BV Practica 3

Biotecnología Vegetal
Grado de Biotecnología-Curso 3º
Curso Académico 2022-2023
Práctica 3. Aislamiento y purificación de protoplastos de

Solenostemon
1. Introducción
Los protoplastos son células vegetales desprovistas de pared celular, que se obtienen
por su liberación utilizando procedimientos mecánicos o por la utilización de soluciones
enzimáticas de celulasas y/o hemicelulasas y pectinasas. Se han aislado protoplastos de
prácticamente todos los órganos y tejidos vivos de las plantas no lignificados: hojas,
pétalos, ápices, tallos, raíces, frutos y células aisladas (1;2). Constituyen un valioso e
interesante sistema experimental para estudios fisiológicos, genéticos y bioquímicos,
pues se pueden tratar como células simples por las técnicas microbiológicas y, además,
son apropiados para el estudio de la biosíntesis de la pared celular, de las membranas y
para obtener preparados de orgánulos celulares. Son muy útiles en experimentos de
biotransformación, para la selección y clonaje de poblaciones celulares y, sobre todo, en
la hibridación somática, por la fusión de protoplastos.
La regeneración de plantas a partir de protoplastos suele presentar mayores
complicaciones que la regeneración de plantas a partir de otros tipos de explantes. No
obstante, se disponen de protocolos de regeneración en numerosas especies (3;4). La
primera fase, tras la selección y esterilización del explante, es la eliminación de la pared
celular mediante enzimas líticos, en una solución con un alto potencial osmótico. La
recuperación de los protoplastos incluye la eliminación de los enzimas por lavado y el
paso a un medio de cultivo para la recuperación de la pared y la promoción de las
primeras divisiones celulares de las células individuales obtenidas de los protoplastos.
La fase de división celular suele ser muy problemática y por diversas causas necesita la
cuidadosa purificación y manipulación previa de los protoplastos así como la puesta a
punto de un medio de cultivo específico y complejo.
2. Objetivos de la práctica
Aislar los protoplastos de cóleo (Solenostemon) y observarlos al microscopio hacer un
estudio detallado de la morfología del protoplasto. Realizar un recuento y determinar el
porcentaje de protoplastos viables obtenidos con y sin tinción.
3. Material
Hojas de Solenostemon Malla de nylon de 50 m
Pinzas Tubos de ensayo
Bisturí Gradilla
Placas Petri estériles Centrifuga
Macerozyme R-10 Pipeta Pasteur
Celulasa Portas y cubreobjetos
Manitol Microscopio
0,7M
Solución de sacarosa al 50%
4. Procedimiento
4.1. Aislamiento de los protoplastos

1. Pretratamiento de 1-2 días de oscuridad a las plantas madres.
2. Obtener los explantes de hoja y cortar con bisturí en las placas Petri añadiendo 10
mL de una solución de lisis compuesta por celulasa al 0,5%, macerozima al 0,05% y
sorbitol 0,7 M (PM= 182,17g/mol). Los cortes se haran de forma paralela desde el
nervio de la hoja hacia el borde (Fig. 1).
* La práctica la realizaremos en condiciones no axénicas puesto que no se cultivarán
Figura 1. Explantes de hojas cortados para el aislamiento de protoplastos

posteriormente los protoplastos.
3. Incubar estáticamente durante toda la noche a 25C (16-22 h) en oscuridad (si es
posible mantenerlos en agitación suave a 50 rpm).
4. Coger las placas, moverlas ligeramente para dispersar los protoplastos y con una
pipeta Pasteur recoger toda la solución.
5. Filtrar a través de una malla de nylon de 50 m, depositando el filtrado en un tubo
de ensayo.
6. Centrifugar el filtrado a 1000 rpm durante 10 min.
7. Eliminar el sobrenadante y disolver el precipitado en 0,5 mL de una solución de
resuspensión (Sacarosa al 50%).
8. Tomar una alícuota y observar al microscopio. Preparar un portaobjetos con dos
gotas de la solución de protoplastos en sacarosa al 50%. Contabilizar con el objetivo
de 10x en seis puntos diferentes de la preparación.
4.2. Recuento y estudio de viabilidad
1. Poner una gota de la solución de protoplastos con sacarosa al 50% en un
portaobjetos, añadir una gota (10 l) de colorante verde rápido. Poner el
cubreobjetos y esperar 5 min. El colorante verde rápido tiñe la membrana celular.
2. Observar al microscopio, hacer un recuento del número de protoplastos y
contabilizar los que están bien formados frente a los que no. Calcular el porcentaje
de viabilidad.
5. Resultados
1. Haz los cálculos necesarios para la preparación de la solución de lisis y solución de
resuspensión
2. Dibujar y describir la morfología de los protoplastos aislados de coleo.
3. ¿Qué cantidad de protoplastos de coleo habéis obtenido, contar los protoplastos
existentes en 6 cuadrantes?
4. Porcentajes de viabilidad.
5. ¿Por qué se utiliza sorbitol/manitol para realizar el aislamiento?
6. Bibliografía
1. Davey MR, Anthony P, Patel D, Power JB (2010). Plant protoplast: isolation, culture and
plant regeneration. En: Plant cell culture: essential methods (Eds. Davey MR, Anthony
P). Wiley, U.K.
2. Daneri-Castro SN, Roberts TH (2016). Isolation of viable protoplasts from the aleurone
layers of commercial barley malting varieties. J. The Institute of Brewing 122: 693-699.
3. Xu ZH, Xue HW (1999). Plant regeneration from cultured protoplasts. En:
Morphogenesis in plant tissue cultures (Eds. Soh WY, Bhojwani SS) Kluwer Acad.Publ.
4. Li YG, Stoutjestijk PA, Larkin PJ (1999). Somatic hybridization for plant improvement.
En: Morphogenesis in plant tissue cultures (Eds. Soh WY, Bhojwani SS) Kluwer
Acad.Publ.

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