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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú. Decana de América


Facultad de Medicina Veterinaria
Escuela Profesional de Medicina Veterinaria

Efecto citoprotector de dos antioxidantes frente al


estrés oxidativo inducido por el plaguicida aletrín en
células neuronales SH-SY5Y

TESIS
Para optar el Título Profesional de Médico Veterinario

AUTOR
Francisco Javier RETUERTO POLO

ASESOR
Dra. Mariella RAMOS GONZALEZ

Lima, Perú

2022
Reconocimiento - No Comercial - Compartir Igual - Sin restricciones adicionales

https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Usted puede distribuir, remezclar, retocar, y crear a partir del documento original de modo no
comercial, siempre y cuando se dé crédito al autor del documento y se licencien las nuevas
creaciones bajo las mismas condiciones. No se permite aplicar términos legales o medidas
tecnológicas que restrinjan legalmente a otros a hacer cualquier cosa que permita esta licencia.
Referencia bibliográfica

Retuerto F. Efecto citoprotector de dos antioxidantes frente al estrés oxidativo


inducido por el plaguicida aletrín en células neuronales SH-SY5Y [Tesis de
pregrado]. Lima: Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Medicina
Veterinaria, Escuela Profesional de Medicina Veterinaria; 2022.
Metadatos complementarios

Datos de autor

Nombres y apellidos Francisco Javier Retuerto Polo

Tipo de documento de identidad DNI

Número de documento de identidad 42714712

URL de ORCID Es opcional

Datos de asesor

Nombres y apellidos Mariella Ramos Gonzalez

Tipo de documento de identidad DNI

Número de documento de identidad 43068125

URL de ORCID https://orcid.org/0000-0001-9990-4074

Datos del jurado

Presidente del jurado

Nombres y apellidos Maria Vásquez Cachay

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 09945245

Miembro del jurado 1

Nombres y apellidos Fidel Francisco Suárez Aranda

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 10833645

Miembro del jurado 2

Nombres y apellidos Alexei Vicent Santiani Acosta

Tipo de documento DNI

Número de documento de identidad 10650758

Miembro del jurado 3

Nombres y apellidos Mariella Ramos Gonzalez

Tipo de documento DNI


Número de documento de identidad 43068125

Datos de investigación

B.2.1.1. Plantas medicinales con potencial


farmaceutico y productos naturales
Línea de investigación terapéuticos: (estudios fitioquímicos, estudios
toxicológicos, estudios farmacológicos,
procesos de su industrialización)

Biotecnología aplicada a la conservación,


Grupo de investigación sanidad y producción animal - BACSPA,
SANIGEN

Perú. Universidad Nacional Mayor de San


Marcos – UNMSM. Vicerectorado de
investigación y posgrado - VRIP.
Proyecto GI 2020
Código : A20080661
Titulo: Neuroprotección del extracto de maca
(Lepidium meyenii) frente al estrés oxidativo
inducido por herbicidas en células neuronales
Agencia de financiamiento SH-SY5Y
Periodo: 2020
Tipo de Investigación: Aplicada
Monto: S/. 30000.00
Facultad: Medicina Veterinaria
Línea de Investigación: Sanidad
Agropecuaria
Fecha de Inscripción: 19/09/2020
Resolución: 01686-R-20
Edificio: FMV-UNMSM
País: Perú
Departamento: Lima
Ubicación geográfica de la Provincia: Lima
investigación Distrito: San Borja
Calle: (según corresponda)
Latitud: -12.081507
Longitud: -76.987423
Año o rango de años en que se
Junio 2019 – febrero 2020
realizó la investigación
Ciencia veterinaria
https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#4.03.01
URL de disciplinas OCDE
Biología celular, Microbiología
https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Universidad del Perú, Decana de América
Facultad de Medicina Veterinaria
Escuela Profesional de Medicina Veterinaria

ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS EN MODALIDAD VIRTUAL


PARA OPTAR EL TÍTULO DE MEDICO VETERINARIO
Autorizado por R.D N° 304-D-FMV-2020

1. FECHA DE LA SUSTENTACIÓN 28/12/2022

HORA INICIO: 12:00 m.

HORA TÉRMINO: 1:57 pm.

2. MIEMBROS DEL JURADO

PRESIDENTE: MV. Dra. Vásquez Cachay, María Elith

MIEMBRO: MV. Dr. Suárez Aranda, Fidel Francisco

MIEMBRO: MV. Dr. Santiani Acosta, Alexei Vicent

ASESORA: MV. Dra. Ramos Gonzalez, Mariella

3. DATOS DEL TESISTA

APELLIDOS Y NOMBRES: RETUERTO POLO, FRANCISCO JAVIER

CÓDIGO:01112683.

R.R. DE GRADO DE TESISTA NÚMERO: N° 01301-R-07

TÍTULO: <EFECTO CITOPROTECTOR DE DOS ANTIOXIDANTES FRENTE AL ESTRÉS OXIDATIVO


INDUCIDO POR EL PLAGUICIDA ALETRIN EN CÉLULAS NEURONALES SH-SY5Y=

4. RECOMENDACIONES

__________________________________________________________

Datos de la plataforma virtual institucional del acto de sustentación:

Grabación archivada en:


https://drive.google.com/file/d/1JcqjzdZXN3PYYvJUjo3w_V-D0rm9SFIJ/view?usp=sharing

5. NOTA OBTENIDA: 14, CATORCE.

Página 1 de 4
6. PÚBLICO ASISTENTE: (Nombre, apellido y DNI)

Nombres y
DESCRIPCIÓN N° DNI Correo electrónico
Apellidos

Francisco
TESISTA 1 Retuerto franciscoretuerto@gmail.com
Polo

María
2 Vásquez mvasquezc@unmsm.edu.pe
Cachay

Mariella
3 Ramos mramosgo@unmsm.edu.pe
Gonzalez
JURADO
Francisco
4 Suárez fsuareza@unmsm.edu.pe
Aranda

Alexei
5 Santiani asantiania@unmsm.edu.pe
Acosta

Víctor Hugo
6 Castillo 40723051 vcastillod@unmsm.edu.pe
Doloriert

Faride
9 Altamirano 43695598 faltamiranoz@unmsm.edu.pe
Zevallos

Raúl Lucas
13 42249664 jlucasl@unmsm.edu.pe
Lopez

Zoyla Mirella
15 Clavo 07717043 zclavop@unmsm.edu.pe
Peralta
COMITÉ DE
SUSTENTACIONES
Mary
Consuelo
17 72217008 mary.sanchez@unmsm.edu.pe
Sánchez
Chumbe

Maria
Antonia
18 72284500 maria.yupanqui1@unmsm.edu.pe
Yupanqui
Pimentel

Leonardo
Jesus
19 10728715 leonardo.giraldo@unmsm.edu.pe
Giraldo
Bardalama

Página 2 de 4
Luis Alberto
20 Inostroza 18089817 linostrozar@unmsm.edu.pe
Ruiz

Junior
21 Francisco 70798064 Junior.siguas@unmsm.edu.pe
Siguas Peña

Carlos
Alberto
22 47488243 carloss.vch@gmail.com
Villaorduña
Chafloque

Medalith
23 Gretel Sierra 73257866 medalith.sierra@unmsm.edu.pe
Marquina

Claudia
Valeria
24 71220558 claudia.nunez1@unmsm.edu.pe
Nuñez La
Torre

Carmen
25 Mirella Polo
Rincón

Carmen
26
Retuerto

Mariela
27 Ramos
Ipanaque
INGRESARON SIN
INSCRIBIRSE Max Hansel
28 De La Cruz
Perez

Paola
29 Berríos
Ledesma

Juan
30 Olazabal
Loayza

Andrés
INFORMÁTICA 31 informatica.fmv@unmsm.edu.pe
Trujillo Peña

Página 3 de 4
7. FIRMAS DE LOS MIEMBROS DEL JURADO

8.

Firmado digitalmente por VASQUEZ


CACHAY Maria Elith FAU
20148092282 soft
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 03.03.2023 15:48:38 -05:00

Firma

MV. Dra. Vásquez Cachay,


María Elith

Apellidos y Nombres

PRESIDENTE

Firmado digitalmente por SANTIANI


Firmado digitalmente por SUAREZ ACOSTA Alexei Vicent FAU
ARANDA Fidel Francisco FAU 20148092282 soft
20148092282 soft Motivo: Soy el autor del documento
Motivo: Soy el autor del documento Fecha: 03.03.2023 15:30:15 -05:00
Fecha: 03.03.2023 16:30:24 -05:00

Firma Firma
Firma

MV. Dra. Ramos Gonzalez, MV. Dr. Suárez Aranda, MV. Dr. Santiani Acosta,
Mariella Fidel Francisco Alexei Vicent

Apellidos y Nombres Apellidos y Nombres Apellidos y Nombres

ASESOR DE LA TESIS MIEMBRO JURADO MIEMBRO JURADO

Página 4 de 4
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
Facultad de Medicina Veterinaria
Escuela Profesional de Medicina Veterinaria
ep.veterinaria@unmsm.edu.pe
<AÑO DE LA UNIVERSALIZACIÓN DE LA SALUD=

INFORME DE EVALUACIÓN DE ORIGINALIDAD

Tesis para optar el título profesional de Médico Veterinario

1. Facultad: Medicina Veterinaria


2. Escuela: Medicina Veterinaria
3. Autoridad académica que emite el informe de originalidad: Escuela Profesional de
Medicina Veterinaria.
4. Apellidos y Nombres de la Autoridad Académica: Santiani Acosta, Alexei Vicent
5. Operador del Programa Informático de similitudes: Sandoval Monzón Rocío Silvia.
6. Documento evaluado: <Efecto citoprotector de dos antioxidantes frente al estrés oxidativo
inducido por el plaguicida aletrin en células neuronales SH-SY5Y=
7. Autor del documento: Retuerto Polo, Francisco Javier
8. Fecha de recepción del documento: 26 de julio del 2021
9. Fecha de aplicación del programa informático: 02 de agosto del 2021
10. Software utilizado
- Turnitin
11. Configuración del programa detector de similitudes:
- Excluye textos entrecomillados
- Excluye bibliografía
- Excluye cadenas menores de 40 palabras
- Exclusión de fuentes para buscar similitud
12. Porcentaje de similitudes según programa detector de similitudes: 8%
13. Fuentes originales de similitudes encontradas:
- FUENTES DE INTERNET 3%
- PUBLICACIONES 7%
- TRABAJOS DEL ESTUDIANTE 0%
14. Observaciones: el mayor porcentaje de las similitudes halladas en la tesis evaluada se
encuentra en la sección revisión bibliográfica.
15. Calificación de originalidad:
DOCUMENTO CUMPLE CRITERIOS DE ORIGINALIDAD, SIN OBSERVACIONES
16. Fecha del informe: 06 de marzo del 2023
Firmado digitalmente por SANTIANI
ACOSTA Alexei Vicent FAU
20148092282 soft
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 07.03.2023 10:10:37 -05:00

Dr. Alexei Vicent Santiani Acosta


Director EPMV
ÍNDICE

RESUMEN .................................................................................................................................... 6

ABSTRACT .................................................................................................................................. 7

I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 8

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 9

II.1. PIRETROIDES .................................................................................................................. 9

II.1.1. Generalidades........................................................................................................ 9

II.1.2. Mecanismo de acción .......................................................................................... 10

II.1.3. Clasificación ......................................................................................................... 12

II.1.4. Toxicidad en mamíferos ...................................................................................... 13

II.1.5. Usos ..................................................................................................................... 14

II.1.5.1. Usos agrícolas .............................................................................................. 14

II.1.5.2. Usos veterinarios ......................................................................................... 14

II.2. PIRETROIDE ALETRÍN.................................................................................................... 14

II.2.1. Estructura ............................................................................................................ 14

II.2.2. Propiedades químicas y físicas ............................................................................ 15

II.2.3. Toxicidad del piretroide aletrín ........................................................................... 16

II.3. ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR PLAGUICIDAS ...................................................... 18

II.3.1. Permetrina (PER) ................................................................................................. 18

II.3.2. Deltametrina........................................................................................................ 19

II.3.3. Fipronil (FIP) ........................................................................................................ 21

II.4. CITOPROTECTORES ...................................................................................................... 22

II.4.1. Melatonina (MLT) ................................................................................................ 22

II.4.2. Silibina ................................................................................................................. 24

III. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 27

III.1. LUGAR DE EJECUCIÓN .................................................................................................. 27

III.2. MATERIALES Y EQUIPOS .............................................................................................. 27

2
III.2.1. Materiales............................................................................................................ 27

III.2.2. Reactivos ............................................................................................................. 27

III.2.3. Equipos ................................................................................................................ 28

III.3. DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 28

III.3.1. Línea celular y condición de cultivo..................................................................... 28

III.3.2. Tratamientos ....................................................................................................... 29

III.3.3. Ensayo de viabilidad celular (Ensayo MTT) ......................................................... 30

III.3.4. Determinación de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS).......... 31

III.3.5. Expresión de genes vinculados al estrés oxidativo por medio de PCR en tiempo
real. ...................................................................................................................... 31

III.3.6. Análisis de resultados. ......................................................................................... 33

IV. RESULTADOS ........................................................................................................... 34

IV.1. ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR (ENSAYO MTT) ....................................................... 34

IV.1.1. Evaluar el efecto de los antioxidantes melatonina y silibina frente a la


citotoxicidad producidos por el piretroide aletrín en células de neuroblastoma
SH‑SY5Y................................................................................................................ 34

IV.1.2. Evaluar el efecto de los antioxidantes melatonina y silibina sobre la producción


de ROS inducidos por el piretroide aletrín en células de neuroblastoma SH‑SY5Y.35

IV.1.3. Evaluar el efecto de los antioxidantes melatonina y silibina sobre la alteración de


la expresión de genes (NFkB1, Nrf2, SOD2 y GPX1) en células de neuroblastoma
SH‑SY5Y inducidos por el piretroide aletrín. ....................................................... 36

V. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 40

VI. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 44

VII. LITERATURA CITADA ............................................................................................ 45

VIII. APÉNDICE .................................................................................................................. 59

VIII.1. Resultados .................................................................................................................... 59

VIII.1.1. Resultados (%) de tratamiento con melatonina y silibina frente a la citotoxicidad


producidos por el piretroide aletrín en células de neuroblastoma SH‑SY5Y ...... 59

3
VIII.1.2. Resultados (Unidades fluorescentes) de tratamiento con melatonina y silibina
sobre la producción de ROS inducidos por el piretroide aletrín en células de
neuroblastoma SH‑SY5Y. ..................................................................................... 59

VIII.1.3. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la alteración de la


expresión de genes NFkB1 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por el
piretroide aletrín. ................................................................................................ 60

VIII.1.4. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la alteración de la


expresión de genes Nrf2 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por el
piretroide aletrín. ................................................................................................ 60

VIII.1.5. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la alteración de la


expresión de genes SOD2 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por el
piretroide aletrín. ................................................................................................ 61

VIII.1.6. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la alteración de la


expresión de genes GPX1 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por el
piretroide aletrín. ................................................................................................ 61

4
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Clasificación de piretroides según su estructura química y al síndrome que producen 13


Figura 2. Estructura química del piretroide aletrín 15
Figura 3. Esquema del diseño experimental 30
Figura 4. Citotoxicidad inducida por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y y efecto citoprotector de melatonina (MEL, 1
μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24 horas. 34
Figura 5. Estrés oxidativo (Producción de ROS) inducido por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y y efecto antioxidante
de MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24 horas. 35
Figura 6. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular NFkB1) inducido por aletrín (25 μM) en SH-
SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación
de 24 horas. 36
Figura 7. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular Nrf2) inducido por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y
e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24
horas. 37
Figura 8. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular SOD2) inducido por aletrín (25 μM) en SH-
SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación
de 24 horas. 38
Figura 9. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular GPX1) inducido por aletrín (25 μM) en SH-
SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación
de 24 horas. 39

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Piretrinas y piretroides Tipo I y II ............................................................................................ 10

Tabla 2 Propiedades físico-químicas del piretroide insecticida aletrín. (Pubchem, 2020) .................... 16

Tabla 3 Secuencia de primers forward y reverse para genes relacionados a estrés oxidativo e
inflamación&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&...32

5
RESUMEN

Los piretroides son compuestos sintéticos de amplio uso en la actividad agropecuaria. Estos

compuestos pueden resultar peligrosos para la salud humana y animal por producir signos clínicos

de índole nerviosa, por lo que resulta importante un mayor conocimiento sobre la reversión del daño

a nivel celular causados por la intoxicación con estos plaguicidas químicos. Debido a esto, nuestro

estudio tuvo como objetivo evaluar la citoprotección de los antioxidantes melatonina y silibina frente

al efecto citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín, primer piretroide sintético, en las células de

neuroblastoma SH-SY5Y, modelo in vitro usado ampliamente en investigaciones vinculadas con

estrés oxidativo, citotoxicidad y enfermedades neurodegenerativas. Para eso evaluamos el efecto del

piretroide aletrín solo y en co-incubación simultánea con melatonina o silibina sobre la viabilidad

celular (a través del ensayo con sales de tetrazolio - MTT), sobre la producción de especies reactivas

de oxígeno (ROS) y sobre la expresión de genes relacionados a estrés oxidativo (Nrf2, NFkB1, SOD2

y GPX1). Nuestro estudio demostró que los antioxidantes melatonina y silibina presentan un efecto

citoprotector frente al efecto citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín en las células SH-SY5Y,

ambos antioxidantes muestran una capacidad para inhibir el incremento de los valores de ROS, así

como detener la disminución de la viabilidad celular en células SH-SY5Y incubadas con aletrín, y

con respecto a la alteración de la homeostasis oxidativa producido por aletrín en la línea SH-SY5Y

a través de genes implicados en vías de señalización de estrés oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2

y GPX1, la silibina parece mostrar un mayor efecto protector sobre este efecto.

Palabras clave: Aletrín, citotoxicidad, efecto citoprotector, silibina, melatonina.

6
ABSTRACT

Pyrethroids are synthetic compounds widely used in agricultural activity. These compounds

can be dangerous for human and animal health because they produce clinical signs of a nervous

nature, which is why greater knowledge about the reversal of damage at the cellular level caused by

poisoning with these chemical pesticides is important. Due to this, our study aimed to evaluate the

cytoprotection of the antioxidants melatonin and silybin against the cytotoxic effect caused by the

pyrethroid allethrin, the first synthetic pyrethroid, in SH-SY5Y neuroblastoma cells, an in vitro

model widely used in research related to oxidative stress, cytotoxicity and neurodegenerative

diseases. For this, we evaluated the effect of the pyrethroid allethrin alone and in simultaneous co-

incubation with melatonin or silybin on cell viability (through the assay with tetrazolium salts -

MTT), on the production of reactive oxygen species (ROS) and on the expression of genes related to

oxidative stress (Nrf2, NFkB1, SOD2 and GPX1). Our study demonstrated that the antioxidants

melatonin and silybin have a cytoprotective effect against the cytotoxic effect caused by the

pyrethroid allethrin in SH-SY5Y cells. Both antioxidants show an ability to inhibit the increase in

ROS values, as well as stop the decrease in ROS. cell viability in SH-SY5Y cells incubated with

allethrin, and regarding the alteration of oxidative homeostasis produced by allethrin in the SH-SY5Y

line through genes involved in oxidative stress signaling pathways such as NFkB1, Nrf2, SOD2 and

GPX1, silybin seems to show a greater protective effect on this effect.

Keywords: allethrin, cytotoxicity, cytoprotective effect, silybin, melatonin.

7
I. INTRODUCCIÓN

Los diversos plaguicidas y fitosanitarios sintéticos usados en la industria agropecuaria han

demostrado ser eficientes en la mejora de cultivos y la sanidad animal, de ahí su amplio uso en el

mundo. Dentro de este grupo de compuestos insecticidas encontramos a los piretroides que son

análogos sintéticos de las piretrinas naturales y que al pasar del tiempo han ido reemplazando a otros

plaguicidas por su eficacia y seguridad en su uso (Casida, 1980).

Los compuestos piretroides han ido mejorando en el tiempo y en la actualidad se cuentan

con dos tipos (Tipo I y Tipo II) de acuerdo a su clasificación estructural química (Soderlund et al,

2002, Bradberry et al., 2005). En el grupo de compuestos piretroides sintéticos tenemos al aletrín

que es un insecticida piretroide tipo I, usado ampliamente en el mundo en agricultura, ganadería y

salud pública (Schechter et al, 1949).

El mecanismo de acción de aletrín, así como del resto de piretroides sintéticos, implica la

prolongación del tiempo de apertura de canales de sodio dependientes de voltaje, lo que ocasiona un

aumento de los ciclos despolarizantes de las células neuronales, lo que se manifiesta en signos

clínicos de relación nerviosa como salivación, incoordinación motora, temblores entre otros, en

mamíferos (Narahashi, 1992)

Hace algunos años se creía que los piretroides, al haber reemplazado a otros plaguicidas

como organofosforados, eran los más seguros en el mercado; sin embargo, en la actualidad se viene

demostrando su peligrosidad para salud de humanos y animales, así como su impacto en el ambiente

(Kupferschmidt, 2016)..

Por estos motivos, nuestro estudio tiene como objetivo evaluar la citoprotección de dos

antioxidantes (melatonina y silibina) frente al efecto citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín

en células de la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y. Para eso evaluamos el efecto resultante

del piretroide aletrín solo y en co-incubación con melatonina o silibina sobre la viabilidad celular,

8
sobre la producción de ROS, por sus siglas en inglés, reactive oxygen species (especies reactivas de

oxígeno) y sobre la manifestación de genes vinculados al estrés oxidativo (Nrf2, NFkB1, SOD2 y

GPX1). Nuestro estudio pretende demostrar la capacidad citoprotectora que tienen estos dos

antioxidantes frente al piretroide aletrín como una alternativa viable de profilaxis frente a la creciente

presentación de enfermedades neurotóxicas por plaguicidas.

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

II.1. PIRETROIDES

II.1.1. Generalidades

Los insecticidas piretroides son derivados sintéticos del insecticida natural pyrethrum,

utilizado en Asia y Persia antes del siglo XX (McLaughlin, 1973; Taplin, 2011), extraído del

Chrysanthemum cinerariaefolium, y en el cual se pueden identificar a las piretrinas, seis ésteres

insecticidas fotolábiles tóxicos para los insectos (Casida, 1980; Coats, 1990; Soderlund, 2012).

Los ésteres cetoalcohólicos de los ácidos crisantémico y piretroico confieren sus propiedades

insecticidas a las piretrinas. Estos compuestos de naturaleza fuertemente lipofílica son capaces de

penetrar en el cuerpo de los insectos rápidamente y producir una toxicosis. Las piretrinas naturales

presentan fotosensibilidad extrema, descomponiéndose en horas, por lo que no llegan a acumularse

de forma suficiente en el organismo de los insectos para poder matarlos. Se han realizado interesantes

avances durante la última década en referencia a la modificación de la estereoquímica, la estructura

y las formulaciones para desarrollar mejores compuestos (piretroides) que presenten rendimiento

biológico y propiedades químicas adecuadas para el sector agrario. Es así que se han producido la

adición del grupo ciano en el resto de alcohol, las halogenaciones de la cadena lateral de ciclopropano

de la molécula de piretrina, la mezcla de isómeros ópticos y geométricos, y las formulaciones de

grado técnico (las cuales contienen 85% o más de los ingredientes activos), compuesto con solventes

y portadores (Soderlund et al , 2002; Kaviraj y Gupta, 2014).

Terminada la segunda guerra mundial, las piretrinas fueron reemplazadas por insecticidas

más económicos y estables, los cuales estaban compuestos por los organoclorados y los

9
organofosforados, pero en la década de los 1970, por aspectos ligados a la conservación ambiental y

a la toxicidad relacionada con los vertebrados, se observó el retorno de las piretrinas y el desarrollo

de derivados sintéticos más estables y potentes: los piretroides (Valentine, 1990).

Los piretroides presentan un potente efecto neurotóxico en insectos en comparación a los

mamíferos (Narahashi et al., 1995), mostrando rápidamente signos de intoxicación (pérdida de

coordinación del movimiento, convulsiones y parálisis final), que indican acción a nivel del sistema

nervioso (Soderlund y Bloomquist, 1989).

Tabla 1 Piretrinas y piretroides Tipo I y II

Piretrinas Piretroides
Ésteres del ácido Ésteres del ácido Ésteres sin el grupo α Ésteres con el grupo α
crisantémico pirétrico ciano ciano
Tipo I Tipo II
Piretrina I Piretrina II 1º generación 3º generación
Aletrín Fenvalerato
Cinerina I Cinerina II 2º generación 4º generación
Resmetrín
Jasmolina I Jasmolina II 3º generación Cialotrín
Permetrín Cipermetrina
4º generación Deltametrin
Bifentrín
(Kaviraj y Gupta, 2014)

En 1949, se sintetizó el aletrín, el primer piretroide, en el Departamento de Agricultura de

los Estados Unidos (Schechter et al, 1949). Posterior a esto y de acuerdo a su estructura, estos se

clasificaron en piretroides tipo I, sin la adición de un grupo α-ciano (entre los cuales se encuentra el

aletrín), y piretroides tipo II, que contienen el grupo α-ciano, lo cual le confiere un mayor poder

neurotóxico que los de tipo I (Soderlund et al, 2002, Bradberry et al., 2005).

II.1.2. Mecanismo de acción

El mecanismo de acción de los piretroides involucra la hiperexcitación como resultado de la

modificación de la cinética de los canales de sodio dependientes de voltaje, que moderan el aumento

transitorio de la permeabilidad del sodio de la membrana de las células excitables (Narahashi, 1971,

10
1972, 1992; Narahashi et al., 1992). Se ha observado que los piretroides prolongan el tiempo de

apertura de canales de sodio sensibles al voltaje como resultado de la reducción de la tasa de cierre

y por inducir actividad repetitiva intensa en órganos sensibles y en fibras nerviosas desmielinizadas

(Vijverberg et al., 1982; Yamamoto et al., 1983; Holloway et al., 1989). Asimismo, se ha observado

diferentes efectos a nivel de canales de iones sodio, calcio y cloruro con los piretroides Tipo I, no α-

ciano y los piretroides Tipo II, α-ciano (Breckenridge et al., 2009).

De acuerdo a los estudios de Narahashi (1992) en ratas describió que en dos tipos de canales

de sodio se observa una gran sensibilidad diferencial a los piretroides. Las neuronas del ganglio de

las raíces dorsales de la rata presentaban dos tipos de canales de sodio, uno insensible a la acción

bloqueadora de la tetrodotoxina (TTX) y el otro sensible a TTX. Dos piretroides, uno de tipo I

(aletrín) y el otro de tipo II (deltametrina), mostraron a nivel del canal de sodio que presentaba

resistencia a TTX eficacia para prolongar la corriente de sodio, aunque solo presentaron un pequeño

efecto en el canal de sodio sensible a TTX. Ambos canales de sodio mostraron diferencias en sus

propiedades fisiológicas, las que incluyen el voltaje de activación y la inactivación en estado estable,

y el curso temporal de la corriente.

Estudios en genética molecular referente a los mecanismos de resistencia a los piretroides,

que incluyen sensibilidad nerviosa reducida, han permitido confirmar que los canales de sodio

sensibles al voltaje son sus principales sitios de acción (Soderlund y Knipple, 2003).

De igual manera, los piretroides tipo II, en preparaciones de cerebro de mamíferos, son

capaces de unirse y bloquear receptores GABA. Este bloqueo tiene un efecto neuroexcitador

indirecto el cual implica la eliminación de la entrada neuronal inhibitoria, así como ser el modo de

acción que se ha establecido para convulsivos como la picrotoxinina. In vivo, se ha observado

consistencia entre la acción en los receptores GABA con los signos excitadores de intoxicación por

piretroides. La acción que presentan los piretroides a nivel de los receptores GABA, para los

isómeros neurotóxicos de los compuestos de α-ciano, es de tipo estéreo-selectivo, aunque no presenta

11
la estereoespecificidad absoluta esperada debido a las relaciones estructura-toxicidad. En sistemas

experimentales en los que los efectos sobre los receptores GABA y los canales de sodio pueden

ensayarse en la misma preparación, no se observa bloqueo del receptor GABA a concentraciones de

piretroide que alteran la función del canal de sodio (Abalis et al., 1986; Soderlund et al., 2010).

Para el caso de la deltametrina, se ha reportado que esta no tiene efectos sobre la actividad

de los receptores de canal GABA (Ogata, 1988), por lo que la discrepancia con la reportes previos

sugeriría que el sistema GABA está involucrado en intoxicación por deltametrina solo en altas dosis

(Bloomquist y Soderlund, 1985) La escasa correlación entre las potencias de los piretroides para

inhibir la función del receptor GABAA y sus toxicidades, incluso entre los piretroides de tipo II,

sugiere que el receptor GABAA no es un objetivo primario crítico para la toxicidad de los piretroides.

Sin embargo, la potencia de los piretroides para inhibir la función del receptor GABAA y su

estereoespecificidad abogan por una acción específica sobre el receptor GABAA como un objetivo

secundario que contribuye a la toxicidad de ciertos piretroides (Ramadan et al., 1988).

La descripción inicial de los síndromes de intoxicación CS (coreoatetosis-salivación) y T

(tremor), que siguen a la administración intracerebral de piretroides en ratones muestran que el

síndrome CS fue similar a los signos de intoxicación producida por administración intracerebral de

picrotoxinina (Lawrence y Casida, 1982).

II.1.3. Clasificación

Los piretroides se encuentran clasificados en dos subgrupos (Tipo I y Tipo II)

fundamentados según los signos de intoxicación que producen (Barnes y Verschoyle, 1974; Gammon

et al., 1981; Lawrence y Casida, 1982; Verschoyle y Aldridge, 1980), y de acuerdo a su conformación

química, es decir si llevan o no un grupo α-ciano (Elliott et al., 1974).

Los piretroides tipo I producen una intoxicación conocida como el <Síndrome T=, en el cual

en ratas se presentó con comportamiento agresivo, ataxia, hiperexcitación, temblores en todo el

12
cuerpo, convulsiones; mientras que los piretroides tipo II poseen un grupo α-ciano en su molécula y

producen una intoxicación denominada <Síndrome CS= y en la que se presentan coreoastetosis y

salivación (Lawrence y Casida, 1982; Verschoyle y Aldridge, 1980; Verschoyle y Barnes, 1972),

aunque algunos piretroides tipo II exhiben signos de ambos síndromes (Soderlund et al., 2002)

(Figura 1).

Tipo I – No ciano Tipo II – α-ciano

Síndrome T Síndrome CS

Temblor Salivación profusa

Agresividad Coreoatetosis

Incoordinación Incoordinación

Irritabilidad Masticación

Postración Hiperactividad

Muerte Muerte

Figura 1. Clasificación de piretroides según su estructura química y al síndrome que producen

(Lawrence y Casida, 1982, y Soderlund 2002)

II.1.4. Toxicidad en mamíferos

Las corrientes de cola inducidas por la permetrina para la descomposición de Para / TipE

disminuyen al menos 100 veces más lentamente que las observadas en estudios de canales de sodio

de mamíferos o invertebrados marinos. Esto sugiere que la toxicidad selectiva de los insecticidas

piretroides se debería en parte a la gran afinidad de los piretroides a los canales de sodio de los

insectos que los correspondientes a los mamíferos (Warmke et al., 1997).

En mamíferos se han descrito dos síndromes distintos de intoxicación; el síndrome T

producido por los primeros piretroides se caracteriza por presentar temblores similares a los que se

13
observan a los producidos por DDT; el síndrome CS, producido por piretroides más avanzados, se

caracteriza por convulsiones sinuosas con retorcimientos (coreoatetosis), acompañado de salivación

profusa conocido como Síndrome CS (Verschoyle y Aldridge, 1980).

Estudios en ratas (EPA, 2009; Ray y Forshaw, 2000; Wolansky y Harrill, 2008), se han

observado en casos de intoxicación: temblor fino severo, reflejo de hiperexcitabilidad marcado,

activación simpatética y parestesia (en exposición dérmica), postración y conducta agresiva, y

efectos neuromecánicos en los cerebros de ratas (Hossain et al., 2005).

II.1.5. Usos

II.1.5.1. Usos agrícolas

La utilización de los piretroides en la agroindustria es muy elevada. Durante el 2014, este

grupo de insecticidas se encontraba en el segundo lugar en la lista de insecticidas más usados a nivel

mundial (Zhang, 2018).

II.1.5.2. Usos veterinarios

En referencia al uso veterinario, desde la década de 1970 y años posteriores, se observó el

potencial de este grupo de insecticidas en el tratamiento topical de ectoparásitos, como ácaros,

garrapatas, pulgas, etc (Breese, 1977; Casida et al., 1983; Lemke, et al., 1989; Nolan et al., 1979;

Stubbs, et al., 1982). Asimismo, este tratamiento está ampliamente difundido, tanto en animales de

compañía, así como en los destinados a consumo humano, en diferentes formulaciones, como pour

on, sprays, shampoos, polvos, aerosoles, otros (Anadón et al., 2009).

II.2. PIRETROIDE ALETRÍN

II.2.1. Estructura

14
El aletrín es el primer piretroide descubierto y pertenece al Tipo I. El nombre IUPAC

(Pubchem, 2020) de este compuesto es: [(2-metil-4-oxo-3-propil-2-enilciclopentano-1) 2,2-dimetil-

3-(2-metilpropanil-1) ciclopropano-1-carboxilato]; y presenta la siguiente estructura química:

Figura 2. Estructura química del piretroide aletrín

(Pubchem, 2020)

II.2.2. Propiedades químicas y físicas

El aletrín aparece como un líquido viscoso de color ámbar, insoluble y más denso que el

agua. Tóxico por ingestión, inhalación y absorción cutánea. Un insecticida doméstico sintético que

mata moscas, mosquitos, insectos de jardín, etc. (Pubchem, 2020).

15
Tabla 2. Propiedades físico-químicas del piretroide insecticida aletrín. (Pubchem, 2020)

II.2.3. Toxicidad del piretroide aletrín

A medida que los efectos ambientales siguen incrementándose, la incidencia de

enfermedades tropicales debido a los mosquitos, particularmente la malaria y el dengue vienen

aumentando. Debido a esto, se ha extendido constantemente la utilización de insecticidas a nivel

doméstico. Asimismo, se encuentra en aumento la preocupación por la salud. Sin embargo, y a pesar

de la creciente incidencia de resistencia insecticida a los insecticidas como piretroides, su uso sigue

siendo crucial para controlar la propagación de insectos (Kupferschmidt, 2016).

La mayoría de los tipos de insecticidas domésticos disponibles actualmente son piretroides

como aletrín, y hay una gran variedad de dispositivos insecticidas como bobinas de mosquitos,

esteras vaporizadoras, aerosoles, y vaporizadores líquidos. La mayoría de los insecticidas se aplican

a los cultivos en forma de pulverizadores aéreos y terrestres, o se aplican en interiores como aerosoles

o bombas de aerosol disponibles comercialmente. El cuerpo humano puede ser expuesto a los efectos

producidos por los piretroides, teniendo en cuenta la vía de administración de estos insecticidas: al

absorberse vía respiratoria, en caso de vapor; vía gastrointestinal. posterior a su ingesta; y por

16
absorción a nivel de la epidermis mediante el contacto directo con órganos sensoriales a nivel de

sistema nervioso periférico. El aletrín es un piretroide tipo I que ha sido ampliamente utilizado como

componente principal de los insecticidas utilizados para controlar las plagas domésticas (Gupta et

al., 2013; Botnariu et al., 2016).

La exposición aguda y crónica a aletrín puede dañar tejidos como el sistema nervioso,

sistema sanguíneo, tejido adiposo y otros tejidos (Narendra et al., 2007; Ramoz-Chavez et al., 2015).

Además, en recientes estudios de piretroides se ha demostrado que la toxicidad en mamíferos tiene

efectos inmunogenotoxicológicos, cancerígenos y antiprogestogénicos. Asimismo, los insecticidas

piretroides presentan inmunosupresión, carcinogenicidad, hepatotoxicidad y estrogenicidad en

mamíferos (Madhubabu y Yenugu, 2014; Nasuti et al 2007).

Aletrín es el primer piretroide en ser sintetizado, es un compuesto axónico con capacidad

para unirse e inhibir el cierre de los canales de sodio a nivel de la membrana de la célula nerviosa,

para prolongar el potencial de membrana que conlleva a la hiperactividad del sistema nervioso,

produciendo finalmente la parálisis y/o la muerte. El aletrín es capaz de persistir por periodos

prolongados de tiempo en el ambiente, acumulándose en diversas superficies de las casas. La

degradación de aletrín a través de la vía oxidativa conlleva a la generación de radicales libres que

causan daño en el ADN y diversos efectos adversos para la salud (Kale et al., 1999).

Por otro lado, se ha reportado que aletrín induce neurotoxicidad en roedores (Bloomquist,

1996; Hossain et al 2005), genotoxicidad en sistemas bacterianos (Hour et al., 1998) y genotoxicidad

en linfocitos de sangre periférica humana (Ramos-Chavez et al., 2015). La apoptosis mediada por

mitocondrias se presenta como el mecanismo implicado de toxicidad para el aletrín en las células

epiteliales de córnea (Gupta et al., 2013). El mecanismo de acción del aletrín varía de acuerdo al

subtipo de canales de calcio voltaje-dependientes (Neal et al., 2010). Adicionalmente, se ha

observado una alteración en perfiles bioquímicos correspondientes a plasma de humanos que fueron

expuestos tanto a aletrín como a pralletrina (Narendra et al., 2008).

17
En ratas que fueron expuestas a aletrín por un periodo de 60 días (Madhubabu y Yenugu,

2016), se presentó compromiso a nivel del patrón de expresión en genes implicados en el transporte

del colesterol y la espermatogénesis. En estos individuos se observó un descenso en el recuento y

producción de espermatozoides; en la actividad de la testosterona y de enzimas esteroidogénicas; y

la incapacidad para experimentar reacción acrosómica en espermatozoides. De acuerdo a estos

resultados, la toxicidad del aletrín afectaría la función reproductiva al presentar acción a nivel

molecular afectando la producción de andrógenos, la espermatogénesis, la producción de esperma y

su función.

II.3. ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR PLAGUICIDAS

II.3.1. Permetrina (PER)

La permetrina tiene el potencial de inducir estrés oxidativo, el cual es resultante de la

producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como los efectos tóxicos relacionados in

vivo. En ratas tratadas con PER (150 mg / kg de peso corporal / día) durante 60 días, PER redujo la

producción de O2.- y H2O2 en monocitos de rata en el grupo bajo tratamiento frente al grupo control

(Gabbianelli et al., 2009a). No obstante, PER incrementó la producción de O2.- (33 veces), así como

la actividad del sistema de peróxido de hidrógeno-mieloperoxidasa (MPO) (67 veces) en neutrófilos

polimorfonucleares (PMN) (Gabbianelli et al, 2009b).

In vitro, también se observó que PER condujo a la producción de ROS. En el caso de ratones

C57BL/6, sus células tímicas expuestas a PER (150, 300, 600 y 1000 mM) por 12 h, presentaron

liberación de O2.- posterior a los cinco minutos de exposición, con efectos significativos en la

producción de O2.- posterior a los 15 minutos (Olgun y Misra, 2006).

De acuerdo con un estudio in vitro, en partículas sub-mitocondriales del cuerpo estriado, se

reveló que PER (10 mM) produjo una reducción en la liberación de O2.- de la cadena transportadora

de electrones al inhibir el complejo mitocondrial I, sugiriendo que las ROS mitocondriales no estaban

18
involucradas en el daño del ADN nuclear (Falcioni et al., 2010). Adicionalmente, PER mostró

enantiómeros, los cuales fueron selectivos al estrés oxidativo al tratarse las células con PER. En un

estudio en el que se expusieron células de feocromocitoma suprarrenal de rata (PC12) a 1R-trans-

PER (10, 20 y 30 mg/L), 1S-cis-PER (10, 20 y 30 mg/L), 1S-trans-PER (10 , 20 y 30 mg/L), 1S-

trans-PER (10, 20 y 30 mg/L) y rac-PER (10, 20 y 30 mg/L), respectivamente, 1R-trans-PER mostró

una dosis dependiente de la acumulación de ROS intracelular, y 1S-cis-PER solo incrementó

levemente la producción de ROS a una concentración de 30 mg/L. La generación de ROS inducida

por ellos siguió el orden: 1R-transPER4, 1S-trans-PER4, rac-PER41R-cis-PER4, 1S-cis-PER, lo que

sugiere que la enantioselectividad debe tenerse en cuenta al evaluar los efectos oxidativos de PER

(Hu et al., 2010).

En animales, el PER puede mostrar peligrosos efectos en forma de generación de óxido

nítrico (NO) (Zhang et al., 2011). En un estudio realizado en peces cebra, con el fin de investigar la

toxicidad inmune de algunos productos químicos disruptores endocrinos, entre los que se incluye el

PER, se reveló que este incrementó de forma significativa la expresión de ARNm de la sintasa de

óxido nítrico inducida (iNOS) después de que estos animales fueron expuestos a PER (0.1, 0.5, 2.5

y 12.5 mg/L) durante 3 días en la etapa embrionaria, lo cual sugiere que la generación de NO podría

estar implicada en la muerte de las células inmunes en este pez (Jin et al., 2010).

En los estudios para evaluar los efectos de la exposición al PER desde el día posterior al

parto hasta el día 21 o la vida temprana de la rata con 300 o 500 días, una dosis baja de PER (34.05

mg / kg pc) disminuyó los niveles de NO en el cuerpo estriado e hipocampo, y aumento del nivel

plasmático de NO, lo que sugiere que la generación de NO podría depender de los tejidos, y que las

especies reactivas de nitrógeno (RNS) observadas en ratas adultas podría deberse al tratamiento con

PER en etapas tempranas de la vida (Carloni et al, 2013; Fedeli et al, 2013).

II.3.2. Deltametrina

19
El estrés oxidativo se entiende como la falta de equilibrio entre agentes antioxidantes y

oxidantes, el cual se presenta a través de la formación de un excedente de ROS y/o radicales libres,

como es el caso del peróxido de hidrógeno (H2O2), el anión superóxido (O2•-), el hidroperoxilo

radical (HOO•) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) como el óxido nítrico catalizado por la

sintasa de óxido nítrico (NOS) y peroxinitrito (Dasuri et al., 2013). La deltametrina causa daño por

estrés oxidativo a través de la generación de ROS y RNS (Rehman et al., 2006; Romero et al., 2015).

Deltametrina (10 μM) incrementó de forma significativa la generación de ROS en las células de rata

PC12 de feocromocitoma suprarrenal (Li et al., 2007a; Li et al., 2007b). De igual manera, en dosis

de 25 y 50 μM de deltametrina, por 1 h elevaron los niveles de ROS, que sirven como un marcador

temprano de apoptosis en timocitos murinos (Kumar y Sharma, 2015). Asimismo, la deltametrina (1

y 5 μM) produjo, en ratas, la inducción de la muerte celular y la generación de ROS en hepatocitos

primarios (Arora et al., 2016).

Estas investigaciones in vitro muestran que la deltametrina podría causar de forma directa

un daño por estrés oxidativo por medio de la generación de ROS. In vivo, se presentó una elevación

significativa que depende del tiempo y la dosis en la generación de ROS en la trucha arco iris

(Erdogan et al., 2011).

La generación de NO como resultado del tratamiento con deltametrina también produce un

daño oxidativo (Romero et al., 2012). Un estudio descubrió que al administrar deltametrina en el

cerebro de ratas, en dosis de 12,5 mg/kg de peso corporal, incrementaron de forma significativa las

actividades de deltametrina, NOS y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y la expresión de proteína

de nNOS y PARP (Wu y Liu, 1999). Asimismo, otros estudios en ratas han demostrado la inducción

de neurotoxicidad por parte de la deltametrina (0.6 mg/kg peso corporal); este efecto tóxico se debió,

en parte a la generación de NO (Galal et al., 2014; Ogaly et al., 2015). Estos estudios demostraron

la relación existente entre la neurotoxicidad que induce la deltametrina y el daño oxidativo.

Igualmente, la deltametrina fue promotora de la generación de NOS (Chávez-Mardones y Gallardo-

Escarate, 2015), el factor principal que se requiere para generar el estrés oxidativo (Arslan et al.,

20
2017). Posterior al tratamiento con deltametrina, los niveles plasmáticos de NO incrementaron (7,5

g / L) en el caso de búfalos de agua (Ince et al., 2010).

Todavía no se encuentra claro el mecanismo específico mediante el cual la deltametrina

incrementa la generación de ROS y RNS, no obstante, un estudio ha confirmado que el estrés

oxidativo que induce la deltametrina, así como la toxicidad vinculada es debido a la generación de

ROS y RNS. El estrés oxidativo producto de la deltametrina podría destruir la oxidación y el

equilibrio de la antioxidación para producir daño celular al ADN, las proteínas y los lípidos, (Shen

et al, 2015), provocando, de esta manera, la muerte celular y la apoptosis.

II.3.3. Fipronil (FIP)

FIP puede inducir estrés oxidativo que conduce a la generación de ROS y efectos tóxicos

relacionados in vivo. En el caso de ratas Wistar, cuando fueron tratadas con FIP (2.5, 5 y 10

mg/kg/pc), las concentraciones más elevadas de FIP (5 y 10 mg/kg/pc) incrementaron de forma

significativa la generación de ROS del esperma (Khan et al., 2015).

Existe evidencia de varios estudios sobre la generación de ROS inducida por FIP, in vitro.

Cuando las células comerciales neuronales SH-SY5Y fueron tratadas con FIP (100 lM) por 6 h, FIP

podría inducir una generación significativa de ROS (Lee et al., 2011; Ki et al., 2012; Park et al.,

2016). En un estudio en células Drosophila S2 (Zhang et al., 2015) se reveló que FIP produjo un

aumento en ROS de forma dependiente de la concentración cuando estas fueron tratadas con 20, 30

40 y 50 μg/mL de FIP (Zhang et al., 2015).

FIP condujo a la generación de ROS después de que las células de neuroblastoma SH-SY5Y

se expusieron a FIP (25, 50 y 100 lM) por 6 h, de manera dependiente de la concentración (Park et

al., 2013). Wang et al. (2013) informaron, en caso de las células de Spodoptera frugiperda, que FIP

incrementó de manera significativa el nivel de ROS intracelular cuando estas fueron expuestas a 200

y 400 μg / mL) por 48 h.

21
Para investigar el origen de la toxicidad de FIP con mayor detalle, Vidau et al. (2011)

utilizaron mitocondrias provenientes de hígado de rata como herramienta para revelar el motivo de

la producción de ROS, y descubrieron que el FIP indujo un incremento dependiente de la dosis en el

consumo de oxígeno en las mitocondrias. No obstante, otro estudio reciente documentó que el FIP

(5, 10, 15 y 25 μM) no podía incrementar la generación de especies reactivas de oxígeno de las

mitocondrias aisladas del hígado de rata (Tavares et al., 2015), lo que sugiere que entre las

mitocondrias aisladas y las células enteras hubo algunas diferencias en la producción de ROS

inducida por FIP.

Asimismo, se informaron aumentos significativos en la producción de NO en las células de

neuroblastoma SH-SY5Y producidos por tratamientos con FIP sulfona (37 μM) y FIP (100 μM), lo

cual indicaría que el estrés oxidativo podría presentarse como una de las principales vías de

neurotoxicidad inducida por FIP y atribuirse en parte al metabolismo y la disposición del FIP

(Romero et al., 2016). Debido a esto, estudios in vitro u in vivo demostraron que la producción de

RNS o ROS desarrolla un rol preponderante en el estrés oxidativo, así como en las toxicidades

relacionadas que son inducidas por FIP. Además, la generación de ROS o RNS podría ser inducida

por FIP de una manera dependiente de la dosis. Es de interés estudiar que las mitocondrias serían un

objetivo de importancia del FIP y el perjuicio a estas estaría vinculado con la toxicidad. En particular,

el metabolito del FIP, la sulfona del FIP, podría ser responsable de la toxicidad inducida por FIP en

lugar del propio FIP en función del estrés oxidativo, lo que sugiere que la relación entre el estrés

oxidativo y la toxicidad inducida por los metabolitos del FIP debería ser altamente preocupante en

la investigación adicional (Wang et al, 2016a).

II.4. CITOPROTECTORES

II.4.1. Melatonina (MLT)

La melatonina, sintetizada y secretada principalmente por la glándula pineal (Macchi y

Bruce, 2004), es una hormona endógena que fue identificada químicamente como N-acetil-5-

22
metoxitriptamina y aislada en la década de 1960 por primera vez (Lerner et al, 1960). En la síntesis

de MLT, el triptófano es el aminoácido esencial precursor que se deviene en serotonina y,

posteriormente, en MLT por intermedio de dos reacciones consecutivas que involucran dos enzimas:

hidroxiindol-O-metil transferasa (HIOMT) y serotonina-N-acetil transferasa (NAT) (Klein y Moore,

1979, Axelrod y Weissbach, 1960). MLT también es producida por células cerebrales, la piel, el

epitelio de vías respiratorias, la médula ósea, el sistema inmunitario, el ovario, los testículos, el

intestino y otros (Reiter et al, 2009). Las propiedades de MLT y sus derivados como captadores de

radicales libres se encuentran bien documentadas (Tan et al, 2007). Asimismo, el uso de MLT como

un potente antioxidante debido a tales propiedades presenta una gran cantidad de evidencia.

Debido a sus propiedades químicas y físicas, MLT posee ciertas ventajas frente a otras

moléculas antioxidantes. Es una hormona presente en el cuerpo de forma natural. La MLT, al ser una

molécula anfifílica, puede entrar en todos los órganos y compartimentos subcelulares, representando

una diferencia con otros captadores de radicales fisiológicos. Adicionalmente, se estima que MLT

desintoxica, a través de su cascada de reacciones, hasta 10 radicales, aumentando las concentraciones

efectivas (Tan et al, 2007). Al comparar MLT con otros antioxidantes, su eficacia ha sido igual o

mejor respecto a la protección de los tejidos contra el daño oxidativo (vitamina C y E). La ventaja

más interesante de la MLT podría ser su selectividad para la membrana mitocondrial, propiedad que

no se presenta en otras moléculas antioxidantes (Dragicevic et al, 2011).

En cuanto a su toxicidad, la toxicidad aguda de MLT en estudios en animales y humanos es

extremadamente baja (Malhotra et al, 2004), con un amplio margen de seguridad (Arendt, 1997).

Aunque en estudios clínicos se han observado algunos efectos secundarios, relacionados en su

mayoría a somnolencia y fatiga, no se han presentado datos referentes a efectos toxicológicos graves

(Schernhammer et al, 2012). En un estudio cruzado doble ciego por un periodo de seis meses, con 3

mg / día de MLT, se observó en hombres sanos la alteración de la calidad del semen (Luboshitzky et

al, 2002).

23
En una línea celular derivada de un carcinoma de colon en roedores se ha observado que

altas dosis de MLT (1, 2 y 3 mM) producen una supresión progresiva significativa de la síntesis de

ADN (Farriol et al, 2000). Otro mecanismo del MLT para inhibir el crecimiento de células

cancerosas es la disminución, en células tumorales MCF-7, de la expresión de telomerasa, enzima

responsable del alargamiento de los telómeros que se activa en la mayoría de los cánceres humanos.

(Leon-Blanco et al, 2003). Además, una vez que se forman los tumores, esta hormona también

parece controlar su crecimiento. MLT inhibe, a través de procesos mediados por receptores de

membrana, el metabolismo y la absorción de los ácidos grasos, incluido el ácido linoleico (LA) en

células de hepatoma, y su transformación a la molécula de señalización mitogénica ácido 13-

hidroxioctadecadienoico (13-HODE) (Blask et al., 2004).

Otros estudios, en tumores pancreáticos inducidos químicamente por diferentes agentes, en

modelos animales in vivo e in vitro, han demostrado las propiedades antitumorales de MLT, sola o

en combinación con otras moléculas antitumorales (Padillo et al., 2010; Ruiz-Rabelo et al., 2011;

Ruiz-Rabelo et al., 2007). Adicionalmente, se ha observado que la administración de melatonina

restaura las alteraciones bioquímicas y morfológicas en el tejido hepático en ratas Wistar en casos de

intoxicación con cipermetrina (Bhatti et al., 2014).

II.4.2. Silibina

La Silybum marianum, Silimarina, perteneciente a la familia Asteraceae, es conocida como

cardo mariano. Esta planta es originaria del sur de Europa, y puede encontrarse en Australia, América

del Norte y del Sur, el norte de África y algunas partes de Asia. El cardo mariano ha sido utilizado

como tratamiento para enfermedades hepáticas y para incrementar la producción de leche en madres

lactantes desde la antigüedad (Abenavoli et al., 2010; Bazzano et al., 2016; Capasso et al., 2009;

Negi et al., 2008). De igual manera, la silimarina ha sido utilizada como protector hepático en caso

de envenenamiento por mordeduras de serpientes y para eliminar el exceso de bilis de la vesícula

biliar (Ross, 2008).

24
La silimarina es el componente principal del extracto de cardo mariano (conjunto de

flavonolignanos entre los que se encuentran la isosilina A y B, la silibínina, la silidianina, la silibina

A y B, y la silicristina) y se encuentra en las hojas, semillas y frutos de S. marianum (Karimi et al.,

2011; Luper, 1998; Napolitano et al., 2013). Asimismo, la silimarina está compuesta principalmente

por silibina, la cual presenta efectos terapéuticos más activos que los otros flavonolignanos (Dixit et

al., 2007; Bijak, 2017). Debido a la baja solubilidad en agua, la biodisponibilidad oral de la silimarina

es baja. No obstante, a través de formulaciones especiales se logró incrementar su solubilidad y

absorción (Bijak, 2017).

La silimarina presenta varios efectos beneficiosos, entre los que destacan sus efectos

hepatoprotectores (Vargas ‐ Mendoza et al., 2014). Se mostraron papeles positivos de la silimarina

en la esteatohepatitis no alcohólica, la enfermedad del hígado graso no alcohólico y la fibrosis en los

hepatocitos humanos experimentales.

La silimarina presenta propiedades antivirales en pacientes con hepatitis C crónica, (Lani et

al., 2015; Polyak, et al., 2013) y un papel hepatoprotector (Polyak et al., 2013). Además, el cardo

mariano, en ciertas concentraciones, presentó propiedades antibacteriales y un efecto inhibitorio en

el establecimiento de biopelículas, (Evren y Yurtcu, 2015). A nivel clínico, la silimarina mostró

efectos contra el Alzheimer y el Parkinson (Ullah y Khan, 2018; Yaghmaei et al., 2014). Asimismo,

en pacientes con artritis, la silimarina mostró efectos antiinflamatorios significativos (Hussain et al.,

2009). Adicionalmente, se ha observado que el cardo mariano presenta actividad anticancerígena

sobre diferentes células cancerosas (Agarwal et al., 2006; Won et al., 2018).

En el caso de ratones con cáncer de glándulas mamarias, la silimarina presentó actividad

anticancerígena, así como disminuyó el volumen del tumor, inhibiendo su crecimiento. También ha

disminuido la toxicidad de los agentes de quimioterapia. Además, la silimarina previene el síndrome

mano-pie inducido por la capecitabina (Elyasi et al., 2016; Forghani et al, 2014). A nivel de la piel,

las formulaciones tópicas de silimarina presentaron actividad anticancerígena, suprimiendo el tumor

25
de piel, de igual manera, de igual forma, en ratones, protegieron la piel del estrés oxidativo producido

por la radiación UV. En pacientes con cáncer de mama presenta un efecto protector contra la

radiodermatitis (Karbasforooshan et al, 2018; Katiyar et al., 2011). Adicionalmente, en el caso de

dermatitis atópica, la silimarina resultó útil en su tratamiento. Además, mostró un efecto de

cicatrización de heridas (Mady et al., 2016; Sharifi et al., 2012).

El extracto de cardo mariano tiene efecto modulador del sistema inmune. Fue útil para el

tratamiento de la inflamación en pacientes en diálisis peritoneal debido a su efecto inmunomodulador

(Balouchi et al., 2014; Karimi et al., 2018; Nazemian et al., 2010). En la terapeútica del síndrome

metabólico ha demostrado su utilidad (Tajmohammadi et al., 2018). Este efecto es mejorable a través

de la administración conjunta con berberina (Fogacci et al., 2019).

En pacientes con diabetes, la silimarina presenta un efecto beneficioso en la reducción de la

glucosa en sangre en ayunas, glucosa plasmática posprandial y HbA (1c) (Hussain, 2007; Voroneanu

et al., 2016). De la misma manera, en caso de complicaciones diabéticas, como la nefropatía

diabética, la silimarina mostró un efecto preventivo (Khazim et al., 2013; Rafieian-Kopaie y Nasri,

2012; Stolf, et al, 2017).

La silibina interfiere en la acumulación de grasa en el hígado, la resistencia a la insulina y el

estrés oxidativo (Federico et al., 2017; Marin et al., 2017). Asimismo, produce una mejora de las

pruebas funcionales del hígado (Aller et al., 2015) y posibilita una reducción de la hepatotoxicidad

provocada por altas dosis de acetaminofeno, así como interviene en la reducción del estrés oxidativo

en el caso de ratones (Brandon ‐ Warner et al., 2012; Papackova et al., 2018).

26
III. MATERIALES Y MÉTODOS

III.1. LUGAR DE EJECUCIÓN

El trabajo experimental se desarrolló en los Laboratorios de Farmacología y Toxicología,

Fisiología Animal y Biotecnología Reproductiva de la Facultad de Medicina Veterinaria de la

Universidad Nacional Mayor de San Marcos, durante el período comprendido entre los meses de

junio 2019 a febrero de 2020.

III.2. MATERIALES Y EQUIPOS

III.2.1. Materiales

- Agua ultrapura.

- Cinta Masking Tape.

- Cofias.

- Contenedores de plástico (7 litros).

- Filtros de jeringa estériles (0.20 µm).

- Frascos para cultivo celular estériles de 25 cm².

- Gradilla para tubos cónicos de 50 ml.

- Guantes.

- Jeringas de 10 ml estériles con aguja 21 x 1 ½=.

- Mascarillas.

- Papel absorbente para limpieza de materiales y equipos.

- Pipetas estériles de 10 ml.

- Placas de 96 pocillos

- Plumón marcador indeleble.

- Recipientes para desechos.

- Tubos de polipropileno con tapa Falcon™ de 50 ml.

III.2.2. Reactivos

- Alcohol al 70%

27
- Antibiótico y antimicótico (Pen-Strep + Anfotericina B al 1%)

- DCFH-DA (cas: 4091-99-0, Sigma Aldrich, USA)

- Médio de cultivo: Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 - DMEM/F-12

(Lonza/BioWhittaker, USA)

- Suero Fetal Bovino al 10% (SFB).

- Dimetil Sulfóxido - DMSO

III.2.3. Equipos

- Baño María eléctrico.

- Cámara de flujo laminar

- Incubadora Forma™ Series II con temperatura de 37 ºC ± 1ºC

- Microscopio invertido

- Pipeteador Automático <Dragon Lab= Levo Plus

- Refrigeradora com temperatura de 4ºC ± 1ºC (Congeladora)

- Tanque de nitrógeno

III.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

III.3.1. Línea celular y condición de cultivo

Para el presente estudio se adquirió, de la European Collection of Authenticated Cell

Cultures (ECACC 94030304), Sigma-Aldrich, la línea celular dopaminérgica del neuroblastoma

humano SH-SY5Y. Para el mantenimiento de las células se utilizó medio DMEM/F-12 suplementado

con 10% de SFB inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina.

Inicialmente, se realizaron los cultivos en flask de 25 mL, con medio de cultivo suplementado, a 37

°C y en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

De acuerdo con los ensayos, se subcultivaron las células SH-SY5Y en placas negras, o

transparentes de 96 pocillos con una confluencia del 95 % en placas de 96 pocillos a una densidad

de 5 × 104 células por pocillo para realizar los diferentes tratamientos. Las células se trataron con

28
aletrín (25 µM) en DMEM/F-12 con FBS al 1% y en co-tratamiento simultáneo con melatonina (1

µM) o silibina (50 µM). Se usó un grupo de vehículo que contenía 0,1% de DMSO en paralelo para

cada experimento. En el presente estudio, todas las células SH-SY5Y usadas fueron utilizadas a un

bajo número de pases (<12).

III.3.2. Tratamientos

Se ha utilizado una única dosis de aletrín que corresponde a 25 µM, dosis por debajo de la

IC50 (datos no mostrados). El aletrín es una sustancia soluble en solventes orgánicos, por esa razón

se ha utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente.

En este estudio se buscó inhibir el efecto citotóxico que produjo el insecticida aletrín, de ahí

que hemos utilizado dos sustancias citoprotectoras como son la melatonina (1 µM) y la silibina (50

µM) en co-tratamiento simultáneo con el piretroide aletrín a la dosis ya mencionada (Martínez et al.,

2020).

Cultivos y co-tratamientos simultáneos

C: Control (células SH-SY5Y)

V: Vehículo (células SH-SY5Y + DMSO 0.1%)

A: Aletrín (células SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrín 25 uM)

A + MEL: Aletrín + Melatonina (células SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrín 25 uM + melatonina 1 µM)

A + SILIBINA: Aletrín + Silibina (células SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrín 25 uM + silibina 50 µM)

Los cultivos tuvieron un periodo de incubación de 24 horas para todos los tratamientos

mencionados, realizándose 6 experimentos independientes por cada tratamiento.

29
Ensayo de viabilidad celular (Ensayo MTT)

Cultivo control Añadido de Sales Células con actividad Lectura a 540 nm.
de tetrazolio – metabólica Mayor intensidad
Cultivo Celular células de neuroblastoma SH-SY5Y

MTT (amarillo) transforman MTT a (Púrpura), mayor


Formazán - Púrpura absorbancia
Cultivo + DMSO
(Vehículo) Determinación de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS).

Añadido de Esterasas liberan Lectura con longitud


Cultivo + DMSO
diclorofluorescein DCFH. Oxidación de de onda de excitación
+ Aletrín
a diacetato DCFH a DCF por ROS de 485 nm
(A)
(Fluorescencia) (visibilidad) y de
emisión de 530 nm
A+ Melatonina (detección)
Expresión de genes vinculados al estrés oxidativo por medio de PCR en
tiempo real.
Extracción de ARN Síntesis de ADNc PCR en tiempo real
A+ Silibina Total. Método de para NFkB1, Nrf2,
reactivo Trizol SOD2 y GPX1

RT SYBR Green
2

Figura 3. Esquema del diseño experimental

III.3.3. Ensayo de viabilidad celular (Ensayo MTT)

Mediante ensayo colorimétrico cuantitativo con bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-

difeniltetrazol (MTT) se utilizó para medir la actividad metabólica celular como indicador de la

viabilidad y proliferación celular previamente descrito por Denizot y Lang, (1986). Se añadieron 50

μL del reactivo de MTT a una concentración final de 0,5 mg/mL a cada pocillo al término de las 24

horas de incubación. La placa fue colocada en una incubadora humidificada a 37 °C, con 5% de CO2

y 95% de aire (v/v), por 2 horas adicionales. Este ensayo colorimétrico se basa en la reducción de

una sal de tetrazolio amarilla (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio o MTT) a

cristales de formazán de color morado por las células metabólicamente activas. Las células que

presentan actividad metabólica reducen la sal de tetrazolio amarilla (MTT) a cristales de formazán

de color púrpura mediante las enzimas oxidorreductasas dependientes del NAD(P)H. Los cristales

de formazán insolubles se disuelven con DMSO. El formazán insoluble fue disuelto con DMSO. La

determinación colorimétrica de la reducción de MTT se midió por espetrofotometría con la emisión

de una señal (540 nm) a fin de cuantificar. Cuanto más oscura sea la disolución, mayor será el número

30
de células metabólicamente activas viables. Las células controles fueron aquellas que solo se

cultivaron con DMEM/F-12 y fueron consideradas con una viabilidad celular al 100%. El valor de

la concentración inhibitoria (IC50) se calculó por el efecto dosis-dependiente con el software

OriginPro 9.0.

III.3.4. Determinación de la generación de ROS – especies reactivas de oxígeno.

Las células neuronales SH-SY5Y, descongeladas lentamente en Baño María a 37 °C, fueron

cultivadas en placas negras de 96 pocillos con una confluencia del 95 % y una densidad de 5 × 104

células por pocillo e incubados los tratamientos antes mencionados por 24 h. Luego, se añadieron 10

μM de diacetato de 2’-7’- diclorofluoresceína (DCFH-DA), un tinte fluorogénico que mide la

actividad de hidroxilo, peroxilo y otras ROS dentro de la célula, a los pocillos por un periodo de 30

minutos a 37 °C. El protocolo de ensayo DCFH se basa en la difusión de DCFH-DA en la célula y

luego es desacetilado por esterasas celulares a un compuesto no fluorescente, y seguidamente

oxidado por ROS en 2’, 7’-diclorofluoresceína (DCF). DCF es altamente fluorescente. Se realizó la

evaluación de la producción de ROS a través de un lector de microplaca de fluorescencia, utilizando

una longitud de onda de emisión de 530 nm, así como una longitud de onda de excitación de 485 nm

(Biotek, USA). Las lecturas obtenidas de cada pocillo corresponden a unidades arbitrarias de

fluorescencia. Estos resultados son exportados por el lector de microplaca como una hoja de cálculo

Excel.

III.3.5. Expresión génica vinculada al estrés oxidativo por medio de PCR en tiempo real.

Las células de neuroblastoma SH-SY5Y se incubaron por 24 h a 37 °C, 5 % de CO2 y 95 %

de humedad en un matraz de cultivo de 25 cm2, según los tratamientos descritos en la Tabla 3.

Utilizando el método de reactivo Trizol se extrajo el ARN total (Invitrogen, USA), el cual fue

purificado haciendo uso del kit de limpieza Rneasy MinElute según el protocolo del fabricante

(Qiagen, USA). La concentración y pureza de ARN final se determinó utilizando un

31
espectrofotómetro Nano (Microdigital NABI, Korea), obteniendo el ratio A260/A280 entre 1.9 y 2.1

en todas las muestras.

Desde 5 μg de ARN total, mediante transcripción inversa usando el kit RT 2 de primera

cadena se sintetizó el ADNc de primera cadena (Qiagen, Hilden, Alemania), según el protocolo del

fabricante, iniciando con un paso de supresión de ADN genómico. Finalmente, se procedió a diluir

el cDNA en agua libre de nucleasas 1:10, y se almacenó a -80 °C, para posterior análisis.

Se realizaron ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real para NFkB1, Nrf2, SOD2 y

GPX1, analizando las expresiones génicas de sus respectivos ARNm. Se utilizaron cebadores

específicos para los genes relacionados a estrés oxidativo e inflamación (Tabla 3):

Tabla 3. Secuencias de primers forward y reverse para genes relacionados a estrés oxidativo

e inflamación.

Genes Primer forward Primer reverse

NFkB1 5´TTTTCGACTACGCGGTGACA3´ ´3´GTTACCCAAGCGGTCCAGA5´

Nrf2 5´CTGGTCATCGGAAAACCCCA3´ ´3´TCTGCAATTCTGAGCAGCCA5´

SOD2 5´ CCACTGCTGGGGATTGATGT3´ 3´CGTGGTTTACTTTTTGCAAGCC5´

GPX1 5´ TTCGAGCCCAACTTCATGCT3´ 3´CGATGTCAGGCTCGATGTCA5´

GADPH 5´ GAGAAGGCTGGGGCTCATTT3´ 3´AGTGATGGCATGGACTGTGG5´

Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real, BioRad CFX96, utilizando

la mezcla maestra RT2 SYBR Green qPCR (Qiagen, USA) según el protocolo del fabricante. Cada

primer tuvo una concentración de 400 nM. A continuación se describe el protocolo de

termociclación: 95 °C durante 10 minutos, 40 ciclos compuestos de 15 segundos a 95 °C, 1 min a

60 °C.

32
El cálculo de las alteraciones relativas en la expresión de genes génica se realizó según Pfaffl

(2001), mediante el uso como gen de mantenimiento de GAPDH (sin diferencias probadas entre

grupos). Para extraer las eficiencias de los datos sin procesar se utilizó el software libre LinRegPCR

(Ramakers et al, 2003).

III.3.6. Análisis de resultados.

Se realizaron seis réplicas para cada condición experimental, y los resultados obtenidos en

cada replica fueron representativos. Los datos exhibidos se muestran como medias ± media del

error estándar (SEM). Mediante el análisis de varianza (ANOVA) de una vía se realizaron las

comparaciones estadísticas entre tratamientos frente al vehiculo (no significativo frente al

control), seguido por la prueba post-hoc de Tukey, usando GraphPad Prism 9.0. Se consideró

una diferencia estadística cuando p< 0,05. La IC50 se calculó mediante una curva dosis-

respuesta, mediante ajuste sigmoidal con el software Origin-Pro 9.1.

33
IV. RESULTADOS

IV.1. ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR (ENSAYO MTT)

Los datos significan la media ± SEM de seis experimentos realizados de forma independiente

por cada tratamiento. ***P<0,001 en comparación con el vehículo. &&& P<0,001 en comparación

con aletrín usando ANOVA 3 Tuckey

IV.1.1. Los antioxidantes melatonina y silibina inhiben el efecto citotoxico del piretroide

aletrín en células SH‑SY5Y.

Para evaluar la viabilidad hemos utilizado el ensayo de MTT. Las absorbancias obtenidas

fueron normalizadas como porcentajes del control (100%). En las células de neuroblastoma SH-

SY5Y, tras 24 h (período de incubación), aletrín (25 µM) redujo la viabilidad celular

significativamente (P < 0,001) en un 31 %. Por otra parte, este efecto fue inhibido significativamente

(P < 0,001) por melatonina (1 µM) y silibina (50 µM), permitiendo que las células vivas restantes

proliferen y alcancen incluso niveles similares al control en 55 % y 50 %, respectivamente (Figura

4).

150
REDUCCIÓN DEL MTT (%)

&&& &&&
104.71%
107.2%
100% 98.65 %
55% 50%
100
***
69.43 %

31%

50

0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM

Figura 4. Citotoxicidad inducida por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y y efecto citoprotector de
melatonina (MEL, 1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas SH-
SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina 1
µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).

34
IV.1.2. Los antioxidantes melatonina y silibina reducen la producción de ROS inducida por

el piretroide aletrín en células SH‑SY5Y.

Para evaluar la producción de ROS hemos utilizado la sonda fluorescente DCFH-DA. Los

niveles de ROS fueron determinados por unidades fluorescentes. En las células SH-SY5Y, tras un

período de incubación de 24 h, aletrín (25 µM) incrementó los niveles de ROS significativamente

(P < 0,001) en un 38 %. Por otra parte, este efecto fue reducido significativamente (P < 0,001) por

MEL (1 µM) y silibina (50 µM) en 24 % y 23 %, respectivamente (Figura 5).

4000
Producción de ROS
(Fluorescencia)

3000 ***
2145.33

&&&
2000 38 % &&& 1650.50
1576.33 1637.33
1555
24 % 23 %

1000

0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM

Figura 5. Estrés oxidativo (Producción de ROS) inducido por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y y efecto
antioxidante de MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24 horas.
La producción de ROS fue determinada por unidades fluorescentes. C: control (celulas SH-SY5Y),
Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% +
aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina 1 µM), SIL (celulas SH-
SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).

35
IV.1.3. Los antioxidantes melatonina y silibina reducen la expresión de genes (NFkB1, Nrf2,

SOD2 y GPX1) en células SH‑SY5Y expuestas al piretroide aletrín.

Se evaluó si aletrín era capaz de alterar la homeostasis oxidativa en células SH-SY5Y a

través de genes implicados en vías de señalización de estrés oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2 y

GPX1 estrechamente implicados en dicha homeostasis por el ensayo de qPCR.

Aletrín a concentración de 25 µM incrementó significativamente (P < 0,001) la expresión

de NFκB1 en 2,65 veces respecto del vehículo, este efecto citotóxico fue reducido

significativamente por MEL y silibina en 1,34 (P < 0,01) y 1,74 (P < 0,001) veces, respectivamente

(Figura 6).

3
***
2.65
x2.6

&&
Expresión de NFB1

1.97
(Tasa de cambio)

2
x 1.34
&&&
1.52

x1.74
1.02 1.01
1

0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM

Figura 6. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular NFkB1) inducido por aletrín (25
μM) en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un
período de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas
SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina
1 µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).

36
Por otro lado, aletrín disminuyó significativamente (P < 0,001) la expresión de Nrf2 en 1,79

veces respecto del vehículo, este efecto oxidativo fue reducido significativamente solo por silibina

en 1,61 veces (P < 0,01). (Figura 7).

2
Expresión de Nrf2
(Tasa de cambio)

1.01
1.00
&&
1 x1.79 0.90
x1.61
0.78

***
0.56

0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM

Figura 7. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular Nrf2) inducido por aletrín (25 μM)
en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período
de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas
SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina
1 µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).

37
Respecto de la expresión de la molécula antioxidante SOD2, aletrín disminuyó

significativamente (P < 0,001) su expresión en 1,79 veces, mientras que silibina incremento este

efecto en 1,5 veces de forma significativa (P < 0,05). (Figura 8).

2
Expresión de SOD2
(Tasa de cambio)

1.04
0.98
1 x1.79 &
0.84
x1.5
***
0.56 0.59

0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM

Figura 8. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular SOD2) inducido por aletrín (25
μM) en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un
período de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas
SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina
1 µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).

38
Finalmente, aletrín disminuyó (P < 0,001) la expresión molecular de GPX1 en 1,6 veces, y

por su parte la silibina redujo este efecto oxidante en 1,43 veces de forma significativa (P < 0,05).

(Figura 9).

2
Expresión de GPX1
(Tasa de cambio)

1.05 1.04

1
&
x1.43 0.80

0.58
***
0.56
x1.6

0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM

Figura 9. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular GPX1) inducido por aletrín (25 μM)
en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período
de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas SH-
SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina 1 µM),
SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).

39
V. DISCUSIÓN

Los piretroides son los plaguicidas más utilizados en todo el mundo, sin embargo su uso se

ha vuelto indiscriminado a pesar de los controles y normativa existente. Los compuestos químicos

plaguicidas se consideran el principal factor ambiental vinculado con los trastornos

neurodegenerativos humanos. Aun cuando se presenta una amplia evidencia referente a los efectos

tóxicos producidos por los piretroides, es necesaria una mayor cantidad de estudios a fin de evaluar

su neurotoxicidad, así como los mecanismos conducentes al daño potencial a nivel del sistema

nervioso. Se requieren estrategias de prueba in vitro alternativas, en particular para la detección,

como parte de un esquema de prueba (Martínez et al., 2019; Martínez et al., 2020).

El presente estudio pretende describir los efectos tóxicos del piretroide aletrín sobre la línea

celular neuronal SH-SY5Y, que es considerada como un modelo in vitro usado ampliamente en

investigaciones vinculadas con estrés oxidativo, citotoxicidad y enfermedades neurodegenerativas.

Este estudio demuestra que el plaguicida aletrín puede inducir la muerte celular promoviendo la

participación de los mecanismos de estrés oxidativo y la alteración de la expresión molecular de

genes relacionados a estrés oxidativo como NFκB1, Nrf2, SOD2 y GPX1. Sin embargo, estos

efectos pueden ser reducidos por la acción de dos antioxidantes como son la melatonina (MEL) y

silibina (principal compuesto activo de la silimarina).

El ensayo de viabilidad celular (reducción de sales de MTT) muestra que las células de

neuroblastoma SH-SY5Y, tras un tiempo de incubación de 24 h con aletrín (25 µM) disminuyeron

su viabilidad celular de forma significativa (P < 0,001) en un 31 %. Sin embargo, este efecto

citotóxico fue reducido significativamente (P < 0,001) por MEL (1 µM) y silibina (50 µM) en 55

% y 50 %, respectivamente (Figura 3). Efectos citotóxicos similares han sido demostrados en otros

trabajos con plaguicidas (Romero et al., 2016; Martínez et al., 2019; Martínez et al., 2020). Por

ejemplo, el fipronil, un insecticida de amplio espectro de la familia del fenilpirazoles y que actúa

sobre el receptor GABA, produjo citotoxicidad en células SH-SY5Y in vitro demostrado a través de

MTT y LDH, incluso su metabolito (fipronil sulfone) fue más tóxico que el propio fipronil, donde

40
los tratamientos con fipronil (100 μM) y fipronil sulfona (3 μM) indujeron un aumento de 4,7 y 5

veces en los peróxidos lipídicos medidos como malondialdehído (MDA) y un aumento de 2,2 y 2,0

veces en los niveles de óxido nítrico (NO), mientras que el antioxidante Trolox (análogo de vitamina

E) (0,3, 1 μM) y MEL (1 μM) tuvieron la capacidad para reducir en parte el efecto citotóxico

ocasionado por fipronil en células SH-SY5Y. Los resultados de los referidos estudios sugieren que

uno de los mecanismos principales de neurotoxicidad que induce el fipronil para producir

citotoxicidad puede ser el estrés oxidativo (Romero et al., 2016). Por otra parte, plaguicidas como

ciflutrín, cipermetrina y glifosato han reducido la viabilidad de células SH-SY5Y de forma dosis

dependiente posiblemente por activación de vías de estrés oxidativo (Martínez et al., 2019; Martínez

et al., 2020).

Existe suficiente evidencia en diferentes estudios in vitro (Wang et al., 2016b; Romero et

al., 2016; Martínez et al., 2019; Martínez et al., 2020) para inferir que la muerte celular (viabilidad

celular reducida) sería consecuencia del daño oxidativo celular producido por la exposición celular

a compuesto químicos como los plaguicidas. Además, una de las alteraciones biológicas de mayor

importancia es la inducción del estrés oxidativo, la cual se encuentra asociada a la exposición a

plaguicidas (Lu et al., 2019). Varios factores de transcripción como Nrf2, NF-κB1, SOD2 y GPX1

y citocinas proinflamatorias como el TNF-α pueden ser activados por el estrés oxidativo. Uno de

los principales mecanismos de defensa celular contra el estrés oxidativo es la activación de la vía de

señalización Nrf2 que representa un punto de convergencia para múltiples vías de señalización

activadas por el estrés oxidativo que resulta en la regulación positiva coordinada de una batería de

proteínas antioxidantes involucradas en la defensa celular (Yang et al., 2015; Nguyen et al., 2003).

Otro factor de transcripción que es inducido por estrés oxidativo es el NF-κB1. Tras su activación

son secretadas citocinas proinflamatorias, entre las cuales está el TNFα (Buelna-Chontal y Zazueta,

2013).

Es así que nuestro estudio muestra que los niveles de ROS en células SH-SY5Y, tras un

tiempo de incubación de 24 h con aletrín (25 µM) se incrementaron significativamente (P < 0,001)

41
en un 38 %. Por otra parte, este efecto fue reducido significativamente (P < 0,001) por MEL (1 µM)

y silibina (50 µM) en 24 % y 23 %, respectivamente. También se evaluó la capacidad de aletrín para

alterar la homeostasis oxidativa en células SH-SY5Y a través de genes implicados en vías de

señalización de estrés oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2 y GPX1 estrechamente implicados en

dicha homeostasis por RT-PCR. El aletrín (25 µM) incrementó significativamente (P < 0,001) la

expresión de NFκB1 en 2,65 veces respecto del vehículo, este efecto citotóxico fue reducido

significativamente por MEL y silibina en 1,34 (P < 0,01) y 1,74 (P < 0,001) veces, respectivamente.

Por otro lado, aletrín disminuyó significativamente (P < 0,001) la expresión de Nrf2 en 1,79 veces

respecto del vehículo, este efecto oxidativo fue reducido significativamente solo por silibina en 1,61

veces (P < 0,01). Respecto de la expresión de la molécula antioxidante SOD2, aletrín disminuyó

significativamente (P < 0,001) su expresión en 1,79 veces, mientras que silibina aumentó este efecto

en 1,5 veces de forma significativa (P < 0,05). Finalmente, aletrín disminuyó (P < 0,001) la

expresión molecular de GPX1 en 1,6 veces, y por su parte silibina redujo este efecto oxidante en

1,43 veces de forma significativa (P < 0,05). El efecto antioxidante de MEL y silibina también han

sido probados en otros estudios in vitro de neurotoxicidad (Romero et al., 2016; Martínez et al.,

2019)

Hemos podido demostrar que el efecto citotóxico producido por aletrín fue reducido por las

dos sustancias antioxidantes testadas: MEL, un potente eliminador de radicales libres y fármaco

neuroprotector (Esparza et al., 2003, 2005; Rodríguez et al., 2004) y silibina, un flavonoide derivado

de la hierba cardo mariano (Silybum marianum) con propiedades antioxidantes (Schumann et al,

2003; Lu et al, 2009) y un agente con supuesta propiedad neuroprotectora ante enfermedades

neurodegenerativas (Yin et al., 2011). Nuestros resultados demostraron que MEL (1 μM) y silibina

(50 μM) atenuaron significativamente los parámetros de estrés oxidativo inducido por aletrín, pero

silibina parece mostrar el mayor efecto protector contra la citotoxicidad inducida por aletrín algo

similar a lo demostrado por Martínez et al. (2019) quienes evaluaron el efecto citotóxico del

piretroide ciflutrín y varios compuestos antioxidantes como MEL y silibina que fueron capaces de

reducir el efecto citotóxico y oxidativo producido por ciflutrín. Adicionalmente, tanto en estudios

42
in vitro como in vivo, la melatonina ha demostrado ser un potente eliminador de diversos ROS

(Reiter et al., 2001).

Los nuevos datos que presentamos, en nuestro estudio, sobre parte de mecanismos del estrés

oxidativo y citotoxicidad inducidos por aletrín y la capacidad de reducir este efecto por parte

principalmente de silibina, nos demuestran que la ingesta de compuestos ricos en flavonoides podría

paliar los efectos negativos de compuestos con capacidad citotóxica.

43
VI. CONCLUSIONES

a) Los antioxidantes melatonina y silibina presentan un efecto citoprotector frente al efecto

citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín en las células neuronales SH-SY5Y.

b) Ambos antioxidantes muestran una capacidad para inhibir el incremento de los niveles de

especies reactivas de oxígeno - ROS, así como inhibir la disminución de la viabilidad celular en

células neuronales SH-SY5Y incubadas con aletrín.

c) Con respecto a la alteración de la homeostasis oxidativa producido por el aletrín en células de

neuroblastoma SH-SY5Y a través de genes implicados en vías de señalización de estrés

oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2 y GPX1, la silibina parece disminuir este efecto.

44
VII. LITERATURA CITADA

1. Abalis I, Eldefrawi M, Eldefrawi A. 1986. Effects of insecticides on GABA‐induced chloride

influx into rat brain microsacs, Journal of Toxicology and Environmental Health., 18:1, 13-

23.

2. Abenavoli L, Capasso R, Milic N, Capasso F. 2010. Milk thistle in liver diseases: Past, present,

future. Phytotherapy Research 24: 142331432.

3. Agarwal R, Agarwal C, Ichikawa H, Singh R, Aggarwal B. 2006. Anticancer potential of

silymarin: From bench to bed side. Anticancer Research 26(6B): 445734498.

4. Anadón A, Martínez-Larrañaga M, Martínez M. 2009. Use and abuse of pyrethrins and

synthetic pyrethroids in veterinary medicine. Veterinary Journal 182(1), 7-20.

5. Arendt J. 1997. Safety of melatonin in long - term use. J. Biol. Rhythm. 12:6733681.

6. Arora D, Siddiqui M, Sharma P, Shukla. Y. 2016. Deltamethrin induced RIPK3- mediated

caspase-independent non-apoptotic cell death in rat primary hepatocytes. Biochem. Biophys.

Res. Commun. 479:217-223.

7. Arslan H, Altun S, Ozdemir S. 2017. Acute toxication of deltamethrin results in activation of

iNOS, 8-OHdG and up-regulation of caspase 3, iNOS gene expression in common carp

(Cyprinus carpio L.). Aquat. Toxicol. 187:90-99.

8. Axelrod J, Weissbach H. 1960. Enzymatic O-methylation of N- acetylserotonin to melatonin.

Science. 131:131231312.

9. Balouchi S, Gharagozloo M, Esmaeil N, Mirmoghtadaei M, Moayedi B. 2014. Serum levels

of TGFβ, IL‐10, IL‐17, and IL‐23 cytokines in β‐ thalassemia major patients: The impact of

silymarin therapy. Immunopharmacology and Immunotoxicology 36(4): 2713274.

10. Barnes J, Verschoyle R. 1974. Toxicity of new pyrethroid insecticide. Nature 248:711.

11. Bazzano A, Hofer R, Thibeau S, Gillispie V, Jacobs M, Theall, K. 2016. A review of herbal

and pharmaceutical galactagogues for breast‐feeding. The Ochsner Journal 16(4): 5113524.

12. Bhatti G, Sidhu I, Saini N, Puar S, Singh G, Bhatti J. 2014. Ameliorative role of melatonin

against cypermethrin induced hepatotoxicity and impaired antioxidant defense system in

Wistar rats. IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology 8:39-

45
48.

13. Bijak M. 2017. Silybin, a major bioactive component of milk thistle (Silybum marianum L.

gaernt.)‐chemistry, bioavailability and metabolism. Molecules 22:11.

14. Blask D, Dauchy R, Sauer L, Krause J. 2004. Melatonin uptake and growth prevention in rat

hepatoma 7288 CTC in response to dietary melatonin: Melatonin receptor - mediated

inhibition of tumor linoleic acid metabolism to the growth signaling molecule 13-

hydroxydecadienoic acid and the potential role of phytomelatonin. Carcinogenesis. 25: 9513

960.

15. Bloomquist J, Soderlund D. 1985. Neurotoxic insecticides inhibit GABA-dependent chloride

uptake by mouse brain vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 133(1):37-43.

16. Bloomquist J. 1996. Ion channels as targets for insecticides. Annu Rev Entomol. 41:1633190.

17. Botnariu G, Birsan C, Podoleanu C, Moldovan C, Stolnicu S, Chiriac A. 2016. Skin necrosis

caused by prallethrin-A worldwide used insecticide. Environ. Toxicol. Pharmacol 43:103 -

104

18. Bradberry .M, Cage S, Proudfoot A. Allister J. 2005. Poisoning due to Pyrethroids. Toxicol

Rev. 24: 933106.

19. Breckenridge C, Holden L, Sturgess N, Weiner M, Sheets L, Sargent D, Soderlund D, Choi J,

Symington S, Clark J, Burr S, Ray D. 2009, Evidence for a separate mechanism of toxicity for

the Type I and the Type II pyrethroid insecticides. Neurotoxicology. 30: 1:S17-31.

20. Breese M. 1977. The potential for pyrethroids as agricultural, veterinary and industrial

insecticides. Pesticide Science 8(3):264-269.

21. Capasso R, Aviello G, Capasso F. 2009. Silymarin BIO ‐C®, an extract from Silybum

marianum fruits, induces hyper‐prolactinemia in intact female rats. Phytomedicine 16: 8393

844.

22. Carloni M, Nasuti C, Fedeli D, Montani M, Vadhana M, Amici A, Gabbianelli R. 2013. Early

life permethrin exposure induces long-term brain changes in Nurr1, NF-k Band Nrf2. Brain

Res. 1515:19328.

23. Casida J, Gammon D, Glickman A, Lawrence L. 1983. Mechanisms of Selective Action of

46
Pyrethroid Insecticides. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 23(1): 413-438.

24. Casida J. 1980. Pyrethrum flowers and pyrethroid insecticides. Environ Health Perspect

34:189-202.

25. Chavez-Mardones J, Gallardo-Escarate C. 2015. Next-generation transcriptome profiling of

the salmon Louse Caligus rogercresseyi exposed to deltamethrin (AlphaMax (TM)): discovery

of relevant genes and sex-related differences. Mar. Biotechnol. 17:793-810.

26. Coats J. 1990. Mechanisms of toxic action and structure-activity relationships for

organochlorine and synthetic pyrethroid insecticides. Environmental Health Perspectives

87:255-262.

27. Dasuri K, Zhang L, Keller J. 2013. Oxidative stress, neurodegeneration, and the balance of

protein degradation and protein synthesis. Free Radic. Biol. Med. 62:170-185.

28. Dixit N, Baboota S, Kohli K, Ahmad S, Ali J. 2007. Silymarin: A review of pharmacological

aspects and bioavailability enhancement approaches. Indian Journal of Pharmacology 39:1723

179.

29. Dragicevic N, Copes N, O’Neal-Moffitt G, Jin J, Buzzeo R, Mamcarz M, Tan J, Cao C, Olcese

J, Arendash G, et al., 2011. Melatonin treatment restores mitochondrial function in

Alzheimer’s mice: A mitochondrial protective role of melatonin membrane receptor signaling.

J. Pineal Res. 51:75386.

30. Elliott M, Farnham A, Janes N, Needham P, Pulman D. 1974. Synthetic insecticide with a new

order of activity. Nature 248(5450): 710-711.

31. Elyasi S, Hosseini S, Niazi Moghadam M, Aledavood S, Karimi G. 2016. Effect of oral

silymarin administration on prevention of radiotherapy induced mucositis: A randomized,

double‐blinded, placebo‐controlled clinical trial. Pythotherapy Research 30(11): 187931885.

32. EPA. 2009. Reregistration Eligibility Decision (RED) for Permethrin Revised May 2009.

33. Erdogan O, Ceyhun S, Ekinci D, Aksakal E. 2011. Impact of deltamethrin exposure on mRNA

expression levels of metallothionein A, B and cytochrome P450 1A in rainbow trout muscles.

Gene 484:13-17.

34. Evren E, Yurtcu E. 2015. In vitro effects on biofilm viability and antibacterial and antiadherent

47
activities of silymarin. Folia Microbiologica, 60(4), 3513356.

35. Falcioni M, Nasuti C, Bergamini C, Fato R, Lenaz G, Gabbianelli R. 2010.The primary role

of glutathione against nuclear DNA damage of striatum induced by permethrin in rats.

Neuroscience 168:2310.

36. Farriol M, Venereo Y, Orta X, Castellanos J, Segovia-Silvestre T. 2000. In vitro effects of

melatonin on cell proliferation in a colon adenocarcinoma line. J. Appl. Toxicol. 20:21324.

37. Fedeli D, Carloni M, Nasuti C, Gambini A, Scocco V, Gabbianelli R. 2013. Early life

permethrin exposure leads to hypervitaminosis D, nitricoxide and catecholamines impairment.

Pestic. Biochem. Physiol. 107:93397.

38. Federico A, Dallio M, Loguercio C. 2017. Silymarin/silybin and chronic liver disease: A

marriage of many years. Molecules 22(2): pii: E191.

39. Fogacci F, Grassi D, Rizzo M, Cicero A. 2019. Metabolic effect of berberine‐silymarin

association: A meta‐analysis of randomized, double‐blind, placebo‐controlled clinical trials.

Phytotherapy Research 33:8623 870

40. Forghani P, Khorramizadeh M, Waller E. 2014. Silibinin inhibits accumulation of myeloid‐

derived suppressor cells and tumor growth of murine breast cancer. Cancer Medicine 3(2):

2153224.

41. Gabbianelli R, Falcioni M, Nasuti C, Cantalamessa F, Imada I, Inoue M. 2009b. Effect of

permethrin insecticide on rat polymorphonuclear neutrophils.Chem. Biol. Interact. 182:2453

252.

42. Gabbianelli R,Falcioni M ,Cantalamessa F,Nasuti C. 2009a. Permethrin induces lymphocyte

DNA lesions at both Endo III and Fpg sites and changes in monocyte respiratory burst in rats.

J.Appl. Toxicol. 29:3173322.

43. Galal M, Khalaf A, Ogaly H, Ibrahim M. 2014. Vitamin E attenuates neurotoxicity induced

by deltamethrin in rats. BMC Complement. Altern. Med. 14:458.

44. Gammon D, Brown M, Casida, J. 1981. Two classes of pyrethroid action in the cockroach.

Pesticide Biochemistry and Physiology 15(2): 181-191.

45. Gupta G, Chaitanya R, Golla M, Karnati R. 2013. Allethrin toxicity on human corneal

48
epithelial cells involves mitochondrial pathway mediated apoptosis. Toxicol in Vitro.

27(8):224232248.

46. Holloway S, Salgado V, Wu C, Narahashi T. 1989. Kinetic properties of single sodium

channels modified by fenvalerate in mouse neuroblastoma cells. Pflügers Archiv European

Journal of Physiology 414(6): 613-621.

47. Hossain M, Suzuki T, Sato I, Takewaki T, Suzuki K, Kobayashi H. 2005. Neuromechanical

effects of pyrethroids, allethrin, cyhalothrin and deltamethrin on the cholinergic processes in

rat brain. Life Sciences. 77 (7): 795-807.

48. Hour T, Chen L, Lin J. 1998. Comparative investigation on the mutagenicities of

organophosphate, phthalimide, pyrethroid and carbamate insecticides by the Ames and lactam

tests. Mutagenesis. 13(2): 1573166.

49. Hu F, Li L, Wang C, Zhang Q, Zhang X, Zhao M. 2010. Enantioselective induction of

oxidative stress by permethrin in rat adrenal pheochromocytoma (PC12) cells. Environ.

Toxicol. Chem.29:6833690.

50. Hussain S, Jassim N, Numan I, Al‐Khalifa I, Abdullah T. 2009. Anti‐inflammatory activity of

silymarin in patients with knee osteoarthritis. A comparative study with piroxicam and

meloxicam. Saudi Medical Journal 30(1): 983103.

51. Hussain S. 2007. Silymarin as an adjunct to glibenclamide therapy improves long ‐ term and

postprandial glycemic control and body mass index in type 2 diabetes. Journal of Medicinal

Food 10 (3): 543 3 547.

52. Ince S, Kucukkurt I, Aytekin I, Bacak E. 2010. Short-term effect of deltamethrintreatment on

oxidative stress biomarkers in Anatolian water buffaloes. Asian J. Anim. Vet. Adv. 5:266-270.

53. Jin Y, Chen R, Liu W, Fu Z. 2010. Effect of endocrine disrupting chemicals on the

transcription of genes related to the innate immune system in the early developmental stage of

zebra fish (Danio rerio). Fish. Shellfish Immunol. 28:8543861.

54. Kale M, Rathore N, John S, Bhatnagar D. 1999. Lipid peroxidative damage on pyrethroid

exposure and alterations in antioxidant status in rat erythrocytes: a possible involvement of

reactive oxygen species. Toxicol Lett 105 (3): 197 3 205.

49
55. Karbasforooshan H, Hosseini S, Elyasi S, Fani Pakdel A, Karimi G. 2018. Topical silymarin

administration for prevention of acute radiodermatitis in breast cancer patients: A randomized,

double ‐ blind, placebo ‐ controlled clinical trial. Phytoyherapy Research 33:3793386.

56. Karimi G, Vahabzadeh M, Lari P, Rashedinia M, Moshiri M. 2011. "Silymarin", a promising

pharmacological agent for treatment of diseases. Iranian Journal of Basic Medical Sciences,

14(4): 3083317.

57. Karimi, G, Hassanzadeh‐Josan S, Memar B, Esmaeili S, Riahi‐ Zanjani B. 2018.

Immunomodulatory effects of silymarin after subacute exposure to mice: A tiered approach

immunotoxicity screening. Journal of Pharmacopuncture 21(2):90397.

58. Katiyar S, Mantena S, Meeran S. 2011. Silymarin protects epidermal keratinocytes from

ultraviolet radiation‐induced apoptosis and DNA damage by nucleotide excision repair

mechanism. PLoS ONE 6(6): e21410.

59. Kaviraj A, Gupta A. 2014. Biomarkers of type II synthetic pyrethroid pesticides in freshwater

fish. BioMed research international, 2014: 928063

60. Khan S, Jan MH, Kumar D, Telang AG. 2015. Firpronil induced spermotoxicity is associated

with oxidative stress, DNA damage and apoptosis in male rats. Pestic Biochem Physiol. 124:83

14.

61. Khazim K, Gorin Y, Cavaglieri R, Abboud H, Fanti P. 2013. The antioxidant silybin prevents

high glucose‐induced oxidative stress and podocyte injury in vitro and in vivo. American

Journal of Physiology. Renal Physiology 305 (5): F691 3 F700.

62. Ki Y, Lee J, Park J, Shin I, Koh H. 2012. Reactive oxygen species and mitogen-activated

protein kinase induce apoptotic death of SHSY5Y cells in response to fipronil. Toxicol Lett.

211:18328.

63. Klein D, Moore R. 1979. Pineal N-acetyltransferase and hydroxyindole-O-methyltransferase:

Control by the retinohy-pothalamic tract and the suprachiasmatic nucleus. Brain Res.

174:2453262.

64. Kumar A, Sharma N, 2015. Comparative efficacy of piperine and curcumin in deltamethrin

induced splenic apoptosis and altered immune functions. Pestic. Biochem. Physiol. 119:16-

50
27.

65. Kupferschmidt K. 2016. Pick your poison. Science 354: 171 3 173

66. Lani R, Hassandarvish P, Chiam CW, Moghaddam E, Chu JJ, Rausalu K, Merits A, Higgs S,

Vanlandingham D, Abu Bakar S, Zandi K., 2015. Antiviral activity of silymarin against

chikungunya virus. Scientific Reports 5:11421.

67. Lawrence L, Casida J. 1982. Pyrethroid Toxicology : Mouse lntracerebral Relationships.

Pesticide biochemistry and physiology 18:9-14.

68. Lee J, Kang J, Ki Y, Lee S, Lee S, Lee K, Koh H. 2011. Akt/GSK3b signaling is involved in

fipronil-induced apoptotic cell death of human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Toxicol Lett.

202:133-141.

69. Lemke L, Koehler P, Patterson R. 1989. Susceptibility of the Cat Flea (Siphonaptera:

Pulicidae) to Pyrethroids. Journal of Economic Entomology 82(3): 839-841.

70. Leon-Blanco M, Guerrero J, Reiter R, Calvo J, Pozo D. 2003. Melatonin inhibits telomerase

activity in the MCF-7 tumor cell line both in vivo and in vitro. J. Pineal Res. 35:2043211.

71. Lerner A, Case J, Takahashi Y. 1960. Isolation of melatonin and 5- methoxyindole-3-acetic

acid from bovine pineal glands. J. Biol. Chem.235:199231997.

72. Li H, Wu S, Shi N. 2007a. Transcription factor Nrf2 activation by deltamethrin in PC12 cells:

Involvement of ROS. Toxicol. Lett. 171:87-98.

73. Li H, Zhong Y, Wu S, Shi N. 2007b. NF-E2 related factor 2 activation and heme oxygenase-

1 induction by tert-butylhydroquinone protect against deltamethrin mediated oxidative stress

in PC12 cells. Chem. Res. Toxicol. 20:1242-1251.

74. Luboshitzky R, Shen-Orr Z, Nave R, Lavi S, Lavie P. 2002. Melatonin administration alters

semen quality in healthy men. J. Androl. 23:5723578.

75. Luper S. 1998. A review of plants used in the treatment of liver disease: Part 1. Alternative

Medicine Review 3(6): 4103421.

76. Macchi M, Bruce J. 2004. Human pineal physiology and functional significance of melatonin.

Front. Neuroendocrinol. 25:1773195.

77. Madhubabu G, Yenugu S. 2014. Allethrin induces oxidative stress, apoptosis and calcium

51
release in rat testicular carcinoma cells (LC540), Toxicol. Vitro 28: 1386 - 1395.

78. Madhubabu, G, and Yenugu, S. 2017. Allethrin toxicity causes reproductive dysfunction in

male rats. Environmental Toxicology. 32: 17013 1710

79. Mady F, Hanaa Essa H, El‐Ammawi T, Abdelkader H, Hussein A. 2016. Formulation and

clinical evaluation of silymarin pluroniclecithin organogels for treatment of atopic dermatitis.

Drug Design, Development and Therapy 10:110131110.

80. Malhotra S, Sawhney G, Pandhi P. 2004. The therapeutic potential of melatonin: A review of

the science. Med. Gen. Med. 6:46.

81. Marin V, Gazzin S, Gambaro S, Dal Ben M, Calligaris S, Anese M, Raseni A, Avellini C,

Giraudi P, Tiribelli C, Rosso, N. 2017. Effects of oral administration of silymarin in a juvenile

murine model of non‐alcoholic steatohepatitis. Nutrients 9(9): 1006.

82. McLaughlin G. 1973. History of Pyrethrum. En: Pyrethrum; The Natural Insecticide. Nueva

York. Academic Press. 1973. p 3-14

83. Napolitano J, Lankin D, Graf T, Friesen J, Chen S, McAlpine J, Oberlies N, Pauli G. 2013.

HiFSA fingerprinting applied to isomers with near‐Identical NMR spectra: The

silybin/isosilybin case. Journal of Organic Chemistry 78(7): 282732839.

84. Narahashi T, Carter D, Frey J, Ginsburg K, Hamilton B, Nagata, K, Roy M, Song J,

Tatebayashi H. 1995. Sodium channels and GABAA receptor-channel complex as targets of

environmental toxicants. Toxicology Letters, 82-83: 239-245.

85. Narahashi T, Frey J, Ginsburg K, Roy,M. 1992. Sodium and GABA-activated channels as the

targets of pyrethroids and cyclodienes. Toxicology Letters, 64-65: 429-436.

86. Narahashi T. 1971. Mode of action of pyrethroids. Bulletin of the World Health Organization

44(1):337-345.

87. Narahashi T. 1972. Effects of Insecticides on Excitable Tissues. En: Advances in Insect

Physiology. Academic Press 8:1-93.

88. Narahashi T. 1992. Nerve membrane Na ’ channels as targets of insecticides. Trends in

Pharmacological Sciences 13:231, 236-241.

89. Narendra M, Bhatracharyulu N, Padmavathi P, Varadacharyulu N. 2007. Prallethrin induced

52
biochemical changes in erythrocyte membrane and red cell osmotic haemolysis in human

volunteers, Chemosphere 67: 1065 3 1071.

90. Narendra M, Kavitha G, Helah Kiranmai A, Raghava Rao N, Varadacharyulu N. 2008.

Chronic exposure to pyrethroid-based allethrin and prallethrin mosquito repellents alters

plasma biochemical profile. Chemosphere. 73(3):3603364.

91. Nasuti C, Gabbianelli R, Falcioni M, Di Stefano A, Sozio P, Cantalamessa F. 2007.

Dopaminergic system modulation, behavioral changes, and oxidative stress after neonatal

administration of pyrethroids. Toxicology 229 (2007) 194e205.

92. Nazemian F, Karimi G, Moatamedi M, Charkazi S, Shamsara J, Mohammadpour A. 2010.

Effect of silymarin administration on TNF‐α serum concentration in peritoneal dialysis

patients. Phytotherapy Research 24(11):165431657.

93. Neal A, Yuan Y, Atchison W. 2010. Allethrin differentially modulates voltage-gated calcium

channel subtypes in rat PC12 cells. Toxicol Sci.;116(2):6043613.

94. Negi, A, Kumar J, Luqman S, Shanker K, Gupta M, Khanuja S. 2008. Recent advances in

plant hepatoprotectives: A chemical and biological profile of some important leads. Medicinal

Research Reviews 28(5): 7463772.

95. Nolan J, Roulston W, Schnitzerling H. 1979. The Potential of Some Synthetic Pyrethroids for

Control. Aust Vet J 55(10):463-466.

96. Ogata N, Vogel S, Narahashi T. 1988. Lindane but not deltamethrin blocks a component of

GABA-activated chloride channels. The FASEB Journal. 2:2895-2900.

97. Olgun, S, Misra H. 2006. Pesticides induced oxidative stress in thymocytes. Mol. Cell

Biochem.290: 1373144.

98. Padillo F, Ruiz-Rabelo J, Cruz A, Perea M, Tasset I, Montilla P. 2010. Melatonin and

celecoxib improve the outcomes in hamsterrs with experimental pancreatic cancer. J. Pineal

Res. 49:2643270.

99. Papackova Z, Heczkova M, Dankova H, Sticova E, Lodererova A, Bartonova L, Poruba M,

Cahova M. 2018. Silymarin prevents acetaminophen‐induced hepatotoxicity in mice. PLoS

ONE, 13(1): e0191353.

53
100. Park J, Lee J, Lee S, Park S, Park K, Jeong M, Koh H. 2013. Potential autophagy enhancers

protect against fipronil-induced apoptosis in SH-SY5Y cells. Toxicol Lett. 223:25334.

101. Park J, Park Y, Lee J, Park K, Paik M, Jeong M, Koh H. 2016. Meloxicam inhibits fipronil-

induced apoptosis via modulation of the oxidative stress and inflammatory response in SH-

SY5Y cells. J Appl Toxicol. 36:10323.

102. Polyak S, Ferenci P, Pawlotsky J. 2013. Hepatoprotective and antiviral functions of silymarin

components in HCV infection. Hepatology 57(3):126231271.

103. Rafieian‐Kopaie M, Nasri H. 2012. Silymarin and diabetic nephropathy. Journal of Renal

Injury Prevention 1(1):, 335.

104. Ramadan A, Bakry N, Salam A, Marei A, Eldefrawi A, Eldefrawi M. 1988. Action of

pyrethroids on GABAA receptor function, Pesticide Biochemistry and Physiology.32(2):97-

105,

105. Ramos-Chavez L, Sordo M, Calderon-Aranda E, Castaneda-Saucedo E, Ostrosky-Wegman P,

Moreno-Godinez ME. 2015. A permethrin/allethrin mixture induces genotoxicity and

cytotoxicity in human peripheral blood lymphocytes. J Toxicol Environ Health a. 78(1):7314.

106. Rehman H, Ali M, Atif F, Kaur M, Bhatia K, Raisuddin S. 2006. The modulatory effect of

deltamethrin on antioxidants in mice. Clin. Chim. Acta 369:61-65.

107. Reiter RJ, Acuña-Castroviejo D, Tan D y Burkhardt, S. 2001, Free Radical-Mediated

Molecular Damage. Annals of the New York Academy of Sciences, 939: 200-215.

108. Reiter R.J., Paredes S.D., Manchester L.C., Tan D.X. 2009. Reducing oxidative/nitrosative

stress: A newly-discovered genre for melatonin. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 44:1753200.

109. Romero A, Ramos E, Castellano V, Martínez MA, Ares I, Martínez M, Martínez-Larrañaga

MR, Anadón A. 2012. Cytotoxicity induced by deltamethrin and its metabolites in SH-SY5Y

cells can be differentially prevented by selected antioxidants. Toxicol In Vitro. Sep;26(6):823-

30

110. Romero A, Ares I, Ramos E, Castellano V, Martinez M, Martinez-Larranaga, M, Anadón A,

Martinez, M. 2015. Evidence for dose-additive effects of a type II pyrethroid mixture. In vitro

assessment. Environ. Res. 138:58-66.

54
111. Romero A, Ares I, Ramos E, Castellano V, Martinez M, Martinez-Larranaga M, Anadón A,

Martinez M. 2015. Evidence for dose-additive effects of a type II pyrethroid mixture. In vitro

assessment. Environ. Res. 138:58-66.

112. Romero A, Ramos E, Ares I, Castellano V, Martínez M, Martínez-Larrañaga M, Anadón A,

Martínez M. 2016. Fipronil sulfone induced higher cytotoxicity than fipronil in SH-SY5Y

cells: protection by antioxidants. Toxicol Lett. 252:42349.

113. Ross S. 2008. Milk thistle (Silybum marianum): An ancient botanical medicine for modern

times. Holistic Nursing Practice 22(5): 2993300.

114. Ruiz-Rabelo J, Vázquez R, Arjona A, Perea D, Montilla P, Túnez I. 2011. Improvement of

capecitabine antitumoral activity by melatonin in pancreatic cancer. Pancreas. 40:4103414.

115. Ruiz-Rabelo J, Vázquez R, Perea M, Cruz A, González R, Romero A. 2007. Beneficial

propierties of melatonin in an experimental model of pancreatic cancer. J. Pineal Res. 43:2703

275.

116. Schechter M, Green N, LaForge F. 1949. Constituents of pyrethrum flowers XIII. Cinerolone

and the synthesis of related cyclopentenolones. J. Am. Chem. Soc. 71:316533173.

117. Schernhammer E, Giobbie-Hurder A, Gantman K, Savoie J, Scheib R, Parker L, Chen W.

2012. A randomized controlled trial of oral melatonin supplementation and breast cancer

biomarkers. Cancer Causes Control. 23:6093616.

118. Sharifi R, Rastegar H, Kamalinejad M, et al., 2012. Effect of topical application of silymarin

(Silybum marianum) on excision wound healing in albino rats. Acta Medica Iranica 50(9):

5833588.

119. Shen C, Shen D, Shentu J, Wang M, Wan M. 2015. Could humic acid relieve the biochemical

toxicities and DNA damage caused by nickel and deltamethrin in earthworms (Eisenia

foetida)? Environ. Sci. Proc. Imp. 17:2074-2081.

120. Sitio Web Pubchem. 2020. Estados Unidos: National Center for Biotechnology Information -

Pubchem. [Internet], [02 agosto 2020]. Disponible en:

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11442

121. Soderlund M, Bloomquist J. 1989. Neurotoxic actions of pyrethroid insecticides. Annu. Rev.

55
Entomol. 34(90): 77-96.

122. Soderlund D, Clark J, Sheets L, Mullin L, Piccirillo V, Sargent D, Stevens J, Weiner, M. 2002.

Mechanisms of pyrethroid neurotoxicity: implications for cumulative risk assessment.

Toxicology 171(1):3-59.

123. Soderlund D, Knipple D. 2003. The molecular biology of knockdown resistance to pyrethroid

insecticides. Insect Biochemistry and Molecular Biology 33(6):563-577.

124. Soderlund D. 2010. Toxicology and Mode of Action of Pyrethroid Insecticides. En: Hayes’

Handbook of Pesticide Toxicology. 3º ed. USA: 166531686.

125. Soderlund D. 2012. Molecular mechanisms of pyrethroid insecticide neurotoxicity: Recent

advances. Archives of Toxicology 86(2):165-181.

126. Stolf A, Cardoso C, Acco A. 2017. Effects of silymarin on diabetes mellitus complications: A

review. Pytotherapy Research 31(3): 3663374.

127. Stubbs V, Wilshire C, Webber L. 1982. Cyhalothrin4a novel acaricidal and insecticidal

synthetic pyrethroid for the control of the cattle tick (Boophilus microplus) and the buffalo fly

(Haematobia irritans exigua). Australian Veterinary Journal, 59(5):152-155.

128. Tajmohammadi A, Razavi B, Hosseinzadeh H. 2018. Silybum marianum (milk thistle) and its

main constituent, silymarin, as a potential therapeutic plant in metabolic syndrome: A review.

Phytotherapy Research 32(10): 193331949.

129. Tan D, Manchester L, Terron M, Flores L, Reiter R. 2007. One molecule, many derivatives:

A never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species. J. Pineal

Res. 42:28342.

130. Taplin D. 2011. Pyrethrins and Pyrethroids in Dermatology. Archives of Dermatology 126(2):

213.

131. Tavares M, Palma I, Medeiros H, Guelfi M, Santana A, Mingatto F. 2015. Comparative effects

of fipronil and its metabolites sulfone and desulfinyl on the isolated rat liver mitochondria.

Environ Toxicol Pharmacol. 40:2063214.

132. Ullah H, Khan H. 2018. Anti‐Parkinson potential of silymarin: Mechanistic insight and

therapeutic standing. Frontiers in Pharmacology 9: 422.

56
133. Valentine W. 1990. Pyrethrin and pyrethroid insecticides. Veterinary Clinics of North America

- Small Animal Practice 20(2): 375-382.

134. Vargas‐Mendoza N, Madrigal‐Santillán E, Morales‐González A, Esquivel‐Soto J, Esquivel‐

Chirino C, García‐Luna y González‐Rubio M, Gayosso-de-Lucio J, Morales‐González J.

2014. Hepatoprotective effect of silymarin. World Journal of Hepatology 6(3): 1443149.

135. Verschoyle R, Aldridge W. 1980. Structure-activity relationships of some pyrethroids in rats.

Archives of Toxicology 45(4): 325-329.

136. Verschoyle R, Barnes J. 1972. Toxicity of natural and synthetic pyrethrins to rats. Pesticide

Biochemistry and Physiology 2(3):308-311.

137. Vijverberg H, van der Zalm J, van den Bercken J. 1982. Similar mode of action of pyrethroids

and DDT on sodium channel gating in myelinated nerves. Nature 295: 6013603

138. Vidau C, Gonzalez-Polo R, Niso-Santano M, Gomez-Sanchez R, Bravo-San Pedro J, Pizarro-

Estrella E, Blasco R, Brunet J, Belzunces L, Fuentes J. 2011. Fipronil is a powerful uncoupler

of oxidative phosphorylation that triggers apoptosis in human neuronal cell line SHSY5Y.

Neurotoxicology. 32:9353943.

139. Voroneanu L, Nistor L, Dumea R, Apetrii A. 2016. Silymarin in type 2 diabetes mellitus: A

systematic review and meta‐analysis of randomized controlled trials. Journal Diabetes

Research 2016:5147468.

140. Wang X, Li Y, Zhong S, Zhang H, Wang X, Qi P, Xu H. 2013. Oxidative injury is involved

in fipronil-induced G2/M phase arrest and apoptosis in Spodoptera frugiperda (Sf9) cell line.

Pest Biochem Physiol. 105:1223130.

141. Wang X, Aránzazu M, Wu Q, Ares I, Martínez-Larrañaga M, Anadón A, Yuan Z. 2016a.

Fipronil insecticide toxicology: oxidative stress and metabolism, Critical Reviews in

Toxicology 46:10, 876-899

142. Wang X, Martinez, M, Dai M, Chen D, Ares I, Romero A, Castellano V, Martinez M,

Rodriguez J, Martinez-Larrañaga, M, Anadón A, Yuan Z. 2016b. Permethrin-induced

oxidative stress and toxicity and metabolism. A review. Environ. Res. 149:86-104.

143. Warmke J, Reenan R, Wang, P, Qian S, Arena J, Wang J, Wunderler D, Liu K, Kaczorowski

57
G, Van der Ploeg L, Ganetzky B, Cohen C. 1997. Functional expression of Drosophila para

sodium channels. Modulation by the membrane protein TipE and toxin pharmacology. The

Journal of general physiology. 110 (2), 119 3 133.

144. Won D, Kim L, Jang B, Yang I, et al., 2018. In vitro and in vivo anti‐cancer activity of

silymarin on oral cancer. Tumor Biology 40(5): 1010428318776170.

145. Wu A, Liu Y. 1999. Effects of deltamethrin on nitric oxide synthase and poly(ADPribose)

polymerase in rat brain. Brain Res. 850:249-252.

146. Yaghmaei P, Azarfar K, Dezfulian M, Ebrahim‐Habibi A. 2014. Silymarin effect on amyloid‐

β plaque accumulation and gene expression of APP in an Alzheimer's disease rat model. Daru

22(1):24.

147. Yamamoto D, Quandt F, Narahashi T. 1983. Modification of single sodium channels by the

insecticide tetramethrin. Brain Research 274(2): 344-349.

148. Zhang B, Xu Z, Zhang Y, Shao X, Xu X, Cheng J, Li Z. 2015. Fipronil induces apoptosis

through caspase-dependent mitochondrial pathways in Drosophila S2 cells. Pest Biochem

Physiol. 119:81389.

149. Zhang J, Wang Y, Xiang H, Li M,Li W, Ma K, Wang X, Zhang J, 2011. Oxidative stress: role

in acetamiprid-induced impairment of the male mice reproductivesystem.Agric.Sci.China 10:

7863796.

150. Zhang W. 2018. Global pesticide use: Profile, trend, cost / benefit and more. Proceedings of

the International Academy of Ecology and Environmental Sciences, 8(1): 1-27

58
VIII. APÉNDICE

VIII.1. Resultados

VIII.1.1. Resultados (%) de tratamiento con melatonina y silibina frente a la

citotoxicidad producidos por el piretroide aletrín en células de neuroblastoma

SH‑SY5Y

Control Control + Control + Vehículo Control + Vehículo Control + Vehículo


Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)

97.18757 96.93382 75.5678 111.144 95.79192

105.3711 105.3711 51.1694 108.2893 120.8332

99.47134 97.94883 84.9503 106.7033 101.2878

100.7401 99.53478 77.6549 101.605 107.0607

98.01227 100.296 64.8234 107.528 93.4447

99.21759 91.7953 62.4128 107.9488 109.8118

VIII.1.2. Resultados (Unidades fluorescentes) de tratamiento con melatonina y

silibina sobre la producción de ROS inducidos por el piretroide aletrín en

células de neuroblastoma SH‑SY5Y.

Control Control + Control + Vehículo Control + Vehículo Control + Vehículo


Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)

1532 1528 2137 1752 1510

1661 1661 3644 1707 2220

1568 1544 1812 1682 1439

59
1588 1569 1697 1444 1530

1545 1581 1810 1695 1473

1564 1447 1772 1544 1731

VIII.1.3. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la variación de

la expresión génica NFkB1 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos

por el piretroide aletrín.

Control Control + Control + Vehículo Control + Vehículo Control + Vehículo


Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)

1.1 1.03 2.6 2.6 1.5

0.9 1.2 2.6 1.9 1.6

1.3 0.85 2.3 2.1 1.8

0.85 0.89 2.7 2.2 1.4

0.85 0.86 2.8 1.7 1.3

1.1 1.2 2.9 1.3 1.5

VIII.1.4. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la variación de

la expresión génica Nrf2 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por

el piretroide aletrín.

Control Control + Control + Vehículo Control + Vehículo Control + Vehículo


Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)

1.2 1.3 0.5 0.56 0.88

60
1.02 0.7 0.66 0.78 0.89

1.01 0.99 0.45 0.69 0.78

0.88 0.89 0.78 0.88 0.97

0.89 1.1 0.32 0.89 0.89

0.98 1.06 0.65 0.85 0.99

VIII.1.5. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la variación de

la expresión génica SOD2 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por

el piretroide aletrín.

Control Control + Control + Vehículo Control + Vehículo Control + Vehículo


Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)

1.1 0.78 0.56 0.56 0.88

0.89 0.99 0.77 0.59 0.99

0.87 1.3 0.78 0.58 0.78

0.85 1.2 0.26 0.47 0.79

1.2 1.1 0.56 0.81 0.88

0.99 0.89 0.45 0.55 0.71

VIII.1.6. Resultados (tasa de cambio) de melatonina y silibina sobre la variación de

la expresión génica GPX1 en células de neuroblastoma SH‑SY5Y inducidos por

el piretroide aletrín.

61
Control Control + Control + Control + Vehículo Control + Vehículo
Vehículo Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)

1.02 0.99 0.65 0.66 0.89

0.79 1.2 0.66 0.55 0.69

0.99 1.1 0.51 0.45 0.79

1.3 1.3 0.62 0.49 0.73

1.2 0.78 0.45 0.48 0.99

0.99 0.89 0.49 0.87 0.72

62

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