FORO

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y
BIOFÁRMACOS EN ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP
COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN
Por
TERESA VARGAS CORTEZ
Como requisito parcial para obtener el Grado de MAESTRÍA EN CIENCIAS
con Orientación en Farmacia.
Agosto, 2014
EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y BIOFÁRMACOS EN
ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN
Aprobación de la tesis:
Dr. Xristo Zárate Kalfópulos
PRESIDENTE
Dra. Mónica Azucena Ramírez Cabrera
SECRETARIA
Dra. María Elena Cantú Cárdenas
VOCAL
Dra. María Aracely Hernández Ramírez
SUB-DIRECTORA DE ESTUDIOS DE POSGRADO

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y BIOFÁRMACOS EN
ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN
Revisión de la tesis:
Dr. Xristo Zárate Kalfópulos
ASESOR
Dra. Mónica Azucena Ramírez Cabrera
COMITÉ TUTORIAL
Dr. Benito David Mata Cárdenas
COMITÉ TUTORIAL
Dra. María Elena Cantú Cárdenas
COMITÉ TUTORIAL
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a todas esas personas e instituciones que en mayor o menor medida me
ayudaron a construir este proyecto, no solo profesional si no de vida.
A CONACyT por las becas y soporte económico recibido. A la escuela de graduados en Ciencias
de la Facultad de Ciencias Químicas por todo el apoyo brindado de instalaciones así como
económico.
Le doy gracias a mi asesor de tesis el Dr. Xristo Zárate de quien he aprendido muchas cosas y
sé que aun puedo seguir aprendiendo, gracias por su paciencia, por guiarme y por todo el
soporte que me brindó.
A mi comité tutorial: Dra. María Elena Cantú, Dra. Mónica Azucena Ramírez y el Dr. Benito
David Mata por todos sus consejos, correcciones, recomendaciones, tiempo y ayuda durante
estos dos años.
A la coordinadora del posgrado en Farmacia, la Dra. Lucia Cantú por todo su apoyo, su
espléndido trabajo y atención a mí y a los alumnos de Farmacia.
A nuestro coordinador ante CONACyT, el Dr. Jacobo Ruiz, muchas gracias por su
profesionalismo y siempre estar al pendiente de todo lo referente con CONACyT, sobre todo la
ayuda que me presto para la beca mixta.
Muchas gracias también a la Dra. Ma. Teresa Garza González por su apoyo y consejos en todos
los aspectos y siempre tener un tiempo para nosotros los alumnos de posgrado. También por
ayudarme a creérmela, poquito a poco.
A mi querido amigo y jefe del INGGEN, el Dr. Isaías Balderas, gracias por su ayuda, consejos y
aguantarme cuando lo necesitaba y también por tener a alguien con quien platicar de otras
cosas que no fueran de la escuela.
A la Dra. Ivonne Camacho, por siempre creer en mí, por sus hermosas palabras de aliento y
siempre haber estado allí para mí desde la licenciatura.
A todos mis maestros de la licenciatura, por haberme hecho amar mi carrera, por tenerme
paciencia, por enseñarme y guiarme siempre. A mis maestros de posgrado por guiarme en lo
que fue una nueva etapa de mi vida y mostrarme que siempre se puede aprender más.
También a mis queridas maestras de la preparatoria, QFB. Rosario Zamora, QFB. Salome.
Siempre las tendré en mi corazón, por apoyarme siempre, les prometí que sería una excelente
QFB, y así será mientras Dios me preste vida.
A la Dra.Megan McEvoy por aceptarme en su laboratorio y a las chicas del mismo que nos
apoyaron bastante durante la estancia en la Universidad de Arizona.
A Karina Navarro, por siempre recibirme con una sonrisa, tener paciencia para explicarme con
lujo de detalle y siempre estar al corriente con cualquier cosa que se necesitase, gracias por tu
excelente trabajo.
A mis amigos de la licenciatura, que siempre han estado conmigo, se convirtieron en mis
hermanos, me abrieron las puertas de su casa, corazón y familia, y desde entonces se
convirtieron en mis hermanos.
A mis queridos amigos del posgrado, a todos ustedes que quizás tengo poquito de conocerlos,
pero sé que esta amistad perdurará mucho, mucho tiempo más. Carlos (tu y yo estábamos
destinados a conocernos), Julio (por siempre escucharme y alegrarme), Zutroy (por ser Zutroy),
Celene (por siempre tener una sonrisa para mi), Cesar (por compartirme tu alegría), Viri (por tu
ayuda sincera), Gera (yo soy 89), Dany (por tu sinceridad y hacerme reír), e Iris (por que se
cuento contigo).
A mis amiguitas de QPN, Adri Hdz (por siempre escucharme y apoyarme en todo momento),
Adri Romo (por todos tus consejos y apoyo), Jessica y Karen (confió en ustedes).
A mis queridos amigos del INGGEN, Enrique Cantú (por enseñarme, encaminarme y tener
paciencia conmigo, por siempre escucharme y cuidarme), Jessica Gómez (por siempre estar al
pendiente de mí y apoyarme siempre en el lab), Eder Arredondo (por tu guía, consejos y
cuidarnos), Isaac Díaz (por siempre animarme), Gonzi Fonzi (te extrañamos), Aldo Clemente
(por tus sabios consejos en todo momento). A mis niños de servicio, Silvia, Marisol, Memo y
Oscar, por todo su apoyo y esos momentos alegres que me hicieron pasar.
A mi hermosa familia por siempre apoyarme y siempre brindarme un lugar al que regresar, a
mi papa por su sabiduría y cuidarme, a mi madre por enseñarme como debe luchar una mujer,
a nunca depender de nadie y siempre dar lo mejor de mí. A mi hermano mayor Esteban por
siempre cuidarme y estar al pendiente de mí y a su querida esposa Janeth. A mis queridos
hermanos menores por siempre estar conmigo, Enrique por mostrarme que a veces la
serenidad es el mejor camino, a Adrianita por enseñarme que siempre habrá una solución.
Por último y más importante, le agradezco a Dios, gracias por tu amor eterno.
Dedicatoria
Quiero dedicar este proyecto a todas las personas que siempre estuvieron a mi lado en todo
momento, a todas esas personas importantes para mí y que siempre han creído en mí y me
han ayudado a levantarme cuando todo lo veo perdido.
Dedico mi trabajo a mi querida familia, el tesoro más grande que la vida y Dios me han dado. A
mis padres Esteban Vargas Medrano y Leticia Cortez Bravo y mis hermanos, Adriana, Enrique,
Esteban y su hermosa esposa Janeth.
A mis amigos, que me han acompañado durante las etapas de mi vida y se han quedado en mi
corazón por siempre.
A todos mis maestros que de alguna manera siempre me alentaron a superarme día con día.
TABLA DE CONTENIDOS
Capítulo Página
CAPÍTULO 1 ___________________________________________________________ 12
1. INTRODUCCIÓN _______________________________________________________ 12
CAPÍTULO 2 ___________________________________________________________ 21
2. ANTECEDENTES _______________________________________________________ 21
2.1. SmbP como proteína de fusión _______________________________________________ 21
2.2. Purificación de proteínas ____________________________________________________ 27
2.3. Cromatografía de afinidad ___________________________________________________ 28
2.3.1. Uso de proteínas de fusión en la cromatografía de afinidad ___________________ 29
2.3.2. Purificación por medio de cromatografía de afinidad con iones metálicos
inmovilizados (IMAC) ___________________________________________________________ 29
2.3.3. Purificación por medio de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) ___________ 33
CAPÍTULO 3 ___________________________________________________________ 35
3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS ________________________________________________ 35
3.1. Objetivo general ___________________________________________________________ 35
3.2. Objetivos específicos _______________________________________________________ 35
3.3. Hipótesis _________________________________________________________________ 36
CAPÍTULO 4 ___________________________________________________________ 37
4. METODOLOGÍA _______________________________________________________ 37
4.1. Estrategia general experimental ______________________________________________ 37
4.2. Crecimiento de Nitrosomonas europaea _______________________________________ 38
4.3. Recolección de células de N. europaea _________________________________________ 40
4.4. Extracción de ADN genómico ________________________________________________ 40
4.5. Amplificación de SmbPp y SmbPc _____________________________________________ 41
4.6. Construcción de plásmidos __________________________________________________ 42
4.6.1. Construcción de pET28b-SmbPp y pET28b-SmbPc ___________________________ 42
4.6.1.1. Digestión de plásmidos y genes de SmbPp y SmbPc ________________________ 42
1
4.6.1.2. Ligación de pET28b más SmbPp y SmbPc ________________________________ 43
4.6.1.3. Transformación de pET28b-SmbPp y pET28b-SmbPc _______________________ 43
4.6.1.4. Extracción de ADN plasmídico de clonas seleccionadas _____________________ 44
4.6.1.5. Cribado de colonias transformantes ____________________________________ 44
4.6.2. Construcción de pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-SmbPc-GFP____________________ 45
4.6.2.1. Digestión de GFP y plásmidos pET28b-SmbPp ____________________________ 45
4.6.2.2. Ligación de pET28b-SmbPp y pET28b-GST con GFP ________________________ 46
4.6.2.3. Transformación de pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-SmbPc-GFP _______________ 46
4.6.2.4. Extracción de ADN plasmídico de clonas seleccionadas _____________________ 46
4.6.3. Construcción de pET30a-SmbPc-GFP y pET30a-SmbPp-GFP ____________________ 47
4.6.3.1. Amplificación de SmbPp-GFP y SmbPc-GFP_______________________________ 47
4.6.3.3. Ligación de pET30a más SmbPp-GFP y SmbPc-GFP _________________________ 48
4.6.3.4. Transformación de pET30a más SmbPp-GFP y SmbPc-GFP __________________ 49
4.6.3.5. Extracción de ADN plasmídico _________________________________________ 49
4.6.4. Construcción de pET30a-SmbPc-RFP, pET30a-SmbPp-RFP y pET28b-GST-RFP _____ 49
4.6.4.1. Amplificación de RFP ________________________________________________ 50
4.6.4.2. Digestión de inserto RFP y de plásmidos pET30a-SmbPp-GFP, pET30a-SmbPc-GFP y
pET28b-GST-GFP _____________________________________________________________ 51
4.6.4.3. Ligación de pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET30a-GST más RFP ___________ 51
4.6.4.4. Transformación de pET30a-SmbPp-RFP, pET30a-SmbPc-RFP y pET28b-GST-RFP _ 52
4.6.4.5. Extracción de ADN plasmídico de las colonias obtenidas ____________________ 52
4.6.5. Construcción de plásmidos pET30a-SmbPp-X, pET30a-SmbPc-X y pET28b-GST-X ___ 53
4.6.5.1. Amplificación de insertos _____________________________________________ 53
4.6.5.2. Digestión de plásmidos pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET28b-GST e insertos de
interés 54
4.6.5.3. Ligación de pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET28b-GST con insertos de interés 55
4.6.5.4. Transformación de la ligación pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET28b-GST con
insertos de interés ___________________________________________________________ 55
4.6.6. Construcción de plásmido pET30a-SmbPcE-GFPEnt ___________________________ 57
4.6.6.1. Amplificación de SmbPcE y GFPEnt ______________________________________ 57
4.6.6.2. Digestión de los insertos SmbPcE y del plásmido pET30a____________________ 58
4.6.6.3. Ligación de pET30a más SmbPcE _______________________________________ 59
4.6.6.4. Transformación de pET30a-SmbPcE ____________________________________ 59
4.6.6.6. Cribado de las colonias transformantes _________________________________ 59
4.6.6.7. Digestión de pET30a-SmbPcE y GFPEnt ___________________________________ 60
4.6.6.8. Ligación de pET30a-SmbPcE más GFPENT _________________________________ 61
4.6.6.9. Transformación de pET30a-SmbPcE-GFPENT ______________________________ 61
4.6.6.10. Extracción de ADN plasmídico ________________________________________ 61
4.7. Expresión de proteínas _____________________________________________________ 62
2
4.7.1. Transformación de la cepa de E. coli BL21(DE3) _____________________________ 62
4.7.2. Expresión piloto de proteínas ____________________________________________ 63
4.7.2.1. Obtención de la fracción soluble e insoluble ______________________________ 63
4.7.2.2. Visualización de la expresión __________________________________________ 64
4.7.3. Escalamiento de la expresión ____________________________________________ 64
4.8.1. Purificación de SmbPc-GFP ______________________________________________ 65
4.8.1.1. Lisis celular de sedimento celular de expresión ___________________________ 65
4.8.1.2. Purificación de SmbPc-GFP mediante cromatografía de afinidad con iones
metálicos (IMAC) con resina ___________________________________________________ 65
4.8.1.3. Purificación de SmbPc-GFP con iones de cobre y níquel en resina IMAC _______ 66
4.8.1.4. Cromatografía IMAC empleando el sistema ÄKTA prime plus ________________ 67
4.8.1.5. Diálisis para remoción de NaCl _________________________________________ 67
4.8.1.6. Cromatografía de intercambio aniónico con el sistema ÄKTA prime plus _______ 68
4.8.2. Purificación de SmbPcE-GFPENT ___________________________________________ 69
4.8.3. Purificación de SmbPp-RFP ______________________________________________ 69
4.8.3.1. Choque osmótico para la obtención de la fracción periplásmica ______________ 69
4.8.3.2. Purificación de SmbpP-RFP por medio de cromatografía de afinidad de iones
metálicos (IMAC) con resina cargada con Cu (II) ____________________________________ 70
4.9. Remoción de la proteína de fusión ____________________________________________ 71
CAPÍTULO 5 ___________________________________________________________ 72
5. RESULTADOS _________________________________________________________ 72
5.1. Crecimiento de Nitrosomonas europaea _______________________________________ 72
5.2. Extracción de ADN genómico de N. europaea ___________________________________ 73
5.3. Amplificación de SmbPc y SmbPp _____________________________________________ 74
5.4. Construcción de pET28b-SmbpPp y pET28b-SmbPc _______________________________ 75
5.5. Construcción de pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-GST-GFP __________________________ 75
5.6. Construcción de pET30a-SmbPp-GFP y pET30a-SmbPc-GFP ________________________ 76
5.7. Construcción de pET30a-SmbPc-RFP, pET30a-SmbPp-RFP y pET28b-GST-RFP __________ 77
5.8. Construcciones de pET30a-SmbPc, pET30a-SmbPp y pET28b-GST con insertos de interés 78
5.8.1. Amplificación de insertos _______________________________________________ 78
5.8.2. Tamizaje de ADN plasmídico positivo a los insertos de interés _________________ 79
5.9. Construcción de pET30a-SmbPcE-GFPENT _______________________________________ 83
5.9.1. Amplificación de SmbPcE y GFPENT ________________________________________ 84
5.9.2. Construcción de pET30a-SmbPcE _________________________________________ 84
5.9.3. Construcción de pET30a-SmbPcE-GFPENT ___________________________________ 85
5.10. Construcciones obtenidas ___________________________________________________ 86
5.11. Expresión de proteínas _____________________________________________________ 86
5.11.1. Expresión piloto de SmbPp y SmbPp-GFP __________________________________ 86
5.11.2. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-GFP, SmbPp-GFP, GST-GFP y
MBP-GFP ____________________________________________________________________87
5.11.3. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-RFP, SmbPp-RFP, GST-RFP y
MBP-RFP ____________________________________________________________________88
3
5.11.4. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-SHY2, SmbPp-SHY2 y GST-
SHY2 ____________________________________________________________________89
5.11.5. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-LovR, SmbPp-LovR y GST-LovR
____________________________________________________________________91
5.11.6. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-NDPK2 y GST-NDPK2 _____ 93
5.12.1. Purificación de SmbPc-GFP por cromatografía de afinidad con iones metálicos IMAC
con resina cargada con Cu(II) y Ni(II) _______________________________________________ 94
5.12.2. Purificación de SmbPc-GFP mediante el sistema de FPLC ÄKTA prime plus ________ 98
5.12.2.1. Cromatografía IMAC con columna de HisTrap HP _________________________ 98
5.12.2.2. Cromatografía de intercambio aniónico con columna HiTrap Q HP ___________ 99
5.12.3. Purificación de SmbPcE-GFPENT mediante el sistema de FPLC ÄKTA prime plus ___ 101
5.12.4. Purificación de SmbPp-RFP mediante cromatografía de afinidad con iones metálicos
(IMAC) con resina _____________________________________________________________ 102
5.12.5. Purificación de SmbPp-RFP mediante el sistema de FPLC ÄKTA prime plus _______ 103
5.13. Remoción de la proteína de fusión ___________________________________________ 104
CAPÍTULO 6 __________________________________________________________ 106

6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ____________________________________________ 106
CAPÍTULO 7 __________________________________________________________ 119

7. CONCLUSIONES ______________________________________________________ 119
CAPÍTULO 8 __________________________________________________________ 121

8. PERSPECTIVAS _______________________________________________________ 121
CAPÍTULO 9 __________________________________________________________ 122

9. SEGURIDAD EN EL TRABAJO DE DISPOSICIÓN DE RESIDUOS___________________ 122
4
LISTA DE TABLAS
TABLA 1. Medio 1 empleado para el crecimiento de N. europaea, modificado de Brett, M.B., Rusell, L.,
Wilson, A.F. (2004) ...................................................................................................................................... 38
TABLA 2. Medio 2 empleado para el crecimiento de N. europaea, Cabello, F. (2007) ................................ 38
TABLA 3. Medio 3 empleado para el crecimiento de N. europaea (ATCC Medium: 2265 Nitrosomonas
europaea medium) ...................................................................................................................................... 39
TABLA 4. Condiciones empleadas en los diferentes medios empleados ...................................................... 40
TABLA 5. Iniciadores usados para la amplificación de SmbPp y SmbPc ...................................................... 41
TABLA 6. Iniciadores empleados para la amplificación de RFP ................................................................... 50
TABLA 7. Iniciadores empleados para la amplificación de SmbPcE y GFPENT ............................................ 58
TABLA 8. Construcciones obtenidas con diferentes plásmidos .................................................................... 86
TABLA 9. Disposición de los residuos generados ....................................................................................... 122
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrategia general experimental _________________________________________________ 37

Figura 2. Cultivo de N. europaea a los tres días. _____________________________________________ 73
Figura 3. Cultivo de N. europaea a la semana. ______________________________________________ 73
Figura 4. Sedimento celular de N. europaea. _______________________________________________ 73
Figura 5. Extracción de ADN genómico de N. europaea. ______________________________________ 74
Figura 6. Amplificación de SmbPp y Smbpc. ________________________________________________ 74
Figura 7. Análisis de restricción para la construcción pET28b-SmbPp y pET28b-SmbPc. _____________ 75
Figura 8. Análisis de restricción de las construcciones pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-GST-GFP. _______ 76
Figura 9. Análisis de restricción con enzimas XhoI y NdeI de las construcciones pET30a-SmbPp-GFP y
pET30a-SmbPc-GFP. ___________________________________________________________________ 76
Figura 10. Análisis de restricción realizado con las enzimas XhoI y NdeI para las construcciones de
pET30a-SmbPp-RFP y pET30a-SmbPc-RFP. _________________________________________________ 77
Figura 11. Amplificación con iniciador delantero de los genes de interés e iniciador T7 reverso para la
confirmación de insertos en construcciones en pET28b usando GST como proteína de fusión. ________ 78
Figura 12. Amplificaciones para SHY2, PixE y LovR. __________________________________________ 79
Figura 13. Amplificación de NDPK2. ______________________________________________________ 79
Figura 14. .Análisis de restricción de pET30a-SmbPc-LovR y pET30a-SmbPp-LovR realizado con las enzimas
NdeI y XhoI. __________________________________________________________________________ 80
Figura 15. Amplificación de SmbPc-SHY2, SmbPc-NDPK2 y SmbPc-PixE. __________________________ 80
Figura 16. Amplificación del inserto SHY2 a partir de la construcción pET30a-SmbPp-SHY2 con los
iniciadores propios del gen. _____________________________________________________________ 81
Figura 17. Amplificación de NDPK2 a partir de la construcción de pET30a-SmbPp-NDPK2 realizada con los
iniciadores propios del gen. _____________________________________________________________ 82
Figura 18. Amplificación de los genes de LovR y SHY2 con sus respectivos iniciadores a partir de las
construcciones de pET28b-GST-LovR y pET28b-GST-SHY2 _____________________________________ 83
Figura 19. Amplificación de SmbPcE (2), SmbPpE (3) y GFPENT (4) con los iniciadores propios de los genes.
___________________________________________________________________________________ 84
Figura 20. Amplificación de SmbPcE (carriles 7 a 10) con su iniciador delantero y un iniciador reverso de
T7 a partir del ADN plasmídico de las construcciones de pET30a-SmbPcE. ________________________ 85
Figura 21. Análisis de restricción de la construcción pET30a-SmbPcE-GFPENT realizado con las enzimas
NcoI y XhoI. __________________________________________________________________________ 86
Figura 22. Expresión piloto de SmbPp y SmbPp-GFP. _________________________________________ 87
Figura 23. Comparación de expresión de GFP con las proteínas de fusión SmbPc, SmbPp, GST y MBP. _ 88
Figura 24. Comparación de expresión de RFP con las proteínas de fusión SmbPc, SmbPp, GST y MBP. __ 89
6
Figura 25. Expresión piloto de SmbPc-SHY2, SmbPp-SHY2 y GST-SHY2, esto correspondiendo a sus
fracciones solubles.____________________________________________________________________ 90
Figura 26. Expresión piloto de SmbPc-SHY2, SmbPp-SHY2 y GST-SHY2 correspondientes a la fracción
insoluble. ____________________________________________________________________________ 91
Figura 27. Expresión piloto de GST-LovR, SmbPc-LovR y SmbPp-LovR en sus fracciones solubles. ______ 92
Figura 28. Expresión piloto de GST-LovR, SmbPc-LovR y SmbPp-LovR en sus fracciones insolubles. ____ 92
Figura 29. Expresión piloto de SmbPc-NDPK2 y GST-NDPK2 en sus fracciones solubles e insolubles.____ 93
Figura 30. Cromatografía de afinidad Cu(II) en condiciones suaves (baja concentración de NaCl, sin
imidazol en los lavados y baja concentración del mismo para la elución) para la purificación de SmbPc-
GFP. ________________________________________________________________________________ 94
Figura 31. Cromatografía de afinidad con Ni(II) en condiciones suaves (baja concentración de NaCl, sin
imidazol en los lavados y baja concentración del mismo para la elución) para la purificación de SmbPc-
GFP. ________________________________________________________________________________ 95
Figura 32. Cromatografía de afinidad Cu(II) en condiciones fuertes (alta concentración de NaCl e imidazol
para lavado y elución) para la purificación de SmbPc-GFP. ____________________________________ 96
Figura 33. Cromatografía de afinidad Ni(II) en condiciones fuertes (alta concentración de NaCl y de
imidazol para el lavado y elución) para la purificación de SmbPc-GFP. ___________________________ 97
Figura 34. Visualización en luz UV de la fluorescencia de las fracciones obtenidas de la cromatografía con
iones de Cu(II) y Ni(II). _________________________________________________________________ 97
Figura 35. Cromatografía de afinidad con columna HisTrap HP cargada con iones de Ni(II). __________ 98
Figura 36. Cromatograma de Afinidad con Ni(II) para SmbPc-GFP ______________________________ 99
Figura 37. Cromatografía de intercambio aniónico con la columna HiTrap Q HP, se muestran dentro del
recuadro las bandas correspondientes a SmbPc-GFP. _______________________________________ 100
Figura 38. Cromatograma de intercambio aniónico para SmbPc-GFP ___________________________ 100
Figura 39. Cromatografía de afinidad con columna HisTrap HP cargada con iones de Ni(II) para SmbPcE-
GFPENT _____________________________________________________________________________ 101
Figura 40. Cromatograma de afinidad con Ni(II) para SmbPcE-GFPENT __________________________ 102
Figura 41. Cromatografía de afinidad con resina de IMAC cargada con Cu(II) de SmbPp-RFP. _______ 103
Figura 42. Cromatografía de afinidad con columna HisTrap HP cargada con iones de Ni(II) para SmbPp-
RFP _______________________________________________________________________________ 103
Figura 43. Cromatograma de afinidad con Ni(II) para SmbPp-RFP _____________________________ 104
Figura 44. Corte de enteroquinasa para remover SmbPcE de GFP ENT. ___________________________ 105
Figura 45. De derecha a izquierda, expresión de SmbPc-RFP, SmbPc-LovR y SmbPp-RFP. ___________ 109
Figura 46. De izquierda a derecha, control negative de BL21(DE3), GST-RFP, MBP-RFP y SmbPc-RFP. _ 109
Figura 47. Columna de HisTrap HP al momento de cargar la muestra, se puede apreciar claramente el
color de SmbPc-GFP. __________________________________________________________________ 115
7
NOMENCLATURA
°C Grado Celsius
µL Microlitros
µM Micromolar
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARN Ácido ribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
BL21(DE3) Cepa de E. coli, para expresión de proteínas
bp Pares de bases
CRY1 Criptocromo 1
DH5α Cepa de E. coli, para producción y mantenimiento de ADN recombinante
dNTP´s Desoxirribonucleótidos
EDTA Ácido etilendiaminotetracético
FPLC Fast protein liquid chromatography
g Gramos
GFP Proteína verde fluorescente
GST Glutatión-S-Transferasa
IMAC Cromatografía de afinidad a iones metálicos
IPTG Isopropil-B-D-tiogalactopiranósido
Kbp Kilopares de bases
kDa Kilodaltones
L Litro
LovR Two-component receiver domain protein
M Molar
mAu Miliunidades de absorbancia
MBP Proteína de unión a maltosa
mg Miligramos
mL Mililitros
mM Milimolar
NDPK2 Nucleósido difosfato quinasa II
nM Nanomolar
nm Nanometros
8
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PixE Proteína de subfamilia PatA
pmoles Picomoles
RFP Proteína roja fluorescente
rpm Revoluciones por minuto
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
SHY2 Hipocótilo corto 2
SmbP Proteína pequeña de unión a metales (Small metal binding Protein)
SmbPc SmbP citoplásmica
SmbPp SmbP periplásmica
TAE Tris-ácido acético-EDTA
U.V. Luz ultravioleta
9
RESUMEN
Teresa Vargas Cortez Fecha de graduación: Agosto, 2014
Universidad Autónoma de Nuevo León
Facultad de Ciencias Químicas
Título del Estudio: EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y

BIOFÁRMACOS EN ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP COMO PROTEÍNA DE
FUSIÓN
Número de páginas: 127 Candidato para el grado de Maestría en Ciencias

con orientación en Farmacia
Área de estudio: Ingeniería Genética
Propósito y Método del Estudio. La producción de proteínas recombinantes se ha facilitado

gracias a la implementación de las proteínas de fusión, éstas tienen como fin conferir ciertas
características a la proteína de interés que permitan la purificación por medio de cromatografía de
afinidad. Además, las proteínas de fusión incrementan considerablemente la solubilidad de las proteínas
de interés, facilitando su obtención.
SmbP (Small metal binding protein) es una proteína pequeña, de tan sólo 9.9 kDa aislada de
Nitrosomas europaea, que posee la propiedad de unir diversos iones divalentes, como Ni(II), Cu(II),
Mg(II), Mn(II) y Zn(II) e incluso trivalentes como el Fe(III). Debido a ésto se propone su uso como proteína
de fusión aprovechando su propiedad de unión a Cu(II) y Ni(II) y de esta manera purificar por medio de
cromatografía de afinidad a iones metálicos (IMAC).
La metodología consistió en: 1) Amplificación del ADN codificante para la proteína de interés, 2)
Construcción de plásmidos, 3) Transformación de Escherichia coli DH5α, 4) Extracción de ADN
plasmídico, 5) Tamizaje de transformantes, 6) Transformación de E. coli BL21(DE3), 7) Expresión de
proteínas, 8) Purificación con cromatografía de afinidad unida a iones metálicos.
Contribuciones y conclusiones. Se obtuvieron diversas construcciones de plásmidos con genes

de interés, entre ellos con GFP (Green Fluorescent Protein) y RFP (Red Fluorescent Protein) usadas como
proteínas reporteras de expresión que permitieron visualizar su purificación. Se expresaron diversas
proteínas de interés unidas a SmbP y a GST (Glutation-S-Transferasa) y MBP (Proteína de Unión a
Maltosa) usando estas dos últimas para fines comparativos.
En las pruebas de expresión comparativos se observaron rendimientos considerables por parte

de SmbP, equiparables y en algunos casos mayores a los presentados con MBP y GST. Asimismo, la
solubilidad que presentaron las proteínas unidas a SmbP fue mayor que la presentada por las unidas a
10
GST y similar a la que mostraban con MBP. Mostrando que SmbP mejora el rendimiento de expresión y
genera menos cuerpos de inclusión.
Es posible purificar proteínas unidas a SmbP mediante cromatografía de afinidad unida a iones
metálicos (IMAC). Se purificó GFP y RFP unidas a SmbP y se probaron dos iones, Ni(II) y Cu(II), con la
primera se obtuvo un buen grado de pureza aunque con poco rendimiento, por su parte con Cu(II) el
rendimiento fue mayor aunque la pureza fue menor a comparación con Ni(II). Se probaron diversas
condiciones con el fin de mejorar con Cu(II) la pureza y con Ni(II) el rendimiento, donde las condiciones
fuertes de purificación (alta concentración de sal e imidazol en lavado y elución) fueron las que
presentaron mejores resultados.
Se purificaron GFP y RFP unidas a SmbP mediante un equipo de FPLC, ÄKTA prime plus,
empleando columnas comerciales de sefarosa unida iones Ni(II) mejorando el rendimiento y la pureza de
las proteínas. Además, GFP unida a SmbP se sometió a una segunda purificación por medio de
intercambio aniónico usando también columnas comerciales, logrando una pureza final de
Para finalizar, SmbP es capaz de exportarse al periplasma, por lo que se crearon construcciones
conservando el péptido señal. Se logró purificar la proteína RFP de la fracción periplásmica de E. coli
mediante choque osmótico, facilitando el método de purificación (por la presencia de menos proteínas)
aunque sacrificando la cantidad de proteína obtenida a comparación de expresión citoplásmica.
11
CAPÍTULO 1
1. INTRODUCCIÓN
Los fármacos conocidos y usados hoy en día son obtenidos por numerosas vías,
ya sea de manera natural o sintética. Es indudable el hecho de que por varias décadas
el desarrollo de fármacos se enfocaba primordialmente a la creación y manufactura de
pequeñas moléculas de origen sintético, sin embargo, esta tendencia comienza a
desviarse por otro rumbo: el desarrollo de biofármacos.
El uso de proteínas terapéuticas o biofármacos para el tratamiento de diversas
enfermedades se ha venido implementando cada vez más en los últimos 30 años,
además se sabe que aproximadamente uno de cada cuatro nuevos fármacos que se
lanzan al mercado es un biofármaco.1, 2 Un biofármaco es una molécula biológica con
fines terapéuticos obtenido a partir de un organismo vivo, ya sea a partir de bacterias,
hongos, células animales, levaduras entre otros.2
El término “biofarmacéutico” fue empleado por primera vez en 1980 y se usó
para describir una clase de proteínas terapéuticas producidas por técnicas
12
biotecnológicas modernas, específicamente por vía de la ingeniería genética. Este
término también puede acompañar a otras macromoléculas, por ejemplo, productos
basados en ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) o incluso a la
célula completa.1
Desde el año de 1950, se han ido investigando las proteínas producidas
naturalmente en el cuerpo humano y sus obvias aplicaciones terapéuticas, algunos
ejemplos pueden ser: interferones e interleucinas, factores de crecimiento,
eritropoyetina, factores neurotróficos, etc.1 Después de todo, las proteínas son los
principales componentes de la función celular. La información almacenada en el ADN
dirige la maquinaria sintetizadora de proteínas de la célula para producir proteínas
específicas requeridas para la estructura, regulación y función de la misma.3
Aunque el potencial farmacéutico de estas moléculas reguladoras fue
generalmente apreciado, el uso con fines terapéuticos resultaba impráctico debido a
las pequeñas cantidades que se obtenían por medios naturales. La llegada de la
tecnología del ADN recombinante supero muchas de las limitantes que se tenían y
marco el comienzo de una nueva era de ciencias farmacéuticas.1 A pesar de esto y de
su incremento en la demanda, el uso de proteínas terapéuticas aún se encuentra en su
etapa inicial.
Los biofármacos han claramente revolucionado la medicina actual. Sin embargo,
el traer un producto de esta índole al mercado toma una gran cantidad de tiempo de
investigación y recursos con muchas trabas en su desarrollo. Uno de los más grandes
13
retos de la industria de biofármacos es el hecho de que una gran cantidad de esta clase
de medicamentos no llega a ver la luz en el mercado. 4
No solo se encuentran dificultades en relación a la seguridad y eficiencia
durante el desarrollo de biofármacos, sino también se presentan dificultades
relacionadas a la producción de los mismos. El diseño y producción de biofármacos van
de la mano ya que las características de dicho biofármaco deben ser definidas a la
brevedad, dado que de estas dependerá en gran medida la ruta de producción y el
desarrollo del método de obtención a mayores escalas.4
La tecnología del ADN recombinante ha tenido un gran impacto positivo en la
producción de proteínas farmacéuticamente importantes. Algunas de las dificultades
que ha superado son: el problema de la disponibilidad de fuentes, problemas en la
seguridad del producto, provee una alternativa a la extracción directa de fuentes
inapropiadas/peligrosas (fluidos humanos y animales) y facilita la generación de
proteínas recombinantes terapéuticas que presentan ventajas sobre las nativas.1
Son diversas las ventajas que ofrece la tecnología del ADN recombinante, no
solo permite la producción de proteínas a gran escala usando la misma metodología,
sino también permite realizar modificaciones genéticas a las mismas que provee de
claras ventajas sobre las modificaciones químicas. Las proteínas generadas por
ingeniería genética son biocompatibles y biodegradables, los cambios se dan en el
100% de la producción de proteínas. Las preparaciones finales no poseen
contaminantes que pudiesen ser nocivos para el paciente.5
14
El desarrollo racional de mejores proteínas terapéuticas con una eficiencia
incrementada, mayor seguridad, inmunogenicidad reducida y mejorada distribución
proviene de una convergencia entre la comunidad científica, clínicos, tecnólogos y
productores que han identificado las necesidades y han desarrollado estrategias para
sobrellevarlas.6
La comunidad científica busca resolver los retos que la expresión de proteínas
ha implicado. Ya que, a pesar del inspirador desarrollo y avances en la decodificación
de los genomas, la expresión de los productos de los genes en proteínas funcionales, en
especial con altos rendimientos, permanece como un reto complejo. La expresión de
proteínas requiere de dos decisiones críticas iniciales: la selección de la estrategia de
clonación y la selección del tipo de célula que se usará para la expresión. Así mismo, la
búsqueda de un alto rendimiento agrega otros requerimientos, como la necesidad de
métodos fáciles y factibles para una rápida clonación y aislamiento de proteínas.7
El enfoque de las tecnologías desarrolladas con un mayor impacto sobre las
proteínas terapéuticas actuales comprende versiones modificadas de las proteínas
nativas (obtenidas por ingeniería genética), proteínas de fusión, conjugación a
polímeros, entre otras.6 Es obvio que la ingeniería de proteínas ha revolucionado la
terapéutica basada en este tipo de biomoléculas proveyendo de herramientas para
mejorar las proteínas ya existentes o crear nuevas proteínas para aplicaciones clínicas
específicas.6
15
Desde 1982, más de 100 proteínas y péptidos terapéuticos han sido autorizados
para su producción usando células bacterianas, fúngicas y de mamíferos. La ingeniería
genética ha proporcionado las herramientas moleculares necesarias para la producción
de proteínas heterólogas en un gran ramo de microorganismos, incluyendo bacterias y
levaduras, expandiendo así las capacidades de manufactura.3
Esta expresión-producción de proteínas en sistemas heterólogos engloba la
clonación de un gen específico que codifica para la proteína de interés en un vector de
expresión bajo el control de un promotor inducible. 8 El sistema de producción depende
de la naturaleza de la proteína de interés.9 Con la biotecnología, cualquier biofármaco
puede ser modificado genéticamente usando la fusión celular o la tecnología del ADN
recombinante.
Entre los retos principales de la industria de los biofármacos que se han
discutido para la obtención de proteínas terapéuticas por tecnología del ADN
recombinante se encuentra la producción de las mismas de forma altamente pura y
bien caracterizada. Se han desarrollado diferentes estrategias para producir proteínas
recombinantes a gran escala, una de ellas es el uso de proteínas de fusión que
posteriormente deben ser removidas en la purificación de la proteína de interés. 10
Este avance significativo en el desarrollo de proteínas terapéuticas llego con la
introducción de proteínas de fusión obtenidas por la unión de dos genes que codifican
para dos o más proteínas. Las proteínas de fusión combinan sus propiedades en una
sola proteína. El ejemplo clínico y comercial más exitoso desarrollado con esta
16
tecnología son las inmunoglobulinas. Las proteínas de fusión pueden proporcionar
varios beneficios, como lo son el alargamiento del tiempo de vida media (como en el
caso de las inmunoglobulinas), facilitan la expresión de la proteína de interés y su
purificación por medio de cromatografía afinidad así mismo mejoran la solubilidad y
estabilidad incrementando la potencia de la misma.6
En general, es difícil decidir cuál será el mejor sistema de fusión para una
proteína de interés específica. Esto dependerá de la proteína diana, el sistema de
expresión a usar y la aplicación de la proteína purificada.10 Cabe mencionar que la
localización de la proteína afecta el aislamiento y purificación del producto, por
ejemplo podría secretarlo al medio de crecimiento, transportarlo al periplasma o
mantenerse en el citoplasma.11 Los sistemas de proteínas de fusión comparten ciertas
características: purificación de un paso, efecto mínimo en la estructura terciaria y en la
actividad biológica, remoción fácil y específica para producir la proteína nativa, ensayos
simples y exactos de la proteína durante la purificación y ser aplicables a diferentes
tipos de proteínas.10
El sistema de expresión influirá altamente sobre las condiciones de cultivo que
optimizarán la expresión de la proteína recombinante, dado que distintos hospederos y
vectores de expresión presentan distintos niveles de producción de una misma
proteína recombinante bajo condiciones de cultivo idénticas. Los sistemas de expresión
bacterianos han sido usados y siguen siendo usados ampliamente en la industria, esto
debido a sus ventajas intrínsecas, como rápido crecimiento, altas producciones y
facilidad de manejo.12
17
Los sistemas de expresión bacterianos son los más usados, específicamente
Escherichia coli (E. coli), el cual es por lo regular la primera opción al momento de elegir
el sistema, es incluso el más usado a escala industrial, produce de hecho la mitad de las
proteínas comercializadas actualmente.13 E. coli es por mucho el mejor hospedero
caracterizado con muchos sistemas de expresión disponibles.14
E. coli es también uno de los modelos más simples para la producción de
proteínas recombinantes lo cual facilita el escalamiento. Sin embargo, también impone
limitaciones como la selección de la proteína que se producirá, ya que las bacterias
carecen de capacidad para realizar la mayor parte de las modificaciones
postraduccionales de la proteína.2 De la misma manera la producción de proteínas que
dependen de puentes disulfuro para su estabilidad ha sido considerada difícil en E.
coli.15
La adecuada expresión de proteínas recombinantes en E. coli depende de su
capacidad para evitar interacciones indeseadas con otros polipéptidos, que pueden
derivar a la agregación de intermediarios plegados en vez de a las proteínas deseadas. 15
Algunos factores que afectan el nivel de expresión incluyen pequeñas y sutiles
características de la secuencia del gen, la estabilidad y eficiencia del ARNm, el plegado
correcto y eficiente de las proteínas, el uso de codones, degradación de la proteína
recombinante por proteasas dependientes de ATP y la toxicidad de la proteína. 8
Un vector de expresión para E. coli debe contener, además del gen de interés,
un origen de replicación, un gen que confiera resistencia a antibióticos (o cualquier
18
otro marcador de selección), un promotor y un terminador transcripcional. El origen de
replicación determina el número de copias del vector, el cual influencia la estabilidad
del plásmido.16
El método más intuitivo para aprovechar en E. coli las proteínas recombinantes
es direccionar los polipéptidos hacia el periplasma bacteriano. Las razones para esto
son que en el periplasma al contrario del citoplasma, es un compartimiento oxidante
que almacena las enzimas encargadas de la formación del puente disulfuro y de su
isomerización así como chaperonas y enzimas de plegamiento.15 Otras ventajas que se
describen para la expresión en el periplasma incluyen que el tamaño del péptido a
insertarse no es relevante, existe poca actividad proteolítica, tiene un alto nivel de
expresión, contiene únicamente el 4% de las proteínas totales de la célula, se puede
purificar fácilmente por choque osmótico y permite la acumulación de proteínas que
serían tóxicas en el citoplasma.2, 17
La expresión de proteínas recombinantes en la superficie bacteriana posee
muchas aplicaciones potenciales en la biotecnología y requiere de un mayor
conocimiento de la composición molecular de la molécula de transporte usada como
proteína de fusión.8 La mayoría de las proteínas de fusión usadas son pequeñas y por
tanto su expresión en E. coli deberá ser substancial. Cualquier proteína novel usada
para fusión deberá tener tales características.18
Para lograr esto se ha planteado fusionar diversas proteínas de interés con un
péptido líder adecuado para la expresión deseada. Debido a esto se propone usar la
19
proteína SmbP (Small Metal Binding Protein) como proteína de fusión. SmbP ha sido
aislada del periplasma de Nitrosomonas europaea (N. europaea).19 Con el fin de
mostrar la eficiencia de SmbP como proteína de fusión se plantea usar diferentes
proteínas de origen procariótico y eucariótico para mostrar su expresión y posterior
purificación mediante cromatografía de afinidad.
20
CAPÍTULO 2
2. ANTECEDENTES
2.1. SmbP como proteína de fusión
N. europaea es una bacteria gram negativa que ha sido estudiada durante varias
décadas por jugar un papel importante en el ciclo global del nitrógeno al empezarlo
mediante la oxidación del amonio (NH3) a nitrito (NO2-) y CO2. Se sabe que obtiene su
energía de esta manera y además la demanda de carbono se completa mediante la
fijación del CO2. Minerales adicionales completan las necesidades nutricionales de la
célula. Debido a que no se ha comprobado su crecimiento en otras fuentes de carbón o
de energía ha sido clasificada como quimiolitoautótrofa obligada.20, 21
N. europaea puede utilizar cantidades limitadas de ciertos compuestos
orgánicos, como aminoácidos, piruvato y acetato así como otros compuesto
inorgánicos. Se ha encontrado que agregar algunos aminoácidos al cultivo de N.
europaea incrementa la producción de NO2- y la producción de proteínas (las cuales se
21
correlacionan con el crecimiento). Por tanto es importante cuidar la composición del
medio de cultivo para que atienda a las necesidades especiales de N. europaea.21
N. europaea y otras bacterias oxidantes de amonio participan en la conversión
biogeoquímica del nitrógeno reducido en forma de amonio o amoniaco a la forma de
nitrógeno oxidado como nitrito (NO2-), nitrato (NO3-) o en forma gaseosa (NO, N2O). Los
organismos nitrificadores que fijan el nitrógeno a nitrito o nitrato incrementan las
fuentes de nitrógeno para las plantas. N. europaea logra esto mediante la acción
sucesiva de la amonio monooxigenasa (AMO) y la hidroxilamina reductasa (HOR).21
N. europaea es un miembro de Proteobacteria, un numeroso grupo de
eubacterias, que se presume poseen un ancestro fotosintético en común. Todas las
bacterias oxidantes de amonio que se han identificado pertenecen a la subdivisión beta
de las proteobacterias, incluyendo además del género nitrosomonas y nitrospira, N.
europaea es la bacteria oxidante de amonio mejor estudiada a nivel molecular. 20 Su
genoma consiste en un solo cromosoma circular de 2812094 bp; el nucleótido 1 fue
asignado al origen de replicación predicho. El genoma está dividido en dos centros de
replicación cuyo tamaño varía entre ellos (1/3:2/3). Los genes que participan en la
oxidación del amonio junto con una región duplicada (7.5 kb) se encuentran en el
centro de replicación más grande.20
En general, el genoma de N. europaea está compuesto de 50.7% de G+C. Los
genes están distribuidos de manera equitativa en la circunferencia del genoma. Se
encontraron 2560 genes codificadores de proteínas. Los marcos de lectura abierta
22
(ORF) dieron un total de 2487261 nucleótidos. Las secuencias codificantes para
proteína se buscaron en bases de datos, dando como resultado que 285 de estas
secuencias codificaban para proteínas de función desconocida aún. A
aproximadamente el 75% de éstas se les podría asignar una función determinada.20
Una bacteria gram negativa como E. coli posee una cubierta tri-membranal: una
membrana plasmática interna, una externa y el espacio periplásmico entre ellas. El
espacio periplásmico está compuesto de una estructura de peptidoglicano ocupado por
una solución acuosa de mono y oligosacáridos, proteínas y otros solutos. Se cree que
este espacio, debido a las proteínas presentes, realiza distintas funciones biológicas,
incluyendo la protección contra el deterioro por factores externos (como antibióticos);
consumo, almacenamiento y quimiotaxis de varios nutrimentos, sales y aminoácidos y
otros roles que no entrarían dentro de estos dos.19 Para hacer frente a condiciones
dañinas en el espacio periplásmico, N. europaea posee una abundante cantidad de
chaperonas en especie y cantidad, para permitir el plegamiento de las proteínas y
evitar la agregación en dicho lugar. En un estudio reciente se ha encontrado que las
proteínas periplasmáticas en E. coli difícilmente se agregan en condiciones
desnaturalizantes.22
El cobre es un elemento esencial en las células vivas y es un cofactor en una
gran cantidad de enzimas. Es tóxico en concentraciones elevadas y se han caracterizado
varios sistemas que regulan la concentración de cobre. Existe una variedad de
proteínas que transportan o facilitan el flujo de cobre, éstas incluyen los sistemas
homólogos CopABCD y PcoABCD de Pseudomonas syringae y E. coli respectivamente,

23
estos sistemas confieren resistencia al cobre a bacterias gram negativas secuestrando
el cobre al periplasma y a la membrana externa. También existen una variedad de
chaperonas de cobre y transportadores de cobre como ATPasas de cobre. Las
metalotioneínas son proteínas bien caracterizadas que actúan como “esponjas
metálicas” y contienen un alto número de cisteínas. Otra clase de proteínas que quizás
tengan un rol en la regulación y secuestro de cobre en las plantas son las
metalohistinas, una nueva clase de pequeñas proteínas ricas en histidina caracterizadas
recientemente, que son capaces de unir múltiples iones metálicos.19 SmbP (nombre por
sus siglas en inglés Small Metal Binding Protein) pertenece a esta familia y fue aislada
de N. europaea y caracterizada recientemente.
SmbP posee un peso de 9.9 kDa, posee una estructura monomérica
caracterizada por diez repeticiones de siete aminoácidos caracterizados por el residuo
de histidina conservado en la cuarta posición y residuos conservados en cada una de las
otras seis posiciones. Está formada principalmente de histidinas (17%), alanina (16%),
glutamato (14%), glicina (11%) y lisina (9%), siendo estas el 67% de la composición total
de aminoácidos. Además es de naturaleza y diseño simple, y las predicciones de la
segunda estructura sugieren que es un complejo de cuatro hélices alfa.19
El péptido maduro tiene una longitud de 93 aminoácidos con una masa
molecular (determinada por MS MALDI-TOF) de 9866 Da. Extensivas búsquedas en
bases de datos no han identificado alguna otra proteína con una homología
significante. SmbP posee aproximadamente un átomo de cobre unido por molécula de
proteína aunque es capaz de unirse con hasta 6 átomos de Cu+2.19 Algunos estudios han
24
demostrado que además es capaz de unirse a múltiples metales atómicos, incluyendo
Mn+2, Ni+2, Mg+2, y Zn+2 así como Fe+3.19 SmbP maduro contiene un gran número de
histidinas y residuos ácidos (tres aspartatos y dieciséis glutamatos) que pudieran servir
como ligantes para los múltiples iones de cobre. SmbP difiere de otras proteínas
ligantes de cobre que utilizan cisteína y metionina para ligar.19
Como se mencionó anteriormente, las proteínas de fusión (o proteínas tag) son
un enfoque empleado en el desarrollo y producción de sistemas de expresión de
proteínas recombinantes de uso terapéutico.23 Las proteínas de fusión se han
convertido en la piedra angular de la investigación biológica moderna por su gran
variedad de aplicaciones. Proteínas sin ninguna relación se fusionaron en un principio
para facilitar la detección y/o purificación de una de ellas, sin embargo, se descubrió
que el rendimiento de la proteína recombinante se incrementaba.23
Se han reportado diversas aplicaciones de las proteínas de fusión en la
biotecnología, estas incluyen la facilitación de la purificación de la proteína de interés,
permitir la expresión de proteínas sobre la superficie celular, reducir la perdida de la
proteína de interés debido a la proteólisis, la construcción de moléculas reporteras
para el monitoreo de la expresión de genes y la localización de proteínas así como para
incrementar la circulación y la vida media de las proteínas con fines terapéuticos.24
Por tanto, aunque en un principio, las proteínas de fusión fueron generadas
para facilitar la purificación de proteínas, su inmovilización y para acoplarse a la
actividad de ciertas enzimas, rápidamente se volvió aparente que algunas de ellas
25
incrementaban ampliamente la solubilidad de las proteínas de interés, que de otra
manera se acumularían en cuerpos de inclusión dentro del citoplasma de la célula.25
Esto último ponía solución al problema de la generación de cuerpos de inclusión, el cual
había sido uno de los grandes obstáculos en la producción de proteínas biológicamente
activas en sistemas heterólogos.23
Algunos ejemplos de proteínas de fusión que se han usado para promover la
solubilización de las proteínas incluyen: tioredoxina (trx), glutatión-S-transferasa (GST),
proteína de unión a maltosa (MBP), proteína a, ubiquitina y DsbA (proteína de enlace
disulfuro A).23
En realidad, aun no se conoce del todo como es que este efecto solubilizador
ocurre. De hecho, no es posible saber a ciencia cierta si la solubilidad de diversos
polipéptidos podrá ser mejorada al fusionarla con una proteína altamente soluble, o
que clase de proteína de fusión podrá ser la mejor opción para llevar acabo la
función.23 La razón más probable del incremento del plegado de las proteínas (y por
ende de la solubilidad y disminución de la degradación) es que la proteína de fusión
llega rápida y eficazmente a su conformación nativa mientras emerge del ribosoma y
promueve la adquisición de la estructura correcta favoreciendo una cadena de
reacciones de isomerización en cadena.25
26
2.2. Purificación de proteínas
Las proteínas se han convertido en un objeto de estudio ampliamente común
en diversas áreas de la ciencia con numerosos objetivos, incluyendo aplicación en el
ámbito de la biotecnología, investigación y medicina entre otras. Por tanto, la
purificación de proteínas se ha convertido en una amplia área de investigación, donde a
lo largo de los años se han analizado y propuesto diversas formas de hacer esto posible.
La purificación de proteínas lleva una historia ya de aproximadamente 200
años, donde los primeros intentos fueron de aislar sustancias de plantas con
propiedades similares a las de la “albumina de huevo” por Fourcroy en 1789, 100 años
después Hofmeister en 1889 logra obtener ovoalbúmina cristalizada, siendo la primera
proteína obtenida en forma cristalina. El fraccionamiento de Cohn aparece en 1946
como un método para purificación de proteínas de suero sanguíneo, siendo el primer
método de purificación de proteínas aplicado a gran escala y para usos comerciales. 26
Gracias al desarrollo de la biología molecular, el proceso de obtención de una
proteína específica se ha facilitado enormemente, además la instrumentación y
equipos para dicho fin también ha experimentado un rápido crecimiento.
Anteriormente las fuentes de obtención de proteínas eran poco prácticas, era difícil la
purificación y el rendimiento era muy bajo.26
Existen diversos métodos de uso común en los laboratorios para el aislamiento
y purificación de proteínas, sin embargo, el uso de uno o de otro método dependerá de
diversos factores, por ejemplo, de las propiedades biológicas y fisicoquímicas de la
27
proteína, el uso que se le dará a la proteína obtenida, actividad biológica esperada, el
grado de pureza que se requiere e incluso los recursos con los que se cuenta para dicho
fin.26, 27
Es importante la recolección de información de la proteína de interés, con el fin
de usar el método más conveniente para la purificación. Se deben conocer parámetros
que afecten la estructura, como lo son la temperatura, el pH, solventes orgánicos,
presencia de oxígeno, metales pesados entre otros27, 28
En un método de purificación, el promedio de pasos a seguir es de
aproximadamente cuatro, es difícil obtener una proteína en pocos pasos, incluso
aunque la separación se base en una propiedad bioespecífica.28 Los métodos pueden
variar desde simples procedimientos de precipitación hasta altamente sofisticadas
técnicas de cromatografía, que incluso hoy día siguen en desarrollo y mejora
continua.29 Dichos métodos se pueden clasificar en cuatro distintos grupos
interrelacionados dependiendo de las propiedades de la proteína: características de la
membrana, forma y tamaño, carga neta y biopropiedades.29 Este último es
característico de las técnicas de cromatografía de afinidad.
2.3. Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad consiste en un tipo de cromatografía líquida,
caracterizada por la amplia versatilidad que dicha técnica ofrece.31 Esta técnica explota
28
diversas propiedades, por lo regular bioespecíficas de la proteína que se pretende
purificar. Los métodos de afinidad dependen de las interacciones de la proteína de
interés con un ligando específico, el cual es conocido como “ligando de afinidad”
(substratos análogos, antígenos y/o anticuerpos, substratos de enzimas, por citar
algunos ejemplos).27, 31
Algunos ejemplos de cromatografía de afinidad incluyen: inmunoafinidad,
afinidad a lectina, afinidad biomimética, afinidad a ADN (usado para purificación de
ADN usando nucleótidos complementarios), afinidad a colorante, o afinidad a iones
inmovilizados, este último de interés para el presente proyecto. 31 El uso de
cromatografía de afinidad no es de uso exclusivo para purificar proteínas, ya que
también es posible purificar ADN, ARN, azúcares, aminoácidos, etc.31
2.3.1. Uso de proteínas de fusión en la cromatografía de afinidad
Una de las principales ventajas de una proteína de fusión es que al fusionarse
con una proteína de interés permite su purificación por técnicas relativamente simples
y prácticas de cromatografía de afinidad. Por lo regular dichas proteínas se encuentran
integradas ya a un vector de expresión, donde el mismo posee el gen de dicha proteína
de fusión, estos pueden ser pequeños péptidos o dominios proteicos completos. 31
2.3.2. Purificación por medio de cromatografía de afinidad con iones metálicos
inmovilizados (IMAC)
29
Hasta la fecha han sido descritos un amplio número de sistemas de fusión que
varían de tamaño desde seis aminoácidos (His-tag) hasta proteínas completas capaces
de interaccionar con ligandos immovilizados en una matriz cromatográfica. 24 La
afinidad de ciertas proteínas de fusión a ligandos inmovilizados puede facilitar la
purificación de la proteína de interés, sin embargo, usualmente esto ocurre con una
baja afinidad.25 En dichos sistemas ocurren diversos tipos de interacción, entre ellos
enzima-substrato, receptor bacteriano-proteína sérica, polihistidinas-iones metálicos,
antigéno-anticuerpo.24
Las condiciones de purificación difieren de sistema a sistema y del ambiente
que es tolerado por la proteína de interés. Otros factores que influyen para la elección
del sistema de fusión incluyen la localización de la proteína, el costo, la afinidad por la
matriz, soluciones amortiguadoras a usar y las posibilidades de remover la proteína de
fusión. En algunos casos, la proteína de fusión se puede mantener en la proteína de
interés, esto cuando la actividad de la proteína de interés no se ve afectada o en la
generación de anticuerpos por mencionar algunos ejemplos.24
Estudios previos han mostrado que es posible la purificación de SmbP a través
de cromatografía de afinidad con iones de níquel y la han descrito como una proteína
monomérica periplasmática.19 Como ya se ha mencionado anteriormente, SmbP puede
unir diversos iones metálicos divalentes así como trivalentes y se sabe que es capaz de
unir hasta seis iones metálicos de Cu(II). Basados en dicha evidencia, se pretende
establecer un sistema de fusión que permita la expresión y purificación de diversos
tipos de proteínas usando SmbP como proteína de fusión.

30
La cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, conocida como
IMAC (por sus siglas en inglés: Immobilized Metal-Ions Chromatography) fue descrita
por primera vez por Porath y col., en 1975, dicha cromatografía de afinidad se basaba
en la diferencia de afinidad de las proteínas con iones metálicos unidos a un ligando
quelante inmovilizado sobre un soporte cromatográfico.28
A partir de los estudios de Porath se evaluó la purificación de diferentes
proteínas empleando el sistema de IMAC. El desarrollo de la técnica se aceleró gracias a
la biología molecular moderna y las nuevas técnicas de ADN recombinante. De esta
manera se desarrollaron proteínas recombinantes modificadas genéticamente las
cuales poseyeran una extensión de oligohistidinas extra (péptido de fusión conocido
como His-tag), dicha modificación facilitó enormemente la purificación por IMAC con
iones de Ni(II) ya que la interacción de la proteína con los iones metálicos depende
mucho de la presencia de residuos de histidina.30
Algunas de las características especiales que presenta el sistema IMAC son las
siguientes:
 Se requiere de la exposición de ciertos aminoácidos (histidina, cisteína y
triptófano) sobre la superficie de las proteínas para permitir la adsorción
de la proteína.28
 El acomodo estérico de la cadena polipeptídica juega un papel
importante, proteínas con diferencias en su estructura secundaria y
terciaria pueden ser separadas.28
31
 La unión es afectada por el pH.28, 30
 Se pueden usar diferentes técnicas de elución.28
 Se ha demostrado la eliminación de virus en cierto número de casos.28
IMAC se basa en las interacciones entre metales de transición con ciertos
aminoácidos (histidina, cisteína y triptófano, también conocidos como la triada de
Porath), dichos metales se encuentran inmovilizados a través de enlaces de
coordinación con un agente quelante de metales, el cual se encuentra unido
covalentemente a una matriz insoluble.30, 31

Los metales más usados son los que se
encuentran en el límite de los metales de transición (Cu(II), Zn(II), Ni(II) y Co(II)).31
Dichos metales son considerados como aceptores de pares de electrones, mientras que
los aminoácidos tienen propiedades de donadores de átomos gracias a los
heteroátomos en su estructura (N, O y S).31, 32

Los grupos alfa-amino pueden estar
involucrados también en dicho proceso. La afinidad de la proteína a la matriz depende
mucho del ion metálico usado, por lo regular la afinidad sigue el siguiente orden:
Cu(II)>Ni(II)>Zn(II)>Co(II).28, 30, 31, 32
Varios estudios han demostrado que la histidina es el principal aminoácido que
participa en las uniones de las proteínas con el metal de transición a un pH neutro (o
cercano) y a altas concentraciones ionicas.31 Algunos elementos importantes que
determinan la retención de una proteína al metal son: el número de residuos de
histidina, su disponibilidad en la superficie y su microentorno.31 De hecho, la ausencia
de histidinas se correlaciona directamente con la falta de retención de dicha proteína,
32
esto justifica aún más el uso de proteínas de fusión consistentes en varios residuos de
histidinas o pequeñas proteínas con alto número de residuos de dicho aminoácido. 32
2.3.3. Purificación por medio de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)
El Sistema de FPLC (conocido así por sus siglas en inglés Fast Protein Liquid
Chromatography) fue introducido por primera vez en 1982 por GE Healthcare Life
Sciences pensado como un sistema de cromatografía dedicado exclusivamente a la
separación y purificación de proteínas.28
El sistema de FPLC es una variante de HPLC (High Perfomance Liquid
Chromatography) que permite una alta resolución gracias al pequeño diámetro de las
fases estacionarias.33 La principal diferencia entre el FPLC y el HPLC radica en la
diferencia de presión a la que se somete cada sistema, mientras que el HPLC utiliza
altas presiones (arriba de 400 bar)27, las columnas especiales para FPLC se remiten a
presiones bajas, permitiendo recolectar una alta cantidad de proteínas.27, 33
El FPLC está diseñado para permitir la separación de proteínas conservando su
configuración nativa activa, a diferencia del HPLC donde regularmente ocurre cierta
desnaturalización en las fases de absorción y elusión. El HPLC por su parte es más
apropiado para la separación de proteínas con un peso molecular por debajo de los 30
KDa.29 El sistema de FPLC permite una usar una amplia variedad de técnicas
cromatográficas, como intercambio iónico, quimioenfoque, filtración por gel, fase
reversa, interacciones hidrofóbicas, entre otras.27
33
A partir de la aparición del FPLC han aparecido sucesores a lo largo de los años,
en 1998, la misma compañía GE Healthcare Life Sciences presentó el ÄKTAexplorerTM,
un sistema que permitió un rápido desarrollo y optimización de una diversa variedad
de métodos de purificación, incluyendo el software UNICORNTM.28
34
CAPÍTULO 3
3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
3.1. Objetivo general
Desarrollar una metodología para la producción de proteínas recombinantes
utilizando SmbP como proteína de fusión y E. coli como organismo hospedero.
3.2. Objetivos específicos
 Construir plásmidos con diferentes genes, incluyendo SmbP, MBP y GST
para estudios comparativos.
 Purificar las proteínas recombinantes por medio de cromatografía de
afinidad utilizando una resina funcionalizada con iones metálicos (Cu +2 y
Ni+2).
35
 Establecer métodos eficaces para la expresión y purificación de proteínas
recombinantes fusionadas a SmbP, así como la remoción de ésta para
obtener la proteína de interés completamente libre y pura.
3.3. Hipótesis
La proteína SmbP es una buena opción como proteína de fusión para la
expresión y purificación por medio de cromatografía de afinidad de proteínas
recombinantes en E. coli; en comparación con proteínas de fusión existentes en
el mercado como MBP y GST.
36
CAPÍTULO 4
4. METODOLOGÍA
4.1. Estrategia general experimental
Se utilizarán métodos clásicos de clonación para la construcción de plásmidos
con el gen de SmbP periplásmico y SmbP citoplásmico adicionando diversos genes de
proteínas de interés a estudiar para su posterior expresión y purificación.
Extracción de ADN
Construcción de Transformación de la Tamizaje de
codificante de las
plásmidos. cepa DH5α transformantes
proteinas de interés
Purificación con
Extracción de ADN Transformación de la Expresión de
cromatografía de
plasmídico cepa BL21(DE3) proteínas
afinidad
Figura 1. Estrategia general experimental
37
4.2. Crecimiento de Nitrosomonas europaea
La cepa de Nitrosomonas europaea (ATCC 25978) empleada en el presente
proyecto se obtuvo directamente de ATCC. Se probaron tres diferentes medios en base
a literatura consultada. La composición de los tres medios utilizados es la siguiente:
TABLA 1.
Medio 1 empleado para el crecimiento de N. europaea, modificado de Brett, M.B., Rusell, L.,
Wilson, A.F. (2004)
Concentración
(NH4)2SO4 50 mM
K2HPO4 48 mM
KH2PO4 2 mM
Na2CO3 5 mM
CaCl2 200 µM
MgSO4.7H2O 913 µM
CuSO4.5H2O 667 nM
Fe-EDTA 16 µM
Indicador: Azul de bromofenol
pH 7 – 8
Esterilizar por filtración
TABLA 2.
Medio 2 empleado para el crecimiento de N. europaea, Cabello, F. (2007)
Concentración
(NH4)2SO4 22.7 mM
K2HPO4 2.9 mM
NaH2PO4.2H2O 2 mM
CaCl2 36 µM
MgSO4.7H2O 202.8 µM
Fe-EDTA 16 µM
Ajustar a pH 8.2 con Na2CO3 al 50%.
38
TABLA 3.
Medio 3 empleado para el crecimiento de N. europaea (ATCC Medium: 2265 Nitrosomonas

europaea medium)
Concentración
(NH4)2SO4 23.1 mM
NaH2PO4.2H2O 2.8 mM
KH2PO4 40 mM
Na2CO3 3.5 mM
CaCl2 222.5 µM
MgSO4.7H2O 676.2 µM
CuSO4.5H2O 494.4 nM
FeSO4 30 mM
Ajustar pH 7 – 8 con Na2CO3
*En solución con EDTA 50mM
Se emplearon diferentes condiciones de crecimiento en referencia a las
sugerencias obtenidas de diversas fuentes, incluyendo las mismas de donde se
obtuvieron las composiciones de los diferentes medios usados para el crecimiento de
N. europaea. El medio empleado y sus condiciones se resumen en la siguiente tabla:
39
TABLA 4.
Condiciones empleadas en los diferentes medios empleados
Medio Condiciones
30 °C a 200 rpm
Medio 1
Protegido de la luz
30 °C a 200 rpm
Medio 2
Protegido de la luz
26 °C a 150 rpm
Medio 3
Protegido de la luz
4.3. Recolección de células de N. europaea
La recolección de células de N. europaea se realizó una vez que el crecimiento
alcanzó un D.O.600 de 1.91. A partir de dicho D.O.600 se recolectaron alícuotas de 6 mL y
8 mL de cultivo en una microcentrifuga (marca Thermo Scientific modelo MicroCL 17).
La recolección se realizó a 14000 rpm por dos minutos.
4.4. Extracción de ADN genómico
Para la extracción del ADN genómico se empleó el kit DNEASY BLOOD & TISSUE
de QIAGEN usando las células recolectadas de 6 mL y 8 mL de cultivo respectivamente.
Posteriormente se corrió un gel de agarosa al 0.7% usando TAE como amortiguador
para la observación del ADN genómico extraído.
40
4.5. Amplificación de SmbPp y SmbPc
Se emplearon dos iniciadores delanteros diferentes, uno para la amplificación
de SmbPp y otro para SmbPc, correspondiendo el primero a la secuencia más el
péptido señal para direccionar a periplasma y el segundo a la proteína sin dicha
secuencia (por ende citoplásmico). El iniciador reverso fue el mismo para ambas
amplificaciones.
TABLA 5.
Iniciadores usados para la amplificación de SmbPp y SmbPc
Iniciador Secuencia
SmbPp iniciador delantero 5´– ATGCATGCACATATGAAAACAACCCTGATAAAAGTG – 3´
SmbPc iniciador delantero 5´– ATGCATGCAACATATGAGCGGACATACTGCTCACGT – 3´
SmbP iniciador reverso 5´– ATGCATGGATCCGTGCGATTTATGTTCGGATGC – 3´
Cabe mencionar que los iniciadores delanteros fueron diseñados incluyendo el
sitio de corte para la enzima de restricción NdeI, mientras que para el reverso se
incluyó la secuencia del sitio de corte de la enzima de restricción BamHI.
La amplificación se realizó en un volumen final de 50 µL en microtubos para PCR
de 200 µL. La reacción 1x se conformó de 8 µL del ADN genómico extraído, 5 µL de
solución amortiguadora de reacción, 3 µL de iniciador delantero, 3 µL de iniciador
reverso, 1 µL de dNTP´s, 1 µL Vent polimerasa y completando la reacción con 29 µL de
agua mQ. La amplificación se realizó en un termociclador marca Corbett Research
(modelo CG1-96) con la siguiente programación: un primer paso de 2 minutos a 95 °C
seguido de un segundo paso consistente en 35 ciclos de desnaturalización (un minuto a
41
95 °C), alineamiento (un minuto a 56 °C) y elongación (un minuto a 72 °C) y un tercer
paso de 10 minutos a 72 °C. Mediante una electroforesis con gel de agarosa al 0.7%
usando TAE como solución amortiguadora se confirmó la amplificación del inserto y se
purificó empleando el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION.
4.6. Construcción de plásmidos
4.6.1. Construcción de pET28b-SmbPp y pET28b-SmbPc
Se emplearon técnicas clásicas de clonación (digestión, ligación y
transformación) para la construcción de este primer plásmido.
4.6.1.1. Digestión de plásmidos y genes de SmbPp y SmbPc
Se realizaron dos digestiones simultáneas con los dos genes a insertar y el
plásmido que se usará como vector, en este caso siendo pET28b. La digestión se realizó
con las enzimas NdeI (New England Biolabs, NEB) y BamHI (New England Biolabs, NEB).
Para la digestión del plásmido pET28b, la reacción 1x a volumen final de 20 µL consistió
en 4 µL del plásmido pET28b, 2 µL de solución amortiguadora 3 10x (New England
Biolabs, NEB), 2 µL de BSA (New England Biolabs, NEB) y 9 µL de agua mQ. La digestión
se realizó secuencialmente, primero se agregó 1 µL de BamHI incubando 2 horas a 37
°C, posteriormente se agregó 1 µL de NdeI dejando incubar una hora a 37 °C y
finalmente agregando 1 µL de SAP (Fermentas) e incubando una hora más a 37 °C, las
digestiones se realizaron en una incubadora marca LabTech modelo LSI-3016A.
42
Cumplido el tiempo, la digestión se purificó mediante el kit QIAQUICK GEL
EXTRACTION.
La digestión de los insertos (SmbPp y SmbPc) se realizó a un volumen final de 40
µL. La reacción 1x consistió en 30 µL del inserto obtenido a partir de la amplificación y
posteriormente purificado, 4 µL de la solución amortiguadora 3 10x (NEB), 4 µL de BSA
10x (NEB), 1 µL de NdeI (NEB) y 1 µL de BamHI (NEB). La reacción se incubó durante 3
horas a 37 °C. Posteriormente se purificó mediante el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION.
4.6.1.2. Ligación de pET28b más SmbPp y SmbPc
La reacción de ligación 1x consistió en 1 µL de 10x solución amortiguadora de
ligasa (New England Biolabs, NEB), 1 µL T4 DNA ligase (New England Biolabs, NEB), 4 µL
de pET28b digerido y variando entre cantidades de 0, 2 y 4 µL del inserto (SmbPp y
SmbPc) completando con agua para obtener un volumen final de 10 µL por reacción. La
reacción con 0 de inserto y 4 µL de agua mQ se usó como control negativo. La reacción
se incubo 90 minutos a temperatura ambiente y se guardó toda la noche a – 20 °C.
4.6.1.3. Transformación de pET28b-SmbPp y pET28b-SmbPc
La transformación se realizó en la cepa de E. coli DH5α especial para la
proliferación de ADN plasmídico. Se requirió primero de la desactivación de la ligasa a
65 °C durante 10 minutos como recomendación del instructivo del fabricante de la T4
DNA ligase (New England Biolabs, NEB). Se empleó todo el producto de la reacción de
ligación y se mezcló con 50 µL de células de E. coli DH5α rubidio-competentes en un
microtubo de 1.5 mL en hielo donde se incubó por 20 a 30 minutos. Posteriormente se
43
procedió al choque térmico de 45 segundos a 44 °C y pasando la mezcla de inmediato
nuevamente al hielo, pasados dos minutos se agregaron 800 µL de caldo LB. Una vez
agregado, se mezcla suavemente y se incuba 30 minutos a 37 °C en agitación a 220
rpm. Pasado el tiempo de incubación, se centrifugan los tubos a 14000 rpm durante 2
minutos, se retira el sobrenadante dejando aproximadamente de 50 a 100 µL de caldo
LB. Se resuspenden las células en dicho volumen y se transfieren a placas de agar LB
más Kanamicina (30 mg/mL) y se esparce por la placa por extensión con varilla. Se
incuban las placas durante 16 horas a 37 °C.
4.6.1.4. Extracción de ADN plasmídico de clonas seleccionadas
En base a las colonias obtenidas en las placas con reacción de ligación y en el
control negativo se seleccionaron varias clonas. Dichas colonias se inocularon en 6 mL
de caldo LB y se cultivaron durante 16 horas a 37 °C en agitación a 220 rpm. Se
recolectó el sedimento celular de los 6 mL de cultivo mediante centrifugación durante
2 minutos a 10000 rpm, una vez obtenidas las células se extrajo el ADN plasmídico, lo
cual se realizó con el kit QIAPREP SPIN MINIPREP.
4.6.1.5. Cribado de colonias transformantes
A partir del ADN plasmídico obtenido de las clonas seleccionadas se realizó un
análisis de restricción para confirmar la presencia del plásmido. Para dicho análisis se
empleó una reacción de digestión a un volumen total de 20 µL, la reacción 1x consistió
en 12 µL del ADN plasmídico obtenido, 2 µL de solución amortiguadora 3 (NEBuffer 3)
10x, 2 µL de solución BSA 10x, 1 µL de NdeI (NEB), 1 µL de BamHI (NEB) y 2 µL de agua
mQ. La reacción se incubó durante 3 horas a 37 °C. Para el análisis se realizó una
44
electroforesis en un gel de agarosa al 1% empleando TAE como solución
amortiguadora, usando bromuro de etidio como revelador sobre luz UV.
4.6.2. Construcción de pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-SmbPc-GFP
Se comenzó con la construcción de plásmidos de pET28b-SmbPp y pET28b-
SmbPc agregando el gen de GFP (Green Fluorescent Protein, con un peso de 714 bp)
que se empleará como proteína reportera.
4.6.2.1. Digestión de GFP y plásmidos pET28b-SmbPp
Se tomó el ADN plasmídico de las clonas positivas seleccionadas para SmbPp y
SmbPc y se sometió a una segunda digestión para la inserción del gen de GFP. La
digestión de plásmidos se realizó a un volumen final de 22 µL con una digestión
secuencial. La reacción 1x consistió en 15 µL de plásmido pET28b-SmbPp y pET28b-GST
(construcción con la que se contaba previamente), más 2 µL de solución amortiguadora
4 10x, 2 µL de solución BSA 10x, finalmente se agregaron las enzimas de restricción por
orden secuencial, primero 1 µL de XhoI (NEB) dejando incubar 2 horas a 37 °C, seguido
de 1 µL de NotI (NEB) incubando durante una hora a 37 °C y por último 1 µL de SAP
(Fermentas) durante una hora a 37 °C. Se digirió el inserto de interés, en este caso GFP
(amplificación con la que se contaba previamente) a un volumen final de 40 µL,
empleando 30 µL siendo el volumen total de amplificación, 4 µL de solución
amortiguadora 4 10x, 4 µL de solución BSA 10x, 1 µL de XhoI (NEB) y por último 1 µL de
NotI (NEB). Ambas digestiones fueron purificadas por medio del kit QIAQUICK GEL
EXTRACTION para su posterior uso.
45
4.6.2.2. Ligación de pET28b-SmbPp y pET28b-GST con GFP
La reacción de ligación se llevó a cabo en un volumen final de 10 µL, donde la
reacción 1x consistió en 1 µL de solución amortiguadora de ligasa 10x, 1 µL de T4 DNA
ligase, 4 µL de pET28b-SmbPp y pET28b-GST previamente digeridos y purificados,
agregando volúmenes del inserto digerido, en este caso de GFP variando de 0, 2 y 4 µL
completando el volumen con agua mQ. La ligación con volumen de inserto igual a 0 fue
usado como control negativo de la reacción.
4.6.2.3. Transformación de pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-SmbPc-GFP
Antes de la transformación de las reacciones de ligación, se desactivó la T4 DNA
ligase durante 10 minutos a 65 °C. El protocolo de transformación se realizó como en el
punto 4.7.1.3.
4.6.2.4. Extracción de ADN plasmídico de clonas seleccionadas
El procedimiento para la extracción de plásmidos se realizó como en el punto
4.7.1.4., empleando el mismo kit QIAPREP SPIN MINIPREP.
Para la selección de clonas positivas al inserto GFP se sometió el ADN
plasmídico obtenido durante la extracción a un análisis de restricción. Dicho análisis se
realizó por medio de una digestión a un volumen final de 20 µL, donde la reacción
consistió en 14 µL de ADN plasmídico, 2 µL de solución amortiguadora 4 10x, 2 µL de
solución BSA, 1 µL de XhoI (NEB) y 1 µL de NdeI (NEB). La reacción se incubó durante 3
horas a 37 °C. Para el análisis se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%
46
empleando TAE como solución amortiguadora, usando bromuro de etidio como
revelador sobre luz UV.
4.6.3. Construcción de pET30a-SmbPc-GFP y pET30a-SmbPp-GFP
Se cambió el plásmido pET28b por el pET30a, con el objetivo de mejorar la
expresión de GFP. A continuación se presenta la metodología de construcción.
4.6.3.1. Amplificación de SmbPp-GFP y SmbPc-GFP
A partir de la construcción de pET28b-SmbPp-GFP se realizaron dos
amplificaciones, una con el iniciador delantero para SmbPp y usando el iniciador
reverso para GFP y la segunda con el iniciador delantero para SmbPc y el iniciador
reverso para GFP. Esto con el fin de obtener un inserto con ambos genes incluidos. La
reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 50 µL en tubos de 200 µL
para PCR. La composición de la reacción 1x consistió en 1 µL de enzima Vent
polimerasa (NEB), 1 µL de dNTPs, 3 µL del iniciador delantero (concentración final de 60
pmoles), 3 µL del iniciador reverso (concentración final de 60 pmoles), 5 µL de solución
amortiguadora 10x de polimerasa, 5 µL de ADN plasmídico patrón y completando con
32 µL de agua mQ. El programa de PCR para el termociclador consistió en un primer
paso de un minuto de incubación a 95 °C, un segundo paso consistente en 30 ciclos de
desnaturalización (45 segundos a 95 °C), alineamiento (45 segundos a 56 °C) y
elongación (un minuto a 72 °C) y un tercer paso de incubación de 5 minutos a 72 °C. La
amplificación se visualizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0.7% usando
TAE como solución amortiguadora. La purificación de la amplificación se realizó a partir
del gel empleado para la visualización usando el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION.
47
4.6.3.2. Digestión de insertos SmbPp-GFP y SmbPc-GFP y plásmido pET30a
La digestión de los insertos se realizó a partir de los productos obtenidos de la
amplificación una vez purificados. La reacción se realizó en un volumen total de 40 µL,
donde la reacción 1x consistió en 30 µL del producto de PCR, 4 µL de solución
amortiguadora Fast digest (Thermo Scientific), 1 µL de NdeI (Thermo Scientific) y 1 µL
de XhoI (Thermo Scientific). La reacción se incubó durante 3 horas a 37 °C. La digestión
del plásmido pET30a se realizó a un volumen final de 15 µL, donde se digirió un total de
10 µL de ADN plasmídico con 2 µL de solución amortiguadora Fast digest y 1 µL de XhoI
(Thermo Scientific) incubando una hora a 37 °C, en digestión secuencial se agregó 1 µL
de NdeI (Thermo Scientific) incubando una hora a 37 °C y por ultimo agregando 1 µL de
SAP (Thermo Scientific) e incubando a 37 °C. Las tres digestiones se purificaron por
medio del kit QIAQUICK GEL EXTRACTION.
4.6.3.3. Ligación de pET30a más SmbPp-GFP y SmbPc-GFP
La reacción de ligación para esta construcción se realizó en un volumen final de
10 µL, donde se empleó 1 µL de solución amortiguadora de ligasa 10x (NEB), 1 µL de T4
DNA ligase (NEB), 4 µL de pET30a previamente digerido (con XhoI y NdeI) y 4 µL de
inserto (SmbPp-GFP y SmbPc-GFP). Usando como control negativo una reacción sin los
4 µL de inserto y sustituyéndolo por agua mQ. La reacción se dejó a temperatura
ambiente incubando durante toda la noche.
48
4.6.3.4. Transformación de pET30a más SmbPp-GFP y SmbPc-GFP
Previo a la transformación de las reacciones de ligación, se desactivó la T4 DNA
ligase durante 10 minutos a 65 °C. El protocolo de transformación se realizó como en el
punto 4.7.1.3., exceptuando la cantidad de células rubidio-competentes usadas para
cada transformación, donde en la presente se emplearon 100 µL por cada una.
4.6.3.5. Extracción de ADN plasmídico
Para la detección de colonias transformantes con el inserto ligado, se realizó un
análisis de restricción. La digestión se llevó a un volumen final de 20 µL, donde fueron
digeridos 6 µL de ADN plasmídico extraído previamente, 2 µL de solución
amortiguadora Fast digest (Thermo Scientific) 10x, 1 µL de NdeI (Thermo Scientific), 1
µL de XhoI (Thermo Scientific) y completando a 20 µL con 10 µL de agua mQ. La
visualización del inserto se realizó mediante una electroforesis en un gel de agarosa al
1% usando TAE como solución amortiguadora y bromuro de etidio como revelador para
su visualización por luz UV.
4.6.4. Construcción de pET30a-SmbPc-RFP, pET30a-SmbPp-RFP y pET28b-GST-RFP
Para él estudió del efecto de la expresión de SmbP a nivel periplásmico se
decidió crear dicha construcción empleando RFP (Red Fluorescent Protein con un peso
de 675 bp) como proteína reportera.
49
4.6.4.1. Amplificación de RFP
La amplificación del inserto RFP se realizó a partir de un vector comercial que
incluía el gen para dicho inserto. La reacción para la amplificación se realizó a un
volumen final de 50 µL en tubos especiales para PCR con capacidad de 200 µL. Dicha
reacción 1x consistió en 1 µL de plásmido comercial patrón, 1 µL de Vent polimerasa
(NEB), 1 µL de dNTP´s, 1 µL MgSO4 (NEB), 5 µL de solución amortiguadora de Vent
polimerasa, 3 µL del iniciador delantero (concentración final de 60 pmoles), 3 µL del
iniciador reverso (concentración final de 60 pmoles) y completando el volumen final
con 35 µL de agua mQ, la secuencia de iniciadores se muestra en la tabla 6. El programa
de PCR fue el siguiente: un primer paso de dos minutos a 95 °C seguido de un segundo
paso que consistió en 30 ciclos de desnaturalización (un minuto a 95 °C), alineamiento
(un minuto a 56 °C) y elongación (un minuto a 72 °C) y un tercer paso final de 10
minutos a 72 °C. La amplificación se visualizó mediante un gel de agarosa al 0.7%
usando TAE como solución amortiguadora. La purificación de la amplificación se realizó
por medio del gel empleando el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION.
TABLA 6.
Iniciadores empleados para la amplificación de RFP
Iniciador Secuencia
RFP iniciador delantero 5´– AGTCAGTCAGCGGCCGCATGGACAACACCGAGGACGTC – 3´
RFP iniciador reverso 5´– AGTCAGTCACTCGAGCTACTGGGAGCCGGAGTGG– 3´
50
4.6.4.2. Digestión de inserto RFP y de plásmidos pET30a-SmbPp-GFP, pET30a-
SmbPc-GFP y pET28b-GST-GFP
La digestión del inserto RFP se realizó a partir del producto de purificación de la
amplificación realizada. El volumen de dicha digestión fue de 40 µL, la cual se conformó
de 30 µL del producto de amplificación purificado, 3 µL de solución amortiguadora 3.1
10x (NEB), 3 µL de solución BSA 10x, 0.5 µL de XhoI (NEB) y 1 µL de NotI (NEB) y
completando a 40 µL con agua mQ. La reacción se dejó incubando cinco horas a 37 °C y
se purificó mediante gel de agarosa al 0.7% usando TAE como solución amortiguadora y
empleando el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION. Para la digestión de los plásmidos pET30-
SmbPp-GFP, pET30a-SmbPc-GFP y pET28b-GST-RFP se empleó un volumen de reacción
de 20 µL, donde 10 µL correspondían al ADN plasmídico, 2 µL de solución
amortiguadora 3.1 10x, 2 µL de solución BSA 10x y 3 µL de agua mQ, las enzimas de
restricción se agregaron secuencialmente, siendo la primera 0.5 µL de XhoI (NEB)
incubando 2 horas a 37 °C, seguido de 0.5 µL de NotI (NEB) incubando también 2 horas
a 37 °C y por ultimo 2 µL de SAP (Fermentas) incubando 3 horas a 37 °C. La purificación
de la digestión se realizó mediante un gel de agarosa al 0.7% usando TAE como
solución amortiguadora, con el fin de apreciar las bandas de digestión y purificar
únicamente la banda que correspondía al plásmido digerido sin GFP por medio del kit
QIAQUICK GEL EXTRACTION.
4.6.4.3. Ligación de pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET30a-GST más RFP
La reacción de ligación se llevó a cabo en un volumen final de 10 µL, en donde
dicha reacción consistió en 2 µL de solución amortiguadora de la ligasa, 1 µL T4 DNA
51
ligasa, 2 µL del plásmido (pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc, pET28b-GST) y se varió el
volumen de inserto RFP de 0, 2, 4 y 6 µL, completando el volumen final con agua mQ
según se requiriera. La reacción con un volumen de inserto de cero se empleó como
control negativo.
4.6.4.4. Transformación de pET30a-SmbPp-RFP, pET30a-SmbPc-RFP y pET28b-
GST-RFP
El protocolo de transformación se siguió después de la desactivación de la ligasa
durante 10 minutos a 65 °C. El protocolo de transformación se realizó como en el punto
4.7.1.3.
4.6.4.5. Extracción de ADN plasmídico de las colonias obtenidas
Con el fin de corroborar que las colonias seleccionadas de las transformaciones
(a las cuales se extrajo el ADN plasmídico) realmente contengan el gen de interés se
realizó un análisis de restricción. Dicha digestión se realizó a un volumen final de 20 µL,
donde la reacción consistió en 10 µL de ADN plasmídico, 2 µL de solución
amortiguadora 3.1 10x, 2 µL de solución BSA 10x, 5 µL de agua mQ, 0.5 µL de XhoI
(NEB) y 0.5 µL de NdeI (NEB). La visualización de la digestión se realizó mediante un gel
de agarosa al 1 % usando TAE como solución amortiguadora y bromuro de etidio como
agente revelador. En el caso de pET28b-GST-RFP, el análisis se realizó por medio de una
52
amplificación. Dicha reacción se llevó a un volumen final de 50 µL, en donde ésta
consistió en 1 µL de ADN plásmidico a probar (pET28b-GST-RFP), 1 µL de taq
polimerasa (GenScript), 1 µL de dNTPS, 3 µL de iniciador delantero T7, 3 µL de iniciador
reverso de RFP, 5 µL de solución amortiguadora de polimerasa y completando el
volumen con 36 µL de agua mQ.
4.6.5. Construcción de plásmidos pET30a-SmbPp-X, pET30a-SmbPc-X y pET28b-
GST-X
Se realizaron además de las construcciones con los genes de proteínas
reporteras de expresión, otras donde se incluyeron diferentes genes de interés con
diversos orígenes. Los genes de los cuales también se realizaron construcciones fueron:
NDPK2 (Nucleoside diphosphate kinase II, 714 bp), SHY2 (Short Hypocotyl 2, 593 bp),
LovR (Two-component receiver domain protein, 456 bp), PixE (PatA subfamily protein,
1143 bp) y CRY1 (Cryptochrome 1, 2069 bp). Estas construcciones se realizaron con el
fin de probar la expresión de diversos genes y comparar SmbP con GST como proteínas
de fusión.
4.6.5.1. Amplificación de insertos
La amplificación de los insertos de interés se realizó a partir de genes puros de
dichos insertos con los que se contaba previamente. Las reacciones de amplificación se
realizaron a volúmenes finales de 50 µL en tubos especiales para PCR con una
capacidad máxima de 200 µL. La reacción de amplificación constó de 1 µL del gen
patrón usado, 1 µL de Vent polimerasa (NEB), 1 µL de MgSO4, 1 µL de dNTP´s, 3 µL del
iniciador delantero (concentración final de 60 pmoles), 3 µL del iniciador reverso

53
(concentración final de 60 pmoles), 5 µL de solución amortiguadora de Vent polimerasa
y se completó el volumen a 50 µL con 35 µL de agua mQ. El programa de PCR fue el
siguiente: un primer paso de dos minutos a 95 °C seguido de un segundo paso que
consistió en 30 ciclos de desnaturalización (un minuto a 95 °C), alineamiento (un
minuto a 56 °C) y elongación (un minuto a 72 °C) y un tercer paso final de 10 minutos a
72 °C. El programa de PCR se varió para el caso de la amplificación de PixE y CRY1,
donde debido al tamaño del gen, el tiempo de elongación se aumentó a 1 minuto 30
segundos y dos minutos respectivamente. La amplificación se visualizó mediante un gel
de agarosa al 0.7% usando TAE como solución amortiguadora. La purificación de la
amplificación se realizó por medio del gel empleando el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION.
4.6.5.2. Digestión de plásmidos pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET28b-GST e
insertos de interés
La digestión y purificación de los plásmidos se realizó como en el punto 4.7.4.2.,
incluyendo para pET28b-GST-GFP, donde fue requerida la visualización de las tres
digestiones por medio de un gel de agarosa al 1% usando TAE como solución
amortiguadora y de esta manera purificar únicamente el plásmido con el gen de la
proteína de fusión con el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION y asegurar la remoción de
GFP. La reacción nuevamente se llevó a un volumen final de 20 µL, la cual estaba
compuesta de 10 µL de ADN plasmídico, 2 µL de solución amortiguadora 4 10x, 2 µL de
solución BSA 10x, 2 µL de agua mQ y las enzimas se agregaron secuencialmente,
primero 1 µL de XhoI (NEB) incubando por 2 horas a 37 °C, seguido de 1 µL de NotI
(NEB) incubando 1 hora a 37 °C y por último 2 µL de SAP (Fermentas) e incubando
54
durante dos horas. La digestión de los insertos se realizó también como en el punto
4.7.4.2., partiendo de los productos obtenidos de la amplificación.
4.6.5.3. Ligación de pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET28b-GST con insertos
de interés
Las reacciones de ligación para la construcción de plásmidos se llevaron a cabo
a un volumen final de 20 µL. Las reacciones consistieron en 2 µL de solución
amortiguadora de la ligasa, 1 µL de T4 DNA ligasa, 2 µL del plásmido y se varió la
cantidad de inserto de 0, 2, 4 y hasta 6 µL, completando el volumen con agua mQ. La
reacción con un volumen de inserto igual a 0 fue usado como control negativo de la
reacción de ligación.
4.6.5.4. Transformación de la ligación pET30a-SmbPp, pET30a-SmbPc y pET28b-
GST con insertos de interés
La transformación se realizó después de la desactivación de la T4 DNA ligasa por
medio de una incubación a 65 °C por 10 minutos y se procedió con el mismo protocolo
seguido en el punto 4.7.1.3.
El procedimiento para la extracción de ADN plasmídico se realizó como en el
punto 4.7.1.4., empleando el mismo kit QIAPREP SPIN MINIPREP.
Para la selección del ADN plasmídico obtenido de las clonas de la
transformación que efectivamente contenían el inserto se realizó a una amplificación.
55
Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 50 µL en
microtubos especiales para PCR con capacidad de 200 µL. Cada reacción consistió en 1
µL de ADN plasmídico a examinar, 1 µL de taq polimerasa (GenScript), 1 µL de dNTP´s, 3
µL de iniciador delantero (concentración final de 60 pmoles), 3 µL de iniciador reverso
(concentración final de 60 pmoles), 5 µL de solución amortiguadora de la taq
polimerasa (GenScript) y completando a 50 µL con 36 µL de agua mQ. Los iniciadores se
variaron en el análisis individual de los insertos. Para pET30a-SmbPp-NDPK2, pET30-
SmbPp-SHY2, pET30a-SmbPc-NDPK2, pET28b-GST-LovR y pET28b-GST-SHY2 se usaron
los iniciadores delanteros y reversos correspondientes al inserto. En el caso de pET30a-
SmbPc-PixE, pET30a-SmbPc-SHY2 se emplearon los iniciadores reversos y delanteros de
T7, mientras que para pET28b-GST-NDPK2 se empleó el iniciador delantero T7 y el
reverso de NDPK2. El programa de PCR fue el siguiente: un primer paso de dos minutos
a 95 °C, un segundo paso de 30 ciclos de desnaturalización (un minuto a 95 °C),
alineamiento (un minuto a 56 °C) y elongación (un minuto a 72 °C) y una tercera etapa
final de incubación durante 10 minutos a 72 °C. El ADN plasmídico obtenido de otras
construcciones pET30a-SmbPp-LovR y pET30a-SmbPc-LovR se analizó mediante un
análisis de restricción, la reacción de digestión se llevó a un volumen final de 20 µL la
cual consistió en 10 µL del ADN plasmídico a probar, 2 µL de solución amortiguadora
3.1 10x, 2 µL de solución BSA 10x, 0.5 µL de XhoI (NEB) y 0.5 µL de XhoI (NEB) y
completando a 20 µL con 5 µL de agua mQ. Tanto la amplificación como el análisis se
visualizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0.7% y al 1%
respectivamente, se empleó TAE como solución amortigudora empleando bromuro de
56
etidio como revelador en luz UV. Se comprobó el tamaño de los fragmentos con ayuda
de un marcador de peso molecular de 1 Kbp (250 bp a 10 Kbp).
4.6.6. Construcción de plásmido pET30a-SmbPcE-GFPEnt
Se realizó también una construcción con SmbP citoplásmico en pET30a que
incluyera el sitio de reconocimiento de corte para enteroquinasa, el nuevo inserto
generado se llamó SmbPcE. Esto se logró cambiando el diseño del iniciador y por ende
los sitios también de reconocimiento para las enzimas de restricción con las que se
trabajaron.
4.6.6.1. Amplificación de SmbPcE y GFPEnt
Se realizaron dos reacciones de amplificación para los dos nuevos diseños de
SmbPc y GFP, esta vez con el fin de dejar libre el sitio de reconocimiento de
enteroquinasa propio del plásmido pET30a. Se varió el iniciador reverso para SmbP y se
usó el mismo iniciador delantero de SmbPc, para GFP se cambió el diseño del iniciador
delantero para el sitio de enteroquinasa y se conservó el reverso. Como en las
amplificaciones descritas anteriormente, el volumen de reacción fue de 50 µL, el cual
consistió en 1 µL de ADN patrón (construcción de pET30a-SmbPp-GFP para ambos
casos), 1 µL de Vent polimerasa (NEB), 2 µl de MgSO4, 2 µL de dNTP´s, 3 µL de iniciador
delantero (concentración final de 60 pmoles), 3 µL de iniciador reverso (concentración
final de 60 pmoles), 5 µL de solución amortiguadora de Vent polimerasa y completando
con 33 µL de agua mQ. El programa de PCR fue el siguiente: un primer paso de dos
minutos a 95 °C, un segundo paso que consistió en 30 ciclos de desnaturalización (un
minuto a 95 °C), alineamiento (un minuto a 56 °C) y elongación (un minuto a 72 °C) y un
57
tercer paso final de 10 minutos a 72 °C. La amplificación se visualizó mediante un gel de
agarosa al 0.7% usando TAE como solución amortiguadora. La purificación de la
amplificación se realizó por medio del gel empleando el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION
en un volumen final de 30 µL.
TABLA 7.
Iniciadores empleados para la amplificación de SmbPcE y GFPENT
Iniciador Secuencia
SmbPc iniciador delantero 5´– ATGCATGCAACATATGAGCGGACATACTGCTCACGT – 3´
SmbP Ent. Iniciador reverso 5´– ATGCATGCAGGTACCGTGCGATTTATGTTCGGATGC– 3´
GFP iniciador delantero 5´– ATGCATGCACCATGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG – 3´
GFP iniciador reverso 5´– NNNNNNCTCGAGTTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAG –3´
4.6.6.2. Digestión de los insertos SmbPcE y del plásmido pET30a
La digestión para el inserto obtenido de la amplificación de SmbPcE y del
plásmido pET30a se realizó a un volumen final de 50 µL, en donde la reacción de
digestión para SmbPcE consistió en 30 µL del producto de amplificación purificado, 5 µL
del solución amortiguadora 1.1 10x (NEB), 5 µL de solución BSA 10x, 8 µL de agua mQ, 1
µL de KpnI (NEB)y 1 µL de NdeI (NEB), la reacción se incubó por 1 hora a 37 °C. En el
caso de la digestión del plásmido pET30a, la reacción consistió en 10 µL de plásmido, 5
µL de solución amortiguadora 1.1 10x (NEB), 5 µL de BSA 10x y 26 µL de agua mQ, las
enzimas de restricción se agregaron secuencialmente, primero 1 µL de NdeI (NEB)
incubando por 1 hora a 37 °C, seguido de 1 µL de KpnI (NEB) incubando 1 hora a 37 °C y
por último 2 µL de SAP (Fermentas) incubando durante 1 hora a 37 °C. Ambas
58
digestiones fueron purificadas mediante el kit QIAQUICK GEL EXTRACTION a un
volumen final de 30 µL.
4.6.6.3. Ligación de pET30a más SmbPcE
La reacción de ligación se llevó a un volumen final de 20 µL, dicha reacción
consistió en 2 µL de solución amortiguadora de la ligasa, 1 µL T4 DNA ligasa, 2 µL de
plásmido pET30a digerido, el volumen del inserto SmbPcE se varió de 0, 2, 4 y 6 µL,
completando el volumen según se requiriese con agua mQ usando la reacción con
volumen de inserto 0 como control negativo.
4.6.6.4. Transformación de pET30a-SmbPcE
4.6.6.6. Cribado de las colonias transformantes
Para la selección de ADN plasmídico positivo para la inserción del inserto se
verificó por medio de amplificación por PCR. El volumen final de la reacción fue de 50
µL, donde la composición se conformó de 1 µL de ADN plasmídico a probar, 1 µL taq
polimerasa (GenScript), 1 µL dNTPs, 5 µL solución amortiguadora de la polimerasa, 3 µL
iniciador T7 delantero (concentración final de 60 pmoles), 3 µL iniciador SmbPcE
59
reverso (concentración final de 60 pmoles) y completando el volumen con 36 µL de
agua mQ. El programa de PCR fue el siguiente: un primer paso de dos minutos a 95 °C,
un segundo paso que consistió en 30 ciclos de desnaturalización (un minuto a 95 °C),
alineamiento (un minuto a 56 °C) y elongación (un minuto a 72 °C) y un tercer paso
final de 10 minutos a 72 °C. La amplificación se visualizó mediante un gel de agarosa al
0.7% usando TAE como solución amortiguadora.
4.6.6.7. Digestión de pET30a-SmbPcE y GFPEnt
La digestión del inserto GFPENT se llevó a cabo a partir de la amplificación
previamente purificada por gel. Dicha digestión se llevó a un volumen de 50 µL, donde
la reacción consistió en 30 µL del producto de amplificación, 3 µL de solución
amortiguadora 3.1 10x (NEB), 3 µL de solución BSA 10x, 2 µL de agua mQ, 1 µL de la
enzima NcoI (NEB) y 1 µL de la enzima XhoI (NEB), se incubó durante 3 horas a 37 °C. La
digestión de pET30a-SmbPcE consistió en una reacción de 50 µL también, donde se
usaron 10 µL de dicho ADN plasmídico, 2 µL de solución amortiguadora 3.1 10x (NEB), 2
µL de solución BSA y 32 µL de agua mQ para completar el volumen, las enzimas se
agregaron en orden, primero se agregó 1 µL de NcoI (NEB) y se incubó durante una
hora a 37 °C, posteriormente 1 µL de XhoI (NEB) dejando incubar una hora a 37 °C y por
ultimo 2 µL de SAP (Fermentas) e incubando durante 1 hora a 37 °C. Terminando el
tiempo de incubación, se purificaron ambas digestiones con el kit QIAQUICK GEL
EXTRATION para su posterior uso.
60
4.6.6.8. Ligación de pET30a-SmbPcE más GFPENT
Se realizaron varias reacciones de ligación, cada una de ellas a un volumen final
de 20 µL. Las reacciones consistieron en 2 µL de solución amortiguadora de la ligasa, 1
µL de T4 DNA ligasa (NEB), 2 µL de plásmido digerido, el volumen del inserto varió de 0,
2 y 4 µL, completando a 20 µL con agua mQ según fuese necesario. Se dejó incubando
una hora a temperatura ambiente y posteriormente se incubó a 4 °C durante toda la
noche.
4.6.6.9. Transformación de pET30a-SmbPcE-GFPENT
Para la selección de colonias positivas al inserto de GFPENT se procedió a un
análisis de restricción. Cada reacción se llevó a un volumen final de 20 µL, donde cada
una consistió en 10 µL del ADN plasmídico a analizar, 2 µL de solución amortiguadora
3.1 10x (NEB), 1 µL de enzima NcoI (NEB), 1 µL de enzima XhoI (NEB) y completando
con 6 µL de agua mQ. La visualización del análisis se realizó mediante un gel de agarosa
61
al 1 % usando TAE como solución amortiguadora y bromuro de etidio como agente
revelador.
4.7. Expresión de proteínas
A continuación se describe el protocolo seguido para la purificación de SmbPc-
GFP y SmbPp-RFP.
4.7.1. Transformación de la cepa de E. coli BL21(DE3)
Se realizaron varias pruebas de expresión a partir de las construcciones de
plásmidos hechas. Para esto se transformó la cepa E. coli BL21(DE3), la cual es especial
para la expresión de proteínas, con las diferentes construcciones a probar. Para esta
transformación se empleó 1 µL de ADN plasmídico y 30 µL de células de E. coli
BL21(DE3) rubidio-competentes. Se mezcló el ADN plasmídico con las células y se
incubó la mezcla en hielo por 20 minutos. Después de ese tiempo se hizo a un choque
térmico de 45 segundos a 44 °C, terminado el tiempo se colocó otra vez en hielo
dejando reposar nuevamente por un mínimo de 2 minutos. Posteriormente se
agregaron 850 µL de caldo LB y se incubó durante una hora mínimo a 37 °C con 220
rpm. Pasado el tiempo de incubación se centrifugó por 2 minutos a 10000 rpm. Se
descartan aproximadamente 800 µL de medio dejando el sedimento celular intacto, el
cual se resuspende con el medio remanente y se transfiere a una placa de agar LB con
el antibiótico correspondiente y se incuba por extensión con varilla. Las placas se sellan
y se incuban durante 16 horas a 37 °C.
62
4.7.2. Expresión piloto de proteínas
Se procedió a una expresión de proteínas piloto de las clonas obtenidas
mediante la transformación de la cepa BL21(DE3) de E. coli con el fin de corroborar su
correcta expresión. Para esto se seleccionan varias colonias y se transfiere una sola
clona con ayuda de un aplicador a un tubo con 2 mL de caldo LB. Se incuban a 37 °C a
220 rpm hasta que alcancen una D.O.600 de entre 0.4 – 0.6. Una vez llegado a dicho
D.O.600 se detiene la incubación y una vez atemperados los cultivos se agrega IPTG
(Isopropil-B-D-tiogalactopiranósido) como inductor a una concentración final de 0.1
mM. Se dejan incubando a 25 °C con 220 rpm durante 16 horas. Se recolecta el
sedimento celular en una centrifuga de marca Thermo Scientific (Sorvall modelo ST16R)
asegurándose de retirar completamente el caldo LB.
4.7.2.1. Obtención de la fracción soluble e insoluble
Se procede a la obtención de la fracción soluble a partir del sedimento celular.
Para esto, se resuspende el sedimento en 120 µL de agua mQ, posteriormente se
agregan 40 µL de solución amortiguadora de carga para SDS-PAGE 6x y se mezcla
suavemente, finalmente se hierve durante 10 minutos y se centrifuga 15 minutos a
13000 rpm. Se separa el sobrenadante como fracción soluble, al sedimento restante se
le agregan 120 µL de solución de urea 8 M y se hierve de nuevo durante otros 10
minutos de esta manera los cuerpos de inclusión se solubilizan en la solución de urea,
finalmente se centrifuga obteniendo así la fracción insoluble en el sobrenadante el cual
es posteriormente visualizado mediante el SDS-PAGE al igual que la fracción soluble.
63
4.7.2.2. Visualización de la expresión
Obtenidas ambas fracciones se procede a la visualización por medio de SDS-
PAGE en fase discontinua, usando un gel de resolución al 10% y uno apilador al 4% de
poliacrilamida desgasificada respectivamente. Después de la electroforesis se realiza
una tinción con azul de coomassie.
4.7.3. Escalamiento de la expresión
Se realizó una expresión a escala mayor de SmbPc-GFP, SmbPcE-GFP y SmbPp-
RFP. Se seleccionaron clonas que presentaran una adecuada expresión. La expresión de
SmbPc-GFP se realizó en matraces de 500 mL, se obtuvó un volumen final de cultivo de
4 L. Se inocularon los matraces con un cultivo previo de la clona seleccionada y se
incubaron a 37 °C con agitación de 220 rpm hasta que el cultivo alcanzó un D.O. 600 de
0.4 a 0.6. Una vez llegado a dicho rango se comenzó la inducción agregando IPTG hasta
una concentración final de 0.1 mM, la expresión se llevó durante 16 horas a 25 °C con
agitación constante de 220 rpm. La expresión de SmbPcE-GFPENT se realizó con las
mismas condiciones variando únicamente de medio LB a medio SOC y se emplearon
matraces con deflectores. En la expresión de SmbPp-RFP también se emplearon
matraces de 500 mL con deflectores con un volumen de cultivo final de de 600 mL. Se
colectó el sedimento celular con una centrifuga refrigerada a 4 °C durante 30 minutos a
5 mil rpm y se congeló a -20 °C para su posterior uso.
64
A continuación se describirán los métodos empleados para la purificación de
SmbPc-GFP y SmbPp-RFP.
4.8.1. Purificación de SmbPc-GFP
4.8.1.1. Lisis celular de sedimento celular de expresión
Se lisaron las células del sedimento obtenido de la expresión de SmbPc-GFP. El
protocolo se realizó con perlas de lisis, usando como solución amortiguadora de lisis
Tris 50 mM, NaCl 500 mM a pH 8.0 y una cámara de lisado especial. El lisado obtenido
se centrifugo durante 15 minutos a 13000 rpm, se separó y conservó el sobrenadante a
-20 °C para posteriormente continuar con la purificación.
4.8.1.2. Purificación de SmbPc-GFP mediante cromatografía de afinidad con
iones metálicos (IMAC) con resina
Para la purificación del lisado celular obtenido de la expresión de SmbPc-GFP se
prepararon dos columnas diferentes usando una resina IMAC (Profinity IMAC de
BIORAD). Primero se preparó el empaque de la columna usando 3 mL de resina y
preparándola según instrucciones del manual. La resina de una columna se cargó con
iones de Cu(II) mientras que la otra se cargó con iones de Ni(II) de la manera que el
manual lo indicaba equilibrando al final con la solución amortiguadora de lisis, Tris 50
mM, NaCl 250 mM a pH 8.0.
65
4.8.1.3. Purificación de SmbPc-GFP con iones de cobre y níquel en resina IMAC
La columna con resina IMAC previamente cargada con los iones metálicos se
cargó con la muestra de lisado celular y se dejó incubar una hora a 4 °C con agitación
ocasional hasta asegurar la saturación de la columna por completo. Se probaron dos
condiciones, una suave y otra fuerte. En la condición suave se probaron
concentraciones bajas de NaCl e imidazol, empleando como solución amortiguadora de
lavado 50 mM Tris, 300 mM NaCl a pH 8 y como solución amortiguadora de elución 50
mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol a pH 8, ambas soluciones empleadas con
ambos iones metálicos. Las soluciones amortiguadoras empeladas en las condiciones
fuertes consistieron en una solución amortiguadora de lavado de 50 mM Tris, 500 mM
NaCl, 1 mM imidazol a pH 8 y una solución amortiguadora de elución de 50 mM Tris,
500 mM NaCl y 500 mM imidazol a pH 8, ambas soluciones empleadas en ambos iones
metálicos. Primero se recolectó la fase no unida, posteriormente se lavó con la solución
amortiguadora de lavado seleccionada según la condición. Finalmente se eluyó con la
solución amortiguadora correspondiente con una alta concentración de imidazol para
permitir la elución de la proteína. Las fracciones de fase no unida y de lavado se
prepararon al igual que las de elución para su posterior análisis. El proceso de
purificación se visualizó posteriormente por medio de SDS-PAGE en fase discontinua,
con un gel de resolución al 10% y uno de apilamiento al 4%, terminada la electroforesis
se tiñó con azul de Coomassie para revelar las bandas correspondientes a las proteínas.
66
4.8.1.4. Cromatografía IMAC empleando el sistema ÄKTA prime plus
Se empleó una columna HisTrap HP de 1 mL (GE Healthcare) la cual está
cargada previamente con iones de níquel. Se realizó una purificación con un método
manual. Se equilibró la columna con 5 volúmenes de la solución amortiguadora de
equilibrio (50 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8) así mismo se equilibró el sistema con la
misma solución amortiguadora la cual también se empleó como solución
amortiguadora de lisis. El equilibrio de la columna se realizó con un flujo de 0.5 mL/min
con un presión máxima de 0.5 MPa. Se cargó la muestra a la columna con un flujo de
0.5 mL/min a una presión máxima de 0.5 MPa (según especificaciones de la columna).
Se cargó la muestra hasta una saturación visual (hasta que la columna en su mayoría
presentará el color verde característico de GFP). Posteriormente se lavó la columna con
una solución amortiguadora de lavado con concentración de 50 mM Tris, 500 mM NaCl,
2.5 mM imidazol a pH 8, el lavado se llevó a cabo hasta que la señal de U.V. hubiese
descendido y se mantuviese constante. Para la elución se empleó un gradiente usando
como solución amortiguadora de elución con concentración de 50 mM Tris, 500 mM
NaCl, 100 mM imidazol con pH 8, el gradiente fue de 0% a 50% de la concentración de
la solución amortiguadora de elución. El flujo se mantuvo a 0.5 mL/min a una presión
de 0.5 MPa. Se colectaron fracciones de 0.5 mL y se conservaron para su posterior
análisis mediante SDS-PAGE.
4.8.1.5. Diálisis para remoción de NaCl
Se seleccionaron las diez primeras fracciones obtenidas de la cromatografía de
afinidad con el sistema ÄKTA prime plus, las cuales mostraron una considerable
67
cantidad de proteína, tanto en SDS-PAGE como visualmente. Dichas fracciones se
colectaron en un tubo de diálisis SnakeSkin Pleated (10K MWCO) y se dializó para
eliminar el exceso de NaCl, para eso se empleó una solución amortiguadora de 50 mM
Tris a pH 8.0. Se hicieron 3 diálisis de una hora cada una. La muestra dializada se
conservó para su posterior purificación mediante intercambio iónico.
4.8.1.6. Cromatografía de intercambio aniónico con el sistema ÄKTA prime plus
Se empleó la columna HiTrap Q HP de 1 mL (GE Healthcare). Se empleó como
solución amortiguadora de equilibrio el mismo usado en la diálisis (50 mM Tris a pH
8.0), se equilibró la columna (con un total de cinco volúmenes a 0.5 mL/min a 0.5 MPa)
y el sistema con dicha solución. La muestra se cargó con un flujo de 0.5 mL/min a una
presión máxima de 0.5 MPa según las indicaciones de la columna. Una vez saturada la
columna (saturación visual) se siguió con el lavado empleando la misma solución
amortiguadora de equilibrio hasta que la señal de U.V. descendió a aproximadamente
cero y se mantuviese constante. Posteriormente se eluyó con una solución
amortiguadora de 50 mM Tris, 250 mM NaCl a pH 8.0 con un gradiente de 0 a 100% de
la concentración de la solución amortiguadora de elución, dicho gradiente se corrió en
un volumen de 10 mL. Se colectaron y conservaron las fracciones para su posterior
análisis mediante SDS-PAGE.
68
4.8.2. Purificación de SmbPcE-GFPENT
La purificación de SmbPcE-GFPENT se realizó como en el punto 4.8.1.4.,
únicamente se varió la solución amortiguadora de lavado a uno con concentración de
50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol con un pH de 8.
4.8.3. Purificación de SmbPp-RFP
4.8.3.1. Choque osmótico para la obtención de la fracción periplásmica
El sedimento celular obtenido de la expresión de SmbPp-RFP se sometió a un
choque osmótico con el fin de obtener únicamente la fracción periplásmica. Dicho
procedimiento consistió en la resuspensión del sedimento en una solución
amortiguadora de 20 mM Tris, 30% sacarosa, 2.5 mM EDTA a pH 8.0
(aproximadamente 5 mL por gramo de sedimento obtenido) y posterior agitación a
temperatura ambiente durante una hora. Pasado el tiempo se centrifugó a 4 °C durante
una hora a 5000 rpm. Se separó y conservó el sobrenadante, el sedimento se
resuspendió nuevamente en 2 mL de una solución de MgSO4 5 mM y se agitó en hielo
durante una hora. Pasado el tiempo se centrifugó nuevamente durante una hora a
5000 rpm a 4 °C. Se conservó nuevamente el sobrenadante considerando este como la
fracción periplásmica junto con el primer sobrenadante obtenido.
69
4.8.3.2. Purificación de SmbpP-RFP por medio de cromatografía de afinidad de
iones metálicos (IMAC) con resina cargada con Cu (II)
La columna se empacó con la resina de BIORAD de IMAC con iones cobre como
se indicó en el punto 4.9.1.2. Para la purificación de SmbPp-RFP se cargó la columna
previamente preparada con la fracción de MgSO4 obtenida del choque osmótico, se
retiró la fase no unida y se cargó nuevamente, esta vez con la fracción de la solución al
30 % de sacarosa. Una vez saturada la columna se comenzó con el lavado, el cual se
realizó con una solución amortiguadora de lavado la cual consistía en 30 mM Tris, 250
mM NaCl, 1 mM imidiazol a pH 8.0. Se colectaron y guardaron las fracciones obtenidas
para su posterior análisis. Terminado el lavado se eluyó con una solución
amortiguadora de elución que consistía en 30 mM Tris, 250 mM NaCl, 250 mM imidazol
a pH 8.0. Se colectaron y guardaron las fracciones de elución para su posterior análisis.
El proceso de purificación se visualizó posteriormente por medio de SDS-PAGE en fase
discontinua, con un gel de separación al 10% y el de apilamiento al 4%, terminada la
electroforesis se realizó una tinción de coomassie para la revelación de bandas de
proteínas.
SmbPp-RFP se purificó por medio del equipo FPLC ÄKTA como en el punto
4.8.1.4., variando únicamente la concentración de imidazol en la solución
amortiguadora de lavado de 2.5 mM a 5 mM.
70
4.9. Remoción de la proteína de fusión
La remoción de SmbPcE de GFPENT se realizó mediante la enzima enteroquinasa
de cadena ligera (New England Biolabs, NEB). De las fracciones obtenidas de la
purificación de SmbPcE-GFPENT del punto 4.8.2.1., se tomaron tres alícuotas de 20 µL
cada una a las cuales se les agregó 0.5 µL, 1 µL y 2 µL de la enzima respectivamente. Las
alícuotas se dejaron incubando a temperatura ambiente por 16 horas. Terminado el
tiempo se prepararon con un control de SmbPcE-GFPENT sin enzima para su
visualización por SDS-PAGE empleando un gel de resolución al 12% y uno apilador al
4%. El gel se reveló mediante una tinción de Coomassie.
71
CAPÍTULO 5
5. RESULTADOS
5.1. Crecimiento de Nitrosomonas europaea
Se probaron tres diferentes medios en condiciones de cultivo similares, sin
embargo fue el medio 3 con las condiciones mostradas en la tabla 4 con la que se
obtuvo el crecimiento esperado de la cepa. El crecimiento se hizo evidente debido a la
presencia de turbidez en el medio (el control negativo permaneció sin cambio
conservando la apariencia cristalina e incolora del medio) y primordialmente por la baja
en el pH de 8.0 a 7 – 6 aproximadamente (el cual se llevaba nuevamente a pH 8 con
una solución de Na2CO3), ha sido reportado en literatura que debido a su metabolismo
nitrificante presenta metabolitos que descienden el pH del medio. Se mantuvo el
crecimiento hasta una semana donde se alcanzó una D.O.600 de 1.91. En la primera
imagen se muestra el crecimiento de N. europaea a los tres días, en la segunda se
muestra a la semana justo antes de la recolección del sedimento celular, en la última se
72
muestra una imagen del sedimento mostrando la coloración naranja característica de
la bacteria.
Figura 2. Cultivo de N. europaea a los Figura 3. Cultivo de N. europaea a Figura 4. Sedimento celular de N.
tres días. la semana. europaea.
5.2. Extracción de ADN genómico de N. europaea
La extracción del ADN genómico se realizó con dos sedimentos de N. europaea,
uno de 6 mL de medio y otro de 8 mL. A continuación en la figura 5 se muestra la
electroforesis realizada al ADN extraído, donde el primer carril muestra el marcador de
peso molecular (300 bp a 10 kbp), el segundo y tercer carril muestran la primera
elución de ADN genómico para 6 mL y 8 mL respectivamente, mientras que el cuarto y
quinto representan la segunda elución del ADN extraído para 6 mL y 8 mL
respectivamente. Se aprecian claramente las bandas correspondientes al ADN
genómico, las cuales se presentan arriba del marcador de 10 Kbp.
73
Figura 5. Extracción de ADN genómico de N. europaea.
5.3. Amplificación de SmbPc y SmbPp
A continuación se presenta la amplificación del gen de SmbPc y SmbPp a partir
del ADN genómico extraído de N. europaea. En el primer carril podemos observar el
marcador de peso molecular (300 bp a 10 kbp), en el segundo se observa la banda de
amplificación para SmbPp y en el tercero la de SmbPc, es posible apreciar la diferencia
entre los tamaños de ambos genes, puesto que el correspondiente a SmbPc carece del
péptido señal de direccionamiento a periplasma. El cuarto y quinto carril corresponden
a controles negativos, el cuarto sin polimerasa y el quinto sin ADN genómico.
Figura 6. Amplificación de SmbPp y Smbpc.
74
5.4. Construcción de pET28b-SmbpPp y pET28b-SmbPc
En la siguiente imagen (figura 7) se muestra el análisis de restricción realizado
con las enzimas NdeI y BamHI para el cribado de las colonias positivas en el inserto. En
el primer carril se aprecia el marcador de peso molecular, se pueden apreciar los
fragmentos de corte positivos para SmbPp para los carriles 2, 3, 7, 8 y 9, mientras para
SmbPc se aprecia el corte positivo en el carril número 5, los carriles 4 y 6 corresponden
al análisis de otras dos clonas para SmbPc, sin embargo como se observa no hay
presencia de ADN plasmídico, por tanto tampoco de inserto siendo negativas estos dos
últimas.
Figura 7. Análisis de restricción para la construcción pET28b-

SmbPp y pET28b-SmbPc.
5.5. Construcción de pET28b-SmbPp-GFP y pET28b-GST-GFP
Se muestra la siguiente imagen (figura 8) con el análisis de restricción realizado
sobre el ADN plasmídico obtenido de varias colonias seleccionadas después de la
transformación de la ligación. En el primer carril se muestra el marcador de peso
molecular (250 bp a 10 kbp). Se pueden apreciar claramente en el carril 6 y 7 el
75
fragmento para GST-GFP y en el carril 11 el fragmento correspondiente a SmbPp-GFP.
El análisis se realizó con las enzimas XhoI y NdeI.
Figura 8. Análisis de restricción de las construcciones pET28b-SmbPp-GFP y

pET28b-GST-GFP.
5.6. Construcción de pET30a-SmbPp-GFP y pET30a-SmbPc-GFP
Para el cribado de las clonas transformantes con el inserto positivo para SmbPp-
GFP y SmbPc-GFP se realizó un análisis de restricción el cual se presenta en la siguiente
imagen (figura 9). El corte se llevó a cabo con las enzimas de restricción XhoI y NdeI
para evaluar el tamaño del corte. En el primer carril se observa el marcador de peso
molecular (250 bp a 10 kbp), en los carriles número 2 y 3 es posible observar el corte
correspondiente a SmbPp-GFP y en el 4 y 5 el correspondiente a SmbPc-GFP variando
SmbPp-GFP con un tamaño más grande debido a la péptido señal.
Figura 9. Análisis de restricción con enzimas XhoI y NdeI de las construcciones

pET30a-SmbPp-GFP y pET30a-SmbPc-GFP.
76
5.7. Construcción de pET30a-SmbPc-RFP, pET30a-SmbPp-RFP y pET28b-GST-RFP
Para el análisis de colonias transformantes positivas para el inserto de RFP se
realizó un análisis de restricción. A continuación se presenta la imagen de la
electroforesis en gel de agarosa al 1% (figura 10) donde en el carril 1 se muestra el
marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp), en el carril número 2 se muestra el
análisis realizado a pET30a-SmbPp-RFP mientras que en el carril 3 al 8 se muestran los
análisis realizados a las colonias obtenidas de la transformación de pET30a-SmbPc-RFP.
En la figura 11 se muestra la visualización en gel de agarosa de la amplificación
realizada sobre varias construcciones con GST como proteína de fusión. En la imagen se
puede observar en el carril 1 el marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp), y en el
carril 5 y 6 las amplificaciones para el inserto de GST-RFP, donde la banda en el carril 6
correspondía al peso molecular del inserto GST-RFP.
Figura 10. Análisis de restricción realizado con las enzimas XhoI y NdeI para las
construcciones de pET30a-SmbPp-RFP y pET30a-SmbPc-RFP.
77
Figura 11. Amplificación con iniciador delantero de los genes de interés e iniciador T7
reverso para la confirmación de insertos en construcciones en pET28b usando GST como
proteína de fusión.
5.8. Construcciones de pET30a-SmbPc, pET30a-SmbPp y pET28b-GST con insertos
de interés
5.8.1. Amplificación de insertos
En las siguientes imágenes se muestran las amplificaciones realizadas para los
genes de interés, en este caso SHY2, PixE, LovR y NDPK2. En la figura 12 se puede
observar en el carril 1 el marcador de peso molecular de 10 Kbp, mientras que en el
carril 2 se observa la amplificación de SHY2, en el número 3 la amplificación de PixE y
en el 4 la correspondiente a LovR. En la figura 13 se observa también en el carril
número 1 el marcador de peso molecular y en el segundo carril la banda de
amplificación correspondiente a NDPK2, se observa una banda en aproximadamente
1500 bp correspondiente a una inespecificidad de amplificación.
78
Figura 12. Amplificaciones para SHY2, PixE y LovR.
Figura 13. Amplificación de NDPK2.
5.8.2. Tamizaje de ADN plasmídico positivo a los insertos de interés
A continuación se muestran las imágenes del tamizaje realizado a las clonas
obtenidas con el fin de corroborar que contuvieran el inserto de interés. En la figura 14
se muestra el análisis de restricción realizado sobre las construcciones de pET30a-
SmbPp-LovR y pET30a-SmbPc-LovR, dicho análisis se realizó con las enzimas de
restricción NdeI y XhoI. En el carril 1 se observa el marcador de peso molecular (250 bp
a 10 Kbp), en el carril 2 y 3 se muestra el análisis de restricción del inserto SmbPc-LovR
y del carril 4 al 7 se muestra el realizado sobre SmbPp-LovR.
79
Figura 14. .Análisis de restricción de pET30a-SmbPc-LovR y pET30a-SmbPp-LovR realizado con las enzimas NdeI y
XhoI.
En la figura 15 se puede observar la amplificación realizada sobre
construcciones de pET30a-SmbPc-SHY2, pET30a-SmbPc-NDPK2 y pET30a-SmbPc-PixE.
En dicha imagen se observa en el carril 1 el marcador de peso molecular (250 bp a 10
Kbp). En el carril 2 y 3 se observa la amplificación de SmbPc-SHY2, en el 4 y 5 para
SmbPc-NDPK2 y en el 6 y 7 para SmbPc-PixE. Las amplificaciones se realizaron con
iniciadores de T7.
Figura 15. Amplificación de SmbPc-SHY2, SmbPc-NDPK2 y SmbPc-PixE.
80
En la figura 16 se puede apreciar la amplificación del inserto SHY2 en la
construcción pET30a-SmbPp-SHY2. En donde el primer carril corresponde al marcador
de peso molecular (250 bp a 10 Kbp), y en el carril 2 y 3 se puede observar la
amplificación de dicho inserto realizado con los iniciadores propios del gen SHY2.
Figura 16. Amplificación del inserto SHY2 a partir de la construcción pET30a-SmbPp-SHY2 con los iniciadores propios
del gen.
En la siguiente imagen se puede apreciar la amplificación del inserto de NDPK2
a partir de la construcción de pET30a-SmbPp-NDPK2. En dicha imagen (figura 17) se
muestra en el carril número 1 el marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp) y en los
carriles 2 ,3 y 4 la amplificación de NDPK2 realizada con los iniciadores propios del gen.
81
Figura 17. Amplificación de NDPK2 a partir de la construcción de pET30a-SmbPp-NDPK2 realizada con los iniciadores
propios del gen.
A continuación se muestran las imágenes correspondientes al tamizaje de las
construcciones usando GST como proteína de fusión. En la figura 18 se puede apreciar
en el primer carril el marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp), mientras que en
los carriles 5 y 6 se observa la amplificación del inserto LovR realizada con los
iniciadores propios del gen a partir de clonas con la construcción de pET28b-GST-LovR y
en el carril 7 se observa la amplificación para el gen SHY2 también realizada con los
iniciadores propios del gen a partir de clonas con la construcción pET28b-GST-SHY2.
82
Figura 18. Amplificación de los genes de LovR y SHY2 con sus respectivos iniciadores a partir de las construcciones de
pET28b-GST-LovR y pET28b-GST-SHY2
En la figura 11 se pueden observar las amplificaciones realizadas para los genes
de PixE y NDPK2 llevadas a cabo con su iniciador delantero propio y empleando el
iniciador reverso de T7. En el carril número 1 se observa el marcador de peso molecular
(250 bp a 10 Kbp), mientras que en el carril número 2 se encuentra la amplificación
para GST-PixE realizada a partir de la construcción pET28b-GST-PixE, y en el carril 3 y 4
se puede apreciar la amplificación para GST-NDPK2 realizada a partir de la construcción
de pET28b-GST-NDPK2.
5.9. Construcción de pET30a-SmbPcE-GFPENT
Se realizó una construcción con el sitio de corte para enteroquinasa (Asp-Asp-
Asp-Asp-Lys) para remover la proteína de fusión, en este caso SmbPc.
83
5.9.1. Amplificación de SmbPcE y GFPENT
En la siguiente imagen (figura 19) se aprecian las amplificaciones para la
obtención de los genes de SmbPc, SmbPp y GFP con diferentes sitios de corte para
enzimas de restricción (dichos insertos serán llamados SmbPcE, SmbPpE y GFPENT para
hacer distinción por su sitio de corte), en este caso NdeI y KpnI para SmbP y para GFP
NcoI y XhoI, dejando libre el sitio de corte para enteroquinasa dentro del vector. En el
primer carril se observa el marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp). En el carril
número 2 se aprecia la amplificación de SmbPcE, mientras que en el 3 se observa la
amplificación para SmbPpE en tanto para GFPENT se puede apreciar la amplificación en
el carril número 4.
Figura 19. Amplificación de SmbPcE (2), SmbPpE (3) y GFPENT (4) con los iniciadores propios de los genes.
5.9.2. Construcción de pET30a-SmbPcE
En la siguiente imagen (figura 20) se puede observar la amplificación realizada
para el inserto de SmbPcE empleando su propio iniciador delantero y el iniciador
reverso de T7. Dichas amplificaciones se realizaron a partir del ADN plasmídico extraído
84
de las clonas transformadas con la construcción de pET30a-SmbPcE con el fin de
corroborar la presencia del inserto de SmbPcE. Se puede observar en el primer carril el
marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp), mientras que en el carril 7 a 10 se
puede observar la banda correspondiente a la amplificación de SmbPcE.
Figura 20. Amplificación de SmbPcE (carriles 7 a 10) con su iniciador delantero y un iniciador reverso de T7 a partir
del ADN plasmídico de las construcciones de pET30a-SmbPcE.
5.9.3. Construcción de pET30a-SmbPcE-GFPENT
En la figura 20 se aprecia el análisis de restricción para corroborar la presencia
del inserto GFPENT. Dicho análisis se realizó con las enzimas NcoI y XhoI. En el carril
número 1 se encuentra el marcador de peso molecular (250 bp a 10 Kbp), del carril 5 al
7 se observa la banda correspondiente al inserto de GFPENT obtenido vía la digestión de
las enzimas de restricción antes mencionadas.
85
Figura 21. Análisis de restricción de la construcción pET30a-SmbPcE-GFPENT realizado con las enzimas NcoI y XhoI.
5.10. Construcciones obtenidas
Con la metodología clásica de clonación (digestión, ligación y transformación)
fue posible obtener varias construcciones, las cuales se resumen en la siguiente tabla:
TABLA 8.
Construcciones obtenidas con diferentes plásmidos
SmbPc SmbPp GST MBP

GFP X X X X*
GFPENT X
RFP X X X X*
SHY2 X X X
LovR X X X
NDPK2 X X
PixE X
* Ya se contaba previamente con las construcciones de MBP en el plásmido pIVEX2.3d
5.11. Expresión de proteínas
5.11.1. Expresión piloto de SmbPp y SmbPp-GFP
Durante las expresiones piloto de la fracción periplásmica no se obtuvo el color
característico de GFP. La evaluación de la expresión se realizó mediante SDS-PAGE. A
86
continuación se muestra una imagen (figura 22) de la expresión piloto de SmbPp y
SmbPp-GFP, donde se muestra el marcador en el primer carril, en el numero 2 un lisado
control de BL21(DE3), en el carril numero 3 la expresión de SmbPp y en el 4 y 5 se
pueden apreciar las bandas de expresión para SmbPp-GFP.
Figura 22. Expresión piloto de SmbPp y SmbPp-GFP.
5.11.2. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-GFP, SmbPp-GFP,
GST-GFP y MBP-GFP
Las expresiones piloto de SmbPc-GFP y SmbPp-GFP se realizaron a partir de las
construcciones realizadas con pET30a. En la siguiente imagen (figura 23) se puede
observar la comparación de expresión entre las proteínas de fusión comerciales MBP y
GST contra SmbPc y SmbPp, las cuatro unidas a GFP. En el primer carril se puede
observar el marcador de peso molecular, en el segundo se observa el control negativo
correspondiente a un lisado de E. coli BL21(DE3) sin plásmido. Se muestran tanto la
fracción soluble como en la insoluble de cada expresión, en el carril 3 y 4 se observa la
expresión de SmbPc-GFP en su fracción soluble (FS) e insoluble (FI) respectivamente. A
continuación se presenta la expresión de SmbPp-GFP mostrando la fracción soluble en
87
el carril 5 y la insoluble en el carril 6. En el carril 7 y 8 se pueden apreciar las bandas de
expresión para GST-GFP, siendo la 7 su fracción soluble y la 8 la insoluble. En los
últimos dos carriles se pueden observar las bandas de expresión de MBP-GFP, siendo el
carril 9 la fracción soluble y el carril 10 la insoluble.
Figura 23. Comparación de expresión de GFP con las proteínas de fusión SmbPc, SmbPp, GST y MBP.
5.11.3. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-RFP, SmbPp-RFP,
GST-RFP y MBP-RFP
En la figura 24 se aprecia la expresión de RFP con diferentes proteínas de fusión,
entre ellas las comerciales, GST y MBP así como las propias de la presente
investigación, SmbPc y SmbPp. En el carril número 1 se aprecia el marcador de peso
molecular, en el carril número 10 se observa el control negativo de BL21(DE3). En los
carriles 2 y 3 se pueden observar las bandas de expresión para SmbPc-RFP, siendo en el
carril 2 la fracción soluble (FS) y en el 3 la insoluble (FI). En el carril 4 se puede apreciar
la banda de expresión para SmbPp-RFP fracción soluble y en la 5 su fracción insoluble.
88
En los carriles 6 y 7 se observa la expresión de GST-RFP, siendo la fracción soluble el
carril 6 y la insoluble el 7. En cuanto a MBP-RFP es posible apreciar sus bandas de
expresión en el carril 8 mostrando su fracción soluble y en el 9 su fracción insoluble.
Figura 24. Comparación de expresión de RFP con las proteínas de fusión SmbPc, SmbPp, GST y MBP.
5.11.4. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-SHY2, SmbPp-SHY2
y GST-SHY2
En la figura 25 se puede apreciar la expresión piloto de SHY2 fusionada a
SmbPc, SmbPp y GST mostrando únicamente la fracción soluble correspondiente a cada
expresión. Se puede observar en el primer carril el marcador de peso molecular y en
carril 2 el control negativo correspondiente a un lisado de E. coli BL21(DE3) sin
plásmido. Del carril 3 al 5 se observan las bandas de expresión para SHY2 unida a
SmbPc, mientras que en los carriles 9 al 11 es posible apreciar las bandas de expresión
correspondientes a SHY2 unida a GST. Los carriles 6 al 8 corresponden a la expresión de
SHY2 con SmbPp, sin embargo no se observó banda de expresión para dicha proteína.
89
Figura 25. Expresión piloto de SmbPc-SHY2, SmbPp-SHY2 y GST-SHY2, esto correspondiendo a sus fracciones
solubles.
En la siguiente imagen (figura 26) se aprecia la expresión de SHY2 con SmbPc,
GST y SmbPp, en este caso mostrando las fracciones insolubles de cada una. En el
primer carril se puede observar el marcador de peso molecular y en el número 2 el
control negativo correspondiente a E. coli BL21(DE3). En los carriles del 3 al 5 se puede
observar la expresión de SHY2 con GST mientras que en los carriles del 6 al 8 se
observar la expresión de SHY2 con SmbPc. Los siguientes carriles del 9 al 11 muestran
la expresión de SHY2 con SmbPp aunque no se observó la banda de expresión
correspondiente a dicha proteína.
90
Figura 26. Expresión piloto de SmbPc-SHY2, SmbPp-SHY2 y GST-SHY2 correspondientes a la fracción insoluble.
5.11.5. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-LovR, SmbPp-LovR y
GST-LovR
En la figura 26 se puede observar la expresión piloto realizada para LovR unida a
SmbPc, SmbPp y GST mostrando sus fracciones solubles para cada caso. En el primer
carril se puede observar el marcador de peso molecular y en el número 2 el control
negativo de E. coli BL21(DE3) sin plásmido. En los carriles 3 y 4 se pueden apreciar las
bandas de expresión para GST-LovR, en los carriles 5 y 6 se observan las bandas de
expresión que corresponden a SmbPc-LovR y por último en los carriles 7 y 8 se aprecian
las bandas pertenecientes a SmbPp-LovR.
91
Figura 27. Expresión piloto de GST-LovR, SmbPc-LovR y SmbPp-LovR en sus fracciones solubles.
Además se presenta en la figura 28 las expresiones piloto para LovR unida a
SmbPc, SmbPp y GST, en este caso mostrando la fracción insoluble para cada una. En el
primer carril se puede apreciar el marcador de peso molecular y en el segundo el
control negativo de E. coli BL21(DE3) sin plásmido. En los carriles 3 y 4 se aprecia la
expresión de GST-LovR, así mismo SmbPc-LovR se puede observar en los carriles 5 y 6
mientras que SmbPp-LovR se muestra en los carriles 7 y 8.
Figura 28. Expresión piloto de GST-LovR, SmbPc-LovR y SmbPp-LovR en sus fracciones insolubles.
92
5.11.6. Expresión piloto y comparación de expresión de SmbPc-NDPK2 y GST-NDPK2
La expresión piloto de NDPK2 unida a SmbPc y GST se puede observar en la
figura 29, donde se muestra en el carril número 1 el marcador de peso molecular
mientras que en el número 2 se puede observar el control negativo, correspondiente a
un lisado de E. coli BL21(DE3) sin plásmido. De igual manera en los carriles 3 y 4 se
aprecian las fracciones solubles (FS) correspondientes a la expresión de SmbPc-NDPK2,
los carriles 5 y 6 corresponden a las fracciones insolubles (FI) de esa misma expresión.
En los carriles 7 y 8 se muestran las fracciones solubles correspondientes a la expresión
de GST-NDPK2, en tanto los carriles 9 y 10 corresponden a las fracciones insolubles
para dicha expresión.
Figura 29. Expresión piloto de SmbPc-NDPK2 y GST-NDPK2 en sus fracciones solubles e insolubles.
93
5.12.1. Purificación de SmbPc-GFP por cromatografía de afinidad con iones
metálicos IMAC con resina cargada con Cu(II) y Ni(II)
A continuación se presenta el perfil de cromatografía de afinidad obtenido de la
purificación de SmbPc-GFP (figura 30) en condiciones suaves con una resina de afinidad
(IMAC) cargada con iones de Cu(II). En el carril 1 se muestra el marcador de peso
molecular, en el número 2 se observa el lisado del sedimento de expresión previó a la
purificación (LC). En el carril número 3 se contempla la fase no unida (FNU), del carril 4
al 6 se muestran las fracciones de lavado y del carril 7 al 10 se muestran las fracciones
de elución mostrando la mayor elución de SmbPc-GFP en el carril número 8 donde se
puede apreciar claramente la correspondiente banda.
Figura 30. Cromatografía de afinidad Cu(II) en condiciones suaves (baja concentración de NaCl, sin imidazol en los
lavados y baja concentración del mismo para la elución) para la purificación de SmbPc-GFP.
94
En la siguiente imagen (figura 31) se aprecia la cromatografía de SmbPc-GFP
mediante purificación con iones de Ni(II) también bajo condiciones suaves. En dicha
imagen se puede apreciar en el primer carril el marcador de peso molecular, en el
segundo el lisado del sedimento celular de expresión previo a la purificación, en el
carril 3 se observa la fase no unida y del carril 4 al 6 se observan las fracciones de
lavado mientras que del carril 7 al 10 se muestran las fracciones de elución,
mostrándose la banda correspondiente a SmbPc-GFP con mayor intensidad en el carril
7 y en menor cantidad en el carril 8.
Figura 31. Cromatografía de afinidad con Ni(II) en condiciones suaves (baja concentración de NaCl, sin imidazol en
los lavados y baja concentración del mismo para la elución) para la purificación de SmbPc-GFP.
Se muestran también las purificaciones realizadas con condiciones fuertes, es
decir, altas concentraciones de NaCl e imidazol para lavado y elución. En primer lugar
se muestra la cromatografía de afinidad con iones de Cu(II) en condiciones fuertes
(figura 32), donde en el primer carril se muestra el marcador de peso molecular, en el
segundo carril el lisado del sedimento celular de expresión antes de la purificación
como control (LC) y en el carril número 3 la fase no unida (FNU). Del carril 4 al 8 se
95
muestran las fracciones de lavado y del carril 9 al 13 se aprecian las fracciones de
elución, en donde la banda de SmbPc-GFP es apreciada con claridad en el carril número
10.
Figura 32. Cromatografía de afinidad Cu(II) en condiciones fuertes (alta concentración de NaCl e imidazol para lavado
y elución) para la purificación de SmbPc-GFP.
En la siguiente imagen (figura 33) se aprecia la cromatografía de la purificación
realizada con la resina cargada con iones de Ni(II) bajo condiciones fuertes. En el carril 1
se muestra el marcador de peso molecular, mientras que en el número 2 se aprecia el
lisado del sedimento celular de expresión antes de la purificación como control (LC). En
el carril número 3 se observa la fracción no unida (FNU) mientras que del carril 4 al 9 se
muestran las fracciones obtenidas del lavado y por último del carril 10 al 13 se aprecian
las fracciones de elución, donde en el carril número 10 se puede observar claramente la
banda correspondiente a SmbPc-GFP (marcada dentro del recuadro).
96
Figura 33. Cromatografía de afinidad Ni(II) en condiciones fuertes (alta concentración de NaCl y de imidazol para el
lavado y elución) para la purificación de SmbPc-GFP.
Así mismo, las fracciones se analizaron visualmente mediante luz UV con el fin
de observar la fluorescencia de SmbPc-GFP y percatar su presencia en cualquiera de las
etapas de purificación. A continuación se presenta una de las imágenes obtenidas de
dicho análisis (figura 34) donde es posible apreciar claramente la fluorescencia de
SmbPc-GFP, en especial en las fracciones de elución.
Figura 34. Visualización en luz UV de la fluorescencia de las fracciones obtenidas de la cromatografía con iones de
Cu(II) y Ni(II).
97
5.12.2. Purificación de SmbPc-GFP mediante el sistema de FPLC ÄKTA prime plus
5.12.2.1. Cromatografía IMAC con columna de HisTrap HP
A continuación se muestra la cromatografía obtenida de la purificación de
SmbPc-GFP mediante una columna de HisTrap HP cargada con iones Ni(II) usando el
equipo ÄKTA prime plus. Las fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE y
se presenta en la figura 35 (se juntaron dos geles de 10 pocillos para una mejor
apreciación de la cromatografía). En donde, el primer carril corresponde al marcador de
peso molecular, el segundo a un lisado control antes de la purificación mientras que los
carriles del 3 al 20 muestran las fracciones de elución obtenidas, en las cuales se puede
apreciar claramente la banda correspondiente a SmbPc-GFP (marcadas dentro del
recuadro).
Figura 35. Cromatografía de afinidad con columna HisTrap HP cargada con iones de Ni(II).
En la siguiente gráfica (figura 36) podemos observar el cromatograma de
elución obtenido con el equipo de FPLC ÄKTA prime plus. Se puede apreciar claramente
el pico de elución para SmbPc-GFP. Cabe mencionar que las fracciones se obtuvieron
en volúmenes de 0.5 mL.
98
Cromatograma de Afinidad con Ni(II) para la purificación de
SmbPc-GFP mediante ÄKTA prime plus
2000
1800
1600
mAu 280 nm
1400
1200
1000
800 SmbPc-GFP
600
400
200
0
3.928
5.05
0.561
1.122
1.683
2.244
2.805
3.367
4.489
5.611
6.172
6.733
7.294
7.855
8.416
8.977
9.538
10.1
0
Volumen de elución (mL)
Figura 36. Cromatograma de Afinidad con Ni(II) para SmbPc-GFP
5.12.2.2. Cromatografía de intercambio aniónico con columna HiTrap Q HP
Se recolectaron y dializaron las fracciones de elución obtenidas de la
purificación con la columna HisTrap HP para remover el exceso de NaCl. Después de la
diálisis se realizó una segunda purificación con una cromatografía de intercambio
aniónico. En la siguiente imagen (figura 37) se muestra el SDS-PAGE de las fracciones de
elución obtenidas en la purificación con el ÄKTA prime plus. En el primer carril se
aprecia el marcador de peso molecular, en el segundo se observa la muestra antes de
la purificación por intercambio aniónico mientras que del carril 3 al 10 se muestran las
fracciones de elución (las posteriores fracciones de elución con el gradiente no se
muestran debido a que no se observó ninguna banda en el gel de poliacrilamida). Se
aprecian claramente en el gel las bandas correspondientes a SmbPc-GFP (marcadas
dentro del recuadro).
99
Figura 37. Cromatografía de intercambio aniónico con la columna HiTrap Q HP, se muestran dentro del recuadro las
bandas correspondientes a SmbPc-GFP.
En la próxima gráfica (figura 38) se muestra el cromatograma de elución
obtenido de dicha purificación mediante intercambio aniónico con el equipo de FPLC
ÄKTA prime plus.
Cromatograma de intercambio aniónico para purificación de

SmbPc-GFP mediante ÄKTA prime plus
2500 60
2000 50
40
mAu 280 nm
SmbPc-GFP
1500
30
1000 % Gradiente de
20 elución
500 10
0 0
4.36
0.335
0.671
1.006
1.342
1.677
2.012
2.348
2.683
3.019
3.354
3.689
4.025
4.696
5.031
5.367
0
Volumen de elución
Figura 38. Cromatograma de intercambio aniónico para SmbPc-GFP
100
5.12.3. Purificación de SmbPcE-GFPENT mediante el sistema de FPLC ÄKTA prime
plus
Las fracciones obtenidas de la purificación de SmbPcE-GFPENT se visualizaron por
SDS-PAGE, el perfil del cromatograma se muestra en la figura 39, en donde el primer
carril muestra el marcador de peso molecular, el segundo la fase no unida en la
columna de HisTrap HP de iones Ni(II) y del carril 3 al 13 se muestran las fracciones de
elución que se obtuvieron, la banda correspondiente a SmbPcE-GFP se señala mediante
el recuadro.
Figura 39. Cromatografía de afinidad con columna HisTrap HP cargada con iones de Ni(II) para SmbPcE-GFPENT
En la figura 40 se muestra el cromatograma de elución de SmbPcE-GFPENT donde
obtenido de la purificación con el FPLC ÄKTA prime plus mediante IMAC de iones Ni(II)
donde también se muestra la fase no unida. Se puede apreciar claramente el pico
correspondiente a SmbPcE-GFPENT.
101
Cromatograma de Afinidad con Ni(II) para la purificación de SmbPcE-
GFPENT mediante ÄKTA prime plus
3000 60
2500 50
%Buffer de elución
UV 280 nm
mAu 280 nm
2000 40
1500 30
%Gradiente
1000 20 de elución
500 10
0 0
0.00
8.79
17.57
26.36
35.14
43.93
52.71
61.50
70.28
78.75
79.58
80.41
81.24
82.08
82.91
83.74
84.57
85.41
86.24
Figura 40. Cromatograma de afinidad con Ni(II) para SmbPcE-GFPENT
5.12.4. Purificación de SmbPp-RFP mediante cromatografía de afinidad con iones
metálicos (IMAC) con resina
Debido al buen rendimiento obtenido con la cromatografía de afinidad con
iones de Cu(II) (usando la resina IMAC) se empleó dicha técnica para la purificación de
SmbPp-RFP después del choque osmótico. En la siguiente imagen se muestra el gel de
SDS-PAGE obtenido mediante dicha cromatografía. En donde el primer carril y el
número 11 corresponden a marcadores de peso molecular. En el carril número 2 se
presenta la muestra original obtenida del choque osmótico con sacarosa antes de su
purificación (F.S.). Del carril 3 al 6 se muestran las fracciones obtenidas de la fase no
unida. En los carriles del 7 al 10 y el 12 se muestran las fracciones de lavado y por
último del carril 13 al 19 se pueden observar las fracciones de elución obtenidas donde
se logra apreciar claramente la banda de SmbPp-RFP marcadas dentro del recuadro.
102
Figura 41. Cromatografía de afinidad con resina de IMAC cargada con Cu(II) de SmbPp-RFP.
5.12.5. Purificación de SmbPp-RFP mediante el sistema de FPLC ÄKTA prime plus
SmbPp-RFP se purificó también mediante el FPLC ÄKTA prime plus, empleando
la columna comercial de HisTrap HP para IMAC. En la imagen 42 se muestra el análisis
de las fracciones obtenidas de la purificación mediante SDS-PAGE, en el primer carril se
muestra el marcador de peso molecular, en el segundo la fase no unida y por ultimo las
fracciones de elución del carril 3 al 10, donde se pueden apreciar las bandas
correspondientes a SmbPp-RFP marcadas dentro del recuadro.
Figura 42. Cromatografía de afinidad con columna HisTrap HP cargada con iones de Ni(II) para SmbPp-RFP
103
Mientras tanto, en la figura 43 se puede observar el cromatograma obtenido de
la purificación de SmbPp-RFP con gradiente de elución.
Cromatograma de Afinidad con Ni(II) para la purificación de SmbPp-RFP

mediante ÄKTA prime plus
300 90
80
250
70
% Buffer de elución
SmbPp-RFP
200 60
mAu 280 nm
50
150
40
100 30 % Gradiente
de elución
20
50
10
0 0
0.00 0.56 1.11 1.67 2.22 2.78 3.33 3.89 4.44 5.00 5.55 6.11 6.67 7.22 7.78
Figura 43. Cromatograma de afinidad con Ni(II) para SmbPp-RFP
5.13. Remoción de la proteína de fusión
En la siguiente figura se puede observar el SDS-PAGE realizado del corte de la
enzima enteroquinasa de cadena ligera sobre tres alícuotas de SmbPcE-GFPENT, donde
se varió la cantidad de enzima conservando la cantidad de muestra de proteína a
cortar. En el primer carril se muestra el marcador de peso molecular, en el segundo la
muestra el corte con 0.5 µL de enzima, en el tercero con 1 µL y en el cuarto con 2 µL.
Finalmente el carril número 5 muestra el control, una muestra de SmbPcE-GFPENT sin
enteroquinasa. Las bandas correspondientes a GFPENT se señalan dentro del recuadro.
104
Figura 44. Corte de enteroquinasa para remover SmbPcE de GFPENT.
105
CAPÍTULO 6
6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En el presente proyecto se realizaron varias construcciones con diferentes
genes de interés con el objetivo de comparar sus expresiones con diferentes proteínas
de fusión, incluyendo SmbPc y SmbPp. Los diversos genes empleados variaban entre
ellos en tamaño y naturaleza, esto con el fin de evaluar la versatilidad de SmbPc y
SmbPp y comparar con otras proteínas de fusión. El estudio más importante se realizó
sobre la expresión de GFP y RFP las cuales funcionaron como nuestras proteínas
reporteras de expresión y plegamiento ya que dichas proteínas presentan fluorescencia
y una evidente coloración verde y roja respectivamente cuando han obtenido un
adecuado plegamiento.
La primera manera de evaluación de la expresión de GFP y RFP se realizó de una
manera visual. En las primeras expresiones de SmbPp-GFP no se presentó coloración
verde alguna, sin embargo al lisar las células y correr un gel de SDS-PAGE (figura 22) se
apreciaron claramente las bandas de expresión de SmbPp-GFP, demostrando que la
proteína si se expresaba aunque no se plegaba de la manera debida y por ende no era
106
funcional. Esta observación corresponde a la realizada en el 2000 por Feilmeier y col.
donde probaron diversas fusiones con GFP para estudiar la funcionalidad de la misma
como reportera de localización de proteínas.34 Recientes investigaciones han
comprobado también dicha cualidad de GFP y han trabajado con otras opciones que
permitan la visualización en el periplasma, en algunas de estas han usado RFP y sus
variantes, mostrando que esta proteína reportera (y sus variantes) no presenta
ausencia de actividad cuando es exportada al periplasma.35, 36 Debido a estos resultados
y la literatura consultada se optó por usar RFP como reportera de expresión y
plegamiento para la fracción periplásmica.
Se realizó una secuenciación de la construcción del plásmido pET28b-SmbPp-
GFP en la cual se apreció una cantidad extra de pares de bases que darían como
resultado varios aminoácidos en el extremo N-terminal, se cree que dichos
aminoácidos podrían haber estado afectando al plegamiento adecuado de SmbPp-GFP.
Por esta razón se optó por cambiar el vector pET28b por el pET30a ya que poseía los
mismos sitios de corte para las enzimas seleccionadas y permitía eliminar en los
procesos de digestión los pares de bases extras.
Al realizar las expresiones piloto de SmbPc-GFP y SmbPp-GFP (a partir de las
construcciones en pET30a) se observó el color verde característico de GFP en el
sedimento celular correspondiente a SmbPc-GFP, en tanto en el sedimento celular
correspondiente a SmbPp-GFP no se presentó dicha coloración. Al visualizar la
expresión piloto mediante electroforesis en geles de poliacrilamida se observó la
presencia de bandas de expresión tanto para SmbPc-GFP y SmbPp-GFP (figura 23)

107
confirmando nuevamente el inadecuado plegamiento y por ende falta de actividad de
GFP en el espacio periplásmico.34, 35, 36
En la misma figura 23 se pueden apreciar las fracciones insolubles y solubles de
las expresiones de SmbPc-GFP (36.8 kDa), SmbPp-GFP (36.8 kDa), GST-GFP (53.8 kDa) y
MBP-GFP (68.2 kDa), cada banda correspondiente a su esperado peso molecular. La
expresión de SmbPc-GFP es equiparable a la de GST-GFP y MBP-GFP al comparar el
ancho de banda de dichas expresiones en el SDS-PAGE. SmbPc-GFP presenta menos
cuerpos de inclusión (fracción insoluble) que GST-GFP y en un nivel equiparable con
MBP-GFP como se puede apreciar en dicha figura al juzgar por la pequeña banda
mostrada en el carril 4. SmbPp-GFP presenta una menor cantidad de cuerpos insolubles
a comparación de SmbPc-GFP, GST-GFP y MBP-GFP como se observó en la figura 23 en
el carril 6 donde prácticamente no se observa ninguna banda.
En la figura 24 se muestra la expresión piloto de SmbPc-RFP (37.02 kDa), SmbPp-RFP
(37.02 kDa), GST-RFP (54.3 kDa) y MBP-RFP (68.5 kDa), cada banda de expresión
aparece en peso molecular esperado. Se pueden observar claramente las bandas de
expresión para dichas proteínas quiméricas. En el caso de SmbPc-RFP se observa un
alto rendimiento de expresión, equiparable al de GST-RFP y MBP-RFP, en tanto que la
presencia de cuerpos insolubles de SmbPc-RFP es muy baja y comparable a las
proteínas de fusión comerciales. Por su parte, SmbPp-RFP presenta también un alto
rendimiento y no se observa formación de cuerpos insolubles en comparación con
MBP-RFP el cual si presenta formación de dichos cuerpos. Visualmente es posible
confirmar la presencia de RFP en las cuatro construcciones. A diferencia de SmbPp-GFP,

108
SmbPp-RFP se puede observar a simple vista en el sedimento celular de la expresión
piloto, confirmando el adecuado plegamiento y funcionalidad de SmbPp-RFP, ya que de
otra manera no presentaría la coloración característica de RFP como fue en el caso de
SmbPp-GFP. La observación del color característico de GFP y RFP coincide con la
observada en diversos estudios donde la visualización de GFP y RFP juegan un papel
importante.34, 35, 37
Figura 45. De derecha a izquierda, expresión de SmbPc-RFP, SmbPc-LovR y SmbPp-RFP.
Figura 46. De izquierda a derecha, control negative de BL21(DE3), GST-RFP, MBP-RFP y SmbPc-RFP.
MBP y GST son ampliamente usadas como proteínas de fusión debido a diversas
características que poseen, entre estas dos, se sabe que MBP es la que produce menos
cuerpos de inclusión y por tanto la mayor parte de la producción se encuentra en
109
forma soluble. GST, por su parte, tiene excelentes rendimientos y permite obtener la
proteína de interés de manera práctica y con una alta pureza, sin embargo dichas
ventajas se ven opacadas por la alta generación de cuerpos de inclusión ya que GST
aumenta también la solubilidad de las proteínas aunque en un menor grado. Es decir,
una proteína que por lo regular se expresaría de manera insoluble, al unirla a GST
aumenta su solubilidad en la expresión, sin embargo al unirla a MBP esta solubilidad se
ve mejorada aún más.23, 38, 39
Los resultados obtenidos constatan dichas afirmaciones sobre MBP y GST, ya
que la expresión de GFP y RFP con MBP generó menos cuerpos de inclusión que con
GST, la alta generación de cuerpos insolubles de GST se repite también en el caso de
LovR y en menor medida en SHY2. Considerando los resultados es evidente que SmbP
posee un comportamiento muy similar al de MBP al generar una baja cantidad de
cuerpos de inclusión, a veces prácticamente nula (SmbPp-RFP, figura 24). MBP puede
presentar varias desventajas por su alto tamaño molecular (aproximadamente 42 kDa),
por ejemplo, al remover MBP el rendimiento de la proteína de interés disminuye
considerablemente también se puede generar la posibilidad al remover MBP que la
proteína de interés sea propensa a la agregación, sin mencionar que debido a su
tamaño presenta una pesada carga metabólica para la célula hospedera.40, 41 Debido al
pequeño peso molecular de SmbP se espera que éstas desventajas no se presenten,
mostrando una enorme ventaja sobre MBP. En los resultados obtenidos se lograron
altos rendimientos con SmbP equiparables y en algunos casos mayores a los de GST, la
ventaja de SmbP sobre esta proteína de fusión es clara debido a que SmbP posee la
110
habilidad de mejorar la solubilidad de la proteína de interés (siendo la alta presencia de
cuerpos insolubles la principal desventaja de GST), además aunque GST al pesar 26 kDa
no es una proteína tan grande como MBP sigue teniendo un peso molecular mayor al
de SmbP, por lo que al remover GST el rendimiento será menor en comparación con
SmbP aunque los rendimientos con ambas proteínas de fusión sean idénticos.
Se realizaron también expresiones piloto de SmbPp-SHY2, SmbPc-SHY2 y GST-
SHY2. En la figura 25 se puede observar la expresión de SHY2 con las mencionadas
proteínas de fusión. Se observa la presencia de expresión en las construcciones de
SmbPc-SHY2 y GST-SHY2, donde en la primera se puede observar un alto rendimiento
de expresión, así mismo se pueden observar las bandas de expresión para GST-SHY2
con rendimientos equiparables a los de SmbPc-SHY2. En la siguiente figura 26 se
pueden observar las fracciones insolubles para ambas expresiones, donde podemos ver
que la formación de cuerpos insolubles es baja con ambas proteínas de fusión y
prácticamente equiparables.
SHY2 ha sido una proteína altamente estudiada por su participación en la
regulación de respuestas y señalización en plantas, debido a ello ha sido producida
previamente de manera recombinante y usando proteínas de fusión como MBP y GST.
Si bien pudieron obtener la proteína con un rendimiento aceptable, en nuestros
estudios, la expresión de SHY2 con SmbPc presenta un mayor rendimiento que con
GST, si consideramos lo anteriormente mencionado, una vez removido MBP y GST el
rendimiento disminuirá debido al tamaño de ambas proteínas de fusión, por tanto el
rendimiento total será mayor cuando se emplea SmbPc como proteína de fusión. 42
111
Se realizó las expresiones piloto de SmbPc-LovR, SmbPp-LovR y GST-LovR y se
pueden observar en la figura 27 donde se observan amplias bandas de expresión para
las tres proteínas. Así mismo en la siguiente imagen (figura 28) se aprecian las
fracciones insolubles de las mismas expresiones. En dicha imagen se observa
claramente una cantidad de cuerpos insolubles menor en las fracciones de SmbPc-LovR
y SmbPp-LovR en comparación con las de GST-LovR que muestra una mayor presencia
de cuerpos de inclusión.
NDPK2 interactúa con otra proteína conocida como fitocromo, jugando un
papel importante en la regulación del mismo. Por esta razón se considera una proteína
de interés científico.43 Se realizó la expresión piloto de SmbPc-NDPK2 y GST-NDPK2
como se observa en la figura 29. Dicha figura muestra congruencia con las pasadas
expresiones, en donde se puede observar que SmbPc-NDPK2 posee un rendimiento de
expresión considerable y la formación de cuerpos de inclusión (mostrado en la fracción
insoluble) es nula. Por su parte, la expresión de GST-NDPK2 tiene un rendimiento
similar al de SmbPc-NDPK2 aunque a diferencia de esta ultima la expresión si mostró la
presencia de cuerpos de inclusión como se observa en las fracciones insolubles.
En cuanto a la purificación de la proteína quimérica SmbPc-GFP, se procedió
primero con una cromatografía de afinidad de metales iónicos inmovilizados (IMAC) y
de esta manera evaluar el comportamiento de la proteína quimérica con dos metales,
en este caso Cu(II) y Ni(II). Como se mencionó previamente, SmbP es capaz de unir
varios cationes metálicos divalentes, entre ellos Cu(II) y Ni(II) presentando una mayor
afinidad a Cu(II).19 Durante las primeras purificaciones con dicha cromatografía se

112
probaron diferentes condiciones, tanto de unión, lavado y elución. De esta manera se
comprobó que SmbP se une con mayor afinidad a Cu(II), como se puede apreciar en las
figuras 30, 31, 32 y 33 el rendimiento de SmbPc-GFP con Cu(II) es mayor a comparación
con Ni(II) sin embargo la pureza con la cromatografía con Cu(II) fue menor, siendo
mayor con la de Ni(II) aunque el rendimiento se vio disminuido (figuras 31 y 33). El bajo
rendimiento en Ni(II) se puede atribuir a la menor afinidad de SmbP por este metal a
comparación con Cu(II), este fenómeno también se puede hacer evidente en la figura
34 donde se puede confirmar que SmbPc-GFP eluye con mayor rapidez en la
cromatografía con Ni(II) a comparación con la de Cu(II) donde generalmente eluye
hasta la segunda fracción. Así mismo, en la misma figura 34 es posible observar una
pérdida de proteína en los lavados realizados en la cromatografía con Ni(II) mientras
que con Cu(II) la pérdida es nula. Cabe mencionar que las columnas cargadas con Cu(II)
ocupaban más lisado celular para llegar a la saturación, mientras que las de Ni(II)
usaban un volumen menor. Confirmando con estas últimas observaciones la alta
afinidad de SmbP por Cu(II).19
IMAC es un sistema usado ampliamente para purificación de proteínas de
manera rápida y práctica en un solo paso, sin embargo, algunas proteínas propias de E.
coli presentan también afinidad a iones divalentes presentando un problema. 44 Dicho
problema se presentó también en nuestros resultados donde si bien es posible obtener
buenos rendimientos la pureza se puede ver opacada como en el caso de la purificación
con Cu(II), por lo que es necesario encontrar las condiciones idóneas de expresión y
purificación. En algunas investigaciones han trabajado comparando la eficiencia de
113
purificación con diferentes metales divalentes y han descrito resultados similares a los
nuestros. En el caso de IMAC con Ni(II) han podido purificar proteínas de manera
eficiente pero con bajo rendimiento y con IMAC con Cu(II) han purificado proteínas con
altos rendimientos pero con una pureza moderada.45
Se purificó por medio de una columna de HisTrap HP con el sistema de
cromatografía FPLC de ÄKTA prime plus. La columna comercial empleada mencionada
anteriormente se emplea por lo regular para purificación por IMAC de proteínas con
His-tag, por lo que se encuentra previamente cargada con iones de Ni(II), a los cuales se
sabe el His-tag es afin.12 Por tanto, se purificó con condiciones similares a las probadas
anteriormente, por lo que se empleó una concentración mayor de imidazol en el
lavado. Durante la purificación se logró saturar la columna de HisTrap HP (siendo
evidente por el cambio de color). Además, no hubo pérdida alguna de SmbPc-GFP
durante el lavado de la columna y se pudo visualizar la presencia de SmbPc-GFP en las
fracciones, confirmado posteriormente por los geles de SDS-PAGE (figura 35), donde se
puede apreciar una mayor pureza de la proteína (carriles 3 al 20) a comparación con el
lisado original (carril 2). Al observar el gel, es evidente que se requiere de condiciones
de lavado aún más fuertes para poder obtener mayor pureza, ya que las últimas
fracciones obtenidas (carril 11 al 20) poseen una pureza notablemente mayor a las
primeras eluciones (incluso siendo la única banda presente), aunque la cantidad de
proteína sea menor en dichas fracciones.
Algunas veces, se ha planteado el uso de dos sistemas diferentes de fusión,
como His-tag y MBP con el fin de emplear la habilidad de MBP para mejorar la
114
solubilidad y emplear His-tag para la purificación (o incluso purificar con ambas
proteínas).40, 42 Dado que SmbP se purifica por medio de IMAC al igual que His-tag y
también mejora la solubilidad de la proteína de interés como MBP, SmbP se plantea
como una mejor opción para dichos casos donde se busca tener ambas características
haciendo más práctica la construcción y purificación. Igualmente, dependiendo de la
finalidad de la proteína que se busca obtener y por ende su grado de pureza necesario,
un simple paso de purificación con IMAC puede ser más que suficiente, puesto que
como se ha visto con GFP no altera la actividad de la misma.40
Figura 47. Columna de HisTrap HP al momento de cargar la muestra, se puede apreciar claramente el color de
SmbPc-GFP.
Las fracciones obtenidas se recolectaron y se realizó una diálisis para remover el
exceso de NaCl, esto con el fin de someter la proteína a una segunda purificación, en
este caso con una columna de intercambio aniónico HiTrap Q HP, empleando el equipo
de cromatografía FPLC ÄKTA prime plus. Debido a que el punto isoeléctrico de SmbPc-
GFP se calcula en aproximadamente 5.98 (parámetro calculado con ExPASy-ProtParam
tool) se optó por una cromatografía de intercambio aniónico. La columna se equilibró
con una solución amortiguadora de 50 mM Tris con una concentración alta de NaCl
(500 mM) y un pH de 8.0, misma en la que se encontraba la proteína. Se empleó un
115
gradiente de elución hasta una concentración final de 500 mM de NaCl. SmbPc-GFP
eluyó en la primera fase del gradiente, incluso antes de llegar al 50% de la
concentración de la solución amortiguadora de elución como se puede observar en el
cromatograma (figura 38), por lo que es necesario emplear un gradiente más extenso y
una concentración más baja de NaCl para obtener una mejor resolución.
Conjuntamente fue posible confirmar la presencia de SmbPc-GFP de manera visual
desde la tercera fracción obtenida del equipo y se confirmó por medio del gel de SDS-
PAGE mostrado en la figura 37, en esa misma figura se aprecia una mayor pureza a
comparación de la primera purificación realizada con la columna de HisTrap HP así
como una mayor cantidad de proteína, por lo que se logró concentrar SmbPc-GFP en 6
únicas fracciones de 0.5 mL, dando un total de 3 mL de proteína concentrada y con
elevada pureza obtenida de esta segunda purificación.
La fracción periplásmica obtenida del choque osmótico realizado sobre el
sedimento celular de la expresión de SmbPp-RFP presentaba la coloración
característica de RFP (confirmando nuevamente el adecuado plegamiento de RFP en
periplasma) aunque en una concentración menor a la observada en los lisados celulares
obtenidos de SmbPc-GFP. Finalmente, después de la purificación por medio de IMAC
con iones de Cu(II) se pudo observar la coloración de SmbPp-RFP en mayor medida en
la cuarta fracción de elución. La presencia de SmbPp-RFP se confirmó también gracias a
la electroforesis en geles de poliacrilamida, en la figura 41 se aprecia claramente la
banda que corresponde a la proteína quimérica de SmbPp-RFP y es posible apreciar
una mejora de la pureza (siendo mayor en las fracciones 2, 3, 4 y 6) así como un
116
incremento de la concentración de la proteína y un buen rendimiento. La elución de
SmbPp-RFP evidente a la vista hasta la quinta fracción de elución se puede atribuir al
hecho que se empleó una cantidad de resina mayor a la usada con las previas
purificaciones de SmbPc-GFP y a la alta afinidad que tiene SmbP por Cu(II).19 Con esto
es posible confirmar la presencia de SmbPp-RFP en periplasma (con actividad) al ser
obtenida por un protocolo de choque osmótico como se ha realizado en otros
estudios.19, 34 El rendimiento sin embargo es menor en comparación al de la fracción
citoplásmica, pudiendo ser debido a que el espacio periplásmico posee un volumen
menor al citoplásmico, por lo que será necesario optimizar la producción en
periplasma.34 Aunque, a pesar de dicha desventaja, el rendimiento es bastante alto si
se compara con otras purificaciones de proteínas obtenidas a nivel periplásmico, como
es el caso propio de SmbP, o de otras proteínas con His-tag usando IMAC en otras
investigaciones.19, 46, 47 Aunque no obstante el espacio periplásmico es menor hay que
considerar que la cantidad de proteínas presentes es también menor en comparación
con el citoplasma esto último puede facilitar y mejorar la purificación de la proteína de
interés.29
Se realizó una segunda expresión y un segundo choque osmótico con el fin de
purificar mediante el FPLC ÄKTA prime plus como se realizó con SmbPc-GFP. En la
figura 42 se puede visualizar el SDS-PAGE donde observamos que la pureza se aumentó
con respecto a la purificación realizada con la resina con cobre aunque el rendimiento
es poco. En la figura 43 observamos el cromatograma junto con el gradiente de elución,
es claro decir que la proteína eluyó a un volumen muy temprano, por lo que sería
117
conveniente aumentar el gradiente para aumentar aún más la clara pureza de la
proteína.
Por último se logró realizar el corte con la enzima enteroquinasa de cadena
ligera para la remoción de SmbPcE. Esto se visualiza en la figura 44 donde es posible
apreciar la diferencia entre los pesos moleculares de GFPENT y SmbPcE-GFPENT haciendo
indudable la remoción de SmbPcE. Estos resultados coinciden con los reportados en
cuanto al corte de proteínas con enteroquinasa, donde se observan patrones
similares.48 Considerando que la cantidad de muestra cargada es la misma en todos los
pocillos, se puede observar que el tamaño de banda entre el control y GFPENT no varía
mostrando que debido a su pequeño peso molecular se obtiene finalmente un
rendimiento mayor de la proteína de interés. Ya que no ha sido posible visualizar a
SmbPcE después del corte (aun en geles de porcentaje alto) sería necesario cortar una
mayor cantidad de proteína quimérica con el fin de obtener un volumen mayor de
SmbPcE y sea posible observarla y compararla con GFPENT. Cabe mencionar que la
actividad biológica no se ve afectada, debido a que las muestras después del corte aún
tenían el color característico de GFP y mostraban fluorescencia bajo efecto de la luz UV,
mostrando que la remoción de SmbP no afecta su bioactividad.
118
CAPÍTULO 7
7. CONCLUSIONES
 SmbPc y SmbPp presentan altos niveles de expresión en E.coli como se observa
con GFP y RFP, incluso mayores que con GST y MBP.
 SmbPc y SmbPp incrementan la solubilidad de GFP y RFP y producen bajas
cantidades de cuerpos de inclusión (incluso prácticamente nulos como en el
caso de SmbPp-RFP).
 Es posible purificar proteínas unidas a SmbP con cromatografía de afinidad
(IMAC) con iones de Ni(II) y Cu(II), mostrando una mayor afinidad por Cu(II).
 Se obtiene un mejor rendimiento con la cromatografía (IMAC) con Cu(II), pero
una pureza menor que con Ni(II), aunque con esta ultima el rendimiento
disminuye.
 SmbPp es capaz de transportar proteínas al espacio periplásmico cualidad
confirmada debido a la falta de actividad de SmbPp-GFP, aunque en otras
proteínas no se afecta el plegamiento, como es el caso de SmbPp-RFP.
119
 Es posible expresar y aislar proteínas unidas a SmbPp del espacio periplásmico
mediante choque osmótico con una solución amortiguadora alta en sacarosa.
 Es viable emplear una columna comercial de HisTrap (usada comúnmente para
purificación de proteínas con His-tag) cargada previamente con iones de Ni(II)
para la purificación de SmbPc-GFP con un sistema de FPLC como el ÄKTA prime
plus presentando buenos rendimientos y pureza.
 Se puede emplear una segunda purificación con gradiente aniónico con una
columna comercial con un sistema de FPLC como el ÄKTA prime plus para
mejorar la pureza de las proteínas purificadas con cromatografía de afinidad
con Cu(II) y Ni(II).
 SmbP es una buena opción como proteína de fusión para la expresión y
purificación por medio de cromatografía de afinidad de proteínas específicas en
E. coli; en comparación con proteínas de fusión existentes en el mercado como
MBP y GST, concordando así con los objetivos y la hipótesis planteada.
 La remoción de SmbP fue posible con la enzima enteroquinasa, la proteína de
interés se separa conservando un excelente rendimiento, haciendo evidente la
ventaja de usar una proteína de fusión pequeña como SmbP.
 El plegamiento de la proteína de interés no es afectada al remover SmbP y se
conserva la bioactividad como se observó con GFP.
120
CAPÍTULO 8
8. PERSPECTIVAS
SmbP tiene un enorme potencial de uso como proteína de fusión para
expresión y purificación de proteínas con diversos intereses, sobre todo para la
investigación y en aplicaciones biofarmacéuticas. Por lo que una de las perspectivas del
presente proyecto será el uso de SmbP para la expresión y purificación de proteínas
con interés farmacéutico o con fines de investigación. Así mismo evaluar la actividad de
las proteínas obtenidas y asegurar su funcionalidad por medio de este sistema de
fusión.
En el presente proyecto se proponen diversas técnicas para la purificación de
proteínas quiméricas con SmbP, sin embargo, es posible mejorar los rendimientos
optimizando la expresión y las técnicas de purificación a fin de poder estandarizar
dichos métodos.
121
CAPÍTULO 9
9. SEGURIDAD EN EL TRABAJO DE DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
La disposición de los residuos generados durante el presente proyecto fueron
gestionados de acuerdo a los lineamientos establecidos por la Facultad de Ciencias
Químicas de la UANL en el programa de Manejo Integral de Residuos.
Dichos residuos se dispusieron como se muestra en la siguiente tabla:
TABLA 9.
Disposición de los residuos generados
Colector Residuo generado
 Buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA)

 TFB1 (RbCl, CaCl2, MnCl2, KAc, Glicerol)
Colector A (Soluciones salinas de pH 6-8, sales,  Reactivo Biuret (KOH, CuSO4 Tartrato de sodio y
ácidos y bases orgánicas) tartrato de potasio)
 TBS (Tris Buffer Salino)
 TGS (Tris, Glicerol y SDS
 Agarosa
Colector G (Combinaciones orgánicas solidas)
 Poliacrilamida
Colorantes y lugol  Azul de Coomassie
122
REFERENCIAS
1. Walsh, G. (2007). Pharmaceutical Biotechnology: Concepts and applications. República de
Irlanda: Editorial Wiley.
2. Gamboa, R.A., Trujillo-Roldán, M.A. (2009). Un acercamiento a la producción de proteínas
recombinantes terapéuticas de uso humano. El Residente. Departamento de Inmunología,
Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, México,
D.F. 4, 87–91.
3. Roy, N., Agarwal, S. (2003). Therapeutic Protein Production – An Overview. Technology
Proteomes and Proteomics. 79–82.
4. Jungbauer, A., Graumann, K. (2012). Editorial: Biopharmaceuticals – discovery, development
and manufacturing. Biotechnology Journal. 12, 1422–1423.
5. Kamionka, M. (2011). Engineering of Therapeutic Proteins Production in Escherichia coli. Current
Pharmaceutical Biotechnology. 11, 268–274.
6. Carter, P. J. (2011). Introduction to current and future protein therapeutics: A protein
engineering perspective. Experimental Cell Research. 317, 1261–1269.
7. Liszweski, K. (2012). High-Throughput Protein-Expression Challenges. Genetic Engineering &
Biotechnology News. 32(1).
8. Schumann. W., Ferreira. L.C.S. (2004). Production of recombinant proteins in Escherichia coli.
Genetics and Molecular Biology. 27, 442–453.
9. Sekhon, B.S. (2010). Biopharmaceuticals: an overview. The Thai Journal of Pharmaceutical
Sciences. 34, 1–19.
10. Terpe. K. (2003). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical
fundamentals to commercial systems. Applied microbiology and biotechnology. 60, 523–533.
11. Graumann, K. Premstaller, A. (2006). Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in
microbial systems. Biotechnological Journal. 1, 164–186.
123
12. Amersham Biosciences. The Recombinant Handbook: Protein Amplification and Simple
Purification. Edition AB. 18, 1142–1175
13. Jayaraj, R. Smooker, P.M. (2009). So you Need a Protein – A guide to the production of
recombinant proteins. The Open Veterinary Science Journal. 3, 28–34.
14. Choi, J.H., Lee, S.Y. (2004). Secretory and extracellular production of recombinant proteins using
Escherichia coli. Applied microbiology and Biotechnology. 64, 625–635.
15. De Marco, Ario. (2009). Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-
dependent proteins in Escherichia coli. Microbial Cell Factories. 8, 1–18.
16. Quiroga, A.L. (2010). Optimización del cultivo de Escherichia coli para la producción de cutinasas
recombinantes. Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Departamento
de Ingeniería Química y Biotecnología.
17. Anderlug, G., Gokce, Isa., Lakey, Jeremy. (2003). Expression of proteins using the third domain
of the Escherichia coli periplasmic-protein TolA as a fusion partner. Protein Expression and
Purification. 28, 173–181.
18. Cornelies, P. (2000). Expressing genes in different Escherichia coli compartments. Current
Opinion in Biotechnology. 11, 450–454.
19. Brett, M.B., Rusell, L., Wilson, A.F. (2004). Characterization of a Small Metal Binding Protein
from Nitrosomonas europaea. Biochemistry. 43, 11206–11213.
20. Chain, P., Lamerdin, J., Larimer, F. (2003). Complete Genome Sequence of the Ammonia-
Oxidizing Bacterium and Obligate Chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea. Journal of
Bacteriology. 185, 2759–2773.
21. Hommes, N.G., Sayavedra, L. A., Arp, D.J. (2003). Chemolithoorganotrophic Growth of
Nitrosomonas europaea on Fructose. Journal of Bacteriology. 185, 6809–6814.
22. Liu, Y., Fu, X. Shen, J., Zhang, H. (2004). Periplasmic proteins of Escherichia coli are highly
resistant to aggregation: reappraisal for roles of molecular chaperones in periplasm.
Biochemical and Biophysical Research Communications. 316, 795–801.
124
23. Kapust, R.B., Waugh, D.S. (1999). Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly
effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Science. 8,
1668–1674.
24. Nilsson, J., Stahl, S. (1997). Affinity Fusion Strategies for Detection, Purification, and
Immobilization of Recombinant Proteins. Protein Expression and Purification. 11, 1–16.
25. Baneyx, F. (1999). Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current opinion in
Biotechnology. 10, 411–421.
26. Scopes, R.K. (2000). Overview of Protein Purification and Characterization. Current Protocols in
Protein Science. Editorial Wiley
27. Cutler, P. (2004). Protein Purification Protocols. Methods in Molecular Biology. USA: Humana
Press
28. Jan, C.J. (2011). Protein purification: principles, high resoultion methods, and applications. New
Jersey: Wiley
29. Ausubel, F.M. (2003). Current Protocols in Molecular Biology. USA. Wiley
30. Block, H., Maertens, B., Spriestersbach, A. (2009). Methods in Enzymology, Vol. 463. Germany:
Elsevier Inc.
31. Hage, D. S. (2006). Handbook of Affinity. Florida. USA: CRC Press
32. Prasanna, R., Vijayalakshmi, A. (2010). Immobilized metal-ion affinity systems for recovery and
structure–function studies of proteins at molecular, supramolecular, and cellular levels. Pure
Appl. Chem. 82,39–55
33. Madadlou, A. (2011). Fast Protein Liquid Chromatography. Methods in Molecular Biology. 681,
439–447
34. Feilmeier, B.J. (2000). Green Fluorescent Protein Functions as a Reporter for Protein Localization
in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 182, 4068–4076
35. Speck, J., Katja, M.A. (2010). Efficient phage display of intracellularly folded proteins mediated
by the TAT pathway. Protein Engineering, Design & Selection. 24, 473–484
125
36. Dinh, T., Bernhardt, T.G. (2011). Using Superfolder Green Fluorescent Protein for Periplasmic
Protein Localization Studies. Journal of Bacteriology. 193, 4984–4987
37. Wu, Y., Zhou, Y., Song, J. (2007). Using Green and Red Fluorescent Proteins to Teach Protein
Expression, Purification, and Crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36,
43–54
38. Fox, J.D., Routzahn, K.M., Bucher, M.H. (2003). Maltodextrin-binding proteins from diverse
bacteria and archaea are potent solubility enhancers. Elsevier Science B.V. 537, 53–57
39. Sreejith, R.K., Waugh, D.S. (2012). The Ability to Enhance the Solubility of Its Fusion Partners Is
an Intrinsic Property of Maltose-Binding Protein but Their Folding Is Either Spontaneous or
Chaperone-Mediated. PLOS ONE. 7:11
40. Zhao, X., Li, G., Liang, S. (2013). Several Affinity Tags Commonly Used in Chromatographic
Purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry.2013, 581093
41. Esposito, D., Chatterjee, D.K. (2006). Enhancement of soluble protein expression through the
use of fusion tags. Current Opinion in Biotechnology. 17:353-358
42. Tian, Q., Nagpal, P., Reed, J.W. (2003). Regulation of Arabidopsis SHY2/IAA3 protein turnover.
The Plant Journal. 36:643-651
43. Bolanos, V.M., Davies, O.R. (2006). Structural analysis and classification of native proteins from
E. coli commonly co-purified by immobilized metal affinity chromatography. Biochimica et
Biophysica Acta. 1760:1304-1313
44. Shen, Y., Kim, J.I. (2005). NDPK2 as a Signal Traducer in the Phytochrome-mediated Light
Signaling. Journal of Biological Chemistry. 280:5740-57-49
45. Choe, W.S., Clemmitt, R.H. (2002). Comparison of histidine-tag capture chemistries for
purification following chemical extraction. Journal of Chromatography A. 953:111-121
46. Linder, P. Guth, B. (1992). Purification of Native Proteins from the Cytoplasm and Periplasm of
Escherichia coli using IMAC and Histidine Tails: A Comparison of Proteins and Protocols.
Methods in Enzymology. 4:41-56
126
47. Salema, V., Fernández, L.A. (2013). High yield purification of nanobodies from the periplasm of
E. coli as fusions with the maltose binding protein. Protein Expression and Purification. 91:42-48
48. Hesam, S., Qu, X. (2009). Enhancing the specificity of enterokinase cleavage reaction to promote
efficient cleavage of a fusion tag. Protein Expression and Purification. 59:314-319
127
RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO
Teresa Vargas Cortez
Candidato para el grado de
Maestra en Ciencias con Orientación en Farmacia
Tesis: EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y BIOFÁRMACOS

EN ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN
Edad: 25 años
Campo de estudio: Ciencias de la salud
Biografía:
Datos personales: Nacida en Nuevo Laredo, Tamaulipas el 27 de octubre de 1988, hija

de Esteban Vargas Medrano y Leticia Cortez Bravo.
Educación: Egresada de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido

Químico Farmacéutico Biólogo en el 2011 con mención honorifica, primer lugar de
generación.
Experiencia profesional: Responsable de laboratorio de análisis clínicos en el Hospital

San Ángel, en Nuevo Laredo, Tamps.
128

FORO

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

FORO

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

FORO

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y

BIOFÁRMACOS EN ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP

COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN

TERESA VARGAS CORTEZ

Como requisito parcial para obtener el Grado de MAESTRÍA EN CIENCIAS

con Orientación en Farmacia.

ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN

Dr. Xristo Zárate Kalfópulos

Dra. Mónica Azucena Ramírez Cabrera

Dra. María Elena Cantú Cárdenas

Dra. María Aracely Hernández Ramírez

SUB-DIRECTORA DE ESTUDIOS DE POSGRADO

ESCHERICHIA COLI UTILIZANDO LA PROTEÍNA SMBP COMO PROTEÍNA DE FUSIÓN

Dr. Xristo Zárate Kalfópulos

Dra. Mónica Azucena Ramírez Cabrera

Dr. Benito David Mata Cárdenas

Dra. María Elena Cantú Cárdenas

han ayudado a levantarme cuando todo lo veo perdido.

Esteban y su hermosa esposa Janeth.

corazón por siempre.

CAPÍTULO 6 __________________________________________________________ 106

CAPÍTULO 7 __________________________________________________________ 119

CAPÍTULO 8 __________________________________________________________ 121

CAPÍTULO 9 __________________________________________________________ 122

Figura 1. Estrategia general experimental _________________________________________________ 37

Teresa Vargas Cortez Fecha de graduación: Agosto, 2014

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Químicas

Título del Estudio: EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y

Número de páginas: 127 Candidato para el grado de Maestría en Ciencias

Área de estudio: Ingeniería Genética

Propósito y Método del Estudio. La producción de proteínas recombinantes se ha facilitado

Contribuciones y conclusiones. Se obtuvieron diversas construcciones de plásmidos con genes

En las pruebas de expresión comparativos se observaron rendimientos considerables por parte

el desarrollo de fármacos se enfocaba primordialmente a la creación y manufactura de

pequeñas moléculas de origen sintético, sin embargo, esta tendencia comienza a

desviarse por otro rumbo: el desarrollo de biofármacos.

El uso de proteínas terapéuticas o biofármacos para el tratamiento de diversas

enfermedades se ha venido implementando cada vez más en los últimos 30 años,

lanzan al mercado es un biofármaco.1, 2 Un biofármaco es una molécula biológica con

fines terapéuticos obtenido a partir de un organismo vivo, ya sea a partir de bacterias,

hongos, células animales, levaduras entre otros.2

El término “biofarmacéutico” fue empleado por primera vez en 1980 y se usó

para describir una clase de proteínas terapéuticas producidas por técnicas

término también puede acompañar a otras macromoléculas, por ejemplo, productos

basados en ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) o incluso a la

Desde el año de 1950, se han ido investigando las proteínas producidas

naturalmente en el cuerpo humano y sus obvias aplicaciones terapéuticas, algunos

ejemplos pueden ser: interferones e interleucinas, factores de crecimiento,

principales componentes de la función celular. La información almacenada en el ADN

dirige la maquinaria sintetizadora de proteínas de la célula para producir proteínas

específicas requeridas para la estructura, regulación y función de la misma.3

Aunque el potencial farmacéutico de estas moléculas reguladoras fue

generalmente apreciado, el uso con fines terapéuticos resultaba impráctico debido a

las pequeñas cantidades que se obtenían por medios naturales. La llegada de la

marco el comienzo de una nueva era de ciencias farmacéuticas.1 A pesar de esto y de

su incremento en la demanda, el uso de proteínas terapéuticas aún se encuentra en su