UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

DIVISIÓN DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE ESTRUCTURA DE BIOMOLÉCULAS Y
CINETICA ENZIMÁTICA

“ÁCIDOS NUCLÉICOS”

PROFESOR: Dr. LUIS FELIPE PADILLA VACA

INTEGRANTES
- LUIS GERARDO CERVANTES HURTADO 100
%
- FRIDA SOFIA LEON CASTELLANO 100 %
- CINTHYA ANAYANSI PACHECO PALACIOS 100 %

FECHA DE ENTREGA: 07 DE JUNIO DEL 2022

OBJETIVO

Caracterización, cuantificación, secuenciación, purificación y extracción de ácidos nucleicos a partir de

varias muestras preparadas por el alumno, así como reactivos bases del laboratorio considerando sus
propiedades fisicoquímicas utilizando métodos químicos e instrumentales.

INTRODUCCIÓN

Antecedentes históricos

El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Miescher (1869), el cual, trabajando con
leucocitos y espermatozoides de salmón, obtuvo una sustancia rica en carbono, hidrógeno, oxígeno,
nitrógeno y un porcentaje elevado de fósforo. A esta sustancia se le llamó en un principio nucleína,
por encontrarse en el núcleo. Años más tarde, se fragmentó esta nucleína, y se separó un
componente proteico y un grupo prostético, este último, por ser ácido, se le llamó ácido nucleico. En
los años 30, Kossel comprobó que tenían una estructura bastante compleja.

En 1953, James Watson y Francis Crick, descubrieron la estructura tridimensional de uno de estos
ácidos, concretamente del ácido desoxirribonucleico o ADN.

Figura 1. Frierich Miescher (biólogo suizo)

Clasificación

 ARN (Ácido Ribonucleico)

Ácido que interviene junto al ADN en la síntesis de proteínas y del traslado de la información genética
del ADN. presente en células eucariotas y procariotas. Asimismo, el ARN está compuesto por una
cadena simple que en ocasiones puede duplicarse. Está conformado por nucleótidos, los cuales se
unen por enlaces fosfodiéster cargados negativamente y, cada nucleótido está constituido por: ribosa,
fosfato y 4 compuestos nitrogenados, conocidos como: adenina, guanina, uracilo y citosina.

Cumple con diversas funciones sirve para intermediar en la información genética y de catalizador en
la síntesis de proteína, es decir, el ARN copia la información de cada gen del ADN y, luego pasa al
citoplasma, donde se une al ribosoma para dirigir la síntesis proteica.

Tipos de ARN
  ARN mensajero (ARNm), conocido como ARN codificante, posee el código genético que
determina el esquema de los aminoácidos para formar una proteína.
 ARN transferencia (ARNt), se encarga de llevar los aminoácidos a los ribosomas con el fin de
incorporarlos al proceso de síntesis proteica, asimismo, se encarga de codificar la información
que posee el ARN mensajero a una secuencia de proteínas y, por último.
 ARN ribosómico (ARNr), forma parte de los ribosomas y actúa en la actividad enzimática, el
mismo se encarga de crear los enlaces peptídicos entre los aminoácidos del polipéptido en el
proceso de síntesis de proteínas.

Figura 2. ARN (ácido ribonucleico).

 ADN (Ácido Desoxirribonucleico)

Molécula presente en casi todas nuestras células que contiene la información genética. Esta molécula
posee el código que determina todas las características y el funcionamiento de un individuo.
Responsable de contener toda la información genética de un individuo o ser vivo, información que es
única e irrepetible en cada ser ya que la combinación de elementos se construye de manera única.

Almacena información de genes, el genoma, y también se ocupa de codificar a las proteínas y de

replicar al mismo ADN para de esta manera garantizar que se produzca el traslado de información a
las células nuevas mientras dura la división celular.

Figura 3. ADN (ácido desoxirribonucleico).

Distribución en la naturaleza

El DNA y RNA se encuentran en todos los organismos; en los eucariotas (protistas, hongos, plantas y
animales) y en organismos procariotas tales como las bacterias y en los virus los cuales son parásitos
intracelulares (adenovirus, bacteriófagos, viroides). El DNA en las células eucariotas se encuentra en
el núcleo, mitocondrias o cloroplastos los cuales están delimitados por una estructura membranosa
llamada envoltura nuclear, por el contrario, en los organismos procariontes se encuentra albergado el
material genético en el nucleoide el cual es una región mal demarcada de la célula que carece de una
membrana límite para separarse del citoplasma circundante.

En cuanto al contenido de DNA, este exhibe ser mayor en células eucariotas que en procariotas, en
las células procariotas y eucariotas , las células eucariotas poseen una cantidad de cromosomas
separados cada uno con una sola molécula lineal de DNA, asociado para formar un complejo de
nucleoproteínas que se denomina cromatina, mientras que casi todas los procariotas contienen un
único cromosoma circular; tanto las células procariotas como eucariotas presentan ribosomas los
cuales son lugares de síntesis de proteínas, en su división celular las células eucariotas se dividen por
un proceso de mitosis en el que los cromosomas duplicados se condensan en estructuras complejas,
mientras que los procariotas no presentan huso mitótico para separar las copias después de la
replicación y en su mayor parte exhiben ser organismo asexuados.

En el caso de los virus, el virión tiene una pequeña cantidad de material genético que dependiendo
del virus puede ser de cadena simple o doble, RNA o DNA en el cual el virus puede contener tres o
cuatro genes diferentes o cientos de genes diferentes, mientras que su lugar de almacenamiento de
material genético se encuentra rodeado por una cubierta proteica o cápside, sin incluir al viroide que
no tiene cápside.

Importancia biológica

La investigación sobre el ADN tiene un impacto significativo, especialmente en el ámbito de la

medicina, pero también en agricultura y ganadería (donde los objetivos son los mismos que con las
técnicas tradicionales que el hombre lleva utilizando desde hace milenios - la domesticación, la
selección y los cruces dirigidos - para obtener variedades de animales y plantas más productivos). La
moderna biología y bioquímica hacen uso intensivo de la tecnología del ADN recombinante,
introduciendo genes de interés en organismos, con el objetivo de expresar una proteína
recombinante concreta, que puede ser:

• Aislada para su uso posterior: por ejemplo, se pueden transformar microorganismos para
convertirlos en auténticas fábricas que producen grandes cantidades de sustancias útiles, como
insulina o vacunas, que posteriormente se aíslan y se utilizan terapéuticamente.

• Necesaria para reemplazar la expresión de un gen dañado que ha dado lugar a una patología, lo que
permitiría el restablecimiento de la actividad de la proteína perdida y eventualmente la recuperación
del estado fisiológico normal, no patológico. Este es el objetivo de la terapia génica, uno de los
campos en los que se está trabajando activamente en medicina, analizando ventajas e inconvenientes
de diferentes sistemas de administración del gen (virales y no virales) y los mecanismos de selección
del punto de integración de los elementos genéticos (distintos para los virus y los transposones) en el
genoma diana. En este caso, antes de plantearse la posibilidad de realizar una terapia génica en una
determinada patología, es fundamental comprender el impacto del gen de interés en el desarrollo de
dicha patología, para lo cual es necesario el desarrollo de un modelo animal, eliminando o
modificando dicho gen en un animal de laboratorio, mediante la técnica ‘’knockout’’ Sólo en el caso
de que los resultados en el modelo animal sean satisfactorios se procedería a analizar la posibilidad de
restablecer el gen dañado mediante terapia génica.

• Utilizada para enriquecer un alimento: por ejemplo, la composición de la leche (una importante
fuente de proteínas para el consumo humano y animal) puede modificarse mediante transgénesis,
añadiendo genes exógenos y desactivando genes endógenos para mejorar su valor nutricional, reducir
infecciones en las glándulas mamarias, proporcionar a los consumidores proteínas antipatógenas y
preparar proteínas recombinantes para su uso farmacéutico.

Importancia biomédica

Los médicos forenses pueden utilizar el ADN presente en la sangre, el semen, la piel, la saliva y el pelo
en la escena de un crimen para identificar al responsable. Esta técnica se denomina huella genética, o
también "perfil de ADN". Al realizar la huella genética, se compara la longitud de secciones altamente
variables de ADN repetitivo, como los microsatélites, entre personas diferentes. Este método es
frecuentemente muy fiable para identificar a un criminal, sin embargo, la identificación puede
complicarse si la escena está contaminada con ADN de personas diferentes.

Figura 4. Identificación de restos humanos.

La técnica de la huella genética fue desarrollada en 1984 por el genetista británico Sir Alec Jeffreys y
fue utilizada por primera vez en medicina forense para condenar a Colin Pitchfork en los asesinatos de
Narborough (UK) en 1983 y 1986. Se puede requerir a las personas acusadas de ciertos tipos de
crímenes que proporcionen una muestra de ADN para introducirlos en una base de datos. Esto ha
facilitado la labor de los investigadores en la resolución de casos antiguos, donde sólo se obtuvo una
muestra de ADN de la escena del crimen, en algunos casos permitiendo exonerar a un convicto. La
huella genética también puede utilizarse para identificar víctimas de accidentes en masa, o para
realizar pruebas de consanguinidad.

Importancia industrial

Industria alimenticia:

Las técnicas de micro balística o transfección con Agrobacterium, permiten modificar el material
genético de un organismo, añadiendo segmentos de ADN (genes) provenientes de otro, ya sea de la
misma especie o de una diferente. Cuando un gen de una especie se añade a otra, se obtiene un
organismo genéticamente modificado (OGM), es decir, un organismo transgénico.

Industria farmacéutica:

Los medicamentos de ácido nucleico son productos farmacéuticos elaborados a partir de

componentes estructurales del ADN y el ARN, denominados ácidos nucleicos (oligonucleótidos). A
través de la acción directa en la expresión de los genes, estos medicamentos pueden ser muy
prometedores para tratar enfermedades que antes eran muy difíciles de combatir.

Propiedades físicas y químicas

Renaturalización: Si se restablecen las condiciones iniciales, el ADN recupera su estructura.

Hibridación: Si se desnaturaliza una mezcla de ADN de distintas especies, en la renaturalización

aparecerán formas híbridas. Esto se llama hibridación del ADN.

Desnaturalización: El ADN a temperaturas superiores a los 100 °C se rompen los puentes de hidrógeno
que unen las bases, separándose las dos cadenas. Ocurre lo mismo con variaciones de pH. Los enlaces
fosfato-pentosa-base no se rompen.

Estabilidad: Esto permite la duplicación del ADN y para esto es necesaria la separación de las dos
cadenas, y lo mismo para la transcripción (formación de ARN mensajero).

Extracción y purificación

Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar
las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis
idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el
material inicial complejo, pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los
procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:

- Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);

- Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);

- Digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Tras
la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por
filtración o precipitación. Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos
celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes:

 Extracción/precipitación

A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos
nucleicos. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o
etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte
(como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También puede realizarse una precipitación
selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de las
proteínas mediante cambios del pH.

 Cromatografía

Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación:

La permeación sobre gel aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel para tamizar
moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas más
pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan eluidas en el volumen vacío.

La cromatográfica de intercambio iónico es otra técnica, que se basa en la interacción electrostática

de la molécula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos
(polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico
con simples Tampones salinos.

En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicos se fijan selectivamente en sílice o vidrio, en

presencia de determinadas sales (por ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas
biológicas no se fijan.

 Centrifugación

La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por ejemplo, la ultra
centrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando
mucho tiempo para purificar plásmidos. La centrifugación suele asociarse a otros métodos, como la
cromatografía de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la
centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños (sales, nucleótidos, etc.),
intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño.

 Separación por afinidad.

Esta técnica en fase sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos, pues permite sustituir las
etapas de centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por una operación de separación
magnética, única y rápida.
  Lisis alcalina

Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre
el DNA plasmídico (pequeños círculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosómico
(fragmentado). La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico
(SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas, y la
liberación de los plásmidos. La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal
(acetato potásico), provoca la precipitación de las proteínas y la del DNA cromosómico (por
reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas y DNA cromosómico
se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva
mayoritariamente su estructura nativa.

Figura 5. Extracción y purificación de DNA.

Extracción de RNA de células o tejidos:

 Método resumido de extracción de RNA por ultracentrifugación en gradiente de CICs

1. Homogeneizar el tejido en GTC, Tris-CIH, 2-ME.
2. Añadir sarcosil y centrifugar a 5.000 g, 10 min.
3. Hacer pasar el sobrenadante por una jeringa.
4. Colocarlo en un colchón de CICs y centrifugar a 30.000 g, 15 h.
5. Lavar el pellet con etanol y resuspender en Tris-EDTA.
6. Precipitar con etanol y centrifugar.
7. Lavar de nuevo con etanol y resuspender en agua tratada con DEPC.

Extracción de RNA con fenolcloroformo:

1. Homogeneizar el tejido en solución D (GTC, citrato, sarcosil y 2-ME).

2. Añadir acetato sódico, fenol y cloroformo. Agitar.
3. Centrifugar y recoger la fase acuosa.
4. Pelletear con isopropanol 2 veces.
5. Lavar con etanol.
6. Resuspender el RNA en agua tratada con DEPC.
 Figura 6. Etapas de la extracción de RNA de células o tejidos.

Ensayos de caracterización

 Método de Schneider

En este método se extraen los ácidos nucleicos mediante tratamiento de la fracción no lipídica
insoluble en ácido con TCA diluido a 90 °C durante 15 minutos. Durante el proceso los ácidos se
dividen como productos solubles en el extracto ácido; entonces pueden ser sometidos a reacciones
de coloración.

 Método de Schmidt y Thannhauser

En este método el tejido extraído se incuba durante una noche con álcali caliente, el cual degrada el
RNA a nucleótidos solubles en ácido sin afectar el DNA. Cuando la digestión alcalina se acidifica, el
DNA precipita, junto con una gran cantidad de proteína degrada, que se determina midiendo el
fósforo del DNA.

 Reacciones colorimétricas del componente azúcares

Estos métodos, que son procedimientos colorimétricos más o menos específicos para las pentosas o
desoxipentosas. Los compuestos que contienen pentosa generalmente no interfieren con los métodos
para la estimación de desoxipentosa, y viceversa.

 Southern Blott

Es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN
concreta en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis
en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo con su longitud y, después,
una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.

Figura 7. Métdo de Southern Blot.

Pasos:

1. Extracción del ADN. Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles
fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción. El ADN extraído de la muestra se
trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en
donde tenga una secuencia característica.
3. Electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN resultantes se separan según su
tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas
de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las
moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot"). Tras la electroforesis, las moléculas
de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando
éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario
resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia.
5. Hibridación con sonda radioactiva. Una sonda de locus único es una molécula pequeña de
ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN
de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern
 6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía. Las posiciones de hibridación de la sonda
radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía.
En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos
X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay
desintegración radiactiva.
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales de ADN en varios cromosomas
diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la
radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e
hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente.

Ensayos de cuantificación

Una vez obtenida nuestra muestra de ADN y/o RNA se procederá a cuantificar la cantidad obtenida.

 Cuantificación de ácidos nucleicos por espectroscopía UV

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases
aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de UV de DNA es una
característica de la molécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración.

Si la cantidad de ADN o ARN es muy pequeña, o si la muestra contiene grandes cantidades de

impurezas, la estimación de los ácidos nucleicos se puede llevar a cabo por la intensidad de
fluorescencia emitida por compuestos como el bromuro de etidio.

El método más usado actualmente es espectrofotometría debido a su rapidez, simplicidad y ausencia

de daño. Sin embargo, esta técnica es poco sensible, y para la mayoría de los espectrofotómetros se
requiere una concentración de ADN de al menos 1 μgxmL-1 en la muestra para poder realizar
estimaciones válidas. Por eso es recomendable realizar una electroforesis anteriormente para
comparar la pureza obtenida del ADN. Se mide la absorbancia a 260nm (A260) y a 280nm (A280). Si
comparamos la relación entre ambas absorbancias (A260/ A280) podemos decir si nuestra muestra
fue apropiadamente purificada o se está contaminado con proteínas o RNA.

Clonación de genes y proteínas recombinantes

Biológicamente un clon es un conjunto de individuos idénticos desde el punto de vista genético, esto
debido a que provienen de un mismo elemento precursor (moléculas, células, tejidos, órganos u
organismos pluricelulares completos, entre otros). Cada componente del clon contendrá la misma
información genética que el elemento de partida. Así, la clonación genética consiste en la producción
de copias idénticas de un gen o un fragmento de DNA, célula u organismo.

 Métodos de clonación genética

Para realizar una investigación que recurra a la clonación genética, lo primero que debe hacerse es
cortar el fragmento de DNA que va a utilizarse, en las posiciones correctas y con enzimas llamadas
endonucleasas de restricción, las cuales actúan como tijeras moleculares; a continuación, se unen los
fragmentos obtenidos, proceso realizado naturalmente por una enzima de unión llamada DNA ligasa.

Posteriormente se selecciona una pequeña molécula de DNA circular capaz de generar más copias de
ella misma. Esto se logra utilizando vectores de clonación (plásmidos o DNA viral), es decir moléculas
transportadoras, que transfieren y replican fragmentos de DNA. Los plásmidos se encuentran
naturalmente en las bacterias y son los que guardan información importante para su sobrevivencia,
como es el caso de los genes para ciertas toxinas o genes de resistencia a drogas.

El vector que transporta ahora el gen se conoce como plásmido recombinante y es introducido en
bacterias para que éstas, a través de su maquinaria genética, puedan expresar el gen y dar lugar a la
proteína. Las bacterias se mantienen en condiciones favorables de crecimiento (medio de cultivo)
para su amplificación y obtener de este modo múltiples células que poseen el fragmento de DNA
clonado.

Figura 8. Clonación genética.

El descubrimiento de que el ADN contiene la información necesaria para la síntesis de proteínas abrió
la posibilidad de producir proteínas muy similares a las humanas en microorganismos sencillos, como
bacterias y levaduras, pero sin los problemas y riesgos de otras fuentes. El procedimiento consiste en
introducir el ADN que contiene la información correspondiente a una proteína humana en particular
en células del microorganismo productor. Esto se hace utilizando un plásmido, que es un pedazo de
ADN circular que puede transferirse de un organismo a otro y que contiene varios elementos
necesarios para su permanencia en la célula y la producción de la proteína de interés. De esta forma,
el microorganismo produce la proteína humana, además de sus proteínas, convirtiéndose en una
“fabrica celular”. Las proteínas producidas de esta forma son llamadas proteínas recombinantes.

La primera proteína recombinante aprobada para ser utilizada como medicamento en humanos fue la
insulina, en 1982. Antes de estar disponible mundialmente la insulina recombinante, la diabetes se
trataba con insulina extraída de páncreas de cerdos o bovinos, la que no es idéntica a la humana, lo
que puede resultar en rechazo o neutralización de la proteína y una deficiente acción terapéutica.

Figura 9. DNA recombinante.

 Producción de proteínas recombinantes

Para producir una proteína recombinante es necesario contar con un plásmido capaz de recibir el gen
de interés y que cuente con los elementos necesarios para su replicación y mantenimiento en la
célula huésped y para la producción de la proteína recombinante. Este plásmido es tratado con
enzimas de restricción, las que lo cortan en un sitio específico en el que se insertará el gen de la
proteína de interés. Se utilizan otras enzimas denominadas ligasas para cerrar el plásmido. El
plásmido que contiene el gen de interés es introducido a la célula huésped por métodos químicos o
físicos.

RESULTADOS

Existen variantes en los métodos para purificar el DNA dependiendo del tejido o material con que se
cuente (sangre, tejidos, bacterias, levaduras, etc.) basándose en la solubilidad o precipitación del DNA
o de su afinidad a distintos tipos de matrices.

Para este reporte, llevo a cabo la realización de la práctica 12 “aislamiento de ácidos nucleicos”, en la
cual, mediante el procedimiento por lisis alcalina, se aisló DNA plasmídico a partir de un cultivo de
Escherichia coli que contiene el plásmido.
El primer paso de este método fue el crecimiento de la bacteria con 3 mL de medio Luria Bertrani con
ampicilina incubando a 37 °C/200 g. La pastilla obtenida presentaba un color rojo debido al gen de
expresión.

Figura 10. Pastilla roja obtenida de la bacteria.

Después de un proceso de aislamiento de DNA, se realizo la practica 13 “análisis y cuantificación de

ácidos nucleicos” en donde se iba a comprobar la integridad y calidad del DNA plasmídico obtenido de
Escherichia coli, esto mediante una electroforesis en un gel de agarosa preparado al 1%, para
posteriormente analizar y cuantificar el DNA.

En el primer pozo se colocó marcador, en los siguientes cuatro pozos se coloca respectivamente: 5 µL
de nuestra muestra de plásmido aislado en la práctica anterior (4 µL de plásmido + 1 µL de regulador
de carga); 5 µL de plásmido purificado proporcionado por el profesor (4 µL de plásmido + 1 µL de
regulador); 3 µL de PCR sólo; y finalmente, 1 µL de regulador de carga (azul de bromofenol) con 2 µL
de nuestra muestra de plásmido. En los siguientes 8 pozos se colocaron en el mismo orden las
muestras, únicamente utilizando dos
muestras distintas de plásmido de 2
equipos de trabajo distintos al nuestro.

Las muestras se corrieron a 95 V por 30

minutos. Una vez pasado los treinta
minutos se sacó el gel de agarosa de la
cámara con guantes y se llevó a analizar
bajo iluminación ultravioleta obtenido los
siguientes resultados (figura 12):
 Figura 11. Gel de agarosa sin luz UV.
Figura 12. Electroforesis de DNA
en gel de agarosa

Una vez obtenido el gel y analizado se preparó una muestra para la cuantificación de DNA de la
siguiente manera: 990 µL de agua destilada + 10 µL de DNA. Se realizo una lectura en el
espectrofotómetro con una celda de plástico a 280 y a 260 nm arrojando:

 A260: 0.885
 A280: 0.448

Cálculos

 Concentración:
−3
50 x A260 =concentración de DNA (μg c m )
50 x 0.885=44.25 μg c m−3

Resultado en µg / µL

44.25 μg c m−3 ( 1 c m3
1000 μL)=0.04425
μg
µL
→ en 1 mL

Sin embargo, se utilizó 100 µL, por lo tanto:

μg μg
0.04425 x 100=4.425
µL µL

 Relación de absorbancia:
Absorbancia 260 nm 0.885
= =1.97
Absorbancia 28 0 nm 0.448
 La relación indica que la muestra está libre de contaminación proteica, por lo tanto, la pureza
del DNA obtenida es alta.

DISCUSIÓN

Es importante mencionar, que desde un inicio los pasos fueron muy exactos y cuidadosos, ya que sin
ellos no hubiera sido posible los buenos resultados, desde la realización de aislamiento de ácidos
nucleicos para obtener el DNA plasmídico, cada reactivo utilizado en el procedimiento funge una
parte importante para la obtención del mismo, comenzando por el reactivo GTE el cual ayuda a inhibir
nucleasas y en conjunto con el SDS alcalino rompe células (proteínas), además favorece a la
precipitación y bloquea las cargas de los ácidos nucleicos; al utilizar solventes como el fenol y
cloroformo nos ayudaron a eliminar los excesos que pudieran quedar de proteínas; después, para
poder concentrar la muestra se precipito con etanol, y finalmente, se lava la pastilla con etanol al 70-
80%, para posterior a esto, poder realizar la cuantificación de DNA.

En cuanto a la interpretación de la electroforesis en gel de agarosa, en la figura 12 se pueden apreciar

como el marcador presenta las diferentes conformaciones, empezando de arriba hacia abajo con la
presencia de un plásmido en la conformación relajada, en la parte media se encuentra circular, y en la
parte final están las conformaciones de plásmidos superenrollados. Además, se observa como el
plásmido de ADN completamente digerido usualmente muestra sólo una única banda, una forma
lineal del plásmido en su carril con el tamaño esperado. El plásmido no digerido puede tener dos
formas de mostrar su carril: en forma de dímero CCC (superenrollado) y en forma de monómero CCC.
La forma de dímero, debido a su mayor y doble tamaño comparado a los monómeros, usualmente se
mueve más lento que los monómeros. Adicionalmente, éste aparecerá más arriba en el gel que un
monómero. La forma del monómero CCC corre más rápido que la forma lineal digerida del plásmido
de ADN.

Con la purificación de ADN plasmídico en gel de agarosa utilizando bromuro de etidio para su
identificación, se realizaron los cálculos de las relaciones de absorbancia a 260/280 nm y
concentración de μg/μL (tomando en cuenta el efecto de dilución), se analizaron las muestras en base
a que si el análisis de la muestra se mostraba de forma corrida en el gel de agarosa y por otro lado el
tamaño en pares de bases, obteniendo buenos resultados y un alta purificación.

REFERENCIAS

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capítulo 10 “DNA y RNA Estructura y función”
 McLennan, Alexander. (2014). Bios. Notas instantÿneas de biologa molecular. México: Mc
Graw Hill.
 Burriel, V. (s.f) Estructura y propiedades de los ácidos nucleicos. Química Aplicada a la
Ingeniería Biomédica. Consultado en:
https://www.uv.es/tunon/pdf_doc/AcidosNucleicos_veronica.pdf
 David L. Nelson y Michael M. Cox (2014). Lehninger: Principios de Bioquímica (en inglés) (Sexta
Edición edición). Omega. ISBN 9788428216036.
 Davidson, R. L. P. Adams. (1980). Bioquímica de los ácidos nucleicos de Davidson. España:
Reverté.
 Usos de los Ácidos Nucleicos en la "Biotecnología". (n.d.). From
https://prezi.com/gh1qpqjcwtik/usos-de-los-acidos-nucleicos-en-la- biotecnologia/
 Guillermo Álvarez Llera. La Guia Interactiva de Bioquímica Estructural, es creada y actualizada
por el Laboratorio de Informática Docente, Departamento de Bioquímica de la Facultad de
Medicina, UNAM. Versión 1.0.0. Consultada en;
http://laguna.fmedic.unam.mx/~3dmolvis/lipido/index.html
 Conogasi. (2018). Las proteínas recombinantes: nuestras aliadas en la salud. 2022, Mayo 27,
Conogasi.org Sitio web: https://conogasi.org/articulos/las-proteinas-recombinantes-nuestras-
aliadas-en-la-salud/
 Cuellar M. P.; Padilla V. L. (2018). Universidad de Guanajuato. Bioquímica: un estudio práctico
de las biomoléculas. Guanajuato, Gto., México.