Practica #5
Practica #5
Practica #5
GRUPO 11
TEMA:
CURSO:
DOCENTE:
ALUMNO:
2 OBJETIVOS..............................................................................................................4
3 MARCO TEÓRICO...................................................................................................5
4 MARCO PRÁCTICO..............................................................................................11
5 CUESTIONARIO....................................................................................................14
6 BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................20
1 INTRODUCCIÓN
Las enzimas son esenciales para la vida y son uno de los tipos más importantes de
proteína en el cuerpo humano. Estudiar la cinética de la enzima ofrece la información
sobre el alcance diverso de reacciones en el cuerpo humano, que podemos utilizar para
entender y para predecir el metabolismo de todas las cosas vivas.
De esta forma, la medida de V0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del
sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo
largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la
reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción
inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de
velocidad.
Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos
suelen medir los cambios experimentados bien en la concentración de sustrato (que va
decreciendo), bien en la concentración de producto (que va aumentando).
1. Cuando [S] es mucho menor que Km, el termino Km + [S] es en esencia igual a
la Km. El reemplazo de Km + [S] con Km reduce la anterior ecuación
En otras palabras, cuando [S] está muy por debajo de Km, vi es proporcional a k[S]. Por
ende, la velocidad de reacción inicial es directamente proporcional a [S].
2. Cuando [S] es mucho mayor que Km, el termino Km + [S] es en esencia igual a
[S].
De este modo, cuando [S] excede con mucho a Km, la velocidad de reacción es máxima
(Vmax) y no está afectada por aumentos adicionales de la concentración de sustrato.
La ecuación declara que cuando [S] es igual a Km, la velocidad inicial es de la mitad del
máximo. La ecuación también revela que Km es y puede determinarse la manera
experimental a partir de la concentración de sustrato a la cual la velocidad inicial es de
la mitad del máximo.
Con este tipo de gráfica también se puede visualizar el comportamiento de una enzima
en presencia de un inhibidor. Si se trata de un inhibidor competitivo, observaremos que
la linea intersecta al eje Y en el mismo punto que la linea que representa la cinética sin
inhibidor, es decír, que no se modifica el valor de la Vmax, pero sí vemos un cambio en
la valor de Km (linea azul). Por otro lado, si se trata de un inhibidor no competitivo, el
valor de Km no cambia pero si lo hace la Vmax (linea roja).
En está prueba el fosfato en medio ácido reacciona con ácido molibdico para generar
ácido fosfomolibdico. Este es un compuesto fácilmente reducible, por lo que reacciona
con ácido ascórbico generando ácido dehidroascorbato y óxidos de molibdato que
presentan coloración azul. Por ésta razón los fosfatos son cuantificables mediante
técnicas espectrofotométricas.
Este método servirá para determinar la cantidad de fosfato inorgánico presente en una
muestra después de haber tratado al B-glicerolfosfato con fosfatasa alcalina.
FUNDAMENTO:
El fósforo inorgánico reacciona con el molibdato de sodio formando un complejo
amarillo de fosfomolibdato de sodio. Este es reducido por el ácido 1,2,4-
aminonaftolsulfónico, formándose un complejo de color azul cuya intensidad medida a
660 nm. es proporcional a la concentración de fósforo presente.
TUBO STANDARD DE
FÓSFOR (ug/ml)
BLANCO 0
1 8
2 16
3 24
4 32
5 40
Mezclar y dejar en reposo 10 minutos. leer a 660 nm en el espectrofotómetro usando
cubetas de 16 mm de diámetro contra el blanco. Procure hacer las lecturas antes de los
30 minutos de haber mezclado.
Factor =Abs/
TUBO Absorbancia (nm) Concentración (ug/ml)
conc
1 0.15 8 0.01875
3 0.45 + 0.15
24 +8
0.01875
+ 0.15 +8
4 0.6 32 0.01875
5 0.75 40 0.01875
5 5
∑ A=ab ∑ c
A partir de los datos calcular la constante ab ( 1 1 )
0.15
Ab= =0.01875
8
0.3
Ab= =0.01875
16
0.45
Ab= =0.01875
24
0.75
Ab= =0.01875
40
1) CURVA ESTÁNDAR
N° ug/mol Abs
moles
1 8 0.15
2 16 0.30
3 24 0.45
4 32 0.60
5 40 0.75
120 2.25
ABSORBANCIA
Ab=
CONCENTRACIÓN
2.25
Ab= =0.01875
120
5 CUESTIONARIO
El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio
(Fig. 1) quedando listo para su uso.
2. ¿Cuál es el valor de la velocidad en el casos 1? Según su ejemplo, busque su
velocidad máxima.
TUBO 01
Si el extracto enzimático pasa por purificación a través de una columna de filtración por
sephadex y se coge una de dos alícuotas que dan:
Sería:
Sustrato:
Es cualquier compuesto químico que subyace a otro y sobre el cual está en condiciones
de ejercer algún tipo de influencia.
Por otra parte, hace referencia a una capa o nivel de algo. Es una molécula sobre la cual
actúa una enzima, dicho de otra forma, las enzimas se encargan de catalizar las
reacciones químicas que involucran a su sustrato.
La unión entre enzima y sustrato forma un complejo.
La enzima:
Coenzimas:
Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas no proteicas que transportan grupos
químicos entre enzimas. A veces se denominan cosustratos. Estas moléculas son
sustratos de las enzimas y no forman parte permanente de la estructura enzimática.
ENZIMAS REGULADORAS
Son catalizadores biológicos, que además de las propiedades que caracterizan a las
enzimas, presentan características que le confieren papeles reguladores del
metabolismo. Existen dos tipos:
En las enzimas alostéricas la unión de un sustrato a un sitio activo puede afectar las
propiedades de otros sitios activos en la misma molécula. Un posible resultado de
esta interacción entre subunidades es que la unión del sustrato resulte cooperativo, es
decir que la unión del sustrato en un sitio activo facilita la unión de los otros sustratos
en los sitios activos vecinos.
Enzimas homotrópicas.
El sustrato actúa, también como modulador. Estas enzimas contienen dos o más
centros de unión para el sustrato. La modulación dependerá de cuántos sean los
centros del sustrato que están ocupados.
Enzimas heterotrópicas.
Son estimuladas o inhibidas por un modulador diferente a la del sustrato.
INHIBICIÓN REVERSIBLE
Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera
parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se
combinan con el enzima libre sino con el complejo enzima-sustrato.
INHIBICIÓN COMPETITIVA
El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato,
de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero que no posee
ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima. El inhibidor forma con el
enzima libre un complejo enzima-inhibidor de características cinéticas análogas a las
del complejo enzima-sustrato, pero que, lógicamente, no puede descomponerse a
continuación para dar lugar al enzima libre y a los productos.
INHIBICIÓN ACOMPETITIVA
El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unión al sustrato, sino que
lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima-
sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los productos.
INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-
sustrato, interfiriendo en la acción de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a
un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en la una alteración que
dificulta bien la formación del complejo enzima-sustrato o bien la descomposición de
éste para dar lugar a los productos.
Aunque podría pensarse que los distintos tipos de inhibición estudiados pueden
desempeñar algún papel en la regulación de la actividad enzimática, todo parece indicar
que no es así; la regulación de la actividad enzimática se lleva a cabo mediante
mecanismos que no se ajustan a ninguno de los modelos de inhibición estudiados y que
se describirán en el próximo apartado. El interés del estudio de la inhibición enzimática
reside más en su utilidad para comprender la estructura, mecanismos catalíticos y
especificidad de los enzimas, que en una importancia biológica real.
6 BIBLIOGRAFÍA