ORIGINALES

Detección de Aspergillus spp. mediante PCR en tiempo

real en un modelo murino de infección pulmonar
María José Buitrago, Alicia Gómez-López, Emilia Mellado, Juan Luis Rodríguez-Tudela y Manuel Cuenca-Estrella

Servicio de Micología. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III. Madrid. España.

OBJETIVOS. Valoración de la utilidad de un método Detection of Aspergillus spp. by real-time PCR

de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en in a murine model of pulmonary infection
tiempo real para la detección y cuantificación
del ADN fúngico en un modelo murino de aspergilosis OBJECTIVES. Assessment of a real-time PCR technique
pulmonar. for the detection and quantification of fungal DNA
MÉTODOS. El modelo murino se realizó con ratones in a murine model of pulmonary aspergillosis.
machos ICR libres de patógenos. Los animales se METHODS. Male ICR specific pathogen-free mice were used
dividieron en grupos, se inmunodeprimieron y se in the studies. The animals were divided into groups:
inocularon intranasalmente con diferentes immunosuppressed and intranasally inoculated with
concentraciones de conidias (10 6, 10 5, 10 4 y various inoculum sizes (10 6, 10 5, 10 4, and 10 3 conidia/mL)
10 3 conidias/ml) de una cepa clínica de Aspergillus of a clinical isolate of Aspergillus fumigatus. When
fumigatus. Los animales fueron sacrificados cuando se symptoms of pulmonary aspergillosis were detected, the
detectaron síntomas de aspergilosis pulmonar. Se mice were killed and the lungs removed for culture and
extrajeron los pulmones real-time PCR determination. The PCR reactions used
para cultivo y detección de ADN fúngico mediante primers that amplified a region of Aspergillus spp.
PCR en tiempo real, con dos iniciadores que amplifican ribosomal DNA. Survival time per experimental group was
una región del ADN ribosómico de Aspergillus spp. calculated and correlation coefficients with inoculum size,
Se calcularon el tiempo de supervivencia por grupo colony counts and PCR results were determined.
de experimentación y los coeficientes de correlación RESULTS. Average survival time was significantly associated
con el recuento de colonias y los resultados with the size of the inoculum. Pulmonary colony count
de la PCR. was positive for 90% of the infected mice, but there was
RESULTADOS. El tiempo medio de supervivencia se no statistical relationship between count values and either
asoció significativamente con el tamaño del inóculo survival time or inoculum size. Real-time PCR was positive
empleado. El 90% de los animales mostró un in 100% of the animals and was significantly associated
recuento positivo de colonias de A. fumigatus en el with survival time and inoculum size (p < 0.01).
tejido pulmonar, pero el número de colonias cultivadas CONCLUSION. Real-time PCR is a reliable procedure for
no se asoció significativamente con los días de the quantification and evaluation pulmonary infection
supervivencia ni con la cantidad de conidias inoculadas. due to A. fumigatus in animal models.
La PCR en tiempo real fue positiva en el 100% de los
ratones asociándose significativamente (p < 0,01) Key words: Aspergillus spp. Real-time PCR. Colony count.
con los días de supervivencia y con el tamaño del Invasive aspergillosis. Animal models.
inóculo.
CONCLUSIÓN. La PCR en tiempo real constituye un método
fiable para cuantificar y evaluar la infección pulmonar Introducción
por A. fumigatus en modelo animales.
Aspergillus fumigatus es un hongo oportunista que cau-
sa infecciones invasoras graves en personas inmunodepri-
Palabras clave: Aspergillus spp. PCR en tiempo real.
midas. El diagnóstico precoz de la aspergilosis invasora
Recuento de colonias. Aspergilosis invasora. Modelos
es fundamental, ya que permite adelantar el inicio del tra-
animales. tamiento antifúngico, del que suele depender la supervi-
vencia del enfermo 1. No obstante, actualmente existen
dudas sobre cuáles son las técnicas diagnósticas y las te-
rapéuticas más adecuadas para controlar esta micosis. Los
Correspondencia: Dr. M. Cuenca-Estrella. ensayos clínicos necesarios para determinar estos aspectos
Servicio de Micología. Centro Nacional de Microbiología. son de difícil diseño, financiación y realización, por lo que
Instituto de Salud Carlos III.
Ctra. Majadahonda-Pozuelo, km 2. deben buscarse métodos alternativos.
28220 Majadahonda. Madrid. España. Una de estas alternativas es el desarrollo de modelos
Correo electrónico: mcuenca-estrella@isciii.es
animales que permiten reproducir infecciones humanas
Manuscrito recibido el 19-11-2004; aceptado el 24-1-2005. como la aspergilosis invasora. Los modelos experimentales
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 Buitrago MJ, et al. Detección de Aspergillus spp. mediante PCR en tiempo real en un modelo murino de infección pulmonar

de infección se han utilizado y se utilizan hoy en día para zaron jaulas en estanterías especiales de aluminio, conectadas con
desarrollar nuevas técnicas diagnósticas y para evaluar filtros HEPA y un sistema de ventilación positiva (Tecniplast, Barce-
lona, España). Se utilizó para las jaulas un lecho de viruta irradiada
tratamientos novedosos, como las nuevas moléculas anti-
(Lignocel, Harlan Interfauna, Barcelona, España) y los animales re-
fúngicas y la terapia combinada2. Los resultados obtenidos cibieron pienso estéril de mantenimiento (TRT, Harlan Interfauna) y
en los modelos experimentales tienen sus limitaciones, agua estéril complementada con 1 mg/ml de tetraciclina (Sigma-Al-
pero permiten llegar a conclusiones que pueden conside- drich, Madrid, España), para evitar la contaminación bacteriana. Se
rarse más cercanas a la práctica clínica que aquellas ob- cumplió estrictamente la normativa recogida en el real Decreto
tenidas en experimentos in vitro 3. 223/1988 sobre protección de los animales de experimentación.
Se han desarrollado varios modelos animales de aspergi- La tabla 1 incluye un resumen de los grupos de animales incluidos
losis invasora. En la mayoría de ellos se han empleado roe- en el estudio. Se emplearon un grupo control que no recibió inóculo ni
dores inmunodeprimidos a los que se les administra coni- tratamiento inmunosupresor, y otro grupo control de la inmunosupre-
sión que recibió terapia inmunosupresora y que no fue inoculado con
dias del hongo por vía intranasal, en un intento de
conidias. Los cuatro grupos restantes fueron inoculados con conidias
reproducir la cadena de infección de la aspergilosis, es de- de una cepa clínica de A. fumigatus (CNM-CM-237, Colección de Hon-
cir, inhalación, infección pulmonar y posterior disemina- gos Miceliales del Centro Nacional de Microbiología). La cepa se sub-
ción. Mediante estos modelos de infección se han evaluado cultivó en tubos de agar patata glucosa (APD, Oxoid, Madrid, Espa-
técnicas diagnósticas y diversos tratamientos 4-6. En todos ña), a 37 °C durante 3-5 días. Las conidias se recogieron con solución
ellos se ha necesitado un método de cuantificación de la in- salina (0,85%) estéril complementada con Tween (0,1% v/v, Sigma-Al-
fección por Aspergillus, que permitiera evaluar la respues- drich), lavadas y filtradas (filtros de 11 ␮, Millipore, Madrid, España)
ta a la terapia o la eficacia de una técnica diagnóstica. para evitar la formación de cúmulos. Tras esto, se prepararon las sus-
El método de cuantificación más empleado es el recuen- pensiones de inoculación mediante recuento en cámara hematocito-
métrica de Neubauer (Brand, Merck, Madrid, España). Se realizaron
to de colonias (unidades formadoras de colonias, UFC) por
recuentos de colonias en agar Sabouraud (Oxoid) para evaluar la fia-
gramo de tejido cultivado. Sin embargo, el recuento de bilidad del procedimiento de preparación del inóculo. Cada grupo ex-
colonias puede verse alterado por la presencia de hifas en perimental fue inoculado con un número de conidias diferente, 10 3,
los tejidos que al fragmentarse, pueden aumentar los re- 10 4, 10 5 y 10 6/ml.
cuentos o, en otras ocasiones, rendir un número escaso La inmunodepresión de los animales se llevó a cabo con ciclofosfa-
de colonias. Además, el recuento también puede alterar- mida (Genoxal. Prasfarma, Barcelona, España) (200 mg/kg) y acetato
se por la supervivencia en el tracto respiratorio de coni- de cortisona (Sigma-Aldrich) (112,5 mg/kg). Los ratones recibieron cin-
dias no germinadas, pertenecientes al inóculo adminis- co tandas de inmunodepresión, 3 y 1 día antes de la inoculación y 3, 6 y
trado al animal 2. Por eso, se han desarrollado otras 9 días después de la inhalación de las conidias (días –3, –1, +3, +6 y +9).
El inóculo se administró intranasalmente. Los grupos experimen-
técnicas de cuantificación basadas en tinciones histológi-
tales fueron etiquetados como G-10 6, G-10 5, G-10 4, G-10 3, según el ta-
cas y en la detección de la biomasa fúngica, como la cuan- maño del inóculo recibido (tabla 1). Los animales fueron anestesiados
tificación de quitina, ergosterol o antígenos fúngicos 7-10. mediante inyección intramuscular de 100 ml de una mezcla de keta-
Estas técnicas son laboriosas y, en muchas ocasiones, mina 12,5 mg/ml (Ketolar, Parke-Davis, Madrid, España) y xylazina
poco reproducibles. 2,3 mg/ml (Rompun, Bayer, Madrid, España). En este estado, los ra-
En los últimos años, se han aplicado algunos métodos de tones fueron inoculados por vía intranasal con 30 ␮l de la solución de
cuantificación basados en la detección de ácidos nucleicos, esporas previamente preparada.
demostrando una sensibilidad y una especificidad varia- Tras la inoculación, los animales fueron observados diariamente,
bles 8,11,12. Uno de estos métodos es la reacción en cadena en busca de los síntomas propios de una aspergilosis pulmonar: in-
movilidad, letargo y disnea. Cuando se observó alguno de estos sig-
de la polimerasa (PCR) en tiempo real, que permite cuan-
nos, los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical. Los
tificar los ácidos nucleicos amplificados y que, por tanto, ratones sin signos de infección fueron sacrificados al décimo día de
puede emplearse en modelos animales de infección para observación, considerado como el punto final de los experimentos. La
evaluar la carga fúngica en los tejidos infectados, constitu- disección de los animales se realizó en condiciones asépticas. Se ex-
yendo una alternativa a las técnicas de cuantificación trajeron los pulmones, se pesaron y resuspendieron en 0,5 ml de sue-
mencionadas anteriormente. ro salino estéril. Los pulmones fueron triturados y homogeneizados
El objetivo de este trabajo es la valoración de la utilidad manualmente, tras lo que se separó una alícuota de 50 ␮l, que se
de una técnica basada en la PCR en tiempo real para la sembró en agar Sabouraud-cloranfenicol (Oxoid). Las placas se incu-
detección y cuantificación de ADN fúngico, en un modelo baron a 35 °C durante 24-48 h y se contó el número de colonias cuan-
do éstas fueron visibles. Los resultados obtenidos se expresaron en
animal murino de infección pulmonar por A. fumigatus.
UFC por gramo de tejido analizado. Las colonias recuperadas en pla-
ca se analizaron mediante Southern-Blot, siguiendo los protocolos ha-

Métodos
Modelo murino de aspergilosis invasora TABLA 1. Grupos de experimentación en que se dividieron
Se realizó un modelo estandarizado siguiendo el descrito por Smith los ratones en el modelo murino de aspergilosis pulmonar
et al 13. Se utilizaron ratones machos de 6-7 semanas, ICR, libres de
Grupo Tratamiento inmunosupresor Inóculo recibido
patógenos, con un peso medio de 30 g (Criffa, Barcelona, España). Se
emplearon 30 ratones que se distribuyeron en grupos de cinco rato- Control No No
nes por jaula. El cálculo del tamaño muestral se efectuó con la aplica- Control ID* CF + AC** No
ción STATCAL del programa EPI INFO 2002 (Centres for Diseases G-10 6 CF + AC 10 6 conidias/ml
Control and Prevention, Atlanta, EE.UU.). Con un intervalo de con- G-10 5 CF + AC 10 5 conidias/ml
fianza del 95% y con una potencia estadística 1-beta del 80%, se nece- G-10 4 CF + AC 10 4 conidias/ml
G-10 3 CF + AC 10 3 conidias/ml
sitaban 30 ratones, para que los resultados tuvieran peso estadístico.
Cada animal se identificó individualmente para facilitar el segui- *Control de la inmunosupresión.
miento del experimento. Para la estabulación de los animales se utili- **Ciclofosfamida más acetato de cortisona.

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bituales 14 para verificar que se trataba de la cepa inoculada y no de La cuantificación del ADN amplificado se realizó mediante la cons-
una contaminación. El resto del homogeneizado se reservó para rea- trucción de una recta patrón, en las que se emplearon cantidades co-
lizar un posterior ensayo de detección de ADN fúngico mediante PCR nocidas de ADN de la cepa inoculada, en cantidades decrecientes
en tiempo real. (100 ng hasta 10 fg). A estas muestras se les realizó una PCR en tiem-
po real, obteniéndose la amplificación de las mismas en distintos ci-
clos de la reacción (crossing point). Tras ello se realizó una regresión
Detección de ADN fúngico mediante PCR lineal en la que se utilizaron los logaritmos de las concentraciones de
en tiempo real ADN utilizadas y el crossing point. La cantidad de ADN amplificado
Para la realización de las técnicas moleculares se utilizaron 20 mg en las muestras procedentes de los animales se calculó mediante una
de los homogeneizados pulmonares. Para el proceso de extracción se regresión lineal. Una vez realizadas las reacciones de PCR se com-
empleó el sistema Wizard SV Genomic DNA Purification System (Pro- probó la presencia del amplicón que se quería detectar, así como el
mega, Innogenetics, Madrid, España), siguiendo las instrucciones del tamaño de éste, mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (Sig-
fabricante. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en el ma-Aldrich) con TAE (Tris acetate-EDTA) siguiendo los protocolos ha-
termociclador LightCycler 2.0 System (Roche Aplied Science, Ma- bituales14. Asimismo se procedió a secuenciar el fragmento amplifica-
drid, España), siguiendo el método descrito por Loeffler et al 15. Este do para verificar la presencia de A. fumigatus. Para las reacciones de
método se basa en la utilización de dos sondas FRET (Fluorescence secuenciación se utilizaron 4 ␮l de un sistema de secuenciación (BigD-
Resonance Energy Transfer) específicas marcadas con fluoresceína y ye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, Applied Biosystem,
RED640, y dos iniciadores para la amplificación de una región que Madrid, España), 1 ␮M de los iniciadores utilizados en la reacción de
codifica el fragmento 18S del ADN ribosómico de Aspergillus spp.16. PCR y 5 ␮l del producto final de la amplificación. Las secuencias fue-
Esta sonda es específica para A. fumigatus, aunque se han descrito al- ron ensambladas y comparadas empleando los programas SeqMan II
gunas reacciones cruzadas con otras especies de Aspergillus 15. Las y EditsEq (DNAstar, Inc. Lasergene, Madison, EE.UU.).
reacciones de PCR en tiempo real se realizaron empleando el sistema
LightCycler-FastStart DNA hibridization probes (Roche Aplied Scien-
ce), en un volumen final de 20 ␮l y empleando 3 mM de Cl2Mg, 1 ␮M
Análisis estadístico
El análisis de los resultados se realizó con la ayuda del programa
de cada iniciador, 0,2 ␮M de cada sonda FRET, y 10 ␮l del ADN obte-
informático SPSS 12.0 (SPSS SL, Madrid, España). Se efectuó un aná-
nido. En la tabla 2 se muestran las secuencias de los iniciadores y de
lisis descriptivo de los días de supervivencia de cada grupo experi-
las sondas FRET utilizadas en los experimentos.
mental, así como de los recuentos de colonias por gramo de tejido pul-
monar y de los resultados de la PCR en tiempo real.
Los días de supervivencia fueron tomados como la variable princi-
TABLA 2. Nombre y secuencia de los iniciadores y de las sondas pal para realizar las comparaciones y los análisis de regresión. En
FRET utilizados en las PCR en tiempo real primer lugar, se analizaron las diferencias en el tiempo de supervi-
vencia por grupo experimental, mediante tablas de supervivencia y el
Identificación Secuencia test de Kaplan-Meier, previa comprobación de la normalidad de los re-
Iniciador 18S1 5⬘ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG 3⬘ sultados. Tras ello, se realizó un estudio de correlación entre la su-
Iniciador 18S2 5⬘CCGATCCCTAGTCGGCATAG 3⬘ pervivencia, los recuentos de colonias y los datos de la PCR en tiempo
Sonda AF1-RED LC Red 640-5⬘TGGCGAACCAGGACTTTTACTTTG 3⬘ real mediante coeficientes de correlación de Pearson (r), previa con-
Sonda AF2-FLUOS 5⬘GTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGC 3⬘-Fluos versión logarítmica de las UFC por gramo de tejido obtenidas. Las di-
Las secuencias fueron extraídas de las referencias 12 y 15.
ferencias entre grupos en la cuantificación del ADN fúngico se calcu-
PCR: reacción en cadena de la polimerasa. laron mediante análisis de la varianza con el test Post hoc de Tukey.
El nivel de significación estadística que se aceptó fue p < 0,01.

5
Resultados
En la figura 1 se representan las curvas de superviven-
4 cia de los grupos experimentales incluidos en el modelo
murino de aspergilosis pulmonar. En la figura se repre-
Número de ratones

senta el número acumulado de animales sacrificados, por

3
día de experimentación. En los grupos que recibieron los
inóculos más elevados, 10 6 y 10 5 conidias/ml, la mayoría
2 de los ratones presentaba signos de enfermedad al tercer o
cuarto día de experimentación. Mientras que con los otros
1 dos inóculos, los animales empezaron a ser sacrificados el
cuarto día. Estas diferencias resultaron estadísticamente
significativas (p < 0,01) cuando se analizaron en tablas de
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
supervivencia y con el test de Kaplan-Meier. Las medias
de los días de supervivencia por grupo de experimentación
Días de supervivencia se resumen en la tabla 3, destacando la diferencia entre
la supervivencia media de los animales inoculados con 10 6
Control G-10e3 G-10e4
conidias/ml (2,8 días) y la de los animales inoculados con
G-10e5 G-10e6 10 3 conidias/ml (6,6 días). Por lo tanto, el tiempo medio de
supervivencia tuvo una relación inversa y estadísticamen-
te significativa con el tamaño del inóculo empleado.
Figura 1. Curvas de supervivencia por grupo de experimentación. G-10e6: Una vez halladas estas diferencias significativas en la
grupo de ratones inoculados con 106 conidias/ml; G-10e5: inoculados con 105 co- supervivencia, se calcularon las CFU por gramo de tejido
nidias/ml; G-10e4: inoculados con 10 4 conidias/ml; G-10e3: inoculados con pulmonar y se realizaron las pruebas con la técnica de
103 conidias/ml; Control: grupo control sin inmunodepresión. PCR en tiempo real, con la intención de correlacionar los
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resultados de la supervivencia con ambas técnicas de cuan- y el desarrollo de los modelos discriminatorios, que eva-
tificación de la infección por Aspergillus. En primer lugar lúan varias variables en un mismo modelo e intentan re-
debe indicarse que el recuento de colonias fue positivo en el producir la infección como ocurre en el ser humano, han
90% de los animales inoculados. En dos ratones, uno del hecho que se necesiten otras formas de analizar la infec-
grupo G-105 y otro del G-104, no se detectó la infección me- ción fúngica en los animales 7-10.
diante el cultivo del tejido pulmonar. Además, la correla- Uno de estos métodos puede ser la PCR en tiempo real15.
ción entre los días de supervivencia y el recuento de colo- Esta técnica es un tipo de PCR cuantitativa, basada en la
nias por gramo de tejido pulmonar no fue estadísticamente medición de la fluorescencia emitida por el producto de
significativa (r = 0,123; p > 0,01). En la tabla 3 se muestran la reacción de amplificación. Pueden utilizarse diferentes
los valores de los recuentos por gramo de tejido pulmonar formas de marcaje fluorescente y la cuantificación se rea-
cultivado, clasificado por grupo experimental. liza determinando en qué ciclo se empieza a detectar la
Los resultados obtenidos con la PCR en tiempo real tam- fluorescencia. En este estudio se realizó un modelo animal
bién se resumen en la tabla 3. La técnica de PCR fue po- de aspergilosis pulmonar, en el que se administraron di-
sitiva en el 100% de los ratones incluidos en el modelo. ferentes inóculos, con la intención de evaluar diferencias
Además, los valores de crossing point y la cantidad am- en el tiempo de supervivencia, en el recuento de colonias
plificada de ADN fúngico (ng/mg de tejido pulmonar) se por gramo de tejido pulmonar cultivado y en la cantidad
correlacionaron significativamente con los días de super- de ADN fúngico amplificado por PCR en tiempo real.
vivencia de los animales. El coeficiente de correlación en- Nuestros resultados demuestran que el tiempo de su-
tre el crossing point y los días de supervivencia fue de 0,66 pervivencia era menor cuanto mayor era el inóculo. Esta
(p < 0,01), y entre la cantidad de ADN fúngico y el tiempo tendencia tuvo significación estadística, por lo que los días
de supervivencia de –0,81 (p < 0,01), indicando una rela- de supervivencia fueron tomados como variable de refe-
ción inversa y significativa entre ambas variables. Ade- rencia para comparar los recuentos y los resultados de la
más, las diferencias halladas en los valores del crossing PCR. La PCR en tiempo real resultó ser más sensible que
point y del ADN fúngico fueron estadísticamente significa- los recuentos de colonias (100 frente a 90%), pero además,
tiva (p < 0,01) entre el grupo G-10 6 y el resto de grupos con tanto los valores de crossing point como la cantidad de
animales inoculados. Las diferencias entre los otros tres ADN amplificado por mg de tejido pulmonar, tuvieron una
grupos (G-10 5, G-10 4 y G-10 3) no fueron significativas me- relación con los días de supervivencia de los animales. Es-
diante el test de Tukey. tos resultados significan que a mayor inóculo, los animales
vivían menos días de media, y que se detectaba una mayor
cantidad de ADN fúngico. Esta relación no se obtuvo con el
Discusión recuento de colonias, ya que los valores de esta variable no
fueron dependientes del tamaño de inóculo empleado, lo
Una de las principales limitaciones que siempre han que la invalida como método de cuantificación de la infec-
mostrado los modelos animales es la dificultad para evaluar ción. En nuestro estudio pudo observarse además que la
o cuantificar la infección fúngica por hongos filamentosos. técnica es sensible y específica, ya que se detectó ADN fún-
Estos microorganismos tienen la capacidad de generar hi- gico en todos los ratones inoculados con la cepa clínica de
fas en los tejidos que invaden, por lo que la cuantificación Aspergillus y la amplificación fue negativa, en todos los
de la infección es compleja. La técnica de referencia, que controles sin inocular.
es el recuento de colonias por gramo de tejido cultivado17, La PCR en tiempo real constituye un método fiable para
no puede utilizarse con fiabilidad, ya que los filamentos cuantificar la infección pulmonar por A. fumigatus en este
pueden fragmentarse, lo que hace que se sobreestime el modelo murino. Es un método sencillo, rápido y reproduci-
número de colonias, con el consiguiente error en estudios ble por lo que puede emplearse en modelos que evalúen la
de valoración de antifúngicos o de virulencia de las cepas. eficacia de antifúngicos, en estudios que analicen la viru-
Por lo tanto, la mayoría de los estudios con modelos ani- lencia de determinadas especies o cepas y en trabajos que
males han empleado la supervivencia como variable prin- determinen la cadena de infección de las micosis, la posi-
cipal 2. Sin embargo, las actuales recomendaciones sobre la bilidad de realizar un diagnóstico precoz o la eficacia de la
disminución del sufrimiento de los animales de laboratorio respuesta inmunitaria del huésped. Las técnicas de am-

TABLA 3. Valores medios e intervalos de los días de supervivencia, del recuento de colonias y de los resultados de la PCR
en tiempo real por grupo de experimentación
Recuento colonias ADN fúngico
Días de
en tejido pulmonar Crossing point* por gramo pulmón
supervivencia
Grupo (UFC/g) (ng/mg)

Media Intervalo Media Intervalo Media Intervalo Media Intervalo

Control 10,00 10-00 0,0 0-0 – – 0,00 0

Control ID* 10,00 10-00 0,0 0-0 – – 0,00 0
G-10 6 2,8 1-3 3,1 1-9 19,5 17,8-20,8 1,17 0,34-3,18
G-10 5 4,0 3-7 2,2 0-5 21,2 17,9-30,5 1,04 0,11-3,06
G-10 4 5,4 4-8 2,0 0-4 22,1 19,3-27,6 0,86 0,08-0,98
G-10 3 6,6 5-10 2,4 1-4 23,3 19,6-26,9 0,80 0,01-1,06
*Ciclo en el que se amplificó el ADN fúngico durante la PCR en tiempo real.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa; UFC: unidades formadoras de colonias.

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attenuates the efficacy of subsequent amphotericin B therapy in a murine
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se encuentra alejada en la actualidad. Estas técnicas es- tifungal susceptibility test results and in vivo outcome after fluconazole tre-
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Agradecimientos M. Comparison of glucan detection and galactomannan enzyme immunoas-
Agradecemos la excelente asistencia técnica de Victoria Ruiz Gu- say in gastrointestinal and systemic murine candidiasis. Diagn Microbiol In-
fect Dis. 2003;46:103-8.
tiérrez y el apoyo en la realización de este trabajo de la red temática
11. Bretagne S, Costa JM, Marmoratkhuong A, Poron F, Cordonnier C, Vidaud
de investigación RESITRA (Red de Estudio de la Infección en el Tras- M, et al. Detection of Aspergillus species DNA in bronchoalveolar lavage
plante) financiada por el Fondo de investigaciones Sanitarias del Ins- samples by competitive PCR. J Clin Microbiol. 1995;33:1164-8.
tituto de Salud Carlos III. Alicia Gómez-López disfruta de un contrato 12. Loeffler J, Hebart I, Bialek R, Hagmeyer L, Schmidt D, Serey FP, et al.
de investigación de la red RESITRA asociado al proyecto FIS G03/075. Contaminations occurring in fungal PCR assays. J Clin Microbiol. 1999;37:
Emilia Mellado tiene un contrato del programa Ramón y Cajal del Mi- 1200-2.
nisterio de Educación y Ciencia. 13. Smith JM, Tang CM, Vannoorden S, Holden DW. Virulence of Aspergillus
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