Universidad de Sonora: División de Ciencias Biológicas Y de La Salud
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MANUAL DE PRÁCTICAS
DE
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICOS
REALIZADO POR:
AZALEA LIZÁRRAGA C.
GRISELDA MORENO I.
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HERMOSILLO, SONORA, MÉXICO.
Práctica No. 1
Obtención de un cultivo puro
Introducción
Una de las herramientas indispensables para el trabajo del laboratorio en el
área de microbiología, lo es sin duda la capacidad de poder aislar
perfectamente a un microorganismo a partir de mezclas de éstos, ya que
raramente en la naturaleza se encuentran poblaciones puras de
microorganismos. Sin esta habilidad, que se adquiere solamente con la
práctica diaria, no es posible ni siquiera pensar en la posibilidad de llegar a
trabajar con microorganismos, mucho menos querer identificarlos.
Procedimiento.
1. Levante la tapadera de su caja petri (preparada con el agar
correspondiente para su utilización) lo suficientemente alto para que le
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permita introducir el asa de inoculación y moverla libremente. Realice esto
con una sola mano.
2. Coloque una asada del microorganismo (caldo) cerca del borde del agar y
enseguida distribúyalo con movimientos de izquierda a derecha, hasta que
haya cubierto aproximadamente una cuarta parte de la placa.
Actividades Adicionales:
1.- Investigar:
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a) Cuando menos tres diferentes técnicas con sus ventajas y
desventajas para el aislamiento de microorganismos a partir de
cultivos mixtos.
b) Las características coloniales comúnmente asociadas a su
crecimiento bacteriano; a un crecimiento fúngico.
2. Cuál es la ventaja de utilizar medios selectivos y/o diferenciales, sobre los
medios generales para el aislamiento de un microorganismo a partir de un
cultivo mixto.
3. Investigue cuáles son las hipótesis que existen para explicar la reacción al
gram y cuál de estas hipótesis tiene mayor peso en la comunidad científica.
4. Investigar lo que considere más importante de los medios de cultivo: Agar
nutritivo y caldo BHI.
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Práctica No. 4
Aislamiento y caracterización de Staphylococcus sp
Introducción.
El género Staphylococcus, miembro de la familia Micrococcaceae,
comprende especies de gran importancia tanto en el aspecto clínico como en la
industria alimentaria, entre los que destacan S. aureus, S. epidermidis y S.
saprophyticus, causantes de intoxicaciones, infecciones de la piel, vejiga y
septicemias, entre otros problemas clínicos.
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Procedimiento.
1. Hacer un frotis de la muestra proporcionada por el maestro de práctica y
realizar una tinción al gram. Observar cuidadosamente.
2. Inocular la muestra en los siguientes medios de cultivo: Agar tripticasa soya,
Staphylococcus 110 y/o agar sal manitol.
3. Incubar por 24 – 48 horas, a 35 – 37 C.
4. Observar las características coloniales en cada uno de estos medios.
5. Elegir una colonia típica de cocos gram (+) y realizar prueba de catalasa.
6. De la misma colonia tomar una muestra e inocular un tubo de BHI
incubándolo por 18 horas.
7. Realizar la prueba de coagulasa, utilizando el cultivo de BHI.
8. Reportar los resultados obtenidos y el microorganismo aislado y/o
identificarlo.
Prueba de la catalasa.
1. Tomar una pequeña cantidad de microorganismos del centro de una colonia
pura bien aislada y depositarla sobre un portaobjetos.
2. Agregar una gota de agua oxigenada al 30% sobre los microorganismos.
3. Observe la inmediata aparición de burbujas, lo cual se considera como
prueba positiva.
Prueba de la coagulasa.
1. Agregue 0.5 mL de plasma de conejo a un tubo estéril de 13 x 100 mm.
2. Agregue 0.5 mL de un cultivo puro de staphylococcus sp. en BHI (18 horas).
3. Mezcle suavemente los contenidos para suspender el microorganismo. No
agite.
4. Hacer las observaciones cada 30 minutos por espacio de 4 horas.
5. Inclinar ligeramente el tubo para observar la aparición del coágulo, lo cual
se considera prueba positiva.
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Actividades adicionales:
1. Investigar:
a) El fundamento selectivo y/o diferencial de los medios de cultivo
comúnmente utilizados para aislar Staphylococcus sp. de muestras
clínicas y alimentarias. Como lo son el agar sal manitol, Staphylococcus
110, Vogel y Johnson, Baird Parker, entre otros.
b) El fundamento bioquímico involucrado en la reacción de la catalasa,
coagulasa y fermentación del manitol; y las precauciones en su
realización.
c) La diferencia fundamental que existe entre la prueba de coagulasa en
porta y la de tubo.
2. Ilustre con un diagrama de flujo el procedimiento para aislar e identificar las
especies de Staphylococcus más comunes.
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Práctica No. 5
Introducción.
El género Streptococcus, pertence a la familia Streptococcaceae, la cual se
caracteriza por ser cocos gram positivos agrupados usualmente en forma de
cadenas, aisladas o en pares y por ser además anaerobios facultativos y
grandes productores de ácido láctico.
Procedimiento.
1. Estriar la placa de agar sangre con las cepas proporcionadas.
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2. Incubar a 37C por 24 horas. Debido a que los eritrocitos pueden lisarse con
una incubación prolongada a dicha temperatura, las placas deben de leerse
lo más rápidamente posible.
3. Examinar las placas y observar el desarrollo de las colonias y las zonas de
hemólisis. De ser posible, observar las colonias y zonas adyacentes con el
objetivo panorámico.
4. Hacer tinciones al gram de algunas colonias típicas alfa y beta hemolíticas.
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PRACTICA No. 6
Aislamiento y caracterización de Enterococcus faecalis
Introducción.
En los últimos años, el aislamiento de E. Faecalis, tanto de fluidos corporales
como de alimentos y aguas, ha venido en aumento.
Procedimiento.
1 Estriar la placa de agar sangre con las cepas proporcionadas.
2 Incubar a 37C por 24 horas. Debido a que los eritrocitos pueden lisarse
con una incubación prolongada a dicha temperatura, las placas deben
de leerse lo más rápidamente posible.
3 Examinar las placas y observar el desarrollo de las colonias y las zonas
de hemólisis. De ser posible, observar las colonias y zonas adyacentes
con el objetivo panorámico.
4 Hacer tinciones al gram de algunas colonias típicas alfa hemolíticas.
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5 Tomar el centro de una colonia e inocular un tubo de BHI que contenga
un 7.5% de NaCl.
6 Incube a 37C por 24 horas.
7 Anotar las observaciones.
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PRACTICA No. 7
Introducción:
De los microorganismos alfa hemolíticos de interés en el campo de la clínica
destaca por su importancia, Streptococcus pneumonae, debido a que causa
pneumonía, septicemia y meningitis, principalmente. Su importancia en el
campo de los alimentos no está documentada.
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Procedimiento.
1. Se proporcionarán tubos o placas de Agar sangre o Todd-Hewwll
inoculados con S. pneumonae.
2. Inocular una placa de agar sangre con el microorganismo proporcionado e
incubar por 24 horas a 37C; de preferencia en un Gas-Pak.
3. Observar el tipo de colonia y hemólisis resultante sobre la placa.
4. Preparar el frotis de los cultivos y realice una tinción al gram y una para
tinción de cápsulas.
5. Las colonias sospechosas de ser S. pneumoniae se inocularán en un tubo
con caldo BHI (una colonia por tubo) y se incubarán a 37C por 18 horas.
6. Utilizando el crecimiento bacteriano obtenido en el paso anterior se
inoculará en forma masiva y con hisopo, en una placa de agar sangre recién
preparada (superficie húmeda) y deje reposar por 10 minutos
aproximadamente.
7. Colocar en la parte central de la placa anterior, un disco de Optochin ya
sea que hayan sido preparados al saturar discos de papel filtro con una
solución al 0.025% de hidrocloruro de trihidrocupreina o ethylhidrocupreina,
o los discos preparados comercialmente para tal efecto.
8. Incube a 37C por 24 horas y observe si hay o no crecimiento en el área
que rodea al disco.
9. Por otro lado transferir 1-2 asadas del crecimiento bacteriano obtenido en el
tubo con BHI, a un tubo que contenga 0.5mL de una solución al 2% de
desoxicolato y agite suavemente.
10. Observar el aclaramiento de la solución resultante producida por la lisis del
pneumococo con el detergente.
11. Anotar sus observaciones para la elaboración del reporte final.
Actividades Adicionales.
1. Investigar el fundamento de las siguientes reacciones bioquímicas:
a) Solubilidad en bilis.
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b) Inhibición ante optochin.
c) Reacción de Quellung.
d) Fermentación de la inulina.
Práctica No. 8
Aislamiento y caracterización de Neisseria sp.
Introducción:
El género Neisseria, perteneciente a la familia Neisseriaceae, es
considerado parte de la flora normal de las mucosas del hombre. Sin embargo,
se encuentran comprendidas especies de gran importancia médica, como lo
son N. Gonorrhoeae y N. Meningitidis, causantes principalmente de gonorrea y
meningitis, respectivamente.
Sus miembros son cocos gram negativos que se presentan usualmente
en pares con lados adyacentes aplanados, lo que les da una morfología
característica como de granos de café. La mayoría de las cepas patógenas al
hombre son encapsuladas. Aunque el género es considerado aeróbico, el
gonococo y el meningococo requieren de una concentración incrementada de
CO2 para su aislamiento inicial (del 4 al 8%), fácilmente obtenible con un Gas-
Pak; son fastidiosos nutricionalmente, teniendo requerimientos nutricionales
complejos (especialmente el gonococo) y una temperatura óptima de
crecimiento entre 36 y 39C, lo que les distingue de otras neisserias no
patógenas que crecen a temperaturas de hasta 22C.
Aunque pueden crecer en Agar chocolate, el medio de Thayer y Martín
(modificado o no con antibióticos) es considerado ideal para su desarrollo.
El género es oxidasa positivo ya que contienen niveles altos de
citocromo c oxidasa, y las reacciones confirmatorias para gonococo incluyen la
producción de ácido a partir de la glucosas, más no de fructosa o maltosa, así
como tinción de anticuerpos fluorescentes positiva. En el caso de
meningococo, la producción de ácido es a partir de la glucosa y maltosa.
Procedimiento.
1. Se proporcionará una cepa de Neisseria sp. En tubos con caldo nutritivo.
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2. Inocule una placa de agar chocolate, agar sangre o agar nutritivo e incube a
37C por 24 horas, bajo una atmósfera de CO 2 (jarra anaeróbica o Gas
Pak).
3. Observe los diferentes tipos de colonias que se desarrollan sobre el medio:
Las colonias de Neisseria consideradas patógenas para el humano, son
pequeñas y transparentes como gotas de rocío o bien son pequeñas,
circulares y de color blanco grisáceo; las no patógenas son coloridas (rosas,
amarillas, etc.).
Puede ser que al intentar removerlas del medio, esto se dificulte.
PRUEBA DE LA OXIDASA:
a) Método de la gota.
Usando una pipeta capilar, agregue una gota de una solución al 1% de
hidroxicloruro de dimetil-p-feniendiamina (reactivo de Kovacs), sobre las
colonias.
Las colonias oxidasa positivas se tornarán rosas, luego púrpuras y
finalmente negras.
Tales células ya no son viables para subcultivarse pero pueden teñirse al
gram.
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Actividades adicionales.
1. Investigar:
a) El fundamento selectivo y/o diferencial del agar Thayer y Martin.
b) El fundamento bioquímico involucrado en la prueba de la oxidasa.
Introducción.
Entre los miembros de esta familia se encuentran comprendidos los
géneros bacterianos que más comúnmente se aíslan en todo laboratorio de
microbiología clínica. Es por ello, que se enfatiza tanto el estudio de las
características morfológicas, bioquímicas y serológicas que son requisito para
su aislamiento e identificación.
Son considerados habitantes naturales del tracto gastrointestinal del
hombre y de animales de sangre caliente, aunque se les encuentra también en
el agua, suelo y en plantas.
Su importancia fundamental estriba en el hecho de que pueden causar
serias infecciones en el hombre, tales como la fiebre tifoidea, plaga infecciones
gastrointestinales, urinarias, respiratorias, y bacteremia, entre otras. Son
considerados además los mejores indicadores de contaminación fecal y calidad
sanitaria de aguas y alimentos, por lo que su determinación en el laboratorio de
alimentos es considerado una práctica rutinaria.
Los miembros de la familia son bacilos gram negativos, oxidasa
negativa, fermentan la glucosa la mayoría producen catalasa y reducen los
nitratos a nitritos; las especies móviles presentan flajelos perítricos.
El aislamiento de ciertos géneros a partir de fluidos biológicos, obliga en
muchas situaciones al uso de caldos enriquecedores, junto con medios
diferenciales y selectivos, para incrementar así la posibilidad de aislamiento,
dado la gran cantidad de flora acompañante en estas muestras. Sin embargo,
para cumplir con los objetivos de las prácticas de análisis microbiológicos, su
uso no es necesario.
Procedimiento.
1. Inocule una placa de ENDO, MaConkey o EMB, con las muestras
proporcionadas.
2. Incube a 37C por 24 horas. Observe sus resultados.
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3. Tome del centro de una colonia colorida (lactosa positiva), o incolora
(lactosa negativa) e inoculen posteriormente los tubos necesarios para
realizar las pruebas bioquímicas del IMViC y otras necesarias.
PRUEBA DE INDOL.
1. Agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs directamente a un cultivo de un
caldo con triptófano o peptona de 24-48 horas
2. Agitar suavemente el tubo. Observe los resultados.
Prueba positiva: Un anillo rojo en la superficie del medio
Prueba negativa: no se produce color, o bien toma el color del reactivo de
Kovacs.
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PRUEBA DE LA UREASA.
1. Inocule densamente (2 ó 3 azadas) de un cultivo puro en TSI ó KIA, a un
caldo de urea de Stuart y agite suavemente el tubo para lograr la
suspensión de las bacterias en el caldo.
2. Incube a 35C en incubador o baño de agua.
3. observe a las 8, 12, 24 y 48 horas de incubación el cambio de color
producido.
Positivo: Color rojo rosado intenso en todo el caldo.
Negativo: No se produce cambios de color (amarillo ámbar).
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Positiva: Color verde en el pico de flauta y en el líquido de sinéresis.
Negativa: No se produce cambio de color; se mantiene amarillo por el color
del cloruro férrico.
Actividades adicionales:
Investigar:
1. El fundamento bioquímico involucrado en cada una de las reacciones
anteriores.
2. Las precauciones y/o limitaciones que tienen cada una de las pruebas
bioquímicas anteriores.
3. ¿Porque en el TSI se puede leer la fermentación de 2-3 carbohidratos al
mismo tiempo? ¿Cual es la diferencia con el KIA?
4. ¿Porque la aparición de un color negro evidencia la producción de H 2S y
que gases se producen en el TSI?
5. ¿Porque las reacciones en el TSI no deben de leerse antes de 18 horas?
Ni después de 24 horas.
6. ¿Qué otros reactivos pueden utilizarse para la prueba del indol y como se
afecta el procedimiento empleado en esta práctica?.
7. ¿Porque se pueden diferenciar microorganismos lactosa positivos y
lactosa negativos en las placas de ENDO, McConKey y EMB?.
8. Los cuidados y precauciones que deben de tomar al preparar el caldo de
KCN y al prepararse para descartar los tubos utilizados.
9. Ilustrar con un diagrama de flujo los pasos a seguir para separar
enterobacterias, lactosa positivas y lactosa negativas tomando en cuenta
primero las reacciones bioquímicas del TSI.
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PRÁCTICA No. 11
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Pseudomonas sp.
Introducción.
Dentro del género pseudomonas se encuentran especies de interés para
el microbiólogo clínico, al ocasionar enfermedades específicas como
melloidosis (Pseudomonas pseudomallei) o actuando como patógenos
oportunistas en casos de quemaduras, infecciones post-operatorias,
septicemias, infecciones respiratorias y urinarias, por mencionar algunas
(Pseudomonas aeruginosa, ps. Maltopilla, principalmente). Para el
microbiólogo de alimentos, revisten especial importancia las especies
asociadas a pérdidas de productos cárnicos y cosméticos.
El género está caracterizado por ser bacilos gram negativos, móviles en
su mayoría por flagelos polares, oxidasa positivos y que algunas especies
excretan pigmentos como la ploclanina (.Ps. aeruginosa) y fluorescencia (Ps.
Fluorescens), entre otros. Son aerobios obligados, anaerogénicos; la mayoría
crece óptimamente a temperaturas de 35 a 37C, aunque existen especies que
pueden crecer a 4C, y que se asocian a casos de endotoxemía provocada por
la administración de fluidos intravenosos contaminados, lo que aunado al
hecho de que son relativamente resistentes a muchos germicidas utilizados en
hospitales, los hace ser microorganismos frecuentemente involucrados en
infecciones nosocomiales.
Procedimiento.
1. Inocule la muestra proporcionada de microorganismos a un agar
MacConkey o ENDO y una de agar sangre.
2. Incube por 18-24 horas a 35C.
3. Observe el tipo de colonias características que se desarrollan en ambas
placas.
Haga sus observaciones cuidadosamente:
Tipo de crecimiento colonial, producción de pigmentos y olores
particularmente en el agar sangre.
4. Realice un frotis y tíñalo al gram.
5. Realice la prueba de la oxidasa y catalasa.
6. Tome el centro de una colonia típica e inocule un tubo de TSI
7. Incube 18-24 horas y observe cuidadosamente la reacción característica
desarrollada.
8. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes.
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Prueba de la oxidasa.
1. Agregar 2 ó 3 gotas de reactivo de Kovacs a algunas colonias
sospechosas que se hayan desarrollado sobre la placa. Tenga cuidado
de no inundar la placa con el reactivo y de no invertirla.
2. Observar los cambios de color que se desarrollarán a los 10-15 seg.
Después de haber agregado el reactivo.
Positivo: La colonia toma un color rosado, pasa a marrón y luego a
negro.
Negativo: No se desarrolla color en las colonias.
Nota: Si va a utilizar las colonias oxidasas positivas para realizar las
pruebas bioquímicas, cuide de tomarlas cuando estén en la etapa de
color rosa, pues aquí todavía se presentan bacterias viables y al estar
negras las bacterias están muertas.
PRUEBA DE OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN.
1. Del crecimiento de un tubo de TSI ó KIA, inocular un par de tubos de OF
(medio básico de Hugh y Leifson que contiene un carbohidrato específico
en estudio).
2. Etiquetar un tubo ABIERTO y el otro SELLADO. El inóculo debe ser un
poco denso y teniendo cuidado de picar hasta casi el fondo de ambos
tubos.
3. Al tubo etiquetado como sellado, agregue de 1 a 2ml. De vaselina o
parafina líquida estéril, para excluir el oxígeno.
4. Incube 48 horas a 35C. En ciertos casos es necesario incubar de 3 a 4
días.
5. Observar y anotar la producción de ácido (amarillo) que se extiende sobre
el tercio superior del medio abierto.
Reacción de fermentación: Acidez completa en ambos tubos.
Aerogénico: Acido y gas en ambos tubos.
Movilidad: Crecimiento que se aleja de la línea de punción.
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Fase 1: Positivo: Color rojo en la fase 1 significa la reducción de nitratos a
nitritos; al no haber color se pasa a la fase 2 pues el microorganismo puede
haber reducido los nitratos a nitritos.
Fase 2: Positivo: No se desarrolla color.
Negativo: Aparición de color rojo debido a la reducción de los
nitratos por el zinc.
PRODUCCIÓN DE PIOCIANINA-FLUORESCENCIA:
1. Inocular del crecimiento de un tubo de TSI ó KIA, a los medios
Pseudomonas p y Pseudomonas F.
2. Incubar a 35C por 24-48 horas.
3. Observar la aparición de los colores característicos producidos por la
excreción de los pigmentos piocianina (azul) y/o fluoresceina) (amarillo-
verdoso iridiscente).
ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS:
1. Que otros reactivos pueden utilizarse para realizar la prueba de la oxidasa.
2. Cuál es la diferencia fundamental entre el reactivo de Kovacs para la
prueba de la oxidasa y el utilizado para la prueba del indol.
3. Cómo se interpretaría un desarrollo de color después de haber transcurrido
un minuto de haber agregado el reactivo de Kovacs a las colonias.
4. Que precauciones se deben de tomar al utilizar la prueba de la oxidasa
como indicadora de que existen especies de Pseudomonas en una placa.
5. Cual es el fundamento bioquímico involucrado en la prueba de OF y
porque se requiere de dos tubos, uno abierto y otro sellado.
6. Por qué es necesario realizar la prueba de reducción de nitratos en dos
fases y que cuidados deben de tenerse en su interpretación.
BIBLIOGRAFÍA
Manual DIFCO
Manual BBL.
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