Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

Campus Chihuahua

Cuarto semestre de la carrera Ingeniería en Biotecnología

Elaboración de productos biotecnológicos (Gpo 2)

Actividad 3.4 Informe de práctica-RETO. Uso de almidón de semilla de aguacate para la

producción de ácido láctico por bacterias ácido-lácticas

Equipo 4
Mariana Carnero Viguería A01562441
Aaron Enriquez Terrazas A01562442
Renata Cantera Contreras A01562351
Paola Aimeé Soto Ortiz A01562411

Docentes:
MC. Carmen Rocío Maldonado Barraza
MC. Elías Solís Rivera
Dra. Berenice Eréndira Oseguera Guerra

16 de marzo del 2022

Abstract

El objetivo de este curso fue analizar y determinar el potencial de la semilla de aguacate

como materia prima en la producción de ácido láctico. Para llevar a cabo este objetivo, se
utilizaron diferentes procesos químicos necesarios que en conjunto nos llevaron a observar
la producción de ácido láctico a partir de un medio de cultivo enriquecido con almidón de
semilla de aguacate. Primeramente se procedió a extraer, lavar, pesar, secar y pulverizar las
semillas muestra. Después, se recurrió a la preparación del hidrolizado de la semilla de
aguacate, dividiendo el pulverizado en 3 partes iguales previamente tratadas con ácido
clorhídrico (HCl) 1% v/v, y para después ser puestas a un tratamiento térmico excluyendo
una de las muestras (ASP-HCl) y los hidrolizados finales ser filtrados a bomba de vacío.
Después se calcularon los azúcares reductores en las muestras de ASH por método de
DNS, preparando una curva de calibración. Posteriormente, se procedió a la disolución de
sales M9 5X en agua desionizada y la preparación de reactivos y medios de cultivo para el
aislamiento de BAL y producción de ácido láctico. Una vez hecho lo previo, se procedió al
aislamiento e identificación preliminar de BAL de productos lácteos con queso fresco como
materia prima. Posteriormente, se recurrió al montaje del bioreactor para producción de
ácido láctico, junto con su inoculación, monitoreo de producción de ácido láctico y biomasa.
Finalmente, se recurrió a la cuantificación de la biomasa generada. Los resultados
obtenidos, en cuanto a curvas de calibración mostrando una reducción general de azúcares
reductores, un cambio de pH de 6 a 5.5 e incluso 4.5, aumento de biomasa en las muestras
e identificación de BAL por tinción Gram, nos llevaron a concluir la eficiencia de la semilla
de aguacate como materia prima para obtención de ácido láctico.
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Introducción

El ácido láctico es el principal producto de la fermentación de azúcares, como la glucosa y

lactosa, de las bacterias ácido lácticas (Del Campo, M. et al., 2008). Estas bacterias son
Gram positivas, aerotolerantes, no tóxicas, no son patógenas, ni forman esporas y tampoco
producen pigmentos (Crittenden, 2009, citado por Sánchez y Tromps, 2014). El ácido láctico
es ampliamente empleado en la industria de alimentos ya sea en la fermentación de
productos como los lácteos (leche, yogur y queso), carnes, verduras; para elaborar vinos y
cervezas; como biopreservadores, que, a su vez, mejoran el sabor, olor, textura y su calidad
nutricional; y como probióticos (Ramírez et al., 2011).
El aguacate más utilizado en México, es el aguacate Hass; esta misma especie de aguacate
es una variación o mutación de una raza de aguacate americano. Esta fue creada mediante
una semilla de una raza de aguacate originario de Guatemala durante el año 1926 en un
huerto de California y otro de México en 1935. Más adelante, en 1960 se introdujo en el
mercado mundial y actualmente es una de las más comunes. Entre sus primordiales
propiedades y ventajas, es de resaltar que dispone de una prolongada cosecha, lo cual
permitió incrementar su consumo mundial, al igual que su enorme calidad. En cuanto al
fruto y la semilla de este, son subjetivamente pequeños, debido a que su peso solo es de
unos 300 gramos como más alto, mientras que su piel es rugosa, color verde negruzca. Sin
embargo, esta última característica solo es perceptible una vez que dichos permanecen
todavía en el árbol, empero una vez que es cosechada, la dermis se torna de color violácea
a negra. Dichos frutos son de sorprendente calidad, puesto que aparte de no contener fruta,
dichos cuentan con una poderosa resistencia a la vida post cosecha que involucra la
cosecha, transporte y repartición. Dicho esto, una de las características que más nos
interesa es la semilla de este aguacate y su gran cantidad de beneficios y aplicaciones.
El aguacate Hass contiene en su semilla una potencial fuente de almidón, con un contenido
cercano al 30% (Kahn, 1987). El contenido de almidón de este aguacate es un recurso
importante para la producción de ácido láctico, ya que la bacteria encargada, Lactobacillus,
la cual posee la enzima aldolasa y producen ácido láctico como el producto principal de la
fermentación de la glucosa utilizando la vía de glucólisis (Axelsson, 1998), se alimenta de
este almidón hidrolizado.
Actualmente, en México, se producen más de 1000 toneladas mensuales de semilla de
aguacate que terminan siendo desechados (Marín, 2019), estas mismas semillas pueden
ser una de las materias primas para la obtención del ácido láctico.
El objetivo de esta práctica es conocer, analizar, y demostrar la correcta obtención de ácido
láctico a partir de bioprocesos que con la aportación de los elementos de la semilla de
aguacate den el producto esperado y los resultados previstos dentro de un diagrama de
flujo del proceso a desarrollar.
Hay una gran cantidad de factores que pudieran intervenir en la obtención y producción del
ácido láctico, la contaminación de muestras, instrumento y medio de cultivo, mal manejo de
ambiente en cuanto a temperatura y esterilización referentes al óptimo crecimiento
bacteriano y sus condiciones óptimas, el ajuste de pH, la presencia de oxígeno, la cantidad
y tipo de nutrientes, entre otros. Cualquier mal manejo de instrumentos o falta de
seguimiento a protocolos ya descritos pueden afectar directamente la producción de ácido
láctico por parte de la bacteria.
Proceso de producción de ácido láctico a partir de la semilla de aguacate

Material:
● Semillas de aguacate en pequeños trozos
● Tapones de algodón
● Tiras de pH
● Matraces Erlenmeyer
● Vasos de precipitado
● Mechero Bunsen
● Encendedor
● Maskin tape
● Marcador permanente
● Tijeras
● Pipetas estériles y no estériles
● Embudo Buchner
● Agua destilada
● Queso laurel (10g)
● Cristal violeta
● Yodo lugol
● Alcohol
● Safranina
● Velas
● Agua oxigenada
● Envases farmacéuticos con tapón de goma
● Tapa de crimpado de aluminio
● Crimpadora Manual de Vial
● Cajas petri
● 3 Mallas de tamizado (118 mm, 103 mm y 1.7 mm)
● Portaobjetos
● Tubos Falcon
● Microtubos
● Jeringas
● Celdas espectrofotométricas
● Asa microbiológica
● Frascos de vidrio con tapa
● Tubos de ensayo con y sin tapa

Equipo:
● Molino (2800 revoluciones en 3 rondas)
● Autoclave All American 75x
● Espectrofotometro Beckman Coulter DU730
● Balanza ADAM
● Potenciómetro ROCA,PHS-3CU
● Vortex Talvoys
● Bomba vacio Infinity RS-1
● Refrigerador TOR-Rey 2858
● Centrifugadora Galaxy 20R
● Incubadora TE-E61D Terlab
 ● Microscopio Zeizz, Primo Star
● Nitrogen Regulator 871/N50
● Baño Maria Terlab MR

Reactivos:
● Ácido clorhídrico al 1% v/v
● Disolución NaOH 10N
● Reactivo DNS
● Glucosa a 1g/L
● Muestra problema de semilla de aguacate
● Sales M9 5X
● ECMAS (Experimental Culture Medium Avocado Seed)
● Solución diluyente
● Base de Caldo MRS
● Tween80
● Caldo MRS modificado (sin citrato)
● Base de Agar MRS
● Preinóculo de bacteria Lactobacillus sp
● Sales M9 1X
● 77 unidades
●
●
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de producción de ácido láctico. Propiedad del autor.
Metodología

Laboratorio 1.- Preparación del polvo de semilla de aguacate.

1. Se picaron y pesaron las semillas de aguacate.

2. Se colocaron las semillas picadas en el horno a 60°C hasta su secado (24-48 hrs
dependiendo el tamaño y la humedad de cada semilla, algunas pudieron tomar un
poco más de tiempo).

3. Se molieron las semillas secas usando un molino de bolas hasta obtener un polvo
fino.

4. Se tamizaron las semillas de aguacate secas y molidas.

5. Se recuperó el polvo de aguacate obtenido y se pesó.

6. Se almacenó a temperatura ambiente. Este correspondió al polvo de semilla

(ASP-Avocado Seed Powder).

7. Se calculó el porcentaje de merma en el proceso, el cual fue de alrededor de un

40% que no logró molerse.

Laboratorio 2.- Preparación del hidrolizado de semilla de aguacate.

1. Se dividió en tres partes iguales el peso del polvo de la semilla de aguacate y se

colocaron en matraces Erlenmeyer con tapón de algodón.

2. Se trató todos los ASP (Avocado Seed Powder) con ácido clorhídrico (HCl) 1% v/v.
Se consideró ASP 100 g/L.

a. Uno de los matraces no tuvo tratamiento térmico por lo que se etiquetó como
ASP- HCl.

3. Se sometieron los otros dos matraces a un tratamiento de presión térmica (120°C,

15 psi) durante 15 min en el autoclave.

4. Se ajustó el pH a 7.2 con una solución de NaOH 10N. En este caso, fue un
aproximado de pH ya que se utilizaron tiras de pH.

a. Uno de los matraces se identificará como ASH-1.

5. Se sometió el tercer matraz a un segundo tratamiento térmico con las mismas

condiciones (120°C,15 psi) durante 15 min.
a. Este hidrolizado se identificó como ASH-2.

6. Se filtraron todos los hidrolizados con ayuda de una bomba de vacío. Se utilizaron
dos filtros de diferente tamaño de poro, para cada una de las muestras.

7. Se cuantificó el volumen obtenido.

8. Se almacenaron todos los hidrolizados en 3 frascos diferentes.

Laboratorio 3.- Cuantificación de azúcares reductores.

I. Reactivo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)

1. Se preparó una solución de 100 mL que contenía 2 g de NaOH disuelto.

2. Se agregó 2 g de Ácido 3,5-Dinitrosalicílico con agitación constante

3. Se agregó 40 g de Tartrato sódico-potasio tetrahidratado.

4. Se agregó 0.4 g de fenol.

5. Se agregó 0.1 g de sulfito de sodio.

6. Se aforó a 200 mL con agua destilada.

7. Se guardó en oscuridad y en frasco ámbar. Se dejó reposar 15 min, en caso de uso

inmediato. Se tuvo cuidado con los volúmenes que se manejaron, por que el volumen final
no debió ser mayor a 200 mL.

II. Preparación de la curva de calibración de azúcares reductores

Para la obtención de la curva de calibración de azúcares reductores se utilizó como

estándar la glucosa en un rango de concentración de 0 a 1.0 g/L.

1. Se realizo la curva de calibración de glucosa considerando la siguiente tabla de

estándares:

Tabla 4. Estándares de glucosa de 0 a 1 g/L. Propiedad del autor.

Glucosa μL (1 g/L) Agua μL Concentración (g/L)

125 875 0.125

250 750 0.25
500 500 0.5
750 250 0.75
1000 0 1

2. Se realizó el procedimiento de cuantificación de azúcares reductores.

3. Con los resultados obtenidos, se grafico en el eje de las ordenadas (eje “y”) la
absorbancia a 540 nm y en el eje de las abscisas (eje ”x”) el promedio de la
concentración de glucosa determinada en g/L.
III. Cuantificación de azúcares reductores por el método de DNS

1. Se agregaron 100 μL de la solución problema (estándar o muestra) en un tubo de

ensayo y se agregaron 300 μL del reactivo de DNS preparado.

2. Se ebullo 5 minutos y se dejó enfriar (10 minutos aproximadamente) en un baño de

hielo.

3. Se agregaron 600 μL de agua destilada y se agitó en vórtex a temperatura ambiente.

4. Se leyó la absorbancia en el espectro de UV - Visible a 540 nm.

5. Se elaboró la curva de calibración correspondiente y cuantificación de azúcares

reductores en la muestra problema.

Laboratorio 4.- Preparación de reactivos y medios de cultivo.

I. Sales M9 5X
1. Se disolvieron las siguientes sales en agua desionizada:

Tabla 5. Componentes de las sales M9. Recuperada de BT2002B.2

2. Se esterilizaron por autoclave.

II. ECMAS: Experimental Culture Medium Avocado Seed

1. Preparar el ECMAS considerando la siguiente formulación considerada para un

volúmen de 1 L :
 Tabla 6. Componentes para el ECMAS. Recuperado de BT2002B.2

- El pH de los medios se ajustó a 5,8.

-Se tuvieron 3 medios ECMAS diferentes dependiendo del hidrolizado utilizado:

o ASP-HCL

o ASH-1

o ASH-2

III. Solución diluyente (BAL)

1. Se preparo la solución considerando la siguiente formulación:

Tabla 7. Componentes de la solución diluyente (BAL). Recuperado de BT2002B.2

IV. Base de Caldo MRS

1. Se preparo el medio considerando la siguiente formulación:

Tabla 8. Componentes para la preparación de la base de caldo MRS. Recuperado de

BT2002B.2
 2. Se resuspendieron los componentes en agua destilada y se ajustó el pH a 6.5 ± 0.2.
3. Se agregó Tween80, se hervió hasta disolución completa y se esterilizó por
autoclave.

V. Base de Agar MRS

1. Se preparó el medio considerando la siguiente formulación:

Tabla 9. Componentes para la preparación de la base de agar MRS. Recuperado de

BT2002B.2

2. Se resuspendieron los componentes en agua destilada y se ajustó el pH a 5.7 ± 0.2.

3. Se agregó Tween80, hervir hasta disolución completa y se esterilizó por autoclave.

Laboratorio 5.- Aislamiento e identificación preliminar de bacterias ácido lácticas (BAL) de

productos lácteos.

Se requirió de queso fresco posiblemente adicionado con Lactobacilos. Las muestras

permanecieron en refrigeración (4 a 7°C). La recolección y transporte de las muestras fue el
adecuado para evitar su descomposición y/o contaminación, mediante la conservación de la
red fría adecuada.

II. Aislamiento de bacterias lácticas (BAL)

1. Se pesaron 10 g de cada muestra.

2. Se homogeneizaron durante 5 min con 90 mL de solución diluyente (8.5 g/L NaCL y

1 g/L de peptona).

3. Se prepararon diluciones seriadas (10-1 a 10-5): Se colocó 1 mL de muestra + 9 ml

Solución diluyente.
 4. Se tomó 1 mL de muestra y se colocó en la caja petri. Se agregó medio MRS,
asegurándose que estuviera a una temperatura máxima de 45°C.

5. Se homogeneizó con cuidado con movimientos delicados sobre una superficie plana.

6. Se incubó a 33°C por 24-48 h en atmósfera microaerofílica (5% de O2).

NOTA: Fue necesario revisar el crecimiento cada 24 h y tomar evidencia.

III. Identificación fenotípica de bacterias ácido lácticas (BAL)

Después de la siembra realizada a partir de productos lácteos, se realizó la identificación

fenotípica entre las 24-48 h posteriores. Fue necesario analizar características como:
morfología colonial, prueba de la catalasa, tinción de Gram para morfología microscópica y
capacidad fermentativa.

a) Morfología colonial

1. Se observó la forma, bordes, tamaño, elevación, superficie, color, características

ópticas y consistencia de las colonias que crecieron en agar MRS luego de 24 o 48
hs de incubación a 33°C en condiciones de microaerofilia.

b) Prueba de catalasa

1. Se colocó una gota de agua oxigenada sobre el centro de un portaobjetos de vidrio.

2. Se adicionó una parte de la colonia de interés con un asa microbiológica y se mezcló

hasta formar una suspensión microbiana homogénea.

3. Se observó la producción o no de burbujas.

c) Tinción de Gram y morfología microscópica

1. Se realizo un frotis de la bacterias de interés:

a. Se extendió la colonia en el centro de un portaobjeto de vidrio y se fijó con calor.

b. Se tiñó con cristal-violeta (por un minuto), y se enjuago con agua.

c. Se cubrió con Lugol (por un minuto) y se enjuago con agua.

d. Se realizó una decoloración con alcohol/acetona (aproximadamente 15 segundos) o

hasta que no se observara colorante escurriendo, y se enjuagó con agua.
e. Se tiñó con safranina (por un minuto) y se enjuagó con agua.

f. Se dejó secar al aire.

g. Se observó al microscopio óptico con un objetivo de inmersión 100X, se analizó

morfología y coloración.

h. Se documentaron los resultados en una tabla y se mostró evidencia de las colonias

analizadas.

Laboratorio 6.- Montaje del biorreactor.

Para la preparación de los bioreactores se utilizaron 8 frascos farmacéuticos de vidrio con

tapón de goma y tapa de crimpado de aluminio, para mantener las condiciones de
microaerofilia o anaerobiosis.

1. En los frascos farmacéuticos se colocaron 70 mL de cada uno de los medios

preparados con anterioridad y se etiquetaron como se indica a continuación:

Tabla 10. Etiquetas de frascos para biorreactores. Recuperada de BT2002B.2

2. Se sellaron los frascos farmacéuticos con ayuda de una crimpadora manual.

II. Inoculación de biorreactores

1. Se puso un preinóculo de la bacteria Lactobacillus sp en de medio MRS 18-24h

previas a la inoculación de los biorreactores. Se incubó a 33°C en condiciones de
microaerofilia.

2. Se centrifugó el preinóculo a 5,000 rpm por 15 min y al no obtener el resultado

deseado se centrifugó nuevamente a 5,000 rpm durante 5 minutos. Se decantó
sobrenadante para recuperar el paquete celular.

3. Se resuspendió el paquete celular en 5 mL de sales M9 1X con ayuda de un vórtex.

 4. Se centrifugó nuevamente a 5,000 rpm por 15 min. Se decantó sobrenadante y se
recuperó el paquete celular.

5. Se resuspendió el paquete celular en sales M9 1X para ajustar la DO600 = 0.3,

logrando lo más cercano 0.395, pero al haber tan poca muestra para los pasos
siguientes, se disolvió agregando solución de otro equipo, con la cual aforamos en el
tubo falcon a 32 mL, arrojando ahora una medida del espectrofotómetro DO600 =
0.152

6. Una vez alcanzada la DO de la bacteria, se inocularon los biorreactores con un

volumen equivalente al 10% del volumen de medio contenido, siendo en nuestro
caso 7 mL.

7. Con ayuda de dos agujas de jeringa, se inyectó una mezcla de nitrógeno y CO2 para
generar una condición de anaerobiosis.

8. Se incubó a 33°C.

9. Se monitoreó cada 6 h la producción de ácido láctico durante 48 hrs.

III. Monitoreo indirecto de producción de producto: ácido láctico y biomasa

Con el objetivo de establecer una cinética indirecta o un comportamiento indirecto del

crecimiento celular mediante la producción de ácido láctico, se analizó el comportamiento
del pH evaluando el porcentaje (%) de reducción y su cambio en el tiempo.

1. Se recuperó 1 mL de cada uno de los biorreactores con ayuda de una jeringa.

2. Todas las muestras se centrifugaron a 5,000 rpm durante 5 min.

3. Se recuperó el sobrenadante de cada una:

a. Se midió el pH aproximado utilizando tiras de pH.

b. Se cuantificaron azúcares reductores.

4. Se recuperó el paquete celular para medir biomasa generada.

IV. Cuantificación de biomasa generada

Se evaluó el crecimiento bacteriano midiendo OD600. Para calcular la producción de

biomasa o peso seco celular (gDCW – gDry Cell Weight) se utilizo el método Akhtar y Jones
(2009) indicado en la siguiente fórmula:

1 OD = 0.47 g DCW/L
 1. Se lavó el paquete celular de cada microtubo con 1 mL de sales M9 1X
resuspendiendo en vórtex por aproximadamente 30 segundos.

2. Las muestras se centrifugaron a 5,000 rpm durante 5 min. Se decanto sobrenadante

para recuperar el paquete celular.

3. Se resuspendieron con 1 mL de sales M9 1X con ayuda de un vórtex.

4. Se midió DO600 utilizando como blanco las sales M9 1X.

5. Las lecturas arrojadas por el espectrofotómetro se colocaron en una tabla de Excel.

Resultados:

Laboratorio 1:

El peso de las semillas picadas antes de entrar al horno fue de 385.68 g. Después de salir
del horno, su peso sin humedad fue de 252.38 g, por motivos de percances con la licuadora,
se optó por un molino de bolas, por lo cual se junto toda la semilla del grupo para ser molida
en una sola tanda obteniendo 801.1 g de semilla molida con una merma de 198.9 g
(19.89%).

Laboratorio 2:

Luego del filtrado, las cantidades obtenidas fueron:

ASP: 200 mL

ASH-1: 80 mL

ASH-2: 150 mL

Laboratorio 3:

Tabla 11. Valores obtenidos de absorbancia de la curva tipo de azúcares reductores.

Propiedad del autor

Glucosa μL (1 Concentración Segunda Lectura

g/L) Agua μL (g/L) Lectura Abs Abs

125 875 0.125 0.098 0.261

250 750 0.25 0.351 0.41

 500 500 0.5 0.584 0.754

750 250 0.75 0.884 0.987

1000 0 1 1.524 1.51

Tabla 12. Valores obtenidos de azúcares reductores de muestras problema. Propiedad del
autor

Muestras Concentracion Concentración segunda lectura

Abs
problema primera lectura (g/L) (g/L)

ASP 0.204 0.20374179 0.101903221

ASH-1 0.473 0.382206595 0.231951173

ASH-2 0.284 0.256816825 0.140579192

ASP 0.132 0.155974259 0.067094847

ASH-1 0.051 0.102235786 0.027935427

ASH-2 0.011 0.075698268 0.008597441

Figura 2. Gráficas de absorbancia contra concentración de curva tipo, ecuación de la recta y
R^2. Propiedad del autor.

Laboratorio 4:

Se adjuntan a continuación fotografías tomadas durante la preparación de los medios.

Figura 3. Autoclave donde se realizó la esterilización de los medios de cultivo. Propiedad del
autor.

Laboratorio 5:

La morfología colonial arrojó los siguientes resultados, los cuales fueron tomados
empíricamente bajo el criterio de los y las laboratoristas.

Tabla 13. Morfología colonial observada en los medios de cultivo sólido. Propiedad del autor.
Figura 4.Crecimiento bacteriano de diluciones en medios de cultivo. Propiedad de autor.
 Figura 5. Prueba de la enzima catalasa en portaobjetos. Ante la ausencia de reacción, la
prueba dió negativa a catalasa. Propiedad del autor.

Figura 6. Visualización microscópica de tinción Gram de las muestras de medios de cultivo

sólido. Tinción morada concluyente de bacterias Gram positivas Propiedad del autor.
Laboratorio 6:

Las muestras fueron tomadas a las:

3:15 pm del día 09 de Marzo del 2022 (tiempo cero)

Las tres siguientes muestras fueron tras:

● 19 horas transcurridas desde el tiempo cero (tiempo 1),

● 25 horas transcurridas (tiempo 2)
● 43 horas transcurridas (tiempo 3).

Solo pon la fórmula

Tabla 14. Resultados de absorbancia y biomasa, Práctica 6

Tabla 15. Valores de pH obtenidos en las muestras de los biorreactores. Propiedad del autor
 Tabla 16. Valores de absorbancia de la tercera curva tipo realizada para determinar
azúcares reductores. Propiedad del autor

Glucosa μL (1 g/L) Agua μL Concentración (g/L) Tercera Lectura Abs

125 875 0.125 0.217

250 750 0.25 0.242
500 500 0.5 0.603
750 250 0.75 0.809
1000 0 1 1.362

Figura 6. Tercera curva tipo de azúcares reductores. Propiedad del autor

Tabla 17. Concentración de azúcares reductores en muestras problema de biorreactores.

Propiedad del autor.

Concentración inicial
Ecmas Disolución Abs Concentración final g/ml
g/ml

0 1/2 2.429 0.00423617 1.4

1 1/10 1.099 0.010861975 0.5686
2 1/20 2.406 0.04200481 1.176
3 1/10 2.416 0.021079991 0.78851
Discusión

A partir de los resultados obtenidos se determina que efectivamente la semilla de aguacate

tiene un gran porcentaje de humedad, de acuerdo con el peso húmedo y peso seco se
perdió alrededor de un 35% de peso correspondiente a la humedad. La concentración de
azúcares reductores, en este caso glucosa, nos demostró que es viable decir que la
temperatura es un catalizador, debido a que la diferencia de la concentración de aquellas
muestras problema sin tratamiento térmico fueron menor, que las que sí lo tuvieron, por otro
lado, teniendo en cuenta el porcentaje de almidón en la semilla de aguacate, la cantidad de
azúcares reductores era de esperarse en una mayor concentración, podemos inferir que
durante las prácticas hubieron algunos errores, ya sea técnicos o de reactivos, que
afectaron nuestro proceso. En la tinción de las bacterias presentes en la muestra, las cuales
se tiñeron de color morado, como se puede apreciar en la Figura 6, por lo que es posible
deducir que lo que se está analizando son bacterias del tipo gram positivas, a su vez, la
morfología de la muestra observada bajo el microscopio, indica por la forma y el tipo de
muestra que se trata de bacilos o incluso de levaduras, ademas de que los resultados de la
prueba de catalasa comos e observa en la Figura 4 nos muestran un resultado negativo, ya
que no se produjo la formacion de burbujas (la enzima catalasa descomone el peroxido de
hidrogeno en agua y oxigeno) con lo anterior teniendo en cuenta esto se puede afirmar que
el medio de cultivo asi como los aislamientos no estaban contaminados. Como últimos
indicios de que el proceso fue exitoso, de forma indirecta los resultados de la concentración
final de azúcares reductores, al ser menores, es una forma indirecta de detectar que ese
sustrato fue consumido para producir algo, y la disminución del pH nos indica que lo que se
genero es un producto que debido a su acidez baja el nivel de pH, tras el análisis de todo lo
anterior mencionado, se puede determinar que en los medios de cultivo crecieron colonias
de bacterias BAL. En cualquier caso, el equipo concluye que a pesar de la carencia de
precisión, la naturaleza del proceso continúa señalando que se tuvo bacterias BAL en los
medios de cultivo sólidos, y que se produjo ácido láctico en los biorreactores.

Conclusión

Con relación a lo expuesto se logró conocer, analizar y demostrar la correcta obtención de

ácido láctico, acordes con lo esperado, empleando la semilla de aguacate como materia
prima para crecer BAL. Se encontró una disminución de azúcares reductores en g/L de la
primera lectura a la segunda (ASP 0.203 a 0.101, ASH-1 0.382 a 0.231, ASH-2 0.256 a
0.140, ASP 0.155 a 0.067, ASH-1 0.102 a 0.027 y ASH-2 0.075 a 0.008). Por otro lado, las
pruebas de catalasa y tinción Gram dieron resultados que coinciden con las características
de los lactobacilos. Asimismo, hubo un aumento en la biomasa en gramos en los ECMA,
indicador de crecimiento celular (ECMA 0, 0.708 a 0.185; ECMA 1, 0.155 a 0.240; ECMA 2,
0.187 a 0.377; y ECMA 3 0.194 a 0.418). Pero, esto estuvo acompañado en un aparente
aumento general del pH de los biorreactores (Frasco 0, 6 a 6; Frasco 1, 5.5 a 6; Frasco 2, 6
a 5.5; Frasco 3, 4.5 a 6), sin embargo, estas mediciones fueron tomadas visualmente, por lo
que están sujetas a errores del laboratorista. De igual manera, hubo una disminución en la
concentración en g/mL de azúcares reductores en los ECMA (ECMA 0, 1.4 a 0.004; ECMA
1, 0.568 a 0.010; ECMA 2, 1.176 a 0.042; y ECMA 3, 0.788 a 0.021). Una observación a
destacar es que en las cajas petri se visualizó un crecimiento que concordaba con lo
esperado de acuerdo a las concentraciones de bacterias depositadas.
En estos procesos es de suma importancia realizar los procesos adecuadamente ya que
pueden el no seguirlos son fuente de varios errores que pueden mermar o detener por
completo el bioproceso, por ejemplo, el no mantener un campo de esterilidad lleva a la
contaminación de las muestras y el no cuidar las temperaturas puede llevar a que la
bacteria no crezca e incluso a su muerte.

Con todo esto se llega a que se logró producir ácido láctico con BAL usando como alimento
el almidón hidrolizado, glucosa, de la semilla de aguacate. Por lo que, este proceso tiene
potencial de llevarlo a nivel industrial porque, además de dar resultado, se está usando un
desecho de un alimento, del aguacate, del cual México es el mayor productor, por lo que
habría suficiente materia prima para llevarlo a cabo y sería barata de conseguir.

Investigación Ácido láctico:

Métodos de purificación para el ácido láctico:

-​​Extracción con solventes a partir del caldo fermentado.
-Obtención del lactato, decoloración con carbón y tratamiento con ozono.
-Precipitación
-Destilación en vacío
-Adsorción
-Procesos con membranas
-Cromatografía de intercambio iónico (Eyal et al. 2001).

Aplicaciones del ácido láctico

-Skincare, elimina las células muertas de la superficie de la piel, ayudándola a lucir más
brillante y reduciendo la apariencia de líneas finas.
-Utilizado como aromatizante, aditivo, saborizante y conservante de alimentos por la
industria alimentaria (Anon, 1992).
-Las industrias químicas lo utilizan como solubilizador y como agente controlador de pH en
celofanes, resinas de fenol formaldehído, flujo de la soldadura, reveladores de impresión
litográfica y textil, formulaciones adhesivas, baños de electrochapado y de electro
pulimento, detergentes.
-Los ésteres del ácido láctico son utilizados como agentes emulsionantes en productos de
bollería (Datta, 1995; Sodegard, 1998).
-Aplicaciones farmacéuticas y cosméticas: lociones, soluciones contra el acné,
humectantes.
-El lactato de calcio se puede utilizar para una terapia de deficiencia de calcio y como
agente anticaries.
-Los ésteres del ácido láctico como el etil/butil lactato son utilizados como disolventes
limpios (Datta, 1995; Sodegard, 1998).
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