Universidad de Sonora: División de Ciencias Biológicas Y de La Salud

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UNIVERSIDAD DE SONORA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS
DE
ANÁLISIS BACTERIOLÓGICOS

REALIZADO POR:

AZALEA LIZÁRRAGA C.
GRISELDA MORENO I.

1
HERMOSILLO, SONORA, MÉXICO.

Práctica No. 1
Obtención de un cultivo puro

Introducción
Una de las herramientas indispensables para el trabajo del laboratorio en el
área de microbiología, lo es sin duda la capacidad de poder aislar
perfectamente a un microorganismo a partir de mezclas de éstos, ya que
raramente en la naturaleza se encuentran poblaciones puras de
microorganismos. Sin esta habilidad, que se adquiere solamente con la
práctica diaria, no es posible ni siquiera pensar en la posibilidad de llegar a
trabajar con microorganismos, mucho menos querer identificarlos.

En la literatura correspondiente existen diversas “técnicas” que garantizan, con


la práctica, el desarrollo de esta habilidad, lo que nos permitiría fácilmente
sugerirle una para su uso en esta materia; más sin embargo, en nuestra
experiencia, consideramos que cada individuo debe elegir aquella que mejor
resultados le haya dado en su práctica cotidiana.

De suma importancia es también la habilidad que desarrolla un microbiólogo


para decidir el procedimiento a seguir en la identificación de un microorganismo
dadas las características macro y microscópicas que los cultivos presentan in
vitro. Por ello, el conocimiento de las diversas formas coloniales de crecimiento
y como se relacionan éstas con los diferentes géneros microbianos
comúnmente encontrados en situaciones o fluidos similares, la delicadeza y
atención que se imprime en el procedimiento de obtener tinciones y su
observación al microscopio, constituyen los pilares fundamentales sobre los
que se sustenta el trabajo, meticuloso y detallado que todo profesional enfrenta
en su práctica cotidiana.

Procedimiento.
1. Levante la tapadera de su caja petri (preparada con el agar
correspondiente para su utilización) lo suficientemente alto para que le

2
permita introducir el asa de inoculación y moverla libremente. Realice esto
con una sola mano.
2. Coloque una asada del microorganismo (caldo) cerca del borde del agar y
enseguida distribúyalo con movimientos de izquierda a derecha, hasta que
haya cubierto aproximadamente una cuarta parte de la placa.

Gire la placa aproximadamente 90 grados y empiece a estriar de nuevo,


teniendo cuidado de solo tocar una vez la parte anteriormente inoculada, hasta
cubrir de nuevo otra cuarta parte de la placa.

Repita este mismo procedimiento hasta que haya cubierto aproximadamente


90% del área de la superficie de la placa, lo cual se logra generalmente a la
cuarta vez.

3. Póngale nombre a su placa, utilizando para ello la parte que contiene el


agar.
4. Incube la placa en forma invertida para evitar que el agua de condensación
caiga sobre la superficie del agar y evite la formación de colonias discretas
o separadas.
5. Observe las características coloniales desarrolladas, teniendo especial
cuidado de anotar toda la información que considere relevante para la
posterior identificación del microorganismo.
6. Prepare un frotis para la tinción al gram.
Anote características morfológicas observadas, así como reacción al gram de
las mismas.

Nota: Si usted considera que su técnica para sembrar es diferente a ésta y le


ofrece mejores resultados, puede utilizarla.

Actividades Adicionales:

1.- Investigar:

3
a) Cuando menos tres diferentes técnicas con sus ventajas y
desventajas para el aislamiento de microorganismos a partir de
cultivos mixtos.
b) Las características coloniales comúnmente asociadas a su
crecimiento bacteriano; a un crecimiento fúngico.
2. Cuál es la ventaja de utilizar medios selectivos y/o diferenciales, sobre los
medios generales para el aislamiento de un microorganismo a partir de un
cultivo mixto.
3. Investigue cuáles son las hipótesis que existen para explicar la reacción al
gram y cuál de estas hipótesis tiene mayor peso en la comunidad científica.
4. Investigar lo que considere más importante de los medios de cultivo: Agar
nutritivo y caldo BHI.

4
Práctica No. 4
Aislamiento y caracterización de Staphylococcus sp

Introducción.
El género Staphylococcus, miembro de la familia Micrococcaceae,
comprende especies de gran importancia tanto en el aspecto clínico como en la
industria alimentaria, entre los que destacan S. aureus, S. epidermidis y S.
saprophyticus, causantes de intoxicaciones, infecciones de la piel, vejiga y
septicemias, entre otros problemas clínicos.

Son microorganismos catalasa positivo, en forma de cocos gram


positivos que se presentan agrupados en agregados irregulares o racimos, o
bien formando pequeñas cadenas.

Su crecimiento en medios sólidos está dado por colonias grandes,


circulares y convexas que varían en coloración desde blancas a amarillo
naranja, debido a la presencia de pigmentos carotenoides excretados por
algunos miembros del género.

S. aureus, la especie tipo, produce una gran cantidad de productos


extracelulares, entre los cuales se encuentran hemolisinas, coagulasa,
leucocidina y enterotoxina, que ayudan a la diferenciación entre especies. Otra
prueba bioquímica de suma importancia es la fermentación del manitol, la cual
es positiva para S. aureus.

En la industria alimentaria, es importante no solo el aislamiento e


identificación de S. aureus de alimentos involucrados en problemas de
intoxicación alimentaria, sino también, el poder determinar la presencia de la
toxina, lo cual requiere de técnicas inmunológicas como el método de
Outcherlony y la hemaglutinación, entre otros.

5
Procedimiento.
1. Hacer un frotis de la muestra proporcionada por el maestro de práctica y
realizar una tinción al gram. Observar cuidadosamente.
2. Inocular la muestra en los siguientes medios de cultivo: Agar tripticasa soya,
Staphylococcus 110 y/o agar sal manitol.
3. Incubar por 24 – 48 horas, a 35 – 37 C.
4. Observar las características coloniales en cada uno de estos medios.
5. Elegir una colonia típica de cocos gram (+) y realizar prueba de catalasa.
6. De la misma colonia tomar una muestra e inocular un tubo de BHI
incubándolo por 18 horas.
7. Realizar la prueba de coagulasa, utilizando el cultivo de BHI.
8. Reportar los resultados obtenidos y el microorganismo aislado y/o
identificarlo.

Prueba de la catalasa.
1. Tomar una pequeña cantidad de microorganismos del centro de una colonia
pura bien aislada y depositarla sobre un portaobjetos.
2. Agregar una gota de agua oxigenada al 30% sobre los microorganismos.
3. Observe la inmediata aparición de burbujas, lo cual se considera como
prueba positiva.

Nota: No utilizar colonias de placas de agar sangre.


No invierta el orden de la técnica, porque pueden obtenerse falsos
positivos.
No es necesario mezclar el microorganismo con el agua oxigenada.

Prueba de la coagulasa.
1. Agregue 0.5 mL de plasma de conejo a un tubo estéril de 13 x 100 mm.
2. Agregue 0.5 mL de un cultivo puro de staphylococcus sp. en BHI (18 horas).
3. Mezcle suavemente los contenidos para suspender el microorganismo. No
agite.
4. Hacer las observaciones cada 30 minutos por espacio de 4 horas.
5. Inclinar ligeramente el tubo para observar la aparición del coágulo, lo cual
se considera prueba positiva.
6
Actividades adicionales:
1. Investigar:
a) El fundamento selectivo y/o diferencial de los medios de cultivo
comúnmente utilizados para aislar Staphylococcus sp. de muestras
clínicas y alimentarias. Como lo son el agar sal manitol, Staphylococcus
110, Vogel y Johnson, Baird Parker, entre otros.
b) El fundamento bioquímico involucrado en la reacción de la catalasa,
coagulasa y fermentación del manitol; y las precauciones en su
realización.
c) La diferencia fundamental que existe entre la prueba de coagulasa en
porta y la de tubo.
2. Ilustre con un diagrama de flujo el procedimiento para aislar e identificar las
especies de Staphylococcus más comunes.

7
Práctica No. 5

Aislamiento y caracterización del género Streptococcus sp.

Introducción.
El género Streptococcus, pertence a la familia Streptococcaceae, la cual se
caracteriza por ser cocos gram positivos agrupados usualmente en forma de
cadenas, aisladas o en pares y por ser además anaerobios facultativos y
grandes productores de ácido láctico.

El género posee especies de suma importancia para el hombre, ya sea por el


tipo de infecciones y secuelas clínicas que produce (faringitis, glomerulonefritis,
fiebre reumática, endocarditis y septicemia, entre otras); como por la gran
utilidad que prestan en la industria alimentaria (elaboración de quesos, yoghurt,
etc.).

La especie típica, es S. pyogenes (estreptococo del grupo A), destacando


también por su importancia S. pneumoniae y S. faecalis en el campo de la
clínica y S. lactis y S. cremoris en la industria alimentaria.

Son microorganismos muy complejos antigénicamente, por lo que encontramos


varias clasificaciones serológicas, siendo las más importantes la clasificación
de Lancefield, que ayuda a su clasificación taxonómica y diagnóstica; y la
basada en la presencia de una proteína M específica de tipo, considerada
como el factor de virulencia más importante del género.

Producen una gran cantidad de productos extracelulares, tales como enzimas y


toxinas importantes en el proceso infeccioso o de transformación alimenticia.

Procedimiento.
1. Estriar la placa de agar sangre con las cepas proporcionadas.

8
2. Incubar a 37C por 24 horas. Debido a que los eritrocitos pueden lisarse con
una incubación prolongada a dicha temperatura, las placas deben de leerse
lo más rápidamente posible.
3. Examinar las placas y observar el desarrollo de las colonias y las zonas de
hemólisis. De ser posible, observar las colonias y zonas adyacentes con el
objetivo panorámico.
4. Hacer tinciones al gram de algunas colonias típicas alfa y beta hemolíticas.

9
PRACTICA No. 6
Aislamiento y caracterización de Enterococcus faecalis

Introducción.
En los últimos años, el aislamiento de E. Faecalis, tanto de fluidos corporales
como de alimentos y aguas, ha venido en aumento.

Dado su hábitat natural, el intestino de animales de sangre caliente, su


presencia es importante por considerarse un excelente indicador de la calidad
sanitaria de agua y alimentos, lo que hasta hace pocos años atrás sólo podía
evidenciarse con la búsqueda de coliformes, clásicos indicadores de
contaminación con materia fecal.

En el campo de la medicina, se ha documentado su importancia como


causante de problemas infecciosos en el tracto genitourinario, hecho explicable
dado la cercanía de este tracto con el gastrointestinal, sobre todo en la mujer.

El microorganismo esta clasificado como un enterococo alfa hemolítico, por lo


que en su aislamiento e identificación es necesario separarlo bioquímicamente
de los no enterococos, para posteriormente identificarlo como E. Faecalis y no
S. equinus.

Procedimiento.
1 Estriar la placa de agar sangre con las cepas proporcionadas.
2 Incubar a 37C por 24 horas. Debido a que los eritrocitos pueden lisarse
con una incubación prolongada a dicha temperatura, las placas deben
de leerse lo más rápidamente posible.
3 Examinar las placas y observar el desarrollo de las colonias y las zonas
de hemólisis. De ser posible, observar las colonias y zonas adyacentes
con el objetivo panorámico.
4 Hacer tinciones al gram de algunas colonias típicas alfa hemolíticas.
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5 Tomar el centro de una colonia e inocular un tubo de BHI que contenga
un 7.5% de NaCl.
6 Incube a 37C por 24 horas.
7 Anotar las observaciones.

Actividades adicionales, Investigar:


1. El fundamento bioquímico selectivo y diferencial del medio de bilis esculina
y mostrar imagen de resultado de E. Faecalis en este agar.
2. Cómo diferenicar bioquímica y/o serológicamente entre enterococos y no
enterococos.
3. Esquematizar con un diagrama de flujo como aíslas e identificas a E.
Faecalis de una muestra que contenga además S. equinus, S. bovis y S.
faecium.

11
PRACTICA No. 7

Aislamiento y caracterización de Streptococcus pneumoniae.

Introducción:
De los microorganismos alfa hemolíticos de interés en el campo de la clínica
destaca por su importancia, Streptococcus pneumonae, debido a que causa
pneumonía, septicemia y meningitis, principalmente. Su importancia en el
campo de los alimentos no está documentada.

Típicamente el microorganismo se caracteriza por ser gram positivo, de forma


ovoide o lanceolada, usualmente en forma de pares de cocos, aunque no es
poco común observar pequeñas cadenas de cocos en secresiones o cultivos
primarios; el microorganismo sufre autólisis espontánea, lo que dificulta,
algunas veces, su aislamiento en el laboratorio.

Las colonias pueden ser pequeñas, suaves y circulares o grandes y muy


mucoides, dependiendo del tipo de cepa aislado, y con una depresión en el
centro de las mismas.

Aunque sus requerimientos nutricionales son bastantes complejos, crecen


fácilmente en infusiones o agares que contengan 5% de sangre, lo que
además facilita su identificación.

Son considerados solubles en soluciones de sales biliares; su crecimiento se


ve inhibido ante la presencia de Optochin y fermentan la inulina, siendo estas
las principales reacciones bioquímicas de utilización diagnóstica.

Los cultivos puros de S. neumoniae se identifican por medio de la reacción de


Quellung (omnisuero).

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Procedimiento.
1. Se proporcionarán tubos o placas de Agar sangre o Todd-Hewwll
inoculados con S. pneumonae.
2. Inocular una placa de agar sangre con el microorganismo proporcionado e
incubar por 24 horas a 37C; de preferencia en un Gas-Pak.
3. Observar el tipo de colonia y hemólisis resultante sobre la placa.
4. Preparar el frotis de los cultivos y realice una tinción al gram y una para
tinción de cápsulas.
5. Las colonias sospechosas de ser S. pneumoniae se inocularán en un tubo
con caldo BHI (una colonia por tubo) y se incubarán a 37C por 18 horas.
6. Utilizando el crecimiento bacteriano obtenido en el paso anterior se
inoculará en forma masiva y con hisopo, en una placa de agar sangre recién
preparada (superficie húmeda) y deje reposar por 10 minutos
aproximadamente.
7. Colocar en la parte central de la placa anterior, un disco de Optochin ya
sea que hayan sido preparados al saturar discos de papel filtro con una
solución al 0.025% de hidrocloruro de trihidrocupreina o ethylhidrocupreina,
o los discos preparados comercialmente para tal efecto.
8. Incube a 37C por 24 horas y observe si hay o no crecimiento en el área
que rodea al disco.
9. Por otro lado transferir 1-2 asadas del crecimiento bacteriano obtenido en el
tubo con BHI, a un tubo que contenga 0.5mL de una solución al 2% de
desoxicolato y agite suavemente.
10. Observar el aclaramiento de la solución resultante producida por la lisis del
pneumococo con el detergente.
11. Anotar sus observaciones para la elaboración del reporte final.

Actividades Adicionales.
1. Investigar el fundamento de las siguientes reacciones bioquímicas:
a) Solubilidad en bilis.

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b) Inhibición ante optochin.
c) Reacción de Quellung.
d) Fermentación de la inulina.

Práctica No. 8
Aislamiento y caracterización de Neisseria sp.

Introducción:
El género Neisseria, perteneciente a la familia Neisseriaceae, es
considerado parte de la flora normal de las mucosas del hombre. Sin embargo,
se encuentran comprendidas especies de gran importancia médica, como lo
son N. Gonorrhoeae y N. Meningitidis, causantes principalmente de gonorrea y
meningitis, respectivamente.
Sus miembros son cocos gram negativos que se presentan usualmente
en pares con lados adyacentes aplanados, lo que les da una morfología
característica como de granos de café. La mayoría de las cepas patógenas al
hombre son encapsuladas. Aunque el género es considerado aeróbico, el
gonococo y el meningococo requieren de una concentración incrementada de
CO2 para su aislamiento inicial (del 4 al 8%), fácilmente obtenible con un Gas-
Pak; son fastidiosos nutricionalmente, teniendo requerimientos nutricionales
complejos (especialmente el gonococo) y una temperatura óptima de
crecimiento entre 36 y 39C, lo que les distingue de otras neisserias no
patógenas que crecen a temperaturas de hasta 22C.
Aunque pueden crecer en Agar chocolate, el medio de Thayer y Martín
(modificado o no con antibióticos) es considerado ideal para su desarrollo.
El género es oxidasa positivo ya que contienen niveles altos de
citocromo c oxidasa, y las reacciones confirmatorias para gonococo incluyen la
producción de ácido a partir de la glucosas, más no de fructosa o maltosa, así
como tinción de anticuerpos fluorescentes positiva. En el caso de
meningococo, la producción de ácido es a partir de la glucosa y maltosa.

Procedimiento.
1. Se proporcionará una cepa de Neisseria sp. En tubos con caldo nutritivo.

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2. Inocule una placa de agar chocolate, agar sangre o agar nutritivo e incube a
37C por 24 horas, bajo una atmósfera de CO 2 (jarra anaeróbica o Gas
Pak).
3. Observe los diferentes tipos de colonias que se desarrollan sobre el medio:
Las colonias de Neisseria consideradas patógenas para el humano, son
pequeñas y transparentes como gotas de rocío o bien son pequeñas,
circulares y de color blanco grisáceo; las no patógenas son coloridas (rosas,
amarillas, etc.).
Puede ser que al intentar removerlas del medio, esto se dificulte.

4. Aplique el reactivo de la oxidasa a una de tales colonias y haga frotis de


cuando menos 4 diferentes colonias oxidasa positiva.
5. Realice también una tinción de gram.
6. Por otra parte, se le proporcionarán unas preparaciones fijas de Neisseria
sp. Para que le sirvan como referencia.

PRUEBA DE LA OXIDASA:

a) Método de la gota.
Usando una pipeta capilar, agregue una gota de una solución al 1% de
hidroxicloruro de dimetil-p-feniendiamina (reactivo de Kovacs), sobre las
colonias.
Las colonias oxidasa positivas se tornarán rosas, luego púrpuras y
finalmente negras.
Tales células ya no son viables para subcultivarse pero pueden teñirse al
gram.

b) Método con la tira de papel.


Remueva una colonia o asada del microorganismo y deposítela sobre una
tira de papel filtro impregnada con el reactivo de Kovacs.
El papel donde se depositan las bacterias se volverá púrpura oscuro en
10-30 segundos.

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Actividades adicionales.

1. Investigar:
a) El fundamento selectivo y/o diferencial del agar Thayer y Martin.
b) El fundamento bioquímico involucrado en la prueba de la oxidasa.

2. Elaborar un diagrama de flujo que permita la separación de meningococo,


gonococo y dos especies más de Neisserias consideradas no patógenas
para el hombre, tales como N. Flavescens, N. Sicca, N. Lactamica, etc.

PRÁCTICAS No. 7-10


AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Introducción.
Entre los miembros de esta familia se encuentran comprendidos los
géneros bacterianos que más comúnmente se aíslan en todo laboratorio de
microbiología clínica. Es por ello, que se enfatiza tanto el estudio de las
características morfológicas, bioquímicas y serológicas que son requisito para
su aislamiento e identificación.
Son considerados habitantes naturales del tracto gastrointestinal del
hombre y de animales de sangre caliente, aunque se les encuentra también en
el agua, suelo y en plantas.
Su importancia fundamental estriba en el hecho de que pueden causar
serias infecciones en el hombre, tales como la fiebre tifoidea, plaga infecciones
gastrointestinales, urinarias, respiratorias, y bacteremia, entre otras. Son
considerados además los mejores indicadores de contaminación fecal y calidad
sanitaria de aguas y alimentos, por lo que su determinación en el laboratorio de
alimentos es considerado una práctica rutinaria.
Los miembros de la familia son bacilos gram negativos, oxidasa
negativa, fermentan la glucosa la mayoría producen catalasa y reducen los
nitratos a nitritos; las especies móviles presentan flajelos perítricos.
El aislamiento de ciertos géneros a partir de fluidos biológicos, obliga en
muchas situaciones al uso de caldos enriquecedores, junto con medios
diferenciales y selectivos, para incrementar así la posibilidad de aislamiento,
dado la gran cantidad de flora acompañante en estas muestras. Sin embargo,
para cumplir con los objetivos de las prácticas de análisis microbiológicos, su
uso no es necesario.

Procedimiento.
1. Inocule una placa de ENDO, MaConkey o EMB, con las muestras
proporcionadas.
2. Incube a 37C por 24 horas. Observe sus resultados.

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3. Tome del centro de una colonia colorida (lactosa positiva), o incolora
(lactosa negativa) e inoculen posteriormente los tubos necesarios para
realizar las pruebas bioquímicas del IMViC y otras necesarias.

PRUEBAS CON AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI) ó KIA.


1. Tomar del centro de la colonia única, con una aguja de inoculación e
inocule por picadura y estría, sin importar el orden.
2. Incube a 35C por 24 – 48 horas. Ni antes ni después.
3. Interprete los resultados
a) Fermentación de la glucosa únicamente: Reacción ácida (amarillo) en el
fondo del tubo; estría permanece roja.
b) Fermentación tanto de la glucosa como la sacarosa y la lactosa:
Reacción ácida en picadura y estría.
c) Producción de gas (aerogénico): Burbuja o burbujas en el medio,
ocurriendo a veces el deslizamiento del medio o muescas en el tubo.
d) Producción de H2S: Aparición de un precipitado negro en el fondo o
todo el tubo.

PRUEBA DE INDOL.
1. Agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs directamente a un cultivo de un
caldo con triptófano o peptona de 24-48 horas
2. Agitar suavemente el tubo. Observe los resultados.
Prueba positiva: Un anillo rojo en la superficie del medio
Prueba negativa: no se produce color, o bien toma el color del reactivo de
Kovacs.

PRUEBA DEL ROJO DE METILO


1. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo a 2.5 ml. De un caldo MR-VP
previamente inoculado e incubado por 24-48 horas a 37C.
2. Interpretar el resultado del color que se desarrolla inmediatamente:
Positiva: Color rojo en la superficie del medio,
Negativa: Color amarillo en la superficie del medio.

PRUEBA DE VOGES PROSKAUER


1. Utilice un cultivo de 24-48 horas en caldo MR-VP. A 2.5ml. de este caldo,
agregar primero 0.6ml. de una solución de alfa naftol al 5% y enseguida
agregar 0.2ml. de una solución de KOH al 40%.
2. Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxígeno a fin de oxidar
la acetoína producida.
3. Dejar reposar por lo menos 15 minutos, antes de interpretar los resultados.
Positiva: Rojo rosado en la superficie del medio.
Negativo: Amarillo en la superficie del medio.
PRUEBA DEL CITRATO
1. Estríe con un inóculo ligero un tubo con el medio de citrato de simmons.
2. Incube por 24-28 horas a 37C.
Positivo: Crecimiento del microorganismo y/o cambio del medio a un color
azul intenso.
Negativo: No se observa crecimiento ni cambio de color.

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PRUEBA DE LA UREASA.
1. Inocule densamente (2 ó 3 azadas) de un cultivo puro en TSI ó KIA, a un
caldo de urea de Stuart y agite suavemente el tubo para lograr la
suspensión de las bacterias en el caldo.
2. Incube a 35C en incubador o baño de agua.
3. observe a las 8, 12, 24 y 48 horas de incubación el cambio de color
producido.
Positivo: Color rojo rosado intenso en todo el caldo.
Negativo: No se produce cambios de color (amarillo ámbar).

PRUEBA DEL MALONATO.


1. Del crecimiento de un TSI ó KIA, inocule con 2 ó 3 azadas, un tubo de caldo
de malonato.
2. Incube a 35C por 24-48 horas.
3. Observe si existe crecimiento al final de la incubación y los cambios de color
desarrollados.
Positiva: Color azul claro a azul de prusia intenso en el caldo.
Negativo: No se observa cambio de color (verde claro) o se torna amarillo
(Fermentación de la glucosa).

PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO


1. Etiquete dos tubos como P (prueba) y C (control), los cuales contienen :
Tubo P: Caldo KCN básico con 0.5% de KCN.
Tubo C: Caldo KCN básico sin KCN.
2. Del crecimiento de un TSI, inocule ambos tubos e incube a 35C por 24-48
horas, pudiendo en ciertos casos necesitarse de incubaciones más
prolongados.
3. Observe si se desarrolla turbidez (crecimiento) en los tubos.
Positivo: Crecimiento en ambos tubos.
Negativo: Crecimiento solo en el tubo control.

PRUEBA DE DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS.


1. Del crecimiento de un cultivo puro de TSI, inocule en forma ligera un tubo
con el medio de descarboxilasa de moller al que se le agregarán los
aminoácidos correspondientes (lisina, ornitina o arginina), lisina
descarboxilasa de Falkow ó MIO.
2. Incube a 35 por 24-48 horas. Pudiendo necesitar incubarse hasta 4 días
más.
3. Procure cubrir el medio de moller, con 2-3ml. De vaselina o parafina estéril.
Cualquier aminoácido da los mismos resultados en el desarrollo de color.
Positivo: Púrpura turbio a un púrpura amarillento apagado.
Negativo: Color amarillo claro brillante (fermentación de la glucosa).

PRUEBA DE LA FENIL ALANINA DE AMINASA.


1. Inocule por estría un tubo inclinado de fenil alanina.
2. Incube de 18-24 horas a 37C.
3. Agregue de 4 a 5 gotas del reactivo de cloruro férrico.

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Positiva: Color verde en el pico de flauta y en el líquido de sinéresis.
Negativa: No se produce cambio de color; se mantiene amarillo por el color
del cloruro férrico.

Actividades adicionales:
Investigar:
1. El fundamento bioquímico involucrado en cada una de las reacciones
anteriores.
2. Las precauciones y/o limitaciones que tienen cada una de las pruebas
bioquímicas anteriores.
3. ¿Porque en el TSI se puede leer la fermentación de 2-3 carbohidratos al
mismo tiempo? ¿Cual es la diferencia con el KIA?
4. ¿Porque la aparición de un color negro evidencia la producción de H 2S y
que gases se producen en el TSI?
5. ¿Porque las reacciones en el TSI no deben de leerse antes de 18 horas?
Ni después de 24 horas.
6. ¿Qué otros reactivos pueden utilizarse para la prueba del indol y como se
afecta el procedimiento empleado en esta práctica?.
7. ¿Porque se pueden diferenciar microorganismos lactosa positivos y
lactosa negativos en las placas de ENDO, McConKey y EMB?.
8. Los cuidados y precauciones que deben de tomar al preparar el caldo de
KCN y al prepararse para descartar los tubos utilizados.
9. Ilustrar con un diagrama de flujo los pasos a seguir para separar
enterobacterias, lactosa positivas y lactosa negativas tomando en cuenta
primero las reacciones bioquímicas del TSI.

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PRÁCTICA No. 11
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE Pseudomonas sp.

Introducción.
Dentro del género pseudomonas se encuentran especies de interés para
el microbiólogo clínico, al ocasionar enfermedades específicas como
melloidosis (Pseudomonas pseudomallei) o actuando como patógenos
oportunistas en casos de quemaduras, infecciones post-operatorias,
septicemias, infecciones respiratorias y urinarias, por mencionar algunas
(Pseudomonas aeruginosa, ps. Maltopilla, principalmente). Para el
microbiólogo de alimentos, revisten especial importancia las especies
asociadas a pérdidas de productos cárnicos y cosméticos.
El género está caracterizado por ser bacilos gram negativos, móviles en
su mayoría por flagelos polares, oxidasa positivos y que algunas especies
excretan pigmentos como la ploclanina (.Ps. aeruginosa) y fluorescencia (Ps.
Fluorescens), entre otros. Son aerobios obligados, anaerogénicos; la mayoría
crece óptimamente a temperaturas de 35 a 37C, aunque existen especies que
pueden crecer a 4C, y que se asocian a casos de endotoxemía provocada por
la administración de fluidos intravenosos contaminados, lo que aunado al
hecho de que son relativamente resistentes a muchos germicidas utilizados en
hospitales, los hace ser microorganismos frecuentemente involucrados en
infecciones nosocomiales.

Procedimiento.
1. Inocule la muestra proporcionada de microorganismos a un agar
MacConkey o ENDO y una de agar sangre.
2. Incube por 18-24 horas a 35C.
3. Observe el tipo de colonias características que se desarrollan en ambas
placas.
Haga sus observaciones cuidadosamente:
Tipo de crecimiento colonial, producción de pigmentos y olores
particularmente en el agar sangre.
4. Realice un frotis y tíñalo al gram.
5. Realice la prueba de la oxidasa y catalasa.
6. Tome el centro de una colonia típica e inocule un tubo de TSI
7. Incube 18-24 horas y observe cuidadosamente la reacción característica
desarrollada.
8. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes.

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Prueba de la oxidasa.
1. Agregar 2 ó 3 gotas de reactivo de Kovacs a algunas colonias
sospechosas que se hayan desarrollado sobre la placa. Tenga cuidado
de no inundar la placa con el reactivo y de no invertirla.
2. Observar los cambios de color que se desarrollarán a los 10-15 seg.
Después de haber agregado el reactivo.
Positivo: La colonia toma un color rosado, pasa a marrón y luego a
negro.
Negativo: No se desarrolla color en las colonias.
Nota: Si va a utilizar las colonias oxidasas positivas para realizar las
pruebas bioquímicas, cuide de tomarlas cuando estén en la etapa de
color rosa, pues aquí todavía se presentan bacterias viables y al estar
negras las bacterias están muertas.

PRUEBA DE OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN.
1. Del crecimiento de un tubo de TSI ó KIA, inocular un par de tubos de OF
(medio básico de Hugh y Leifson que contiene un carbohidrato específico
en estudio).
2. Etiquetar un tubo ABIERTO y el otro SELLADO. El inóculo debe ser un
poco denso y teniendo cuidado de picar hasta casi el fondo de ambos
tubos.
3. Al tubo etiquetado como sellado, agregue de 1 a 2ml. De vaselina o
parafina líquida estéril, para excluir el oxígeno.
4. Incube 48 horas a 35C. En ciertos casos es necesario incubar de 3 a 4
días.
5. Observar y anotar la producción de ácido (amarillo) que se extiende sobre
el tercio superior del medio abierto.
Reacción de fermentación: Acidez completa en ambos tubos.
Aerogénico: Acido y gas en ambos tubos.
Movilidad: Crecimiento que se aleja de la línea de punción.

PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS.


1. Del crecimiento de un TSI ó KIA, inocular un tubo inclinado de agar con
nitrato, pH 6.8.
2. Incube de 12 a 24 horas a 35C.
3. Fase 1:
 Agregar los reactivos de nitrato antes de proceder a interpretar:
Agregar 1ml de reactivo A(alfa naftiamina al 0.5%) y 1ml de reactivo
B( dimetil-alfa-naftilamina al 0.6%)
 Un resultado positivo es la aparición de un color rojo dentro de los 60 seg.
De haber agregado el reactivo e indica una prueba completa.
 Si acaso no se aprecia color, se continúa en la fase 2 de la prueba.
4. Fase 2:
 Agregar directamente al tubo que contiene los reactivos A y B, una pizca de
zinc (aproximadamente 20mg) que debe estar exento de nitratos o nitritos;
 Observe aparición de color que puede presentarse a los 30 seg.

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Fase 1: Positivo: Color rojo en la fase 1 significa la reducción de nitratos a
nitritos; al no haber color se pasa a la fase 2 pues el microorganismo puede
haber reducido los nitratos a nitritos.
Fase 2: Positivo: No se desarrolla color.
Negativo: Aparición de color rojo debido a la reducción de los
nitratos por el zinc.

PRODUCCIÓN DE PIOCIANINA-FLUORESCENCIA:
1. Inocular del crecimiento de un tubo de TSI ó KIA, a los medios
Pseudomonas p y Pseudomonas F.
2. Incubar a 35C por 24-48 horas.
3. Observar la aparición de los colores característicos producidos por la
excreción de los pigmentos piocianina (azul) y/o fluoresceina) (amarillo-
verdoso iridiscente).

ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS:
1. Que otros reactivos pueden utilizarse para realizar la prueba de la oxidasa.
2. Cuál es la diferencia fundamental entre el reactivo de Kovacs para la
prueba de la oxidasa y el utilizado para la prueba del indol.
3. Cómo se interpretaría un desarrollo de color después de haber transcurrido
un minuto de haber agregado el reactivo de Kovacs a las colonias.
4. Que precauciones se deben de tomar al utilizar la prueba de la oxidasa
como indicadora de que existen especies de Pseudomonas en una placa.
5. Cual es el fundamento bioquímico involucrado en la prueba de OF y
porque se requiere de dos tubos, uno abierto y otro sellado.
6. Por qué es necesario realizar la prueba de reducción de nitratos en dos
fases y que cuidados deben de tenerse en su interpretación.

BIBLIOGRAFÍA

Pelczar, Jr.; Microbiología, cuarta Edición, 1997, Editorial McGraw.Hill, impreso


en México.

W. Koneman Elmer. 1988. Diagnostico Microbiológico. Editorial Medica


Panamericana, tercera Edición, Philadelphia, U.S.A., traducción de Nora G.
Merrof.

Jean F. Mac Faddin, Pruebas Bioquímicas para la Identificación de importancia


Clínica, Editorial Medica Panamericana, 1981, Baltimore.

Merck, Medios de Cultivo, 1994.

Manual DIFCO

Manual BBL.

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