultados.
4. Mencione otra técnica para la determinación de esta prueba.
39
PRACTICA No. 8
RECUENTO DE RETICULOCITOS
1. COMPETENCIA.
Ejecuta e interpreta la cuenta de reticulocitos en sangre periférica humana para
conocer la eficacia de la eritropoyesis.
2. INTRODUCCIÓN.
Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre del ser humano en
proporción de cinco a diez por mil hematíes. Se caracterizan por contener una
pequeña cantidad de ARN formando un pequeño granulo filamentoso observable al
ser teñido por colorantes. Es una célula anucleada, con capacidad de síntesis de
hemoglobina, proteínas y ARN. Su tamaño es algo superior al eritrocito maduro (8 a 9
micras), conservando un cierto grado de basofilia (hematíe policromatófilo). Con la
tinción vital de azul de cresil brillante, puede observarse la sustancia ribosómica
reticulada. Permanece 48 horas en la médula ósea antes de pasar a sangre periférica,
donde continua como tal 24 horas más hasta finalizar su maduración saturándose de
hemoglobina y convirtiéndose en hematíe maduro (6 a 8 micras)
El número de reticulocitos es de gran valor para Conocer la eficacia de la
eritropoyesis, Clasificar las anemias en regenerativas o arregenerativa y conocer, lo
antes posible, la eficacia de un tratamiento con vitamina B12, ácido fólico o hierro
ferroso.
3. FUNDAMENTO
Los reticulocitos son la etapa anterior del eritrocito en el periodo de maduración
localizándose en médula ósea y sangre periférica: los restos de RNA que presentan
se precipitan y aglutinan por la acción de colorantes supravitales, apareciendo como
gránulos o retículo teñido de azul.
40
4. MATERIAL DE LABORATORIO, EQUIPO Y REACTIVOS REQUERIDOS:
Material de vidrio Equipo
2 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm Microscopio
1 Pipeta Pasteur con bulbo Termómetro
10 Portaobjetos Baño maría
Puente e tinción Contador manual o mecánico
Gradilla Reactivos
Equipo vacutainer Azul de cresil brillante
Torundas con alcohol al 70% Nuevo azul de metileno
Ligadura o tubo látex Solución limpiadora
Franela
Aceite de inmersión
Papel absorbente
Escobillón chico
Aplicadores de madera
Algodón
5. PROCEDIMIENTO 5.1
Cuenta de reticulocitos
1. Colocar en un tubo de ensaye limpio y seco 12 gotas de sangre y 12 gotas de
colorante azul de cresil brillante o colorante nuevo azul de metileno.
2. Mezclar e incubar durante 10 a 15 minutos a baño maría a 37°C.
3. Decantar el sobrenadante (aproximadamente la mitad del mismo).
4. Con el sobrenadante obtenido, mezclar y realizar frotis (procurar que el frotis no
sea tan grueso ni tan delgado)
5. Enfocar el microscopio a 10X y 100X (objetivo de inmersión) y contar el número
de reticulocitos encontrados en 1000 eritrocitos (aproximadamente en 5 campos
donde se observen reticulocitos).
6. Mediante una proporción directa calcular el porcentaje de reticulocitos en 1000
eritrocitos como se indica a continuación:
% Reticulocitos = No. de reticulocitos X 100
1000 eritrocitos
41
Corrección de la Centa de Reticulocitos cuando hay Anemia:
VALORES DE REFERENCIA.
Adultos: 0.5 a 1.5%
Recién nacidos: 2.5 a 6.0%
42
6. CUESTIONARIO.
1. Mencione otros métodos de laboratorio para el recuento de reticulocitos.
2. ¿Qué importancia tiene el recuento de reticulocitos en el diagnóstico clínico?
3. ¿Qué otros colorantes se pueden utilizar para la tinción de reticulocitos?
4. ¿Cuáles fueron las dificultades que encontraste en el desarrollo de esta prueba?
43
PRACTICA No. 9
CUENTA TOTAL DE LEUCOCITOS
1. COMPETENCIA
Realiza cuenta de leucocitos o glóbulos blancos en base a la metodología
establecida.
2. INTRODUCCIÓN
El recuento de leucocitos es la cantidad que hay de glóbulos blancos por mm3, de
sangre total. Si el recuento arroja cifras superiores a 10,000 leucocitos por mm 3, se
denomina leucocitosis, mientras que un resultado por debajo de los valores normales
(5,000X mm3) recibe el nombre de leucopenia, en los niños la cifra de leucocitos
experimenta grandes variaciones durante la enfermedad tanto, que se produce un
aumento de leucocitos mayor en la tarde que en la mañana. Un número elevado de
leucocitos puede ser indicativo de infección.
El término leucocitos incluye todas las células blancas de la sangre (neutófilos,
basófilos, eosinófilos, etc.) que se estudiarán más adelante (cuenta diferencial).
Químicamente los leucocitos se componen de agua (82%), fosfolípidos,
nucleoproteínas, glucógeno, ácido láctico, zinc, magnesio, calcio, cloro, fósforo
inorgánico y bicarbonato, la glucólisis en los leucocitos es fundamentalmente
anaerobia.
Existen dos metodologías para la cuenta de leucocitos; la manual o microscópica y la
electrónica. Los contadores electrónicos de células son sistemas que determinan el
número de células de un medio, utilizando dos características físicas la conductividad
electrónica y la difracción de la luz. Mientras que el método manual consta en la
dilución de la muestra y la cuenta de leucocitos al microscopio.
Para la cuenta de leucocitos, se utiliza la pipeta de Thoma con un bulbo con
capacidad de 10 veces más que el resto de la pipeta. En el bulbo se encuentra una
bolita de plástico para favorecer la homogeneización de la dilución 1:20. Figura 1.
44
Figura 1. Pipeta de Thoma para glóbulos blancos, tubería de hule y boquilla.
Cámara de Neubauer
La cámara de Neubauer consta de un portaobjetos de vidrio de 20X26mm, de
espesor 0.4-0.6mm, con una cuadricula en el centro de su superficie y un
cubrehemacitómetro o hematímetro ópticamente plano.
El área de la cuadricula es de 9 mm2 con 9 cuadros de 1mm2. Con el
cubrehemacitómetro se obtiene una profundidad de 0.1 mm. Por lo tanto el volumen
de la cámara es de 0.9mm3 (0.9 µL); cada uno de los 9 cuadros de 0.1mm 3 (0.1µL).
Los cuadros de las cuatro esquinas están divididos en 16 cuadros 0.25mm de lado
(0.0625 mm2). El cuadro central está dividido en 25 cuadros y cada cuadro está
dividido en 16 cuadros más de 0.05mm de lado (0.0025 mm 2 de área). Figura 2 y 3.
1 2 3
4 5
6
7 8 9
Figura 2. Cámara
de Neubauer
Figura 3. Cuadricula de la cámara
de Neubauer
45
3. FUNDAMENTO
La muestra de sangre diluye en solución de ácido acético y violeta de genciana. La
solución hipotónica de ácido acético destruye a los eritrocitos. El violeta de genciana
permite reconocer fácilmente el líquido y observar mejor los glóbulos blancos, a los
que tiñe ligeramente.
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Procedimiento para la cuenta de leucocitos con la cámara de Neubauer.
1. Una vez obtenida la muestra de sangre con anticoagulante mezclar durante 2
minutos aproximadamente.
2. Con la boquilla de la manguera de hule conectada a la pipeta de Thoma,
introducir el extremo libre de la pipeta en el tubo de sangre y aspirar la sangre
hasta la marcada 0.5 (50 µL). Evitar la formación de burbujas en el interior de la
pipeta.
3. Limpiar el exceso de sangre en la superficie exterior de la pipeta con gasa o
papel absorbente, el volumen de sangre debe permanecer en la marca 0.5. Si el
volumen de sangre está por arriba de la marca 0.5; eliminar el exceso por
contacto con la gasa o papel absorbente.
46
4. Con el extremo libre de la pipeta casi vertical; dentro del contenedor del líquido de
Turk y aspirar lentamente hasta que alcance la marca 11. DiluciOn 1:20. Evitar la
formaciOn de burbujas.
5. Homogeniezar durante 2 minutos manualmente o en agitador mecánico para
homogeneizar la diluciOn y completar la hemolisis de los globulosa rojos.
6. Limpiar la cámara de recuento y el cubrehematímetro con un paño limpio que no
deje pelusa. Puede utilizar, etanol al 96%.
7. Colocar cuidadosamente el cubrehematímetro sobre la cuadricula de la cámara
quedando preparada para colocar la muestra. Figura 4.
8. Desconectar la pipeta de la tubería de hule y con el dedo índice obstruir el
extremo superior de la pipeta para evitar la salida de la diluciOn.
9. Desechar las cuatro primeras gotas del contenido de la pipeta en papel
absorbente.
10. Colocar el extremo inferior de la pipeta sobre el borde del área cuadriculada de la
cámara; permitir el descenso de la diluciOn hasta llenar exactamente la cámara
de Neubauer. Evitar mover el cubrehematimetro. Figura 5.
11. Dejar en reposo la cámara por 1 minuto para permitir que los leucocitos
sedimenten.
12. Colocar la cámara sobre la platina y enfocar con el objetivo de bajo poder (10 X);
los pequeños puntos oscuros corresponde a los glObulos blancos. Figura 6
13. Identificar en la cámara los cuatro cuadrantes donde se deberá realizar el conteo
de leucocitos; comenzar con el cuadro superior izquierdo, hasta terminar con el
cuadrante derecho inferior. Figura 7. Si hay células que lindan con los bordes
exteriores del cuadro grande se cuentan las células que toquen la línea de en
medio pero solamente en dos de los lados.
14. Calcule el número de leucocitos por milímetro cúbico como se indica a
continuaciOn.
47
Figura 4. Cubreobjetos Figura 5. Llenado de la cámara de
sobre la cuadricula de la Neubauer.
cámara de Neubauer.
48
Figura 5. Cámara de Neubauer en el Figura 6. Observación de la
microscopio. cuadricula de la C. de
Neubauer al microscopio.
VALORES DE REFERENCIA.
Adultos: 4500 a 11000 X mm3
5.2 Trabajo a desarrollar por el alumno
1. Realiza el procedimiento para el contero de leucocitos en cámara de Neubauer.
2. Realizar los cálculos correspondientes.
3. Elaborar una tabla por grupo de los resultados de cada equipo.
4. Interpretar el resultado obtenido.
6. CUESTIONARIO.
1. Mencione la importancia que tiene el recuento de leucocitos en el diagnóstico
clínico.
2. ¿Si hay un número elevado de leucocitos, de que se sospecha?
3. Mencione otros métodos de laboratorio para el recuento de leucocitos
4. Defina el término Leucopoyesis.
5. Mencione la función que tienen los Eosinófilos.
6. Mencione los leucocitos que participan en una reacción de hipersensibilidad.
49
PRACTICA No. 10
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y TINTORIALES DE LEUCOCITOS
1. COMPETENCIA
Identifica las características morfolôgicas y tintoriales de los leucocitos a través de un
frotis sanguíneo teñido con el colorante de Wright.
2. INTRODUCCIÓN
A partir de un frotis sanguíneo teñido puede observarse la morfología de los elementos
de la sangre aportando al experto; informaciôn aproximada de la cantidad de
hemoglobina y del numero de glôbulos blancos y rojos
La coloraciôn de las células de la sangre se base en la utilizaciôn de colorantes tipo
Romanowsky que utiliza una mezcla de colorantes básico y acido (azur B y eosina Y). La
coloraciôn de Giemsa. Leishman, May-Grünwald y Wright son algunas de las
coloraciones derivadas del método original de Romanowsky. Son útiles para la tinciôn
diferencial de la mayoría de las estructuras normales y anormales de la sangre. La
mayoría de los métodos mencionados usan colorantes que se disuelven en alcohol
metílico y combinan la fijaciôn y la tinciôn.
Las propiedades de la tinciôn de Romanowsky dependen de la uniôn de los
colorantes a las estructuras químicas de las células sanguíneas. Los ácidos
nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo,
fijan el azur B, colorante básico. Las moléculas de hemoglobina y las proteínas
básicas se unen a la eosina Y (colorante ácido).
Los frotis de sangre deben realizarse en portaobjetos de vidrio que previamente se
hayan lavado y secado, para eliminar restos de grasa. Los frotis de sangre son
esenciales para el estudio morfolôgico y cuantitativo de las células sanguíneas. Un
frotis de buena calidad presentara tres áreas; la cabeza o zona de inicio, el cuerpo ô
zona media y la cola ô área final del mismo. Un frotis no deberá ser ni grueso ni
delgado. En un frotis bien realizado, la tinciôn será de mejor calidad.
Los leucocitos comenzaron a estudiarse en frotis sanguíneos teñidos, por lo que la
nomenclatura utilizada para diferenciarlos se basa principalmente en su aspecto en
esta clase de preparaciôn. Se acepto que las cinco clases de leucocitos
representaban solo dos tipos; el primero caracterizado por citoplasma granuloso y el
50
segundo por citoplasma no granuloso. Entonces los leucocitos se clasificaron en
granulosos y no granulosos.
Dentro de los leucocitos granulosos; los que tienen gránulos específicos que se tiñen
ávidamente con colorantes ácidos, se llaman leucocitos granulosos acidofilos ya que
la resina es el colorante que suele emplearse.
Los que tienen gránulos que se tiñen intensamente con colorantes básicos se llaman
leucocitos granulosos basófilos o sencillamente basófilos.
3. FUNDAMENTO.
Al realizar la tinción de Wright las células se tiñen de acuerdo a su afinidad por los
colorante ácido o básico.
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Tinción de Wright
1 Hacer un frotis sanguíneo.
2 Colocarlo sobre el puente de tinción.
3 Al frotis se le agrega colorante de Wright cubriendo toda la extensión.
4 Inmediatamente después se le agrega el buffer, dejando reposar de 5 a 10 minutos.
También se puede agregar los reactivos por separado, primero el colorante de
Wright durante 10 minutos, cubriendo totalmente la extensión y posteriormente la
solución buffer durante 8 minutos. El tiempo para la tinción va a
51
depender de la madurez del colorante, entre más maduro menor es el tiempo de
tinción.
5 Con la pipeta Pasteur soplar a la muestra para mezclar el colorante de Wright y la
solución buffer
6 Lavar a chorro de agua procurando no dañar la película de sangre.
7 Dejar secar el frotis teñido a temperatura ambiente limpiando el excedente de
colorante de la parte posterior con una torunda de alcohol.
8 Enfocar con el objetivo de 10X y observar al microscopio con el objetivo de
inmersión (100X).
52
6. CUESTIONARIO
1. Menciona las características tintoriales que presentan los leucocitos al teñirlos con
colorante de Wright y colorante de Giemsa.
2. Menciona las características tintoriales que presentan los leucocitos al teñirlos con
colorante de Giemsa y colorante May-Grünwald.
3. ¿Cómo se preparan los colorantes mencionados?
53
PRACTICA No. 11
CUENTA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS Y SUS VALORES ABSOLUTOS
1. COMPETENCIA
Ejecuta el recuento diferencial de leucocitos a partir de un frotis sanguíneo teñido con
el colorante de Wright para identificar los diferentes leucocitos.
2. INTRODUCCION
El porcentaje de los diferentes tipos de leucocitos se realiza en una extensión
sanguínea teñida. El número efectivo de cada variedad de leucocitos en un
microlitro de sangre e calcula a partir de estos porcentajes además de la cuenta
diferencial de los leucocitos, también es conveniente revisar la morfología de los
eritrocitos. Si las extensiones de sangre están mal efectuadas, los leucocitos
pueden estar irregularmente distribuidos, incluso en extensiones bien realizadas,
existe una tendencia de los linfocitos a permanecer en el centro de la extensión y
de las células más grandes (neutrofilos y monocitos) en los extremos. Hasta en las
extensiones de sangre más perfectas, la formula leucocitaria esta expuesta a
muchos errores, debido a una distribución al azar, de los diferentes leucocitos, a la
habilidad de los técnicos; ya que estos deben conocer perfectamente los 5 tipos de
leucocitos que se observan en la sangre y con las células que entran a la sangre en
los procesos patológicos.
3. FUNDAMENTO
La cuenta diferencial de leucocitos se basa en la tinción típica de los componentes de
las células blancas. En la tinción de Wright; el azul de metileno (básico); confiere un
colore azul-morado al núcleo de las células (DNA, RNA) y algunas estructuras del
citoplasma y la eosina (ácido) confiere un color naranja-rojo; las estructuras del
citoplasma (proteínas con grupos amino). Cuando ambos colorantes tiñen los
componentes del citoplasma de rosa-lila; la reacción es neutrofila.
54
10 portaobjetos Reactivos
Puente de tinción Colorante de Wright
Gradilla Solución Buffer de fosfatos
Equipo vacutainer Aceite de inmersión
Torundas con alcohol al 70% Ligadura o Franela Papel absorbente
tubo látex Escobillón chico
5. PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis sanguíneo inmediatamente después de tomar la muestra, porque
los anticoagulantes tienden a alterar la morfología de las células o de preferencia con
la sangre sin anticoagulante que queda en la jeringa.
2. Colocar el frotis sobre el puente de tinción. Agregar colorante de Wright cubriendo
toda la extensión; inmediatamente después se le agrega el buffer, dejando reposar de
5 a 10 minutos.
3. También se pueden agregar los reactivos por separado, primero el colorante de
Wright durante 10 minutos, cubriendo totalmente la extensión y posteriormente la
solución buffer durante 8 minutos.
4. Con la pipeta Pasteur soplar a la muestra para mezclar el colorante de Wright y la
solución buffer.
5. Enjuagar a chorro de agua procurando no dañar la película de sangre.
6. Dejar secar el frotis teñido a temperatura ambiente limpiando el excedente de
colorante de la parte posterior con una torunda de alcohol.
7. Enfocar con el objetivo de 10X y observar al microscopio con el objetivo de
inmersión (100X). Realizar el conteo de los diferentes leucocitos en el centro del
frotis y con desplazamientos en forma de greca.
8. Los diferentes leucocitos se van registrando en el contador manual, hasta contar
100 células.
Cálculos:
Fórmula leucocitaria para obtener el valor absoluto de leucocitos.
La fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas
clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes
55
puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm 3 de
sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.
Por ejemplo:
Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos total es
de 20 000, entonces la cifra absoluta de neutrófilos segmentados sería:
Los valores relativos sólo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos se
encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se
debe emplear la fórmula para obtener el valor real, y así determinar que elemento
celular se encuentra fuera del rango normal, sea elevado o disminuido.
56
A B C
D E
6. CUESTIONARIO:
1. ¿Qué diferencia hay entre un monocito y un linfocito?
2. Escriba algunos ejemplos o casos en donde se encuentre cifras bajas y también
donde hay cifras altas de leucocitos?
3. ¿Qué es una desviación a la izquierda en una cuenta diferencial?
4. ¿Dónde se reproducen los linfocitos T y B?
5. ¿Qué diferencias hay entre un neutrófilo segmentado y un eosinófilo?
57
PRACTICA No. 12
CITOMETRÍA HEMÁTICA
1. COMPETENCIA
Realiza la Citología Hemática en base a la metodología establecida.
2. INTRODUCCIÓN
La Citometría Hemática o Biometría Hemática; es una prueba de laboratorio clínico
que comprende la determinación de varios parámetros como hemoglobina,
hematocrito, glóbulos rojos, glóbulos blancos, etcétera. En la mayoría de los
hospitales, la Citología Hemática consiste en la determinación de la fórmula roja
(hemoglobina, hematocrito, Concentración Media de Hemoglobina Corpuscular
(CMHC), Volumen Corpuscular Medio (VCM), y Hemoglobina Corpuscular Media
(HCM)) y fórmula blanca (leucocitos y cuenta diferencial de leucocitos), además de
plaquetas, velocidad de sedimentación globular y reticulocitos. En la actualidad con
la incorporación de equipo automatizado al laboratorio, se ha hecho posible efectuar
de forma rutinaria el recuento de hematíes. La Citología Hemática tiene una gran
importancia; ya que, además de ser utilizada como procedimiento de rutina
constituye una gran ayuda para el diagnóstico de muchas afecciones. Sirve de
indicador de los progresos del paciente en algunos estados patológicos, como
infecciones y anemias.
3. FUNDAMENTO
A través de los métodos y técnicas conocidas se obtendrán los cálculos y resultados
de los parámetros que abarca la Citología Hemática.
58
4. MATERIAL EQUIPO Y REACTIVOS
Material de laboratorio Equipo
2 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm Microscopio
1 Pipeta Pasteur con bulbo Contador mecánico
10 portaobjetos Centrífuga eléctrica
1 Puente de tinción Microcentrífuga
2 Cámaras de Neubauer Agitador para pipetas de Thoma
2 pipetas de Thoma para glóbulos rojos Contador manual
2 Cajas de petri Contador mecánico
2 Tubos de Wintrobe Gradilla de sedimentación
2 Capilares Lector de microhematocrito
2 Pipetas de Sahli Baño maría
2 Pipetas de toma para glóbulos blancos Espectrofotómetro
1 Pipeta serológica de 5 mL. Reactivos
Celdillas Colorante de Wright
Termómetro Solución buffer de fosfatos
Gradilla Aceite de inmersión
Equipo vacutainer Oxalato de amonio
Torundas con alcohol al 70% Diluyente de Turk
Ligadura o tubo látex Reactivo de Drabkin
Franela Azul brillante de cresilo
Papel absorbente Nuevo azul de metileno
Escobillón chico Solución limpiadora
Boquilla anticoagulante
Papel filtro
Papel parafilm
Aplicadores de madera
Algodón
Cánula metálica
Mechero o lámpara de alcohol
59
5. PROCEDIMIENTO.
1. Realizar las diferentes determinaciones que comprenden una Citología Hemática
Completa
2. Anotar los resultados obtenidos en cada una de las pruebas realizadas, así como
las fórmulas y unidades correspondientes a cada una.
FÓRMULA ROJA
Hematocrito por macrométodo: ______ Hematocrito micrométodo:
V.S.G.: V.C.M.: H.C.M.: C.H.C.M.:
Hemoglobina: ____________________ Glóbulos rojos: ________
Reticulocitos: _________________
FÓRMULA BLANCA.
Cuenta total de leucocitos: ______________
Cuenta diferencial de leucocitos en porcentaje:
N. segmentados:_________ N. Banda:___________ Eosinófilos:
Basófilos: Linfocitos: Monocitos:
Valores absolutos de Leucocitos:
N. segmentados:____________ N. en banda: ___________ Eosinófilos:
Basófilo: Linfocito: Monocito:
6. CUESTIONARIO
1. Menciona los parámetros que incluye una Citología Hemática completa.
2. ¿Qué importancia tiene la Citología Hemática en el diagnóstico clínico?
3. ¿Qué es una Citología Hemática?
60
PRACTICA No. 13
CUENTA DE PLAQUETAS
1. COMPETENCIA
Realiza el recuento de plaquetas por el método directo e indirecto en una muestra de
sangre.
2. INTRODUCCIÓN
Las plaquetas o trombocitos, se desprenden del citoplasma de los megacariocitos
adultos. Son los elementos formes más pequeños (1 a 4 micras) y están desprovistas
de núcleo, por lo que no se trata de verdaderas células, sino fragmentos celulares. En
los frotis se observan a menudo aglomeradas, debido a su gran capacidad de
agregación. La vida media de las plaquetas es aproximadamente de 8 a 11 días. En
sangre periférica las plaquetas se observan en forma discoidal, ovalada, redondeada
o fusiforme y de superficie lisa.
Las plaquetas intervienen fundamentalmente en varios aspectos de la hemostasia.
Forman los llamados tapones hemostáticos primarios y participan en la hemostasia
secundaria.
En ocasiones, el recuento de plaquetas puede dar falsos resultados por su agregación
debido a las condiciones de extracción la muestra; de modo que la lectura del
contador da un número bajo de plaquetas de gran tamaño.
3. FUNDAMENTO
Las plaquetas diluidas con solución de oxalato de sodio, adquieren una tonalidad
brillante, se cuentan al microscopio montadas en la cámara de Neubauer.
61
4. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Material de laboratorio Equipo
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm Microscopio
1 Pipeta Pasteur con bulbo Contador mecánico
10 portaobjetos Agitador para pipetas de Thoma
Puente de tinción Reactivos
2 Cámaras de Neubauer Solución Buffer de fosfatos
2 pipetas de Thoma para glóbulos rojos Oxalato de amonio
2 Cajas de petri Colorante de Wright
Gradilla Aceite de inmersión
Equipo vacutainer
Torundas con alcohol al 70%
Ligadura o tubo látex
Franela
Papel absorbente
Escobillón chico
Boquilla
Papel filtro
5. PROCEDIMIENTO
5.1 Método directo
1. Homogeneizar la muestra y llenar una pipeta de Thoma para glóbulos rojos hasta
la marca de 0.5.
2. Limpiar el excedente de sangre y llenar con líquido diluyente (oxalato de amonio
al 1%) hasta el aforo de 101, evitar la formación de burbujas.
3. Homogeneizar la dilución manualmente o en agitador mecánico por 2 minutos.
4. Desechar de 3 a 5 gotas.
5. Cargar la cámara de Neubauer por ambos extremos.
6. Dejar reposar 15 minutos dentro de una caja de petri con papel húmedo para
evitar la desecación (cámara húmeda).
7. Contar el número de plaquetas en todo el cuadro central.
8. El número de plaquetas se calcula por medio de la siguiente fórmula:
62
5.2 Método indirecto o de Fonio
1. Realizar frotis sanguíneo en portaobjetos y se deja secar al aire.
2. Teñir con colorante de Wrigth o Giemsa.
3. Enjuagar con agua corriente y dejar secar al medio ambiente.
4. Contar 1000 eritrocitos y simultáneamente las plaquetas que se encuentran entre
estos. Figura 1-3.
5. El número de plaquetas contadas, se relacionan con el número total de eritrocitos
contenidos en 1 mm cúbico de sangre. El número de glóbulos rojos se obtiene
realizando un micro hematocrito.
6. Para calcular el número de plaquetas por mm se aplica la siguiente fórmula:
63
VALORES DE REFERENCIA
150 000 a 450 000 plaquetas por mm 3
6. CUESTIONARIO
1. ¿Qué importancia tiene el recuento de plaquetas?
2. Menciona el concepto de trombocitosis
3. Menciona tres funciones de las plaquetas.
4. Mencione los términos que se le da al aumento y disminución de plaquetas.
5. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el método directo con respecto al método
indirecto para el recuento de plaquetas?
64
PRACTICA No 14
DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA (TP) Y DEL TIEMPO DE
TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa)
1. COMPETENCIA
Determina el TP Y TTPa por los métodos establecidos para el estudio de la
hemostasia con el fin de conocer la tendencia hemorragia de una persona.
2. INTRODUCCIÓN
Hemostasia es el nombre que se aplica al conjunto de fenómenos que combaten y
detienen el sangrado por un vaso sanguíneo lesionado.
Los mecanismos hemostáticos son procesos complejos que implican una secuencia
de transformaciones físicas y químicas desencadenadas por la lesión del vaso y que
finalizan con la transformación de la sangre fluida en un trombo o coágulos que
tapona la lesión. Los mecanismos hemostáticos implican fenómenos que tienen lugar
fuera de los vasos (extravasculares), en los vasos y dentro de los vasos
(intravasculares).
a) Fenómenos extravasculares: Comprenden el efecto físico de los tejidos
circunvecinos (piel, músculo, tejido elástico) que tiende a cerrar y ocluir la abertura
en el vaso sanguíneo lesionado, los efectos bioquímicos de las sustancias
liberadas por los tejidos lesionados que reaccionan con el plasma y los factores de
las plaquetas. Mecanismo extrínseco de coagulación.
b) Fenómenos vasculares: El vaso sanguíneo lesionado se cierra casi
instantáneamente (vasoconstricción).
c) Fenómenos intravasculares. Serie compleja de reacciones fisicoquímicas que
transforman la sangre líquida en coagulo de fibrina.
En resumen, la formación del coagulo sanguíneo que tapona la lesión producida sobre
un vaso; es un proceso molecular regulado por la interacción del endotelio, las
plaquetas y las proteínas de la coagulación y fibrinólisis.
El mecanismo intrínseco de la coagulación agrupa los fenómenos vasculares y los
intravasculares que incluyen las reacciones que transforman el fluido sanguíneo en un
coágulo sólido.
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NOMENCLATURA DE LOS FACTORES DE COAGULACIÓN
FACTOR NOMBRE HABITUAL SINÓNIMO
I Fibrinógeno
II Protrombina
III Tromboplastina tisular
IV Calcio Factor lábil, globulina Ac
V Acelerina
VI No asignado Factor estable, (SPCA)
VII Proconvertina Globulina antihemofilico (AHG)
VIII Factor antihemofílico (AHF) Factor antihemofilico A
IX Componente de tromboplastina del plasma
(PTC) Factor Christmas, F. antihemofílico B
X Factor Stuart - Prower Factor antihemofílico C
XI Antecedente de tromboplastina del plasma (PTA)
Factor Hageman Factor de vidrio o de contacto
XII Fibrinasa Factor estabilizador del coágulo o de la
XIII fibrina
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4. PROCEDIMIENTO
VALORES DE REFERENCIA:
Un plasma normal debe coagularse en 12 - 13 segundos.
Causas de error:
a) El contacto de la sangre con una superficie de vidrio produce una actividad
aceleradora del coágulo, incluso en presencia de anticoagulantes que fijen el
calcio adecuadamente.
b) El plasma almacenado a 37º C pierde la actividad del factor V. Las muestras
deben utilizarse en seguida o congelarse.
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4.2 Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPa)
Fundamento: Al agregar al plasma descalcificado, cloruro de calcio y un concentrado
de fosfolípidos hísticos o plaquetarios, el plasma coagulara en menos de 45
segundos; si existe integridad en los factores que intervienen en la vía intrínseca de la
primera fase de la coagulación.
Técnica.
1. Centrifugar la muestra y separar el plasma.
2. Colocar en un tubo 0.1 mL de tromboplastina parcial activada e incubar 2 minutos a
37°C.
3. Adicionar 0.1 mL de plasma, agitando rápidamente y colocar en baño maría a 37°C
por 2 minutos.
4. Adicionar 0.1 mL. de Cloruro de Calcio 0.02 M, iniciar el conteo del tiempo en el
cronómetro; a los 20 segundos observar cuidadosamente la muestra
removiendo con un aplicador parar el cronometro hasta la aparición de los
primeros hilos de fibrina.
VALORES DE REFERENCIA.
Menos de 45 segundos.
5. CUESTIONARIO:
1. Explique qué es la hemofilia.
2. Mencione las fases de la hemostasia.
3. ¿Qué nos indican los valores bajos en cada una de las pruebas que se
practicaron?
4. Mencione 3 factores que influyen en el TP y TTP
5. ¿Cuál es la importancia clínica de estas pruebas?
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PRACTICA No 15
DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE COAGULACIÓN, TIEMPO DE SANGRADO Y
PRUEBA DEL TORNIQUETE
1. COMPETENCIA
Realiza las pruebas de de la hemostasia con el fin de conocer la tendencia
hemorragia del paciente.
2. INTRODUCCIÓN
Los exámenes de coagulación son los más sensibles a las condiciones de extracción
de la muestra, preparación del paciente y transporte. Estas muestras se alteran
fácilmente si no se realizan los procesos pre analíticos adecuados. Otros exámenes
de coagulación son el Fibrinógeno, los Productos de Degradación del Fibrinógeno
(PDF), el Anticoagulante Lúpico, la Antitrombina III y los estudios completos de
Trombofilia. Estos exámenes son más específicos y no son parte de la rutina de los
exámenes de coagulación.
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4. PROCEDIMIENTO
4.1 Tiempo de coagulación (Método de Lee-White)
Fundamento: La sangre al salir de su ámbito normal coagula espontáneamente
debido a la activación de los factores de contacto. Permite valorar mecanismo
intrínseco de la coagulación.
Técnica
1. Marcar dos tubos de 13 X 75 mm.
2. Obtener 5mL de sangre y simultáneamente al aparecer la sangre en la jeringa,
poner en marcha el cronómetro.
3. Separar la aguja de la jeringa y colocar aproximadamente 1mL de sangre en cada
uno de los tubos.
4. Colocar los tubos en baño maría a 37°C durante 5 minutos
5. Inspeccionar uno de los tubos inclinándolo suavemente cada 30 segundos hasta
que al invertir la sangre esté coagulada totalmente y no escurra sangre por las
paredes del tubo. Proceder de la misma forma con el siguiente tubo. Figura 1 –3.
6. El tiempo de coagulación corresponderá al tiempo total registrado
Figura 1 y 2
Figura 3
VALORES DE REFERENCIA:
5 A 8 minutos.
4.2 Tiempo de sangrado (Método de Duke)
Fundamento: El método de Duke consiste en medir el tiempo que tarda en ceder
una hemorragia causada por la lesión de un número pequeño de capilares (lóbulo de
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la oreja). Prueba sensible a los defectos en la retracción del capilar, la cantidad y
calidad de las plaquetas.
Ratnoff propone una prueba similar, realizando la incisión en la yema del dedo, lo que
permite controlar mejor la hemorragia.
Técnica
1. Dar masaje suave en el lóbulo de la oreja, limpiar con alcohol y se dejara secar.
2. Puncionar el lóbulo de la oreja con una lanceta haciendo una incisión de 2 a 3 mm
de profundidad (con movimiento rápido y firme). Tan pronto como se haga la
incisión se pone en marcha el cronómetro.
3. Permitir que la sangre salga de la herida sin presión, absorbiendo la sangre con
papel filtro (sin tocar la piel) cada 15 segundos hasta que cese la hemorragia.
4. Cuando el papel filtro yano se manche de sangre; detener el cronómetro y
registrar el tiempo (fig. 4 – 7).
Figura 4 Figura 5
Figura 6 Figura 7
VALORES DE REFERENCIA.
1 a 3 minutos.
Causas de error:
El tamaño y la profundidad de la herida puede variar si no se tiene estandarizada la
técnica. Algunos piensan que puede ser peligroso punzar el lóbulo de la oreja en
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pacientes en los que se sospeche una diátesis hemorrágica y que una hemorragia
excesiva se comprueba mejor por una punción en el antebrazo, en los niños
pequeños se puede utilizar el talón para la punción.
VALORES DE REFERENCIA
Los individuos normales pueden formar hasta 10 petequias. Más de 11 petequias se
Considera anormal.
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4.4 Trabajo a desarrollar por el alumno
1. Realizar la prueba del torniquete de acuerdo a la metodología propuesta.
2. Elaborar un cuadro de resultados por grupo.
5. CUESTIONARIO
1. ¿Qué otras pruebas de coagulación existen?
2. De la pregunta anterior, explica una de ellas.
3. Menciona algunas recomendaciones para la realización de las pruebas de
coagulación.
4. Define el término petequia.
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BIBLIOGRAFÍA.
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