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Análisis del fenómeno de overloading en columna cromatográfica y

ecuación Van Deemter en estudio HPLC
Alejandro Trillos Carvajal1 & Mariana Benavides Vesga2
†
Laboratorio Química Analítica III, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Carrera 1 N° 18 A 12,
Bogotá, 111711, Colombia
a.trillosc@uniandes.edu.co1, m.benavidesv@uniandes.edu.co2

Resumen: En este trabajo de estudiaron las causas del overloading y las variaciones del flujo con base en la eficiencia
cromatográfica, con el objetivo de optimizar una curva de calibración. En primer lugar, se inyectaron diferentes volúmenes
de la muestra a la misma concentración y despues diferentes concentraciones al mismo volumen. Seguido de esto se
realizaron tres corridas con diferentes velocidades de flujo. Se logró observar el fenómeno de overloading tanto para
concentración como para volumen y el impacto de las diferentes velocidades exitosamente. Aunque se hayan logrado
establecer las condiciones óptimas de las realizadas, se recomienda continuar con un estudio más específico para lograr la
optimización completa del método.

Palabras Clave: Overloading, Flujo, Van Deemter

• INTRODUCCIÓN estacionaria, algunos caminos serán más largos que

otros.
La cromatografía es método físico de separación de
sustancias en una mezcla para la caracterización de B se refiere a la difusión longitudinal, la cual se da
estas. Existen diferentes tipos de cromatografía, debido a que las moléculas tienden de trasladarse
uno de ellos la cromatografía liquida de alta de lugares de mayor concentración a lugares con
eficacia o HPLC. Entre los diferentes tipos de menor concentración.
HPLC, está la RP-HPLC, donde RP significa fase
reversa, es decir, la fase estacionaria es apolar y la Cs y Cm se refieren a la transferencia de masa en
fase móvil es polar. La eficiencia de un método la fase estacionaria y en la fase móvil
cromatográfico se mide por la cantidad de platos respectivamente. se genera debido a que algunas
teóricos que tenga la columna y depende de dos moléculas del analito penetraran más
variables, la altura de los platos teóricos (H o HETP profundamente en los poros de las partículas de
(del inglés, High Equivalent to a Theoretical fase estacionaria y por ende se tardaran más en
Plate)) y la altura de la columna (L) donde: avanzar. Y se genera debido a que el flujo de
elución de un camino es más rápido en el seno del
𝐿 camino que en los bordes debido a la fricción.
𝑁= 𝐸𝑐. 1
𝐻 Todas estas variables dependen a su vez de u que
es la velocidad de flujo de la corrida
Como se observa en la ecuación 11. N es cromatográfica.
directamente proporcional a L e inversamente
proporcional a H, la eficacia de la separación es
mejor entre mayor número de platos teóricos tenga.

A su vez H es definida por la ecuación de van

Deemter1:

𝐴+𝑏
𝐻= + (𝐶𝑠 + 𝐶𝑚 )𝑢 𝐸𝑐. 2
𝑢

Donde A es la difusión de Eddy, la cual se da por

los múltiples caminos que pueden tomar las Figura 1. Representación gráfica de la ecuación de van Deemter 3

moléculas del analito entre las partículas de la fase

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Par realizar la representación gráfica de la curva de

van Deemter se debe hacer la triangulación de los
picos para calcular H y N. Se forma un triángulo
trazando dos tangentes a los puntos de inflexión del
pico, este triangulo tiene como base y de altura h.

Figura 3. Asimetría y simetría de las bandas cromatográficas4.

La anchura de una banda cromatográfica aumenta

a medida que aumenta el tiempo que tarda el analito
en recorrer toda la columna, cuanto más tiempo
transcurra dentro de esta, mayor va a ser el
ensanchamiento. De esta manera, la anchura de la
banda está relacionada directamente con la
eficiencia de la separación de una columna, el
Figura 2. Triangulación de un pico indicando valores de altura objetivo es buscar siempre la banda más estrecha
y anchura1. posible que dé como resultado un pico estrecho con
un comienzo y final claro en la línea base. El
Una vez establecidos los anteriores parametros se ensanchamiento de las bandas se puede explicar a
determina N acorde a la siguiente ecuación1: través de dos grandes factores; los factores externos
a la columna y los factores intrínsecos de esta.
𝐿2
𝑁 = 16 𝐸𝑐. 3
𝑤𝑏2 El objetivo del presente trabajo es estudiar las dos
causas del overloading en una columna; el volumen
Dependiendo de su retención en la fase estacionaria
de inyección y la concentración del analito
se va a obtener una señal en el cromatograma,
experimentalmente utilizando estándares de
conocido como banda cromatográfica que se
cafeína. Por otro lado, también se pretende calcular
expresan en formas de picos. Una banda “ideal”
y graficar la curva de Van Deemter variando los
corresponde en gran medida a una curva Gaussiana
flujos de las corridas de tal manera que se puedan
la cual es evidencia de una separación exitosa y da
encontrar las condiciones óptimas (volumen de
como resultado medidas confiables y certeras dada
inyección, concentración del analito y flujo) para
la eficiencia del método. Sin embargo, mientras el
realizar una curva de calibración de alta calidad que
analito se desplaza por toda la columna el tiempo
permita posteriores cuantificaciones.
que pasa en la fase móvil y la estacionaria es muy
irregular. Como consecuencia de la irregularidad ▪ SECCIÓN EXPERIMENTAL
del desplazamiento se ocasiona un cambio en la
simetría del pico, si la distorsión es al principio de Preparación de los patrones
la banda se conoce como “fronting” y hace
referencia a problemas físicos que puedan existir al Se lavan los balones aforados de 10 mL primero
interior de la columna, por otro lado, si se encuentra con agua destilada, luego se secan y se purgan con
al final se expresa como “tailing” y se traduce como agua tipo I y se vuelven a secar completamente con
una retención excesiva del analito en la fase ayuda de pistolas de aire. Posteriormente se pesan
estacionaria (Figura 3)2. 100 mg de estándar de cafeína y se disuelven por
completo en 10 mL de agua tipo I utilizando un
sonificador. Esta solución se rotula como la
solución madre de 10,000 ppm. Seguido a esto, se
realiza una serie de diluciones continuas para

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obtener soluciones de 1000, 100, 10 y 1 ppm del

estándar cafeína. Finalmente, estas soluciones 10 3.038 3688.86 25042.86 0.196
patrón se transfieren a viales cromatográficos. 3.161 3702.44 12927.70
50 & & & 0.217
Parámetros cromatográficos 3.229 3751.87 27351.86

Columna: InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (3.0

x 150 mm) 2.7-micron
Fase móvil : H2O:ACN (80:20) Isocrática
Temperatura de la columna: 40 °C
Detector: UV-Vis, λ=273nm
Flujo: Variante
Volumen de inyección: Variante

▪ RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis de overloading: diferentes volúmenes

de inyección.

Uno de los fenómenos de overloading de una

columna HPLC se ocasiona al sobreinyectar la
Figura 4. Cromatograma con volumen de inyección 10uL.
columna con elevados volúmenes de la muestra.
Cuando se inyecta una cantidad excesiva de
analito, se satura la superficie de fase estacionaria
con tanta cantidad, por lo que una buena parte de
analito no va a interactuar con esta y entonces va a
seguir fluyendo con la fase móvil. Eso implica que
la primera señal de analito que sea detectada por el
equipo no fue correctamente retenida en la columna
por lo que será lejana a la señal del analito que
efectivamente fue retenida. De esta manera se da
un ensanchamiento importante en la banda
cromatográfica, así como una mala separación
dado que realmente no se está reteniendo una parte
del analito en la columna.

Esta sobrecarga de la columna se pudo evidenciar

Figura 5. Cromatograma con volumen de inyección de 50uL.
al cambiar los volúmenes de inyección y mantener
las otras dos variables contantes. Se realizó el La sobreinyeccion se hace evidente analizando los
ensayo en una muestra de 1000 ppm con un flujo resultados, dado que se encuentra tan deforme el
de 1mL/min. Se inyectó primero un volumen de pico en 50uL que el sistema establece que se trata
10uL y luego de 50uL. Los resultados obtenidos de dos analitos coeluidos y no del mismo
son expuestos en la tabla 1 y en las figuras 4 y 5 se compuesto. Por esa razón se obtienen dos tiempos
pueden observar los picos obtenidos en los de retención y dos áreas que si se suman se obtiene
cromatogramas un área total del pico de 40279.56, lo cual es un
40% mayor al área reportada para 10uL. Los
Tabla 1. Resultados de diferentes volúmenes de inyección.
valores numéricos reportados son una evidencia de
Vol.
TR
Altura
Área del
lo que se observa en el cromatograma, sin embargo,
Inyección [mAu] “Tailing” el fenómeno es más evidente observando solo la
[min] pico
[uL]

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deformación del pico y el “Tailing” obtenido para

cada uno, teniendo en cuenta que fue mucho mayor
para el pico sobreinyectado.

Análisis de overloading: inyecciones de

diferentes concentraciones.

Otro de los factores externos que afectan el

ensanchamiento de una banda cromatográfica en
una columna es la sobrecarga o sobresaturación de
concentración del analito en la muestra. Por lo que
se realiza la prueba de inyectar 5 concentraciones
diferentes del analito cafeína, manteniendo
Figura 7. Cromatograma con concentración 10000ppm.
constantes las otras variables estudiadas; el
volumen de inyección en 10uL y el flujo de
Los valores numéricos que se evalúan demuestran
inyección en 1mL/min. Se recopilan los resultados
que a medida que aumenta la concentración del
numéricos más representativos de las corridas en la
analito en la muestra, el pico resultante se agranda,
tabla 2 y se muestran en la figura 6 y 7 los
tanto en altura como en área, sin embargo, esto no
cromatogramas correspondientes a la menor
se atribuye inmediatamente al fenómeno de
concentración utilizada y la mayor. Los demás
overloading porque ese crecimiento proporcional al
cromatogramas son expuestos en los anexos del
aumento de concentración es una propiedad de este
presente trabajo.
análisis cromatográfico. Aunque el tiempo de
Tabla 2. Resultados de diferentes concentraciones de analito. retención no varie significativamente en las
primeras tres concentraciones, las últimas dos ya
Concentración presentan resultados diferentes al igual que el
TR Altura Área del
[ppm] “Tailing”
[min] [mAu] pico “tailing” por lo que ya se empieza a pensar que si
1 3.020 147.47 557.17 0.131 está presente el fenómeno de la sobreinyección.
10 3.022 267.85 1029.51 0.133 Finalmente, los resultados son corroborados por las
100 3.025 2124.24 8215.48 0.134 figuras 6 y 7 en donde la diferencia es muy notoria,
1000 3.038 3688.86 25042.86 0.196 mientras que el pico de a 1ppm es un pico definido
y delgado con un mínimo de “tailing” que
10000 3.012 3663.30 45495.93 0.273
comienza y termina claramente en la línea base, el
pico a 10000ppm esta deformado en la parte
superior con dos puntos y se observa un pico
mucho más amplio con casi el doble de tailing que
el primero. Incluso el sistema que analiza los datos
llega a establecer que no se trata de un mismo
compuesto, sino que son dos picos muy coeluidos,
ya que presenta análisis para dos picos y no solo
uno. Esto es otra contundente evidencia de que
sobreinyectar la columna con una alta
concentración no permite obtener buenos
resultados.

De los resultados obtenidos se puede establecer que

las primeras tres concentraciones con las que se
Figura 6. Cromatograma con concentración 1ppm. realiza la corrida son buenos valores para realizar

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el análisis. Los tres presentan tiempos de retención tienen nos podemos percatar rápidamente de que la
muy cercanos, así como los valores de “tailing”. La gráfica (Gráfica 1.) no se ve nada a como se ve una
altura y el área evidentemente cambian, dado que gráfica de van Deemter (Figura 1). Esto se debe a
el tamaño es proporcional a la cantidad de analito, que no se tienen suficientes datos de diferentes
sin embargo, todavía se logran observar picos flujos para construir una gráfica de van Deemter
delgados con un buen comienzo y final en la línea completa, pero la gráfica construida en este caso
base y una parte superior completamente definida nos permite analizar el comportamiento de
(ver anexos). Mas, sin embargo, cuando se diferentes flujos para esta corrida cromatográfica.
comparan con los resultados para la corrida de Se debe tener en cuenta que la altura de la columna
1000 ppm ya no se obtiene un pico tan delgado ni (L) es de 150 mm.
definido, por lo que el fenómeno de la sobrecarga
se empieza a hacer evidente desde este punto. Tabla 3. Datos cromatográficos.
Wb
Flujo (min) N H(mm)
Los malos resultados por saturar la columna con
altas concentraciones se pueden explicar debido al 1080878 1,38776E-
hecho de que no todo el compuesto logra 0,5 0,1825
2,1 05
interactuar correctamente con la columna (fase 1175510 1,27604E-
1 0,175
estacionaria) por lo que, una parte del analito no es 2 05
retenida correctamente sino que es eludida por la 1245674 1,20417E-
1,5 0,17
fase móvil y eso implica que salga antes de lo 7,4 05
esperado y mientras el resto del compuesto se
Solamente con calcular los datos de la Tabla 3. es
termina de eluir se ocasiona ese ensanchamiento en
fácil determinar que el flujo con mejor eficiencia
la columna que se ve luego reportado en el
(de los 3 analizados) fue el de 1,5 mL/min. No
cromatograma como un pico muy ancho con la
obstante, la gráfica nos da una mejor idea de cómo
punta deformada. Esto implica que con una
se va a empezar a comportar esta corrida al cambiar
sobrecarga por concentración se obtienen
los flujos ya que sabemos que el comportamiento
resultados poco concluyentes y confiables de la
será el de la gráfica de van Deemter.
corrida.
Al observar la gráfica podemos notar un leve
Se puede establecer que el fenómeno de cambio en la pronunciación de la bajada, seguido
overloading en una columna HPLC se ocasiona por de esto llegara al valle marcado con una flecha roja
dos principales causas; saturación de la columna en la figura 1. Y empezara a subir de nuevo después
con elevados volúmenes de inyección o con de este. Esto significa que, aunque la mejor
muestras altamente concentradas. Ambos siguen el eficiencia analizada fue la de la velocidad de flujo
mismo concepto de saturar la fase estacionaria de de 1,5ml/min, está todavía sigue sin ser la
la columna e impiden la correcta elución del analito velocidad óptima para esta corrida.
de interés. Así mismo, ambos resultados se
presentan de la misma manera, con un pico muy Sin conocer el comportamiento de la gráfica se
ancho y deforme en la punta, por lo que no sería podría pensar erróneamente que a mayor velocidad
posible identificar exactamente la causa del de flujo menor altura de plato teórico, sin embargo,
overloading de la corrida solo con analizar los a velocidades de flujo muy elevadas el analito ya
cromatogramas, sería necesario revisar los otros no interactuara con la fase estacionaria para su
parámetros utilizados. optima separación. Por lo tanto, se recomienda
nuevas pruebas con velocidades de flujo mayores a
Curva de Van Deemter: ¿cómo influye el flujo las propuestas en este caso para seguir
en las corridas cromatográficas? construyendo la gráfica completa de van Deemter
y lograr encontrar esa velocidad de flujo oprima
Al realizar la curva de van Deemter con las
para la corrida en cuestión.
diferentes corridas a los diferentes flujos que se

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[2] Pérez Velázquez, Jesús Ricardo & Cobaleda-

Velasco, Marcos & Muñoz, María & Valdez,
Monica & Luján, Concepción & Ortiz, Miguel &
Velazquez, Jorge Armando & Alanis-Bañuelos,
Ruth & Sierra-Campos, Erick. (2017). Efecto de la
concentración de inyección de la matriz sobre la
resolución en la cromatografía líquida. 1. 67-73.

[3] Figura 1: Relación Entre La Resolución y El

Ensanchamiento de Banda Dentro de La
Gráfico 1. Grafica de van Deemter Columna.https://www.waters.com/nextgen/es/es/e
ducation/primers/beginner-s-guide-to-uplc/the-
▪ CONCLUSIONES promise-of-small-particles.html.

Respecto a los resultados obtenidos se puede [4] Figura 3: Zamora, D. T. Asimetria de Picos
concluir que el fenómeno de overloading ya sea por Mejoramiento de La Señal Cromatográfica.
concentración o por volumen de inyección presenta Universidad de Guayaquil
resultados y tendencias muy parecidas, por lo que https://es.slideshare.net/tizzamora/sesion-4-v-
para determinar cuál de las dos causas afecta en 247761761.
mayor proporción el análisis se hace necesario
hacer un estudio más detallado sobre ambos ▪ ANEXOS
fenómenos y estudiar estadísticamente los datos.
Por otro lado, para la realización de una correcta
curva de Van Deemter se hace necesario también
realizar más corridas con diferentes flujos
intermedios de tal manera que se pueda observar la
tendencia correcta descrita por Van Deemter.

No obstante, de los procedimientos realizados se

pueden obtener las tres condiciones
cromatográficas óptimas que se requerían para
realizar una correcta curva de calibración con los
estándares. Por un lado, se determina que la
concentración óptima de analito se encuentra entre
10 – 100 ppm, con un volumen e inyección de 10
uL y finalmente un flujo de 1.5 mL/min.
Figura 8. Cromatograma con concentración 10ppm
▪ REFERENCIAS

[1] Legaz González, M. E.; San Cristóbal, M. S.;

Díaz Peña, E. M.; Alarcón Aguareles, B.; Córdoba,
C. V. Curso de cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC): Prácticas de laboratorio y
cuestiones teórico-prácticas. Parte I. Introducción y
práctica de laboratorio: Cálculo de la eficiencia y
representación gráfica de la ecuación de van
Deemter. Reduca (Biología). Serie Técnicas y
Métodos. 2011.

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Figura 9. Cromatograma con concentración 100ppm

Figura 10. Cromatograma con concentración 1000ppm