UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y

BIOTECNOLOGÍA
CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

DATOS INFORMATIVOS:
Nivel: Quinto
Docente: PhD. Liliana Lalaleo
Ciclo Académico: Octubre 2021 – Febrero 2022
Integrantes: Abril Viviana Paralelo: “A”
Guevara Jennifer
Moreno Claudio
Núñez Fernanda
Vásconez Juan

PRÁCTICA N° 10

TEMA: CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS

1. DESARROLLO
Usted desea hacer dos construcciones con los plásmidos que se detalla a continuación e insertar dos
genes de interés, realizar los procedimientos en el software APE para insertar el gen de interés (abajo
mencionado) mediante el corte con enzimas de restricción y presentar las construcciones
posteriormente indicar las pruebas confirmatorias para identificar la construcción dentro del
huésped.

PROTOCOLO #1:

Plásmido: pENTR/pTER shMDC1

Gen de interés: cinnamyl-alcohol deshydrogenase (CAD) AJ440712.1

1. Buscar la secuencia del gen de interés en la plataforma del NCBI
• cinnamyl-alcohol deshydrogenase (CAD) AJ440712.1
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AJ440712.1?report=fasta

>AJ440712.1 Linum album mRNA for cinnamoyl-CoA reductase (ccr gene)

GCCAAATCTTGTTTTCCCCTCTTTGCTTTTATCTCATCCCTAGCGCTCTCCTTTCCCCTCCCATCTCCC
AAAAGCAGAAGACGGGGCCAAAAGATTAAGTGAAGCCACACACACACTATGCCGGCTGACAGCTCATCC
CTCCCCGGCCACGGCCAGACCGTCTGCGTCACCGGCGCCGGCGGCTTCATCGCCTCCTGGATCGTCAAA
CTCCTCCTAGATAGAGGCTACTCCGTCAAAGGAACTGTCAGGAATCCAGATGATCCGAAGAACGCTCAC
TTGAGAGCGCTGGAAGGAGCAGACGAGCGGCTGACTCTGTGCAAAGCAGATCTTCTGGATTACCAGAGC
CTCCGTGAAGCCATTAGCGGTTGCCAAGGCGTTTTCCACACTGCTTCCCCCGTCACCGATGATCCAGAA
CAAATGGTGGAGCCGGCGGTGGAGGGGACTAAGAATGTAATTAACGCAGCAGCGGAAGCTAAAGTGAGG
CGGGTTGTATTTACATCATCTATTGGCGCCGTCTACATGGATCCTAACCGGAGCCCCGACACGGTGGTT
GACGAATCCTGTTGGAGCGACCTGGAGTTCTGCAAGAACACTAAGAACTGGTACTGTTACGGGAAGACG
GTGGCGGAGCAGGCGGCGTGGGAGATGGCGAAGGAAAAAGAGGTGGACGTGGTGGTGGTGAACCCGGTT
CTGGTATTGGGCCCATTGTTGCAATCAACTATTAATGCAAGCATAATACACATCCTCAAGTACCTGACA
GGTTCGGCCAAAACTTATGCCAATTCGGTTCAAGCCTATATCCACGTCAAGGACGTTGCACTATCCCAC
ATCCTTGTCTTTGAGAACCCTTCTGCCGCCGGCCGTTACCTTTGCGCCGAAAGCGTGCTCCACCGTGGC
GAGGTTGTTGAAATCCTCGCCAAGTTGTTTCCTGACTACCCTGTCCCTACCAAGTGTTCGGATGAGAAG
AACCCAAGAGCAAAGGCGTACAAGTTCTCATGCCAGAAACTGAAGGACCTTGGGCTGGAGTTCACACCG
GCGAAGCAGTGCCTGTATGAAACGGTGACCTCCCTCCAGGAAAAGGGCCACCTTGCTCTTCCTGCCTCC
AAACAACAGGAGGAACCCATCAAGATCCAGTCTTCTTGACAACATATATTACATACACAGAGGCAAGGC
GCCGGCTAGGGACTGACTACCAAACAGGAAGGAAGGAAGGAGGCTGAACAACAAACCACCCTACAACTA
CAACTTTACCAATTTGCAGCAGCTAGCAATTACGTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCCGTCCTCTCGCCGTG
TTCCTTTGTTTCTTCTTTTGATTGGATCGCGCGCGCATCAATTTACATATATATCCCAAGTACTGTTGT
AACTTGCTACTTTTCTTGATCCTGTAATTAAATTTAAACCCTGTCTGTACTGCCATTTCAAGGGTGCCT
CATCAGTTTTAGTTCCATTATTACTATTAAAAAAAAAAA

2. Buscar la secuencia del plásmido en la página del ADD GENE

- pENTR/pTER shMDC1
https://www.addgene.org/22192/sequences/
> Author sequence
CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCTAGCATGGATCTCGGGGACGTCTA
ACTACTAAGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCC
TTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTG
AACGTTGTGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAACT
AAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTCCTGTTAGTTAGTTACTT
AAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAG
CAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGG
ATCCGGTACCgaattcgaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcggcccagtgtcactagg
cgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgc
aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatc
ttataagttccctatcagtgatagagatcCCCCAACATGCAGAGATTGAAATTCAAGAGATTTCAATCT
CTGCATGTTGTTTTTGGAAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGgaattcGCG
GCCGCACTCGAGATATCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATC
AATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGCAGCTCT
GGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAAC
TGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGC
GATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAG
 GTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTA
GCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGA
CCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAG
CATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTCCCTGC
GCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGG
CGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTG
TTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTG
ATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCG
GAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTAC
AGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGC
TCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACATTATTCAGATTGGGCCCCGTTCCACT
GAGCGTCAGACCCGGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCT
GCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTT
TTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAG
GCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTG
CTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGC
GGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGAT
ACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAA
GCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTC
CTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTAT
GGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT

3. Copiar la secuencia del plásmido en el software APE

Figura 1. Secuencia del Plásmido en el software A plasmid Editor (ApE)

4. Identificar y correr mediante el uso de las herramientas del programa (enzimas de
restricción) un sitio de corte (polylinker) para insertar el gen de interés.

Figura 2. Elección de las enzimas a HindIII (1) y Xbal (1)

Figura 3. Enzimas elegidas dispuestas en la secuencia del plásmido pENTR/pTER shMDC1

Figura 4. De acuerdo a los colores: morado:rrB T1 terminator, verde:rrnB T2 terminator rosa:tet
operator, rojo 1:HindIII, azul:Polylinker, rojo 2:XbaI, naranja:KanR, amarillo:Ori.

5. Indicar en una breve descripción porque selecciono esas enzimas de restricción.

• Las Enzimas seleccionadas son adecuadas para la construcción del plásmido pENTR/pTER
shMDC1 porque las enzimas de restricción HindIII y XbaI se ubican en sitios que no
interfieren con partes importantes del plásmido. Además, cortan el MCS en su totalidad ya
que se encuentran en los extremos.
 6. Presentar la digestión del plásmido (sin modificación) con las enzimas que usted seleccionó.

Figura 5. Resultado
del proceso de digestión
del plásmido

pENTR/pTER shMDC1 con las enzimas de restricción HindIII y XbaI

Tabla 1. Distribución de las enzimas usadas dentro de la digestión del plásmido pENTR/pTER shMDC1
Size Site I Site 2 Mass%
1777 XbaI 844 End 2621 68
778 Start 1 HindIII 779 30
65 HindIII 779 XbaI 844 2
7. Modificar la secuencia del plásmido en la posición encontrada y colocar la secuencia del gen
de interés

Figura 6. Digestión del plásmido pENTR/pTER shMDC1 mediante inserción del gen de interés.

8. Identificar cada una de las partes que componen el plásmido (incluido el gen de interés).
Tabla 2. Descripción componentes de la digestión del plásmido pENTR/pTER shMDC1 (Figura 6)
Color Descripción

Celeste Terminador rrnB T1

Verde Oscuro Terminador rrnB T2

Rosado Operador T

Rojo Enzimas de restricción (Superior: Hind III) (Inferior: XbaI)

Verde Claro CAD (cinnamyl-alcohol deshydrogenase)

Naranja Gen de resistencia a Kanamicina (KanR)

Dorado Ori
9. Presentar la secuencia y el mapa del grafico (circular)
• Secuencia con el gen de interés introducido (CAD):
CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCTAGCATGGATCTCGGGGACGTCTA
ACTACTAAGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCC
TTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTG
AACGTTGTGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAACT
AAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTCCTGTTAGTTAGTTACTT
AAGCTCGGGCCCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAG
CAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGG
ATCCGGTACCgaattcgaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcggcccagtgtcactagg
cgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgc
aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatc
ttataagttccctatcagtgatagagatcCCCCAACATGCAGAGATTGAAATTCAAGAGATTTCAATCT
CTGCATGTTGTTTTTGGAAAAGCTTGCCAAATCTTGTTTTCCCCTCTTTGCTTTTATCTCATCCCTAGC
GCTCTCCTTTCCCCTCCCATCTCCCAAAAGCAGAAGACGGGGCCAAAAGATTAAGTGAAGCCACACACA
CACTATGCCGGCTGACAGCTCATCCCTCCCCGGCCACGGCCAGACCGTCTGCGTCACCGGCGCCGGCGG
CTTCATCGCCTCCTGGATCGTCAAACTCCTCCTAGATAGAGGCTACTCCGTCAAAGGAACTGTCAGGAA
TCCAGATGATCCGAAGAACGCTCACTTGAGAGCGCTGGAAGGAGCAGACGAGCGGCTGACTCTGTGCAA
AGCAGATCTTCTGGATTACCAGAGCCTCCGTGAAGCCATTAGCGGTTGCCAAGGCGTTTTCCACACTGC
TTCCCCCGTCACCGATGATCCAGAACAAATGGTGGAGCCGGCGGTGGAGGGGACTAAGAATGTAATTAA
CGCAGCAGCGGAAGCTAAAGTGAGGCGGGTTGTATTTACATCATCTATTGGCGCCGTCTACATGGATCC
TAACCGGAGCCCCGACACGGTGGTTGACGAATCCTGTTGGAGCGACCTGGAGTTCTGCAAGAACACTAA
GAACTGGTACTGTTACGGGAAGACGGTGGCGGAGCAGGCGGCGTGGGAGATGGCGAAGGAAAAAGAGGT
GGACGTGGTGGTGGTGAACCCGGTTCTGGTATTGGGCCCATTGTTGCAATCAACTATTAATGCAAGCAT
AATACACATCCTCAAGTACCTGACAGGTTCGGCCAAAACTTATGCCAATTCGGTTCAAGCCTATATCCA
CGTCAAGGACGTTGCACTATCCCACATCCTTGTCTTTGAGAACCCTTCTGCCGCCGGCCGTTACCTTTG
CGCCGAAAGCGTGCTCCACCGTGGCGAGGTTGTTGAAATCCTCGCCAAGTTGTTTCCTGACTACCCTGT
CCCTACCAAGTGTTCGGATGAGAAGAACCCAAGAGCAAAGGCGTACAAGTTCTCATGCCAGAAACTGAA
GGACCTTGGGCTGGAGTTCACACCGGCGAAGCAGTGCCTGTATGAAACGGTGACCTCCCTCCAGGAAAA
GGGCCACCTTGCTCTTCCTGCCTCCAAACAACAGGAGGAACCCATCAAGATCCAGTCTTCTTGACAACA
TATATTACATACACAGAGGCAAGGCGCCGGCTAGGGACTGACTACCAAACAGGAAGGAAGGAAGGAGGC
TGAACAACAAACCACCCTACAACTACAACTTTACCAATTTGCAGCAGCTAGCAATTACGTCTCAGTCAG
TCAGTCAGTCCGTCCTCTCGCCGTGTTCCTTTGTTTCTTCTTTTGATTGGATCGCGCGCGCATCAATTT
ACATATATATCCCAAGTACTGTTGTAACTTGCTACTTTTCTTGATCCTGTAATTAAATTTAAACCCTGT
CTGTACTGCCATTTCAAGGGTGCCTCATCAGTTTTAGTTCCATTATTACTATTAAAAAAAAAAATCTAG
ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGG
TCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTC
TGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGT
AATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGAT
GCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTG
TATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACA
GATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGT
ACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAA
TATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTCCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCT
GTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAAC
GGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAA
ATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTT
ATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAG
GATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAA
TATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCA
GAATTGGTTAATTGGTTGTAACATTATTCAGATTGGGCCCCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCGGTAGAA
AAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCA
CCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTC
AGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCT
GTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCG
TGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGT
 TCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGA
GAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGA
GAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTC
TGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCG
GCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT

Figura 7. Mapa circular

10. Describir un método de confirmación para la trasformación mediante una técnica molecular
(PCR).

El gen de resistencia a la Kanamicina es considerado un marcador seleccionable en bacterias y plantas; la

PCR es una prueba de mayor diagnóstico que permite identificar un agente infeccioso, además de que
permite amplificar de forma rápida muestras pequeñas de ADN (Tortora, Funke y Case, 2007).

Los genes de resistencia a los antibióticos actúan como genes marcadores selectivos que permiten realizar
un seguimiento a la transformación de células realizadas a través de los plásmidos recombinantes en un
medio de cultivo selectivo con el antibiótico Kanamicina para asegurar el crecimiento de aquellas bacterias
que poseen la construcción plasmídica con el gen de resistencia a tal antibiótico (Medina, 2000).
11. Presentar los primers que emplearía para confirmar la transformación (puede utilizar la
herramienta (PRIMER-BLAST)

Figura 8. Diseño de pares de primers mediante el uso del software Primer-Blast de NCBI
 Tabla 3. Secuencia de primers realizados mediante Primer-Blast (Figura 8)

Primer en el NCBI Enzimas de Restricción Primers Finales

Forward GAAGCTAAAGTGAGGCGGGT HindIII AAGCTTAAAGTGAGGCGGGT

Reverse CAGGTCGCTCCAACAGGATT XbaI CAGGTCGCTCCAACTCTAGA

PROTOCOLO #2:

Plásmido: pAdTrack

Gen de interés: pinoresinol-lariciresinol (PLR) AB525816.1

1. Buscar la secuencia del gen de interés en la plataforma del NCBI

- pinoresinol-lariciresinol (PLR) AB525816.1
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB525816.1?report=fasta

>AB525816.1 Linum album plr mRNA for pinoresinol-lariciresinol reductase, complete

cds

ATGGGTTCCCTGGGGAAAGTGAATAATGAGATTCCGACTAAGAGCAGCGGCGGCAGCAAAGTGCTGGTG
ATAGGGGGAACTGGCTACTTGGGGAAGAGGCTGGTGAAGGCTAGTTTGGATTCGGGCCACGACACCTAC
GTCATGCATCGCCCGGAGATTGGCGTCGACATCGAGAAAGTTCAGCTGCTGCTCTCCTTCAAGATGCAA
GGCGCCCATCTCGTCTCCGCCTCCTTCGACGACCAGCGCAGCCTCGTCGATGCTGTCAAGTTGGTCGAC
GTCGTCATCTGCGCCATCTCCGGGGTTCACATCCGCAGCCACCAGATCCTTCTTCAGCTCAAGCTCGTC
GAAGCCATCAAAGAAGCCGGTAACGTCAAGAGGTTTGTGCCGTCGGAGTTCGGAACAGATCCGGCGAGG
ATGGAAAATGCGATGGAGCCAGGAAGGATCACATTCGACGACAAAATGGTGGTGAGGAGAGCGATAGAG
GAAGCTGGGATCCCTTTCACTTACGTCTCTGCTAATTGCTTCGCTGGATACTTCCTTGGCGGCCTTTGC
CAACCAGGCTACATTCTTCCTTCTAGAGACCATGTTACTTTGCTTGGAGATGGCGACAAAAAGGGGGTG
TACGTGGACGAGGATGATACAGCCGCTTACACATTGAGGGCCATAGACGATCCTCGAACCCTCAACAAG
ACGATCCACGTGAAGCCACCTAAGAACGTGTTGTCCCAAAGAGAAGTTGTTGGGATTTGGGAGAAATAT
ATCGGCAAAGAGCTCCAAAAGACCATTCTATCCGAGCAAGACTTCCTGGCTACTATGAGAGAACAAAAC
TATGCAGAGCAAGTTGGACTGACGCACTATTATCACGTGTGTTACGAGGGGTGTCTGTCGAATTTCGAG
GTTGATGATGAGCAGGAAGCCTCCAAGCTCTACCCTGATGTTCACTACACCACCGTCGAGGAATATCTA
AAGCGTTACGTCTAGCTAGTCAGTCG

2. Buscar la secuencia del plásmido en la página del ADD GENE

- PAdTrack
https://www.addgene.org/16404/sequences/

> Addgene NGS Result

TTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTT
TGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAA
GTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACA
GGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTT
GGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCG
TAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACGTGGAGACTCGCCCAGGTGTTTTTCTCAGG
TGTTTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCGTTTTATTATTATAGTCAGTCGAGTCTAGCAAGCTAGCTT
GATCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTAT
TTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAA
CAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCT
CTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCTGAGTCCGGACTTGTACA
GCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCT
CGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGT
CGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGA
TCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGT
TGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGT
TCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGA
TGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGG
GGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCT
TGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACA
CGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCT
CCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCT
GCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACA
TTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGG
AAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAAT
AGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATG
CCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTAC
TGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTAC
TATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATT
TACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTA
TTAATCACTAGCAGATCTGGTACCGTCGACGCGGCCGCGATATCCTCGAGAAGCTTTCTAGAGGATCTG
GGCGTGGTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGC
AGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCAT
GCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGC
AAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGC
TTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAG
TGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGAC
CCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTC
CTCCCCTCCCAATGCGGTTTAAAACATAAATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGT
GTCTTGCTGTCTTTATTTAGGGGTTTTGCGCGCGCGGTAGGCCCGGGACCAGCGGTCTCGGTCGTTGAG
GGTCCTGTGTATTTTTTCCAGGACGTGGTAAAGGTGACTCTGGATGTTCAGATACATGGGCATAAGCCC
GTCTCTGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAGCTTCATGCTGCGGGGTGGTGTTGTAGATGATCCAGTC
GTAGCAGGAGCGCTGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGGGGCAGGCC
CTTGGTGTAAGTGTTTACAAAGCGGTTAAGCTGGGATGGGTGCATACGTGGGGATATGAGATGCATCTT
GGACTGTATTTTTAGGTTGGCTATGTTCCCAGCCATATCCCTCCGGGGATTCATGTTGTGCAGAACCAC
CAGCACAGTGTATCCGGTGCACTTGGGAAATTTGTCATGTAGCTTAGAAGGAAATGCGTGGAAGAACTT
GGAGACGCCCTTGTGACCTCCAAGATTTTCCATGCATTCGTCCATAATGATGGCAATGGGCCCACGGGC
GGCGGCCTGGGCGAAGATATTTCTGGGATCACTAACGTCATAGTTGTGTTCCAGGATGAGATCGTCATA
GGCCATTTTTACAAAGCGCGGGCGGAGGGTGCCAGACTGCGGTATAATGGTTCCATCCGGCCCAGGGGC
GTAGTTACCCTCACAGATTTGCATTTCCCACGCTTTGAGTTCAGATGGGGGGATCATGTCTACCTGCGG
GGCGATGAAGAAAACGGTTTCCGGGGTAGGGGAGATCAGCTGGGAAGAAAGCAGGTTCCTGAGCAGCTG
CGACTTACCGCAGCCGGTGGGCCCGTAAATCACACCTATTACCGGCTGCAACTGGTAGTTAAGAGAGCT
GCAGCTGCCGTCATCCCTGAGCAGGGGGGCCACTTCGTTAAGCATGTCCCTGACTCGCATGTTTTCCCT
GACCAAATCCGCCAGAAGGCGCTCGCCGCCCAGCGATAGCAGTTCTTGCAAGGAAGCAAAGTTTTTCAA
CGGTTTGAGACCGTCCGCCGTAGGCATGCTTTTGAGCGTTTGACCAAGCAGTTCCAGGCGGTCCCACAG
CTCGGTCACCTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCATATCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGGCGGCTTTCG
CTGTACGGCAGTAGTCGGTGCTCGTCCAGACGGGCCAGGGTCATGTCTTTCCACGGGCGCAGGGTCCTC
GTCAGCGTAGTCTGGGTCACGGTGAAGGGGTGCGCTCCGGGCTGCGCGCTGGCCAGGGTGCGCTTGAGG
CTGGTCCTGCTGGTGCTGAAGCGCTGCCGGTCTTCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCATTTGACCATG
GTGTCATAGTCCAGCCCCTCCGCGGCGTGGCCCTTGGCGCGCAGCTTGCCCTTGGAGGAGGCGCCGCAC
GAGGGGCAGTGCAGACTTTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGCGCGAGAAATACCGATTCCGGGGAGTAGGCA
TCCGCGCCGCAGGCCCCGCAGACGGTCTCGCATTCCACGAGCCAGGTGAGCTCTGGCCGTTCGGGGTCA
AAAACCAGGTTTCCCCCATGCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGGTTTCCATGAGCCGGTGTCCACGC
TCGGTGACGAAAAGGCTGTCCGTGTCCCCGTATACAGACTTGAGAGGGAGTTTAAACGAATTCAATAGC
TTGTTGCATGGGCGGCGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAAAAATCAGGCAAAGCCTCGCGCAAAAA
AGAAAGCACATCGTAGTCATGCTCATGCAGATAAAGGCAGGTAAGCTCCGGAACCACCACAGAAAAAGA
CACCATTTTTCTCTCAAACATGTCTGCGGGTTTCTGCATAAACACAAAATAAAATAACAAAAAAACATT
TAAACATTAGAAGCCTGTCTTACAACAGGAAAAACAACCCTTATAAGCATAAGACGGACTACGGCCATG
CCGGCGTGACCGTAAAAAAACTGGTCACCGTGATTAAAAAGCACCACCGACAGCTCCTCGGTCATGTCC
GGAGTCATAATGTAAGACTCGGTAAACACATCAGGTTGATTCACATCGGTCAGTGCTAAAAAGCGACCG
AAATAGCCCGGGGGAATACATACCCGCAGGCGTAGAGACAACATTACAGCCCCCATAGGAGGTATAACA
AAATTAATAGGAGAGAAAAACACATAAACACCTGAAAAACCCTCCTGCCTAGGCAAAATAGCACCCTCC
CGCTCCAGAACAACATACAGCGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAA
AACCTATTAAAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGT
GCAGAGCGAGTATATATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAAC
CGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTT
TTCCCACGTTACGTCACTTCCCATTTTAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCT
AAAACCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCAT
ATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATGTTAATTAACATGCATGGATCCATATGCGGT
GTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTG
ACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTAT
CCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA
AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCT
CAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCG
TGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGG
CGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG
TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGG
TAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCG
GTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCG
CTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTG
GTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTT
TGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGAT
TATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTAT
TTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTG
GCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC
CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTT
GCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGCCA
TGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCT
GACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGG
TAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAAT
TGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGC
CAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTG
AACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCAC
AACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTG
TCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCA
CGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGG
GCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTG
ATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCA
TCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGG
GGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGA
CCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTG
GCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTG
GCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCT
 TCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTTTGTTAAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAAC
CAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTT
CCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTAT
CAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCA
CTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGA
AAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTA
ACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGATCGAATTAA
TTC

3. Copiar la secuencia del plásmido en el software APE.

Figura 9. Secuencia del Plásmido pAdTrack en el software A plasmid Editor (ApE)

4. Identificar y correr mediante el uso de las herramientas del programa (enzimas de

restricción) un sitio de corte (polylinker) para insertar el gen de interés.
 Figura 10. Elección de las enzimas BglII (1) y HindIII (1)

Figura 11. Enzimas elegidas dispuestas en la secuencia del plásmido pAdTrack.

 Figura 12. De acuerdo con los colores: Verde: EGFP, Rojo: Enzimas de restricción (Superior:
BglII) (Inferior: HindIII), Rosado: PLR, Marrón: ORF, Dorado: Ori, Naranja: KanR / NeoR,
Turquesa: M13 Ori

5. Indicar en una breve descripción porque selecciono esas enzimas de restricción.

• Se seleccionaron las enzimas de restricción BglII y HindIII para la construcción del plásmido
pAdTrack, ya que se encuentran en los extremos del MCS, cortándolo casi en su totalidad.
Además, se ubican en el sitio exacto para interferir y por ende no dañar el gen de interés que
se desea ligar al plásmido.
 6. Presentar la digestión del plásmido (sin modificación) con las enzimas que usted seleccionó.

Figura 13. Resultado del proceso de digestión del plásmido pAdTrack con las enzimas de restricción
BglII y HindIII

Tabla 4. Distribución de las enzimas usadas dentro de la digestión del plásmido pAdTrack.
Size Site I Site 2 Mass%
6232 HindIII 2121 End 8353 75
2082 Start 1 BglII 2083 25
38 BglII 2083 HindIII 2121 1
7. Modificar la secuencia del plásmido en la posición encontrada y colocar la secuencia del gen
de interés

Figura 14. Digestión del plásmido pAdTrack mediante inserción del gen de interés
8. Identificar cada una de las partes que componen el plásmido (incluido el gen de interés).
Tabla 5. Descripción componentes de la digestión del plásmido pAdTrack (Figura 14)
Color Descripción

Verde Proteína Verde Fluorescente (EGFP)

Rojo Enzimas de restricción (Superior: BglII) (Inferior: HindIII)

Rosado PLR (pinoresinol-lariciresinol)

Marrón ORF

Dorado Ori

Naranja Genes de resistencia a Kanamicina y Neomicina (KanR / NeoR)

Turquesa M13 Ori

9. Presentar la secuencia y el mapa del grafico (circular).

• Secuencia con el gen de interés introducido (PLR):
TTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGT
GGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACAT
GTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTT
TTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGA
AGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACG
TGGAGACTCGCCCAGGTGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCGTTTTATTATTATAGTCAG
TCGAGTCTAGCAAGCTAGCTTGATCGCGTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAA
AAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAAC
AACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTA
CAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATG
CCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAG
GGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGT
GGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTG
TCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAA
GTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGC
CGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTC
ATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAG
CTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGA
ACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTC
ACCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGT
ACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCA
AAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGA
TGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCAT
AAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATG
ATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTG
GCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTT
ACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATCACT
AGCAGATCTATGGGTTCCCTGGGGAAAGTGAATAATGAGATTCCGACTAAGAGCAGCGGCGGCAGCAAAGTGCTGGT
GATAGGGGGAACTGGCTACTTGGGGAAGAGGCTGGTGAAGGCTAGTTTGGATTCGGGCCACGACACCTACGTCATGC
ATCGCCCGGAGATTGGCGTCGACATCGAGAAAGTTCAGCTGCTGCTCTCCTTCAAGATGCAAGGCGCCCATCTCGTC
TCCGCCTCCTTCGACGACCAGCGCAGCCTCGTCGATGCTGTCAAGTTGGTCGACGTCGTCATCTGCGCCATCTCCGG
GGTTCACATCCGCAGCCACCAGATCCTTCTTCAGCTCAAGCTCGTCGAAGCCATCAAAGAAGCCGGTAACGTCAAGA
GGTTTGTGCCGTCGGAGTTCGGAACAGATCCGGCGAGGATGGAAAATGCGATGGAGCCAGGAAGGATCACATTCGAC
GACAAAATGGTGGTGAGGAGAGCGATAGAGGAAGCTGGGATCCCTTTCACTTACGTCTCTGCTAATTGCTTCGCTGG
ATACTTCCTTGGCGGCCTTTGCCAACCAGGCTACATTCTTCCTTCTAGAGACCATGTTACTTTGCTTGGAGATGGCG
ACAAAAAGGGGGTGTACGTGGACGAGGATGATACAGCCGCTTACACATTGAGGGCCATAGACGATCCTCGAACCCTC
AACAAGACGATCCACGTGAAGCCACCTAAGAACGTGTTGTCCCAAAGAGAAGTTGTTGGGATTTGGGAGAAATATAT
CGGCAAAGAGCTCCAAAAGACCATTCTATCCGAGCAAGACTTCCTGGCTACTATGAGAGAACAAAACTATGCAGAGC
AAGTTGGACTGACGCACTATTATCACGTGTGTTACGAGGGGTGTCTGTCGAATTTCGAGGTTGATGATGAGCAGGAA
GCCTCCAAGCTCTACCCTGATGTTCACTACACCACCGTCGAGGAATATCTAAAGCGTTACGTCTAGCTAGTCAGTCG
AAGCTTTCTAGAGGATCTGGGCGTGGTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATC
TGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCG
CATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACT
CTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCA
GCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGC
CCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGC
TGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTTAAAACATAAATAAAAAA
CCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTTATTTAGGGGTTTTGCGCGCGCGGTAGGCCCG
GGACCAGCGGTCTCGGTCGTTGAGGGTCCTGTGTATTTTTTCCAGGACGTGGTAAAGGTGACTCTGGATGTTCAGAT
ACATGGGCATAAGCCCGTCTCTGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAGCTTCATGCTGCGGGGTGGTGTTGTAGATG
ATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGGGGCAGGCC
CTTGGTGTAAGTGTTTACAAAGCGGTTAAGCTGGGATGGGTGCATACGTGGGGATATGAGATGCATCTTGGACTGTA
TTTTTAGGTTGGCTATGTTCCCAGCCATATCCCTCCGGGGATTCATGTTGTGCAGAACCACCAGCACAGTGTATCCG
GTGCACTTGGGAAATTTGTCATGTAGCTTAGAAGGAAATGCGTGGAAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGACCTCCAAG
ATTTTCCATGCATTCGTCCATAATGATGGCAATGGGCCCACGGGCGGCGGCCTGGGCGAAGATATTTCTGGGATCAC
TAACGTCATAGTTGTGTTCCAGGATGAGATCGTCATAGGCCATTTTTACAAAGCGCGGGCGGAGGGTGCCAGACTGC
GGTATAATGGTTCCATCCGGCCCAGGGGCGTAGTTACCCTCACAGATTTGCATTTCCCACGCTTTGAGTTCAGATGG
GGGGATCATGTCTACCTGCGGGGCGATGAAGAAAACGGTTTCCGGGGTAGGGGAGATCAGCTGGGAAGAAAGCAGGT
TCCTGAGCAGCTGCGACTTACCGCAGCCGGTGGGCCCGTAAATCACACCTATTACCGGCTGCAACTGGTAGTTAAGA
GAGCTGCAGCTGCCGTCATCCCTGAGCAGGGGGGCCACTTCGTTAAGCATGTCCCTGACTCGCATGTTTTCCCTGAC
CAAATCCGCCAGAAGGCGCTCGCCGCCCAGCGATAGCAGTTCTTGCAAGGAAGCAAAGTTTTTCAACGGTTTGAGAC
CGTCCGCCGTAGGCATGCTTTTGAGCGTTTGACCAAGCAGTTCCAGGCGGTCCCACAGCTCGGTCACCTGCTCTACG
GCATCTCGATCCAGCATATCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGGCGGCTTTCGCTGTACGGCAGTAGTCGGTGCTCGTCC
AGACGGGCCAGGGTCATGTCTTTCCACGGGCGCAGGGTCCTCGTCAGCGTAGTCTGGGTCACGGTGAAGGGGTGCGC
TCCGGGCTGCGCGCTGGCCAGGGTGCGCTTGAGGCTGGTCCTGCTGGTGCTGAAGCGCTGCCGGTCTTCGCCCTGCG
CGTCGGCCAGGTAGCATTTGACCATGGTGTCATAGTCCAGCCCCTCCGCGGCGTGGCCCTTGGCGCGCAGCTTGCCC
TTGGAGGAGGCGCCGCACGAGGGGCAGTGCAGACTTTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGCGCGAGAAATACCGATTCCGG
GGAGTAGGCATCCGCGCCGCAGGCCCCGCAGACGGTCTCGCATTCCACGAGCCAGGTGAGCTCTGGCCGTTCGGGGT
CAAAAACCAGGTTTCCCCCATGCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGGTTTCCATGAGCCGGTGTCCACGCTCGGTG
ACGAAAAGGCTGTCCGTGTCCCCGTATACAGACTTGAGAGGGAGTTTAAACGAATTCAATAGCTTGTTGCATGGGCG
GCGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAAAAATCAGGCAAAGCCTCGCGCAAAAAAGAAAGCACATCGTAGTCATGC
TCATGCAGATAAAGGCAGGTAAGCTCCGGAACCACCACAGAAAAAGACACCATTTTTCTCTCAAACATGTCTGCGGG
TTTCTGCATAAACACAAAATAAAATAACAAAAAAACATTTAAACATTAGAAGCCTGTCTTACAACAGGAAAAACAAC
CCTTATAAGCATAAGACGGACTACGGCCATGCCGGCGTGACCGTAAAAAAACTGGTCACCGTGATTAAAAAGCACCA
CCGACAGCTCCTCGGTCATGTCCGGAGTCATAATGTAAGACTCGGTAAACACATCAGGTTGATTCACATCGGTCAGT
GCTAAAAAGCGACCGAAATAGCCCGGGGGAATACATACCCGCAGGCGTAGAGACAACATTACAGCCCCCATAGGAGG
TATAACAAAATTAATAGGAGAGAAAAACACATAAACACCTGAAAAACCCTCCTGCCTAGGCAAAATAGCACCCTCCC
GCTCCAGAACAACATACAGCGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAACCTATTA
AAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGTGCAGAGCGAGTATATAT
AGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAAC
GAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTCACTTCCCATTTTAAGAAA
ACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAACCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCAC
GTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATGTTAATTAACA
TGCATGGATCCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTT
CCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGG
TTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAA
GGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGT
GGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACC
CTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTA
TCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCT
TATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGG
ATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGAC
AGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA
CCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCT
TTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAA
AAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGT
CTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGA
CTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCC
ACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTT
TATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC
GTTGTTGCCATTGCTGCAGCCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCACGTAGAAAGCCAGTCC
GCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAA
AGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTG
CCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTG
ATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACG
CAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCC
GCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACT
GCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTG
AAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAG
AAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGC
GAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATC
AGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCAT
GGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGT
GGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCT
TCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA
ATTTTGTTAAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAA
AAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAAC
GTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTC
GAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACG
TGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTA
ACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGATCGAATTAATTC
 Figura 15. Mapa circular.

10. Describir un método de confirmación para la trasformación mediante una técnica molecular
(PCR).

Existen marcadores bioluminiscentes, como la proteína verde fluorescente (EGFP), que generan la
emisión de luz en ciertos organismos a través de reacciones enzimáticas; siendo que por medio de
imágenes fluorescentes es posible apreciar la luminiscencia verde del plásmido de interés que lo contiene,
mientras que en aquellas células que no han sido modificadas por el plásmido con el gen de EGFP no
poseerán tal bioluminiscencia (Reynolds, et al, 2013).
11. Presentar los primers que emplearía para confirmar la transformación (puede utilizar la
herramienta (PRIMER-BLAST)

Figura 16. Diseño de primers realizados mediante Primer-Blast

 Tabla 6. Secuencia de primers realizados mediante Primer-Blast (Figura 16)

Enzimas de
Primer en el NCBI Primers Finales
Restricción

Forward GTGCTGGTGATAGGGGGAAC BglII AGATCTGTGATAGGGGGAAC

Reverse CCTCTTGACGTTACCGGCTT HindIII CCTCTTGACGTTACAAGCTT

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