Retuerto PF
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Retuerto PF
TESIS
Para optar el Título Profesional de Médico Veterinario
AUTOR
Francisco Javier RETUERTO POLO
ASESOR
Dra. Mariella RAMOS GONZALEZ
Lima, Perú
2022
Reconocimiento - No Comercial - Compartir Igual - Sin restricciones adicionales
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
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Referencia bibliográfica
Datos de autor
Datos de asesor
Datos de investigación
CÓDIGO:01112683.
4. RECOMENDACIONES
__________________________________________________________
Página 1 de 4
6. PÚBLICO ASISTENTE: (Nombre, apellido y DNI)
Nombres y
DESCRIPCIÓN N° DNI Correo electrónico
Apellidos
Francisco
TESISTA 1 Retuerto franciscoretuerto@gmail.com
Polo
María
2 Vásquez mvasquezc@unmsm.edu.pe
Cachay
Mariella
3 Ramos mramosgo@unmsm.edu.pe
Gonzalez
JURADO
Francisco
4 Suárez fsuareza@unmsm.edu.pe
Aranda
Alexei
5 Santiani asantiania@unmsm.edu.pe
Acosta
Víctor Hugo
6 Castillo 40723051 vcastillod@unmsm.edu.pe
Doloriert
Faride
9 Altamirano 43695598 faltamiranoz@unmsm.edu.pe
Zevallos
Raúl Lucas
13 42249664 jlucasl@unmsm.edu.pe
Lopez
Zoyla Mirella
15 Clavo 07717043 zclavop@unmsm.edu.pe
Peralta
COMITÉ DE
SUSTENTACIONES
Mary
Consuelo
17 72217008 mary.sanchez@unmsm.edu.pe
Sánchez
Chumbe
Maria
Antonia
18 72284500 maria.yupanqui1@unmsm.edu.pe
Yupanqui
Pimentel
Leonardo
Jesus
19 10728715 leonardo.giraldo@unmsm.edu.pe
Giraldo
Bardalama
Página 2 de 4
Luis Alberto
20 Inostroza 18089817 linostrozar@unmsm.edu.pe
Ruiz
Junior
21 Francisco 70798064 Junior.siguas@unmsm.edu.pe
Siguas Peña
Carlos
Alberto
22 47488243 carloss.vch@gmail.com
Villaorduña
Chafloque
Medalith
23 Gretel Sierra 73257866 medalith.sierra@unmsm.edu.pe
Marquina
Claudia
Valeria
24 71220558 claudia.nunez1@unmsm.edu.pe
Nuñez La
Torre
Carmen
25 Mirella Polo
Rincón
Carmen
26
Retuerto
Mariela
27 Ramos
Ipanaque
INGRESARON SIN
INSCRIBIRSE Max Hansel
28 De La Cruz
Perez
Paola
29 Berríos
Ledesma
Juan
30 Olazabal
Loayza
Andrés
INFORMÁTICA 31 informatica.fmv@unmsm.edu.pe
Trujillo Peña
Página 3 de 4
7. FIRMAS DE LOS MIEMBROS DEL JURADO
8.
Firma
Apellidos y Nombres
PRESIDENTE
Firma Firma
Firma
MV. Dra. Ramos Gonzalez, MV. Dr. Suárez Aranda, MV. Dr. Santiani Acosta,
Mariella Fidel Francisco Alexei Vicent
Página 4 de 4
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
Facultad de Medicina Veterinaria
Escuela Profesional de Medicina Veterinaria
ep.veterinaria@unmsm.edu.pe
<AÑO DE LA UNIVERSALIZACIÓN DE LA SALUD=
RESUMEN .................................................................................................................................... 6
ABSTRACT .................................................................................................................................. 7
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 8
II.1.1. Generalidades........................................................................................................ 9
II.3.2. Deltametrina........................................................................................................ 19
2
III.2.1. Materiales............................................................................................................ 27
III.3.5. Expresión de genes vinculados al estrés oxidativo por medio de PCR en tiempo
real. ...................................................................................................................... 31
V. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 40
3
VIII.1.2. Resultados (Unidades fluorescentes) de tratamiento con melatonina y silibina
sobre la producción de ROS inducidos por el piretroide aletrín en células de
neuroblastoma SH‑SY5Y. ..................................................................................... 59
4
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 2 Propiedades físico-químicas del piretroide insecticida aletrín. (Pubchem, 2020) .................... 16
Tabla 3 Secuencia de primers forward y reverse para genes relacionados a estrés oxidativo e
inflamación&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&...32
5
RESUMEN
Los piretroides son compuestos sintéticos de amplio uso en la actividad agropecuaria. Estos
compuestos pueden resultar peligrosos para la salud humana y animal por producir signos clínicos
de índole nerviosa, por lo que resulta importante un mayor conocimiento sobre la reversión del daño
a nivel celular causados por la intoxicación con estos plaguicidas químicos. Debido a esto, nuestro
estudio tuvo como objetivo evaluar la citoprotección de los antioxidantes melatonina y silibina frente
al efecto citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín, primer piretroide sintético, en las células de
estrés oxidativo, citotoxicidad y enfermedades neurodegenerativas. Para eso evaluamos el efecto del
piretroide aletrín solo y en co-incubación simultánea con melatonina o silibina sobre la viabilidad
celular (a través del ensayo con sales de tetrazolio - MTT), sobre la producción de especies reactivas
de oxígeno (ROS) y sobre la expresión de genes relacionados a estrés oxidativo (Nrf2, NFkB1, SOD2
y GPX1). Nuestro estudio demostró que los antioxidantes melatonina y silibina presentan un efecto
citoprotector frente al efecto citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín en las células SH-SY5Y,
ambos antioxidantes muestran una capacidad para inhibir el incremento de los valores de ROS, así
como detener la disminución de la viabilidad celular en células SH-SY5Y incubadas con aletrín, y
con respecto a la alteración de la homeostasis oxidativa producido por aletrín en la línea SH-SY5Y
a través de genes implicados en vías de señalización de estrés oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2
y GPX1, la silibina parece mostrar un mayor efecto protector sobre este efecto.
6
ABSTRACT
Pyrethroids are synthetic compounds widely used in agricultural activity. These compounds
can be dangerous for human and animal health because they produce clinical signs of a nervous
nature, which is why greater knowledge about the reversal of damage at the cellular level caused by
poisoning with these chemical pesticides is important. Due to this, our study aimed to evaluate the
cytoprotection of the antioxidants melatonin and silybin against the cytotoxic effect caused by the
pyrethroid allethrin, the first synthetic pyrethroid, in SH-SY5Y neuroblastoma cells, an in vitro
model widely used in research related to oxidative stress, cytotoxicity and neurodegenerative
diseases. For this, we evaluated the effect of the pyrethroid allethrin alone and in simultaneous co-
incubation with melatonin or silybin on cell viability (through the assay with tetrazolium salts -
MTT), on the production of reactive oxygen species (ROS) and on the expression of genes related to
oxidative stress (Nrf2, NFkB1, SOD2 and GPX1). Our study demonstrated that the antioxidants
melatonin and silybin have a cytoprotective effect against the cytotoxic effect caused by the
pyrethroid allethrin in SH-SY5Y cells. Both antioxidants show an ability to inhibit the increase in
ROS values, as well as stop the decrease in ROS. cell viability in SH-SY5Y cells incubated with
allethrin, and regarding the alteration of oxidative homeostasis produced by allethrin in the SH-SY5Y
line through genes involved in oxidative stress signaling pathways such as NFkB1, Nrf2, SOD2 and
7
I. INTRODUCCIÓN
demostrado ser eficientes en la mejora de cultivos y la sanidad animal, de ahí su amplio uso en el
mundo. Dentro de este grupo de compuestos insecticidas encontramos a los piretroides que son
análogos sintéticos de las piretrinas naturales y que al pasar del tiempo han ido reemplazando a otros
con dos tipos (Tipo I y Tipo II) de acuerdo a su clasificación estructural química (Soderlund et al,
2002, Bradberry et al., 2005). En el grupo de compuestos piretroides sintéticos tenemos al aletrín
El mecanismo de acción de aletrín, así como del resto de piretroides sintéticos, implica la
prolongación del tiempo de apertura de canales de sodio dependientes de voltaje, lo que ocasiona un
aumento de los ciclos despolarizantes de las células neuronales, lo que se manifiesta en signos
clínicos de relación nerviosa como salivación, incoordinación motora, temblores entre otros, en
Hace algunos años se creía que los piretroides, al haber reemplazado a otros plaguicidas
como organofosforados, eran los más seguros en el mercado; sin embargo, en la actualidad se viene
demostrando su peligrosidad para salud de humanos y animales, así como su impacto en el ambiente
(Kupferschmidt, 2016)..
Por estos motivos, nuestro estudio tiene como objetivo evaluar la citoprotección de dos
antioxidantes (melatonina y silibina) frente al efecto citotóxico ocasionado por el piretroide aletrín
en células de la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y. Para eso evaluamos el efecto resultante
del piretroide aletrín solo y en co-incubación con melatonina o silibina sobre la viabilidad celular,
8
sobre la producción de ROS, por sus siglas en inglés, reactive oxygen species (especies reactivas de
oxígeno) y sobre la manifestación de genes vinculados al estrés oxidativo (Nrf2, NFkB1, SOD2 y
GPX1). Nuestro estudio pretende demostrar la capacidad citoprotectora que tienen estos dos
antioxidantes frente al piretroide aletrín como una alternativa viable de profilaxis frente a la creciente
II.1. PIRETROIDES
II.1.1. Generalidades
Los insecticidas piretroides son derivados sintéticos del insecticida natural pyrethrum,
utilizado en Asia y Persia antes del siglo XX (McLaughlin, 1973; Taplin, 2011), extraído del
insecticidas fotolábiles tóxicos para los insectos (Casida, 1980; Coats, 1990; Soderlund, 2012).
Los ésteres cetoalcohólicos de los ácidos crisantémico y piretroico confieren sus propiedades
insecticidas a las piretrinas. Estos compuestos de naturaleza fuertemente lipofílica son capaces de
penetrar en el cuerpo de los insectos rápidamente y producir una toxicosis. Las piretrinas naturales
de forma suficiente en el organismo de los insectos para poder matarlos. Se han realizado interesantes
y las formulaciones para desarrollar mejores compuestos (piretroides) que presenten rendimiento
biológico y propiedades químicas adecuadas para el sector agrario. Es así que se han producido la
adición del grupo ciano en el resto de alcohol, las halogenaciones de la cadena lateral de ciclopropano
grado técnico (las cuales contienen 85% o más de los ingredientes activos), compuesto con solventes
Terminada la segunda guerra mundial, las piretrinas fueron reemplazadas por insecticidas
más económicos y estables, los cuales estaban compuestos por los organoclorados y los
9
organofosforados, pero en la década de los 1970, por aspectos ligados a la conservación ambiental y
a la toxicidad relacionada con los vertebrados, se observó el retorno de las piretrinas y el desarrollo
coordinación del movimiento, convulsiones y parálisis final), que indican acción a nivel del sistema
Piretrinas Piretroides
Ésteres del ácido Ésteres del ácido Ésteres sin el grupo α Ésteres con el grupo α
crisantémico pirétrico ciano ciano
Tipo I Tipo II
Piretrina I Piretrina II 1º generación 3º generación
Aletrín Fenvalerato
Cinerina I Cinerina II 2º generación 4º generación
Resmetrín
Jasmolina I Jasmolina II 3º generación Cialotrín
Permetrín Cipermetrina
4º generación Deltametrin
Bifentrín
(Kaviraj y Gupta, 2014)
los Estados Unidos (Schechter et al, 1949). Posterior a esto y de acuerdo a su estructura, estos se
clasificaron en piretroides tipo I, sin la adición de un grupo α-ciano (entre los cuales se encuentra el
aletrín), y piretroides tipo II, que contienen el grupo α-ciano, lo cual le confiere un mayor poder
neurotóxico que los de tipo I (Soderlund et al, 2002, Bradberry et al., 2005).
modificación de la cinética de los canales de sodio dependientes de voltaje, que moderan el aumento
transitorio de la permeabilidad del sodio de la membrana de las células excitables (Narahashi, 1971,
10
1972, 1992; Narahashi et al., 1992). Se ha observado que los piretroides prolongan el tiempo de
apertura de canales de sodio sensibles al voltaje como resultado de la reducción de la tasa de cierre
y por inducir actividad repetitiva intensa en órganos sensibles y en fibras nerviosas desmielinizadas
(Vijverberg et al., 1982; Yamamoto et al., 1983; Holloway et al., 1989). Asimismo, se ha observado
diferentes efectos a nivel de canales de iones sodio, calcio y cloruro con los piretroides Tipo I, no α-
De acuerdo a los estudios de Narahashi (1992) en ratas describió que en dos tipos de canales
de sodio se observa una gran sensibilidad diferencial a los piretroides. Las neuronas del ganglio de
las raíces dorsales de la rata presentaban dos tipos de canales de sodio, uno insensible a la acción
bloqueadora de la tetrodotoxina (TTX) y el otro sensible a TTX. Dos piretroides, uno de tipo I
(aletrín) y el otro de tipo II (deltametrina), mostraron a nivel del canal de sodio que presentaba
resistencia a TTX eficacia para prolongar la corriente de sodio, aunque solo presentaron un pequeño
efecto en el canal de sodio sensible a TTX. Ambos canales de sodio mostraron diferencias en sus
propiedades fisiológicas, las que incluyen el voltaje de activación y la inactivación en estado estable,
que incluyen sensibilidad nerviosa reducida, han permitido confirmar que los canales de sodio
sensibles al voltaje son sus principales sitios de acción (Soderlund y Knipple, 2003).
De igual manera, los piretroides tipo II, en preparaciones de cerebro de mamíferos, son
capaces de unirse y bloquear receptores GABA. Este bloqueo tiene un efecto neuroexcitador
indirecto el cual implica la eliminación de la entrada neuronal inhibitoria, así como ser el modo de
consistencia entre la acción en los receptores GABA con los signos excitadores de intoxicación por
piretroides. La acción que presentan los piretroides a nivel de los receptores GABA, para los
11
la estereoespecificidad absoluta esperada debido a las relaciones estructura-toxicidad. En sistemas
experimentales en los que los efectos sobre los receptores GABA y los canales de sodio pueden
piretroide que alteran la función del canal de sodio (Abalis et al., 1986; Soderlund et al., 2010).
Para el caso de la deltametrina, se ha reportado que esta no tiene efectos sobre la actividad
de los receptores de canal GABA (Ogata, 1988), por lo que la discrepancia con la reportes previos
sugeriría que el sistema GABA está involucrado en intoxicación por deltametrina solo en altas dosis
(Bloomquist y Soderlund, 1985) La escasa correlación entre las potencias de los piretroides para
inhibir la función del receptor GABAA y sus toxicidades, incluso entre los piretroides de tipo II,
sugiere que el receptor GABAA no es un objetivo primario crítico para la toxicidad de los piretroides.
Sin embargo, la potencia de los piretroides para inhibir la función del receptor GABAA y su
estereoespecificidad abogan por una acción específica sobre el receptor GABAA como un objetivo
síndrome CS fue similar a los signos de intoxicación producida por administración intracerebral de
II.1.3. Clasificación
fundamentados según los signos de intoxicación que producen (Barnes y Verschoyle, 1974; Gammon
et al., 1981; Lawrence y Casida, 1982; Verschoyle y Aldridge, 1980), y de acuerdo a su conformación
Los piretroides tipo I producen una intoxicación conocida como el <Síndrome T=, en el cual
12
cuerpo, convulsiones; mientras que los piretroides tipo II poseen un grupo α-ciano en su molécula y
salivación (Lawrence y Casida, 1982; Verschoyle y Aldridge, 1980; Verschoyle y Barnes, 1972),
aunque algunos piretroides tipo II exhiben signos de ambos síndromes (Soderlund et al., 2002)
(Figura 1).
Síndrome T Síndrome CS
Agresividad Coreoatetosis
Incoordinación Incoordinación
Irritabilidad Masticación
Postración Hiperactividad
Muerte Muerte
Las corrientes de cola inducidas por la permetrina para la descomposición de Para / TipE
disminuyen al menos 100 veces más lentamente que las observadas en estudios de canales de sodio
de mamíferos o invertebrados marinos. Esto sugiere que la toxicidad selectiva de los insecticidas
piretroides se debería en parte a la gran afinidad de los piretroides a los canales de sodio de los
producido por los primeros piretroides se caracteriza por presentar temblores similares a los que se
13
observan a los producidos por DDT; el síndrome CS, producido por piretroides más avanzados, se
Estudios en ratas (EPA, 2009; Ray y Forshaw, 2000; Wolansky y Harrill, 2008), se han
II.1.5. Usos
grupo de insecticidas se encontraba en el segundo lugar en la lista de insecticidas más usados a nivel
garrapatas, pulgas, etc (Breese, 1977; Casida et al., 1983; Lemke, et al., 1989; Nolan et al., 1979;
Stubbs, et al., 1982). Asimismo, este tratamiento está ampliamente difundido, tanto en animales de
compañía, así como en los destinados a consumo humano, en diferentes formulaciones, como pour
II.2.1. Estructura
14
El aletrín es el primer piretroide descubierto y pertenece al Tipo I. El nombre IUPAC
(Pubchem, 2020)
El aletrín aparece como un líquido viscoso de color ámbar, insoluble y más denso que el
agua. Tóxico por ingestión, inhalación y absorción cutánea. Un insecticida doméstico sintético que
15
Tabla 2. Propiedades físico-químicas del piretroide insecticida aletrín. (Pubchem, 2020)
doméstico. Asimismo, se encuentra en aumento la preocupación por la salud. Sin embargo, y a pesar
de la creciente incidencia de resistencia insecticida a los insecticidas como piretroides, su uso sigue
como aletrín, y hay una gran variedad de dispositivos insecticidas como bobinas de mosquitos,
a los cultivos en forma de pulverizadores aéreos y terrestres, o se aplican en interiores como aerosoles
o bombas de aerosol disponibles comercialmente. El cuerpo humano puede ser expuesto a los efectos
producidos por los piretroides, teniendo en cuenta la vía de administración de estos insecticidas: al
absorberse vía respiratoria, en caso de vapor; vía gastrointestinal. posterior a su ingesta; y por
16
absorción a nivel de la epidermis mediante el contacto directo con órganos sensoriales a nivel de
sistema nervioso periférico. El aletrín es un piretroide tipo I que ha sido ampliamente utilizado como
componente principal de los insecticidas utilizados para controlar las plagas domésticas (Gupta et
La exposición aguda y crónica a aletrín puede dañar tejidos como el sistema nervioso,
sistema sanguíneo, tejido adiposo y otros tejidos (Narendra et al., 2007; Ramoz-Chavez et al., 2015).
para unirse e inhibir el cierre de los canales de sodio a nivel de la membrana de la célula nerviosa,
para prolongar el potencial de membrana que conlleva a la hiperactividad del sistema nervioso,
produciendo finalmente la parálisis y/o la muerte. El aletrín es capaz de persistir por periodos
degradación de aletrín a través de la vía oxidativa conlleva a la generación de radicales libres que
causan daño en el ADN y diversos efectos adversos para la salud (Kale et al., 1999).
Por otro lado, se ha reportado que aletrín induce neurotoxicidad en roedores (Bloomquist,
1996; Hossain et al 2005), genotoxicidad en sistemas bacterianos (Hour et al., 1998) y genotoxicidad
en linfocitos de sangre periférica humana (Ramos-Chavez et al., 2015). La apoptosis mediada por
mitocondrias se presenta como el mecanismo implicado de toxicidad para el aletrín en las células
epiteliales de córnea (Gupta et al., 2013). El mecanismo de acción del aletrín varía de acuerdo al
observado una alteración en perfiles bioquímicos correspondientes a plasma de humanos que fueron
17
En ratas que fueron expuestas a aletrín por un periodo de 60 días (Madhubabu y Yenugu,
2016), se presentó compromiso a nivel del patrón de expresión en genes implicados en el transporte
resultados, la toxicidad del aletrín afectaría la función reproductiva al presentar acción a nivel
su función.
producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como los efectos tóxicos relacionados in
vivo. En ratas tratadas con PER (150 mg / kg de peso corporal / día) durante 60 días, PER redujo la
producción de O2.- y H2O2 en monocitos de rata en el grupo bajo tratamiento frente al grupo control
(Gabbianelli et al., 2009a). No obstante, PER incrementó la producción de O2.- (33 veces), así como
In vitro, también se observó que PER condujo a la producción de ROS. En el caso de ratones
C57BL/6, sus células tímicas expuestas a PER (150, 300, 600 y 1000 mM) por 12 h, presentaron
liberación de O2.- posterior a los cinco minutos de exposición, con efectos significativos en la
reveló que PER (10 mM) produjo una reducción en la liberación de O2.- de la cadena transportadora
de electrones al inhibir el complejo mitocondrial I, sugiriendo que las ROS mitocondriales no estaban
18
involucradas en el daño del ADN nuclear (Falcioni et al., 2010). Adicionalmente, PER mostró
enantiómeros, los cuales fueron selectivos al estrés oxidativo al tratarse las células con PER. En un
PER (10, 20 y 30 mg/L), 1S-cis-PER (10, 20 y 30 mg/L), 1S-trans-PER (10 , 20 y 30 mg/L), 1S-
sugiere que la enantioselectividad debe tenerse en cuenta al evaluar los efectos oxidativos de PER
nítrico (NO) (Zhang et al., 2011). En un estudio realizado en peces cebra, con el fin de investigar la
toxicidad inmune de algunos productos químicos disruptores endocrinos, entre los que se incluye el
PER, se reveló que este incrementó de forma significativa la expresión de ARNm de la sintasa de
óxido nítrico inducida (iNOS) después de que estos animales fueron expuestos a PER (0.1, 0.5, 2.5
y 12.5 mg/L) durante 3 días en la etapa embrionaria, lo cual sugiere que la generación de NO podría
estar implicada en la muerte de las células inmunes en este pez (Jin et al., 2010).
En los estudios para evaluar los efectos de la exposición al PER desde el día posterior al
parto hasta el día 21 o la vida temprana de la rata con 300 o 500 días, una dosis baja de PER (34.05
mg / kg pc) disminuyó los niveles de NO en el cuerpo estriado e hipocampo, y aumento del nivel
plasmático de NO, lo que sugiere que la generación de NO podría depender de los tejidos, y que las
especies reactivas de nitrógeno (RNS) observadas en ratas adultas podría deberse al tratamiento con
PER en etapas tempranas de la vida (Carloni et al, 2013; Fedeli et al, 2013).
II.3.2. Deltametrina
19
El estrés oxidativo se entiende como la falta de equilibrio entre agentes antioxidantes y
oxidantes, el cual se presenta a través de la formación de un excedente de ROS y/o radicales libres,
como es el caso del peróxido de hidrógeno (H2O2), el anión superóxido (O2•-), el hidroperoxilo
radical (HOO•) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) como el óxido nítrico catalizado por la
sintasa de óxido nítrico (NOS) y peroxinitrito (Dasuri et al., 2013). La deltametrina causa daño por
estrés oxidativo a través de la generación de ROS y RNS (Rehman et al., 2006; Romero et al., 2015).
Deltametrina (10 μM) incrementó de forma significativa la generación de ROS en las células de rata
PC12 de feocromocitoma suprarrenal (Li et al., 2007a; Li et al., 2007b). De igual manera, en dosis
de 25 y 50 μM de deltametrina, por 1 h elevaron los niveles de ROS, que sirven como un marcador
Estas investigaciones in vitro muestran que la deltametrina podría causar de forma directa
un daño por estrés oxidativo por medio de la generación de ROS. In vivo, se presentó una elevación
significativa que depende del tiempo y la dosis en la generación de ROS en la trucha arco iris
daño oxidativo (Romero et al., 2012). Un estudio descubrió que al administrar deltametrina en el
cerebro de ratas, en dosis de 12,5 mg/kg de peso corporal, incrementaron de forma significativa las
de nNOS y PARP (Wu y Liu, 1999). Asimismo, otros estudios en ratas han demostrado la inducción
de neurotoxicidad por parte de la deltametrina (0.6 mg/kg peso corporal); este efecto tóxico se debió,
en parte a la generación de NO (Galal et al., 2014; Ogaly et al., 2015). Estos estudios demostraron
Escarate, 2015), el factor principal que se requiere para generar el estrés oxidativo (Arslan et al.,
20
2017). Posterior al tratamiento con deltametrina, los niveles plasmáticos de NO incrementaron (7,5
oxidativo que induce la deltametrina, así como la toxicidad vinculada es debido a la generación de
equilibrio de la antioxidación para producir daño celular al ADN, las proteínas y los lípidos, (Shen
FIP puede inducir estrés oxidativo que conduce a la generación de ROS y efectos tóxicos
relacionados in vivo. En el caso de ratas Wistar, cuando fueron tratadas con FIP (2.5, 5 y 10
Existe evidencia de varios estudios sobre la generación de ROS inducida por FIP, in vitro.
Cuando las células comerciales neuronales SH-SY5Y fueron tratadas con FIP (100 lM) por 6 h, FIP
podría inducir una generación significativa de ROS (Lee et al., 2011; Ki et al., 2012; Park et al.,
2016). En un estudio en células Drosophila S2 (Zhang et al., 2015) se reveló que FIP produjo un
aumento en ROS de forma dependiente de la concentración cuando estas fueron tratadas con 20, 30
FIP condujo a la generación de ROS después de que las células de neuroblastoma SH-SY5Y
se expusieron a FIP (25, 50 y 100 lM) por 6 h, de manera dependiente de la concentración (Park et
al., 2013). Wang et al. (2013) informaron, en caso de las células de Spodoptera frugiperda, que FIP
incrementó de manera significativa el nivel de ROS intracelular cuando estas fueron expuestas a 200
21
Para investigar el origen de la toxicidad de FIP con mayor detalle, Vidau et al. (2011)
utilizaron mitocondrias provenientes de hígado de rata como herramienta para revelar el motivo de
consumo de oxígeno en las mitocondrias. No obstante, otro estudio reciente documentó que el FIP
(5, 10, 15 y 25 μM) no podía incrementar la generación de especies reactivas de oxígeno de las
mitocondrias aisladas del hígado de rata (Tavares et al., 2015), lo que sugiere que entre las
mitocondrias aisladas y las células enteras hubo algunas diferencias en la producción de ROS
neuroblastoma SH-SY5Y producidos por tratamientos con FIP sulfona (37 μM) y FIP (100 μM), lo
cual indicaría que el estrés oxidativo podría presentarse como una de las principales vías de
neurotoxicidad inducida por FIP y atribuirse en parte al metabolismo y la disposición del FIP
(Romero et al., 2016). Debido a esto, estudios in vitro u in vivo demostraron que la producción de
RNS o ROS desarrolla un rol preponderante en el estrés oxidativo, así como en las toxicidades
relacionadas que son inducidas por FIP. Además, la generación de ROS o RNS podría ser inducida
por FIP de una manera dependiente de la dosis. Es de interés estudiar que las mitocondrias serían un
objetivo de importancia del FIP y el perjuicio a estas estaría vinculado con la toxicidad. En particular,
el metabolito del FIP, la sulfona del FIP, podría ser responsable de la toxicidad inducida por FIP en
lugar del propio FIP en función del estrés oxidativo, lo que sugiere que la relación entre el estrés
oxidativo y la toxicidad inducida por los metabolitos del FIP debería ser altamente preocupante en
II.4. CITOPROTECTORES
Bruce, 2004), es una hormona endógena que fue identificada químicamente como N-acetil-5-
22
metoxitriptamina y aislada en la década de 1960 por primera vez (Lerner et al, 1960). En la síntesis
posteriormente, en MLT por intermedio de dos reacciones consecutivas que involucran dos enzimas:
1979, Axelrod y Weissbach, 1960). MLT también es producida por células cerebrales, la piel, el
epitelio de vías respiratorias, la médula ósea, el sistema inmunitario, el ovario, los testículos, el
intestino y otros (Reiter et al, 2009). Las propiedades de MLT y sus derivados como captadores de
radicales libres se encuentran bien documentadas (Tan et al, 2007). Asimismo, el uso de MLT como
un potente antioxidante debido a tales propiedades presenta una gran cantidad de evidencia.
Debido a sus propiedades químicas y físicas, MLT posee ciertas ventajas frente a otras
moléculas antioxidantes. Es una hormona presente en el cuerpo de forma natural. La MLT, al ser una
molécula anfifílica, puede entrar en todos los órganos y compartimentos subcelulares, representando
una diferencia con otros captadores de radicales fisiológicos. Adicionalmente, se estima que MLT
efectivas (Tan et al, 2007). Al comparar MLT con otros antioxidantes, su eficacia ha sido igual o
mejor respecto a la protección de los tejidos contra el daño oxidativo (vitamina C y E). La ventaja
más interesante de la MLT podría ser su selectividad para la membrana mitocondrial, propiedad que
extremadamente baja (Malhotra et al, 2004), con un amplio margen de seguridad (Arendt, 1997).
mayoría a somnolencia y fatiga, no se han presentado datos referentes a efectos toxicológicos graves
(Schernhammer et al, 2012). En un estudio cruzado doble ciego por un periodo de seis meses, con 3
mg / día de MLT, se observó en hombres sanos la alteración de la calidad del semen (Luboshitzky et
al, 2002).
23
En una línea celular derivada de un carcinoma de colon en roedores se ha observado que
altas dosis de MLT (1, 2 y 3 mM) producen una supresión progresiva significativa de la síntesis de
ADN (Farriol et al, 2000). Otro mecanismo del MLT para inhibir el crecimiento de células
responsable del alargamiento de los telómeros que se activa en la mayoría de los cánceres humanos.
(Leon-Blanco et al, 2003). Además, una vez que se forman los tumores, esta hormona también
parece controlar su crecimiento. MLT inhibe, a través de procesos mediados por receptores de
membrana, el metabolismo y la absorción de los ácidos grasos, incluido el ácido linoleico (LA) en
modelos animales in vivo e in vitro, han demostrado las propiedades antitumorales de MLT, sola o
en combinación con otras moléculas antitumorales (Padillo et al., 2010; Ruiz-Rabelo et al., 2011;
restaura las alteraciones bioquímicas y morfológicas en el tejido hepático en ratas Wistar en casos de
II.4.2. Silibina
cardo mariano. Esta planta es originaria del sur de Europa, y puede encontrarse en Australia, América
del Norte y del Sur, el norte de África y algunas partes de Asia. El cardo mariano ha sido utilizado
como tratamiento para enfermedades hepáticas y para incrementar la producción de leche en madres
lactantes desde la antigüedad (Abenavoli et al., 2010; Bazzano et al., 2016; Capasso et al., 2009;
Negi et al., 2008). De igual manera, la silimarina ha sido utilizada como protector hepático en caso
24
La silimarina es el componente principal del extracto de cardo mariano (conjunto de
2011; Luper, 1998; Napolitano et al., 2013). Asimismo, la silimarina está compuesta principalmente
por silibina, la cual presenta efectos terapéuticos más activos que los otros flavonolignanos (Dixit et
al., 2007; Bijak, 2017). Debido a la baja solubilidad en agua, la biodisponibilidad oral de la silimarina
La silimarina presenta varios efectos beneficiosos, entre los que destacan sus efectos
al., 2015; Polyak, et al., 2013) y un papel hepatoprotector (Polyak et al., 2013). Además, el cardo
efectos contra el Alzheimer y el Parkinson (Ullah y Khan, 2018; Yaghmaei et al., 2014). Asimismo,
en pacientes con artritis, la silimarina mostró efectos antiinflamatorios significativos (Hussain et al.,
sobre diferentes células cancerosas (Agarwal et al., 2006; Won et al., 2018).
anticancerígena, así como disminuyó el volumen del tumor, inhibiendo su crecimiento. También ha
mano-pie inducido por la capecitabina (Elyasi et al., 2016; Forghani et al, 2014). A nivel de la piel,
25
de piel, de igual manera, de igual forma, en ratones, protegieron la piel del estrés oxidativo producido
por la radiación UV. En pacientes con cáncer de mama presenta un efecto protector contra la
El extracto de cardo mariano tiene efecto modulador del sistema inmune. Fue útil para el
(Balouchi et al., 2014; Karimi et al., 2018; Nazemian et al., 2010). En la terapeútica del síndrome
metabólico ha demostrado su utilidad (Tajmohammadi et al., 2018). Este efecto es mejorable a través
glucosa en sangre en ayunas, glucosa plasmática posprandial y HbA (1c) (Hussain, 2007; Voroneanu
diabética, la silimarina mostró un efecto preventivo (Khazim et al., 2013; Rafieian-Kopaie y Nasri,
estrés oxidativo (Federico et al., 2017; Marin et al., 2017). Asimismo, produce una mejora de las
pruebas funcionales del hígado (Aller et al., 2015) y posibilita una reducción de la hepatotoxicidad
provocada por altas dosis de acetaminofeno, así como interviene en la reducción del estrés oxidativo
26
III. MATERIALES Y MÉTODOS
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, durante el período comprendido entre los meses de
III.2.1. Materiales
- Agua ultrapura.
- Cofias.
- Guantes.
- Mascarillas.
- Placas de 96 pocillos
III.2.2. Reactivos
- Alcohol al 70%
27
- Antibiótico y antimicótico (Pen-Strep + Anfotericina B al 1%)
(Lonza/BioWhittaker, USA)
III.2.3. Equipos
- Microscopio invertido
- Tanque de nitrógeno
humano SH-SY5Y. Para el mantenimiento de las células se utilizó medio DMEM/F-12 suplementado
con 10% de SFB inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina.
Inicialmente, se realizaron los cultivos en flask de 25 mL, con medio de cultivo suplementado, a 37
De acuerdo con los ensayos, se subcultivaron las células SH-SY5Y en placas negras, o
transparentes de 96 pocillos con una confluencia del 95 % en placas de 96 pocillos a una densidad
de 5 × 104 células por pocillo para realizar los diferentes tratamientos. Las células se trataron con
28
aletrín (25 µM) en DMEM/F-12 con FBS al 1% y en co-tratamiento simultáneo con melatonina (1
µM) o silibina (50 µM). Se usó un grupo de vehículo que contenía 0,1% de DMSO en paralelo para
cada experimento. En el presente estudio, todas las células SH-SY5Y usadas fueron utilizadas a un
III.3.2. Tratamientos
Se ha utilizado una única dosis de aletrín que corresponde a 25 µM, dosis por debajo de la
IC50 (datos no mostrados). El aletrín es una sustancia soluble en solventes orgánicos, por esa razón
En este estudio se buscó inhibir el efecto citotóxico que produjo el insecticida aletrín, de ahí
que hemos utilizado dos sustancias citoprotectoras como son la melatonina (1 µM) y la silibina (50
µM) en co-tratamiento simultáneo con el piretroide aletrín a la dosis ya mencionada (Martínez et al.,
2020).
A + MEL: Aletrín + Melatonina (células SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrín 25 uM + melatonina 1 µM)
A + SILIBINA: Aletrín + Silibina (células SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrín 25 uM + silibina 50 µM)
Los cultivos tuvieron un periodo de incubación de 24 horas para todos los tratamientos
29
Ensayo de viabilidad celular (Ensayo MTT)
Cultivo control Añadido de Sales Células con actividad Lectura a 540 nm.
de tetrazolio – metabólica Mayor intensidad
Cultivo Celular células de neuroblastoma SH-SY5Y
RT SYBR Green
2
difeniltetrazol (MTT) se utilizó para medir la actividad metabólica celular como indicador de la
viabilidad y proliferación celular previamente descrito por Denizot y Lang, (1986). Se añadieron 50
μL del reactivo de MTT a una concentración final de 0,5 mg/mL a cada pocillo al término de las 24
horas de incubación. La placa fue colocada en una incubadora humidificada a 37 °C, con 5% de CO2
y 95% de aire (v/v), por 2 horas adicionales. Este ensayo colorimétrico se basa en la reducción de
cristales de formazán de color morado por las células metabólicamente activas. Las células que
presentan actividad metabólica reducen la sal de tetrazolio amarilla (MTT) a cristales de formazán
de color púrpura mediante las enzimas oxidorreductasas dependientes del NAD(P)H. Los cristales
de formazán insolubles se disuelven con DMSO. El formazán insoluble fue disuelto con DMSO. La
de una señal (540 nm) a fin de cuantificar. Cuanto más oscura sea la disolución, mayor será el número
30
de células metabólicamente activas viables. Las células controles fueron aquellas que solo se
cultivaron con DMEM/F-12 y fueron consideradas con una viabilidad celular al 100%. El valor de
OriginPro 9.0.
Las células neuronales SH-SY5Y, descongeladas lentamente en Baño María a 37 °C, fueron
cultivadas en placas negras de 96 pocillos con una confluencia del 95 % y una densidad de 5 × 104
células por pocillo e incubados los tratamientos antes mencionados por 24 h. Luego, se añadieron 10
actividad de hidroxilo, peroxilo y otras ROS dentro de la célula, a los pocillos por un periodo de 30
oxidado por ROS en 2’, 7’-diclorofluoresceína (DCF). DCF es altamente fluorescente. Se realizó la
una longitud de onda de emisión de 530 nm, así como una longitud de onda de excitación de 485 nm
(Biotek, USA). Las lecturas obtenidas de cada pocillo corresponden a unidades arbitrarias de
fluorescencia. Estos resultados son exportados por el lector de microplaca como una hoja de cálculo
Excel.
III.3.5. Expresión génica vinculada al estrés oxidativo por medio de PCR en tiempo real.
Utilizando el método de reactivo Trizol se extrajo el ARN total (Invitrogen, USA), el cual fue
purificado haciendo uso del kit de limpieza Rneasy MinElute según el protocolo del fabricante
31
espectrofotómetro Nano (Microdigital NABI, Korea), obteniendo el ratio A260/A280 entre 1.9 y 2.1
cadena se sintetizó el ADNc de primera cadena (Qiagen, Hilden, Alemania), según el protocolo del
fabricante, iniciando con un paso de supresión de ADN genómico. Finalmente, se procedió a diluir
el cDNA en agua libre de nucleasas 1:10, y se almacenó a -80 °C, para posterior análisis.
Se realizaron ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real para NFkB1, Nrf2, SOD2 y
GPX1, analizando las expresiones génicas de sus respectivos ARNm. Se utilizaron cebadores
específicos para los genes relacionados a estrés oxidativo e inflamación (Tabla 3):
Tabla 3. Secuencias de primers forward y reverse para genes relacionados a estrés oxidativo
e inflamación.
Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real, BioRad CFX96, utilizando
la mezcla maestra RT2 SYBR Green qPCR (Qiagen, USA) según el protocolo del fabricante. Cada
60 °C.
32
El cálculo de las alteraciones relativas en la expresión de genes génica se realizó según Pfaffl
(2001), mediante el uso como gen de mantenimiento de GAPDH (sin diferencias probadas entre
grupos). Para extraer las eficiencias de los datos sin procesar se utilizó el software libre LinRegPCR
Se realizaron seis réplicas para cada condición experimental, y los resultados obtenidos en
cada replica fueron representativos. Los datos exhibidos se muestran como medias ± media del
error estándar (SEM). Mediante el análisis de varianza (ANOVA) de una vía se realizaron las
control), seguido por la prueba post-hoc de Tukey, usando GraphPad Prism 9.0. Se consideró
una diferencia estadística cuando p< 0,05. La IC50 se calculó mediante una curva dosis-
33
IV. RESULTADOS
Los datos significan la media ± SEM de seis experimentos realizados de forma independiente
por cada tratamiento. ***P<0,001 en comparación con el vehículo. &&& P<0,001 en comparación
IV.1.1. Los antioxidantes melatonina y silibina inhiben el efecto citotoxico del piretroide
Para evaluar la viabilidad hemos utilizado el ensayo de MTT. Las absorbancias obtenidas
fueron normalizadas como porcentajes del control (100%). En las células de neuroblastoma SH-
SY5Y, tras 24 h (período de incubación), aletrín (25 µM) redujo la viabilidad celular
significativamente (P < 0,001) en un 31 %. Por otra parte, este efecto fue inhibido significativamente
(P < 0,001) por melatonina (1 µM) y silibina (50 µM), permitiendo que las células vivas restantes
4).
150
REDUCCIÓN DEL MTT (%)
&&& &&&
104.71%
107.2%
100% 98.65 %
55% 50%
100
***
69.43 %
31%
50
0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM
Figura 4. Citotoxicidad inducida por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y y efecto citoprotector de
melatonina (MEL, 1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas SH-
SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina 1
µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).
34
IV.1.2. Los antioxidantes melatonina y silibina reducen la producción de ROS inducida por
Para evaluar la producción de ROS hemos utilizado la sonda fluorescente DCFH-DA. Los
niveles de ROS fueron determinados por unidades fluorescentes. En las células SH-SY5Y, tras un
período de incubación de 24 h, aletrín (25 µM) incrementó los niveles de ROS significativamente
(P < 0,001) en un 38 %. Por otra parte, este efecto fue reducido significativamente (P < 0,001) por
4000
Producción de ROS
(Fluorescencia)
3000 ***
2145.33
&&&
2000 38 % &&& 1650.50
1576.33 1637.33
1555
24 % 23 %
1000
0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM
Figura 5. Estrés oxidativo (Producción de ROS) inducido por aletrín (25 μM) en SH-SY5Y y efecto
antioxidante de MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período de incubación de 24 horas.
La producción de ROS fue determinada por unidades fluorescentes. C: control (celulas SH-SY5Y),
Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% +
aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina 1 µM), SIL (celulas SH-
SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).
35
IV.1.3. Los antioxidantes melatonina y silibina reducen la expresión de genes (NFkB1, Nrf2,
través de genes implicados en vías de señalización de estrés oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2 y
de NFκB1 en 2,65 veces respecto del vehículo, este efecto citotóxico fue reducido
significativamente por MEL y silibina en 1,34 (P < 0,01) y 1,74 (P < 0,001) veces, respectivamente
(Figura 6).
3
***
2.65
x2.6
&&
Expresión de NFB1
1.97
(Tasa de cambio)
2
x 1.34
&&&
1.52
x1.74
1.02 1.01
1
0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM
Figura 6. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular NFkB1) inducido por aletrín (25
μM) en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un
período de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas
SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina
1 µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).
36
Por otro lado, aletrín disminuyó significativamente (P < 0,001) la expresión de Nrf2 en 1,79
veces respecto del vehículo, este efecto oxidativo fue reducido significativamente solo por silibina
2
Expresión de Nrf2
(Tasa de cambio)
1.01
1.00
&&
1 x1.79 0.90
x1.61
0.78
***
0.56
0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM
Figura 7. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular Nrf2) inducido por aletrín (25 μM)
en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período
de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas
SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina
1 µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).
37
Respecto de la expresión de la molécula antioxidante SOD2, aletrín disminuyó
significativamente (P < 0,001) su expresión en 1,79 veces, mientras que silibina incremento este
2
Expresión de SOD2
(Tasa de cambio)
1.04
0.98
1 x1.79 &
0.84
x1.5
***
0.56 0.59
0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM
Figura 8. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular SOD2) inducido por aletrín (25
μM) en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un
período de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas
SH-SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina
1 µM), SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).
38
Finalmente, aletrín disminuyó (P < 0,001) la expresión molecular de GPX1 en 1,6 veces, y
por su parte la silibina redujo este efecto oxidante en 1,43 veces de forma significativa (P < 0,05).
(Figura 9).
2
Expresión de GPX1
(Tasa de cambio)
1.05 1.04
1
&
x1.43 0.80
0.58
***
0.56
x1.6
0
C Veh ALE (25 M) MEL (1 M) SIL (50 M)
+ +
ALE 25 uM ALE 25 uM
Figura 9. Estrés oxidativo (evaluado por la expresión molecular GPX1) inducido por aletrín (25 μM)
en SH-SY5Y e inhibición de este efecto por MEL (1 μM) y silibina (50 μM) después de un período
de incubación de 24 horas.
C: control (celulas SH-SY5Y), Veh: vehículo (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1%), ALE (celulas SH-
SY5Y + DMSO 0.1% + aletrin 25 µM), MEL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + melatonina 1 µM),
SIL (celulas SH-SY5Y + DMSO 0.1% + silibina 50 µM).
39
V. DISCUSIÓN
Los piretroides son los plaguicidas más utilizados en todo el mundo, sin embargo su uso se
ha vuelto indiscriminado a pesar de los controles y normativa existente. Los compuestos químicos
neurodegenerativos humanos. Aun cuando se presenta una amplia evidencia referente a los efectos
tóxicos producidos por los piretroides, es necesaria una mayor cantidad de estudios a fin de evaluar
su neurotoxicidad, así como los mecanismos conducentes al daño potencial a nivel del sistema
como parte de un esquema de prueba (Martínez et al., 2019; Martínez et al., 2020).
El presente estudio pretende describir los efectos tóxicos del piretroide aletrín sobre la línea
celular neuronal SH-SY5Y, que es considerada como un modelo in vitro usado ampliamente en
Este estudio demuestra que el plaguicida aletrín puede inducir la muerte celular promoviendo la
genes relacionados a estrés oxidativo como NFκB1, Nrf2, SOD2 y GPX1. Sin embargo, estos
efectos pueden ser reducidos por la acción de dos antioxidantes como son la melatonina (MEL) y
El ensayo de viabilidad celular (reducción de sales de MTT) muestra que las células de
neuroblastoma SH-SY5Y, tras un tiempo de incubación de 24 h con aletrín (25 µM) disminuyeron
su viabilidad celular de forma significativa (P < 0,001) en un 31 %. Sin embargo, este efecto
citotóxico fue reducido significativamente (P < 0,001) por MEL (1 µM) y silibina (50 µM) en 55
% y 50 %, respectivamente (Figura 3). Efectos citotóxicos similares han sido demostrados en otros
trabajos con plaguicidas (Romero et al., 2016; Martínez et al., 2019; Martínez et al., 2020). Por
ejemplo, el fipronil, un insecticida de amplio espectro de la familia del fenilpirazoles y que actúa
sobre el receptor GABA, produjo citotoxicidad en células SH-SY5Y in vitro demostrado a través de
MTT y LDH, incluso su metabolito (fipronil sulfone) fue más tóxico que el propio fipronil, donde
40
los tratamientos con fipronil (100 μM) y fipronil sulfona (3 μM) indujeron un aumento de 4,7 y 5
veces en los peróxidos lipídicos medidos como malondialdehído (MDA) y un aumento de 2,2 y 2,0
veces en los niveles de óxido nítrico (NO), mientras que el antioxidante Trolox (análogo de vitamina
E) (0,3, 1 μM) y MEL (1 μM) tuvieron la capacidad para reducir en parte el efecto citotóxico
ocasionado por fipronil en células SH-SY5Y. Los resultados de los referidos estudios sugieren que
uno de los mecanismos principales de neurotoxicidad que induce el fipronil para producir
citotoxicidad puede ser el estrés oxidativo (Romero et al., 2016). Por otra parte, plaguicidas como
ciflutrín, cipermetrina y glifosato han reducido la viabilidad de células SH-SY5Y de forma dosis
dependiente posiblemente por activación de vías de estrés oxidativo (Martínez et al., 2019; Martínez
et al., 2020).
Existe suficiente evidencia en diferentes estudios in vitro (Wang et al., 2016b; Romero et
al., 2016; Martínez et al., 2019; Martínez et al., 2020) para inferir que la muerte celular (viabilidad
celular reducida) sería consecuencia del daño oxidativo celular producido por la exposición celular
a compuesto químicos como los plaguicidas. Además, una de las alteraciones biológicas de mayor
plaguicidas (Lu et al., 2019). Varios factores de transcripción como Nrf2, NF-κB1, SOD2 y GPX1
y citocinas proinflamatorias como el TNF-α pueden ser activados por el estrés oxidativo. Uno de
los principales mecanismos de defensa celular contra el estrés oxidativo es la activación de la vía de
señalización Nrf2 que representa un punto de convergencia para múltiples vías de señalización
activadas por el estrés oxidativo que resulta en la regulación positiva coordinada de una batería de
proteínas antioxidantes involucradas en la defensa celular (Yang et al., 2015; Nguyen et al., 2003).
Otro factor de transcripción que es inducido por estrés oxidativo es el NF-κB1. Tras su activación
son secretadas citocinas proinflamatorias, entre las cuales está el TNFα (Buelna-Chontal y Zazueta,
2013).
Es así que nuestro estudio muestra que los niveles de ROS en células SH-SY5Y, tras un
tiempo de incubación de 24 h con aletrín (25 µM) se incrementaron significativamente (P < 0,001)
41
en un 38 %. Por otra parte, este efecto fue reducido significativamente (P < 0,001) por MEL (1 µM)
señalización de estrés oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2 y GPX1 estrechamente implicados en
dicha homeostasis por RT-PCR. El aletrín (25 µM) incrementó significativamente (P < 0,001) la
expresión de NFκB1 en 2,65 veces respecto del vehículo, este efecto citotóxico fue reducido
significativamente por MEL y silibina en 1,34 (P < 0,01) y 1,74 (P < 0,001) veces, respectivamente.
Por otro lado, aletrín disminuyó significativamente (P < 0,001) la expresión de Nrf2 en 1,79 veces
respecto del vehículo, este efecto oxidativo fue reducido significativamente solo por silibina en 1,61
veces (P < 0,01). Respecto de la expresión de la molécula antioxidante SOD2, aletrín disminuyó
significativamente (P < 0,001) su expresión en 1,79 veces, mientras que silibina aumentó este efecto
en 1,5 veces de forma significativa (P < 0,05). Finalmente, aletrín disminuyó (P < 0,001) la
expresión molecular de GPX1 en 1,6 veces, y por su parte silibina redujo este efecto oxidante en
1,43 veces de forma significativa (P < 0,05). El efecto antioxidante de MEL y silibina también han
sido probados en otros estudios in vitro de neurotoxicidad (Romero et al., 2016; Martínez et al.,
2019)
Hemos podido demostrar que el efecto citotóxico producido por aletrín fue reducido por las
dos sustancias antioxidantes testadas: MEL, un potente eliminador de radicales libres y fármaco
neuroprotector (Esparza et al., 2003, 2005; Rodríguez et al., 2004) y silibina, un flavonoide derivado
de la hierba cardo mariano (Silybum marianum) con propiedades antioxidantes (Schumann et al,
2003; Lu et al, 2009) y un agente con supuesta propiedad neuroprotectora ante enfermedades
neurodegenerativas (Yin et al., 2011). Nuestros resultados demostraron que MEL (1 μM) y silibina
(50 μM) atenuaron significativamente los parámetros de estrés oxidativo inducido por aletrín, pero
silibina parece mostrar el mayor efecto protector contra la citotoxicidad inducida por aletrín algo
similar a lo demostrado por Martínez et al. (2019) quienes evaluaron el efecto citotóxico del
piretroide ciflutrín y varios compuestos antioxidantes como MEL y silibina que fueron capaces de
reducir el efecto citotóxico y oxidativo producido por ciflutrín. Adicionalmente, tanto en estudios
42
in vitro como in vivo, la melatonina ha demostrado ser un potente eliminador de diversos ROS
Los nuevos datos que presentamos, en nuestro estudio, sobre parte de mecanismos del estrés
oxidativo y citotoxicidad inducidos por aletrín y la capacidad de reducir este efecto por parte
principalmente de silibina, nos demuestran que la ingesta de compuestos ricos en flavonoides podría
43
VI. CONCLUSIONES
b) Ambos antioxidantes muestran una capacidad para inhibir el incremento de los niveles de
especies reactivas de oxígeno - ROS, así como inhibir la disminución de la viabilidad celular en
oxidativo como NFkB1, Nrf2, SOD2 y GPX1, la silibina parece disminuir este efecto.
44
VII. LITERATURA CITADA
influx into rat brain microsacs, Journal of Toxicology and Environmental Health., 18:1, 13-
23.
2. Abenavoli L, Capasso R, Milic N, Capasso F. 2010. Milk thistle in liver diseases: Past, present,
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VIII. APÉNDICE
VIII.1. Resultados
SH‑SY5Y
59
1588 1569 1697 1444 1530
el piretroide aletrín.
60
1.02 0.7 0.66 0.78 0.89
el piretroide aletrín.
el piretroide aletrín.
61
Control Control + Control + Control + Vehículo Control + Vehículo
Vehículo Vehículo + Aletrín + Aletrín + + Aletrín + Silibina
melatonina (1 μM) (50 μM)
62