UT 5- PARTE I (ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS)

1. INTRODUCCIÓN

En biología molecular, una gran cantidad de técnicas que se realizan comúnmente requieren el uso
de la electroforesis, por lo que supone una parte importante del procedimiento sistemático del
análisis de los ácidos nucleicos y las proteínas.
La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del
medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a
un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia de las proteínas,
que pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa,
debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán
hacia el polo positivo; es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas se realiza pretratamiento con
detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se
homogenizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo, y sólo se separarán
por tamaño.
El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de
un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el
campo eléctrico.

2. COMPONENTES DE UNA EF.

2.1. Cámara de EF

La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico

alrededor de un gel donde se depositan las muestras. Este campo se genera dentro de una solución
amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido
de electrolitos permite la transmisión de la corriente eléctrica, manteniendo el pH estable al paso de
la corriente. La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.
En las cámaras de electroforesis vertical el polo positivo se encuentra en la parte inferior de la
cámara
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y en las horizontales, en uno de los extremos.

En ambos tipos de cámaras el polo positivo se distingue con color rojo y el negativo con negro.

2.2. Gel

La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con la finalidad de evitar perturbaciones
mecánicas durante la separación. El soporte idóneo es un gel semisólido o gelatinoso, compuesto
por polímeros que forman una especie de malla o microporos tridimensionales a través de los cuales
avanzan las moléculas, según el peso molecular, lo que permite la separación por tamaño de los
diferentes componentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. Para la
separación de ácidos nucleicos se usan geles de agarosa o acrilamida y para proteínas, sólo de
acrilamida.

Geles de agarosa:
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en
estado sólido a temperatura ambiente, se disuelve fácilmente a temperatura de 50 a 60ºC (líquida) y
se solidifica cuando se enfría, formando un gel altamente poroso.
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Para elaborar el gel se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solución
amortiguadora adecuada de la misma composición y concentración que el buffer de electroforesis y
se calienta hasta formar una solución. Sin dejar enfriar se vacía inmediatamente sobre un molde de
forma rectangular y en uno de los extremos se coloca un peine con la finalidad de generar los
pocillos u orificios donde se colocarán las muestras.

La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto tóxico y permite realizar
el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados, según la concentración de agarosa
que se emplee. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida.
La concentración de agarosa se escoge según el tamaño del ácido nucleico que se vaya a analizar. El
tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y la
concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido; esto es, a
mayor concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son pequeños la
migración del ácido nucleico es más lenta.

Migración de las moléculas de ADN en un gel de agarosa.

Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un peso molecular alto migran al ánodo
más lentamente que los de menor peso molecular. Esto se debe a que los ácidos nucleicos de peso
elevado tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa.
La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.

Geles de acrilamida (PAGE: Polyachrylamide Gel Electrophoresis):

La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte, con el que se

pueden generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. El gel de poliacrilamida es el
resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
El tamaño de poro de un gel de acrilamida está determinado por la concentración total de acrilamida
presente (acrilamida + bisacrilamida), que generalmente se maneja en proporción de 19:1.
Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre
menores que la de los geles de agarosa.
Cuando la acrilamida se encuentra en disolución acuosa experimenta autopolimerización de forma
espontánea y lenta. El polímero en disolución no forma un gel, sino que se encuentra en estado
viscoso; la formación del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo que se consigue con la
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bisacrilamida). La acrilamida es una neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaución.
También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado, seco y oscuro para reducir la
autopolimerización y la hidrólisis.
El gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que la agarosa y es susceptible de teñirse
por varios procedimientos, y también puede desteñirse en caso necesario. Los geles de acrilamida
pueden digerirse para extraer fracciones separadas (bandas) o desecados para su exposición
radiográfica y registro permanente.
La electroforesis con geles de acrilamida siempre se realiza en cámaras verticales.
La electroforesis de proteínas emplea geles de acrilamida.

Buffer de electroforesis
El buffer de EF es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de
resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida. Éste proporciona el medio para la transmisión de la
corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza la EF.
En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE.
El TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE
contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5.
La PAGE se realiza con TBE.
Marcador de Peso Molecular
Son moléculas de ADN o de proteínas que permiten determinar por comparación el tamaño de los
fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.
Los marcadores de peso molecular están disponibles comercialmente en amplia variedad. En el caso
de marcadores de peso molecular de ácidos nucleicos, éstos pueden ser fagos o plásmidos
sometidos a corte con enzimas de restricción que generan fragmentos de tamaño conocido; también
puede tratarse de moléculas de ADN sintéticas denominadas escaleras, porque contienen
fragmentos con incrementos de tamaño gradual.
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Los marcadores de peso molecular de proteínas suelen ser una serie de proteínas de peso molecular
conocido.

Buffer de carga
Este amortiguador tiene como fin dar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito
en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además, monitorizar el corrimiento de la muestra en
el gel.
Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de
muestra.
El buffer de carga de ácidos nucleicos contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol.
Mientras que el buffer de carga para proteínas contiene Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS,
glicerol y azul de bromofenol.

Transiluminador ultravioleta
El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, excitando la
molécula cromogénica que emite energía fluorescente que permite visualizarla. El transiluminador
es el sistema empleado con más frecuencia por ser simple y efectivo.

Una vez que se tienen los materiales necesarios existen dos maneras de realizar la electroforesis: de
forma horizontal y vertical.

3. EF HORIZONTAL

Se lleva a cabo con gel de agarosa para ácidos nucleicos.

Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la finalidad de evitar que se seque por el
calentamiento inducido por el paso de la corriente eléctrica. Al momento de cargar las muestras en
los pocillos, se puede optar por hacerlo en seco; esto es, llenar parcialmente la cámara con tampón
de EF de tal manera que la parte superior del gel no se cubra de buffer para que los pocillos puedan
llenarse sin la interferencia del líquido. Una vez cargada la muestra, se corre por unos minutos a
bajo voltaje hasta que la muestra entre en el gel y entonces se cubre del todo con el buffer de
corrimiento.
También existe la técnica denominada electroforesis submarina, en la que la totalidad del gel se
cubre con el buffer. La muestra se coloca con el gel sumergido en el buffer.
:
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4. EF VERTICAL

Empleada exclusivamente con gel de poliacrilamida, se utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de
pequeño tamaño. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangulares de vidrio donde la
corriente eléctrica se genera gracias al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las
cubetas o compartimientos del ánodo y el cátodo:

5. PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA EF

A continuación, se exponen los pasos de los que consta una electroforesis típica:
1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
5. Visualizar los ácidos nucleicos

5.1. Electroforesis de ácidos nucleicos

El método más común para la electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de agarosa, con
una concentración de 0.7 a 3%. La carga eléctrica de la molécula de ADN la otorgan sus grupos
fosfato, de carga negativa, y cuyo número es igual al doble del número de pares de bases. Dado que
la forma de la molécula de ADN siempre es la misma, la movilidad de la electroforesis dependerá
únicamente de la longitud del ADN (pb) y se representará en bandas.

La EF se realiza a voltajes de entre 30 y 130 V; a mayor voltaje mayor velocidad de migración. El

avance electroforético se monitoriza a través de la visualización de los colorantes (azul de
bromofenol y azul de xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mezcló la muestra
previa a su colocación en el pocillo.
Si los fragmentos de ADN son pequeños (menos de 50 pb) o bien se requiere discernir entre
fragmentos de ácidos nucleicos con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda utilizar
un gel de poliacrilamida que permita esta resolución.
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Las agarosas con un punto de fusión bajo permiten la preparación de geles a elevadas
concentraciones y se aconseja para obtener una buena separación de moléculas de ADN con < 1000
pb. Son ideales para preparar geles analíticos de productos procedentes de PCR. Algunas son
capaces de separar fragmentos que difieren entre 10 y 20 pb. Para la preparación del gel debe
estandarizarse primero qué concentración de agarosa es la más adecuada, según la muestra que se
desee separar.
El volumen de agarosa depende del tamaño de la cámara de electroforesis; 20 a 25 ml son
suficientes para las dimensiones más comunes del gel: 8 × 6 × 0.5 cm (L × A × A).
Inmediatamente después de vaciar la agarosa a la cámara, debe insertarse el o los peines necesarios.
La agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 minutos, mientras que la poliacrilamida, unos 30
minutos.
Una vez solidificado el gel, se añade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a concentración 1×,
cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm por encima del gel) y se retiran los peines. Las muestras
se mezclan con el buffer de carga y se depositan cuidadosamente en los pocillos, evitando que se
salgan y puedan entrar en otros pozos contaminando el pocillo contiguo. Debe considerarse el uso
de un marcador de peso molecular en, por lo menos, uno de los carriles, para la determinación del
peso molecular de la muestra. Este marcador también debe mezclarse con un buffer de carga,
excepto cuando ya viene preparado para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos se procede a la transmisión de la corriente
eléctrica. Se conectan los cables de la fuente de energía de cada polo eléctrico a la cámara de
electroforesis en el electrodo que le corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso
molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Para el caso de productos de PCR (entre
100 pb y 1.5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100 V. Para muestras de
ADN genómico y plasmídico (> 2 kb) se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V.

Es importante que se estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolución

posible. Durante la EF se monitoriza la migración de la muestra con colores que contiene el buffer
de carga, donde se observa el color azul y el verde correspondientes a los colorantes azul de
bromofenol y azul de xileno, respectivamente. En geles de agarosa, al 2% el azul de bromofenol se
comporta como un fragmento de 100 pb.
La EF se detiene cuando se considera que la muestra se localiza en la posición deseada, o bien
cuando la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes del gel.
Hay múltiples factores que pueden afectar la migración del ADN, como la concentración del gel
utilizado, el tamaño de la molécula de ADN muestra, el empaquetamiento del ADN, el voltaje, la
temperatura del buffer de corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje es muy alto), la
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contaminación con agentes intercalantes en la muestra, la composición del buffer de corrimiento,
etcétera.

5.2. Visualización de las muestras

Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente, el bromuro de

etidio, que tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN.
Debido a esta propiedad es un agente mutagénico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de
etidio, por lo general, se incorpora a la agarosa (0.5 mg/ml) antes de permitir la solidificación, o
puede incorporarse después de la EF, incubando el gel en una solución que lo contenga a 0.5 mg/ml.
El bromuro de etidio fluorece de color naranja cuando se expone a la luz ultravioleta (longitud de
absorción de 254 nm, con longitud de emisión de 366 nm). La señal fluorescente es proporcional a
la cantidad de producto.

Su sensibilidad permite detectar aproximadamente 30 pg de ácido nucleico por banda (según el

grosor del gel).
El bromuro de etidio es teratogénico, mutagénico y cancerígeno, por lo que para este procedimiento
se recomienda el uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio se ha sustituido por un
compuesto comercial, SYBR® Safe, que se une de manera no covalente a los ácidos nucleicos. Con
este colorante, el ADN puede visualizarse con una luz ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm.
Para los geles de acrilamida una alternativa al bromuro de etidio es el nitrato de plata; sin embargo,
éste utiliza reactivos peligrosos, como el formaldehído. Por otro lado, la tinción con plata es más
sensible que el bromuro de etidio, más barata a largo plazo y menos tóxica.
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6. APLICACIONES DE LA EF

Algunos de los usos de la EF para ácidos nucleicos en geles de agarosa son

- Analizar la calidad del ADN genómico tras su extracción
- Determinar los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos
- Analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción (mapa de restricción),
- Comparar los tamaños de distintos tipos de ADN,
- Aaislar y recuperar fragmentos de ADN purificados para clonaciones moleculares, y
analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a las técnicas de hibridación, como el
Southern blot (ADN) o el Northern blot (ARN), donde la presencia de determinada secuencia del
ácido nucleico en una mezcla de moléculas se distingue por su tamaño, la cual se confirma por
hibridación con una sonda específica.
Asimismo, la EF es crucial en técnicas como la secuenciación, donde tras un corrimiento
electroforético de las cuatro reacciones de elongación con los dideoxinucleótidos (como se verá más
adelante), se puede deducir la secuencia del segmento de ácido nucleico. Inclusive, los
secuenciadores automáticos modernos emplean una electroforesis capilar para el discernimiento de
la secuencia.

7.- ELECTROFORESIS CAPILAR

Se trata de una alternativa a la electroforesis convencional, cuya principal diferencia es que la

separación se lleva a cabo en un capilar. Actualmente los capilares, donde se lleva a cabo el proceso
de separación, suelen ser de sílice fundida, aproximadamente entre 20 y 200 µm de diámetro interno
y entre 10 y 100 cm de longitud. Según los equipos se requiere de uno o más capilares.

Ofrece numerosas ventajas:

- Son procesos muy rápidos (1-30 min)
- La migración de las moléculas se sigue mediante detectores ( fluorescencia, conductividad,
absorbancia etc)
- Se consigue gran resolución
- Se realiza en equipos totalmente automatizados lo que garantiza la reproductividad
- Emplea pequeñas cantidades de muestra
- Consume pequeños volúmenes de tampón
7.1. Procedimiento

La muestra se inyecta dentro del capilar. Los fragmentos de ADN deben ser previamente marcados
con fluorocromos de tal manera que al ser excitados por una fuente de excitación emiten
fluorescencia que puede ser detectada por un “detector”

El método de marcaje más utilizado sería la inserción de primers marcados con fluorocromos
durante la PCR.

Seguidamente las lecturas del detector se presentan en la pantalla de un ordenador mostrando el

electroferograma resultante del análisis.
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.De tal manera que el procedimiento sería el siguiente:

Para la separación de fragmentos de ADN, el electrodo negativo ( cátodo) se encontrará en la

entrada del capilar y el electrodo positivo en la salida. Al mismo tiempo que los fragmentos de
ADN que se van moviendo hacia el ánodo (+), se van separando de acuerdo a la acción del campo
eléctrico (los de mayor peso molecular lo harán más lentamente y los de menor peso molecular
viajarán más rápido a través del capilar). Dichos fragmentos al estar marcados con fluorocromos y
al ser excitados por ejemplo por un láser de argón, emite una fluorescencia detectada por el
detector, lográndose así el análisis de múltiples fragmentos. (Por ejemplo: primero llegaría a la
ventana óptica, el fragmento de 100 pares de bases (pb), incide el láser, lo excita y emite una
fluorescencia que se observará en forma de “pico” en la pantalla de un ordenador. A continuación
llegaría el fragmento de 200 pb (a la ventana) incide el láser que lo excita y emite una fluorescencia
en forma de “pico” que se observará en la pantalla del ordenador, después el fragmento de 300 pb (a
la ventana)...así sucesivamente, obteniéndose en la pantalla del ordenador el electroferograma).

También, los termocicladores en tiempo real basan la detección de los fragmentos amplificados en
una electroforesis capilar, donde es posible la detección inmediata de los segmentos amplificados y
su lectura por el láser correspondiente al flurocromo con que el producto está marcado.

9.7.2. Aplicaciones en biología molecular

Actualmente la electroforesis capilar (EC) es una técnica analítica muy utilizada en biología
molecular. Sus aplicaciones son las siguientes:
* Análisis de fragmentos
1- Hacer discriminación alélica por tamaño
2- Análisis de STRs (aplicaciones forenses, pruebas de paternidad,….)

* Secuenciación de ADN (se estudia en otro tema)

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