Practica #5

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA- CICLO III-2023

“Año de la unidad, la paz y el desarrollo”

GRUPO 11

TEMA:

Practica N°5: CINETICA ENZIMATICA

CURSO:

Estructura, función celular y tisular II

DOCENTE:

Dra. Elva Dhenis Lujan Castillo

ALUMNO:

Mariñas Arellano Eder Josue


ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN.....................................................................................................3

2 OBJETIVOS..............................................................................................................4

3 MARCO TEÓRICO...................................................................................................5

3.1 CONCEPTOS BÁSICOS...................................................................................5

3.1.1 CINÉTICA ENZIMÁTICA.........................................................................5

3.1.2 GENERALIDADES DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA..........................5

3.2 ESTUDIO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA.................................................5

3.2.1 ENSAYOS ENZIMÁTICOS.......................................................................6

3.3 CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN...........................................................7

3.4 GRÁFICA DE LINEWAVER BURKE.............................................................8

3.5 MÉTODO DE FISKE – SUBBAROW............................................................10

4 MARCO PRÁCTICO..............................................................................................11

4.1 MÉTODO DE FISKE - SUBBAROW PARA LA DETERMINACIÓN DEL


FÓSFORO INORGÁNICO:........................................................................................11

5 CUESTIONARIO....................................................................................................14

6 BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................20
1 INTRODUCCIÓN

Las enzimas son esenciales para la vida y son uno de los tipos más importantes de
proteína en el cuerpo humano. Estudiar la cinética de la enzima ofrece la información
sobre el alcance diverso de reacciones en el cuerpo humano, que podemos utilizar para
entender y para predecir el metabolismo de todas las cosas vivas.

A fin de mantener la homeostasis se requiere un conjunto completo y equilibrado de


actividades de enzimas. La cinética enzimática, la medición cuantitativa de las tasas de
reacciones catalizadas por enzima, y el estudio sistemático de factores que afectan estas
tasas, constituye una herramienta fundamental para el análisis, diagnóstico y tratamiento
de los desequilibrios enzimáticos que subyacen muchas enfermedades humanas. Por
ejemplo, el análisis de la cinética puede revelar el número y el orden de los pasos
individuales mediante los cuales las enzimas transforman sustratos en productos, y
conjuntamente con mutagénesis dirigida hacia sitio, los análisis cinéticos pueden revelar
detalles del mecanismo catalítico de una enzima dada. La aparición de enzimas
particulares en la sangre, o un aumento repentino de las concentraciones de las mismas,
sirve como un indicador clínico para enfermedades como infarto de miocardio, cáncer
de próstata y daño hepático.
2 OBJETIVOS

 Describir el alcance y los propósitos generales del estudio de la cinética


enzimática.
 Describir el mecanismo de acción de las enzimas en las reacciones químicas.
 Esbozar cómo la temperatura y la concentración de iones hidrógeno, enzima y
sustrato afectan la tasa de una reacción catalizada por enzima.
 Describir la aplicación de formas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten
para estimar la Km y la Vmáx.
3 MARCO TEÓRICO

3.1 CONCEPTOS BÁSICOS

3.1.1 CINÉTICA ENZIMÁTICA

Comprende el estudio de los parámetros que influencian la velocidad de las reacciones


químicas catalizadas por enzimas y la interpretación de los datos en término de los
mecanismos moleculares posibles.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.


Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción
catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario
purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de
pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes
de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad
máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los
productos o la desaparición de los reactivos.

3.1.2 GENERALIDADES DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en


función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente,
la cinética de la reacción.

A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va


disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción.

De esta forma, la medida de V0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del
sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo
largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la
reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción
inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de
velocidad.

3.2 ESTUDIO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA


Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de
sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima
constante. Si representamos V0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica parecida a la
siguiente:

Cuando [S] es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la


concentración de sustrato, y, por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S], la
enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]. En
este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

3.2.1 ENSAYOS ENZIMÁTICOS

Un ensayo enzimático es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante


el cual se puede medir la velocidad de una reacción enzimática.

Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos
suelen medir los cambios experimentados bien en la concentración de sustrato (que va
decreciendo), bien en la concentración de producto (que va aumentando).

Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un


comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de
sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo
(disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva
asintótica en la gráfica.
La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es
decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible
medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta
forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de
progreso. Esta aproximación es muy útil como alternativa a las cinéticas rápidas, cuando
el período inicial es demasiado rápido para ser medido con precisión.

3.3 CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN

Si la concentración de E es constante, el aumento en la concentración de S puede hacer


aumentar la velocidad de formación de P siempre que dicha concentración de S no sea
tan alta como para que toda la E se encuentre formando el complejo ES. Llegado ese
punto, ulteriores aumentos de la concentración de S no podrán provocar aumentos en la
velocidad de formación de P ya que no habrá más E libre para formar más complejo ES.
Estas ideas fueron recogidas por L. Michaelis y M. Menten, quienes en 1913 llevaron a
cabo una serie de experimentos que les permitió desarrollar la primera expresión
matemática de la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas.

La ecuación de Michaelis-Menten ilustra en términos matemáticos la relación entre la


velocidad de reacción inicial vi y la concentración de sustrato [S] sólo es válido cuando
la concentración del sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y para
condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentración del complejo
enzima-sustrato es constante.

La constante Km de Michaelis es la concentración de sustrato a la cual vi es la mitad de


la velocidad máxima (Vmax/2) alcanzable a una concentración particular de enzima. De
este modo, Km tiene las dimensiones de la concentración de sustrato.

La dependencia de la velocidad de reacción inicial de [S] y Km puede ilustrarse al


evaluar la ecuación de Michaelis-Menten en tres condiciones.

1. Cuando [S] es mucho menor que Km, el termino Km + [S] es en esencia igual a
la Km. El reemplazo de Km + [S] con Km reduce la anterior ecuación
En otras palabras, cuando [S] está muy por debajo de Km, vi es proporcional a k[S]. Por
ende, la velocidad de reacción inicial es directamente proporcional a [S].

2. Cuando [S] es mucho mayor que Km, el termino Km + [S] es en esencia igual a
[S].

De este modo, cuando [S] excede con mucho a Km, la velocidad de reacción es máxima
(Vmax) y no está afectada por aumentos adicionales de la concentración de sustrato.

3. Cuando [S] = Km:

La ecuación declara que cuando [S] es igual a Km, la velocidad inicial es de la mitad del
máximo. La ecuación también revela que Km es y puede determinarse la manera
experimental a partir de la concentración de sustrato a la cual la velocidad inicial es de
la mitad del máximo.

3.4 GRÁFICA DE LINEWAVER BURKE

Existe otra representación de la cinética enzimática aparte de la ecuación de Michaelis-


Menten, conocida como diagrama de Lineweaver-Burk, que es más práctico para
calcular los parámetros cinéticos de una enzima. En esta representación se grafica
el inverso de los valores de la cinética de Michaelis-Menten, lo que da como resultado
una linea recta con la siguiente ecuación.
La ecuación de Lineweaver-Burk se usa para determinar los valores de Km y Vmax. En
la gráfica, el punto donde la línea intersecta al eje Y es el valor inverso de Vmax,
mientras que el punto donde la linea corta al eje X representa el valor inverso de Km.

Con este tipo de gráfica también se puede visualizar el comportamiento de una enzima
en presencia de un inhibidor. Si se trata de un inhibidor competitivo, observaremos que
la linea intersecta al eje Y en el mismo punto que la linea que representa la cinética sin
inhibidor, es decír, que no se modifica el valor de la Vmax, pero sí vemos un cambio en
la valor de Km (linea azul). Por otro lado, si se trata de un inhibidor no competitivo, el
valor de Km no cambia pero si lo hace la Vmax (linea roja).

A pesar de la practicidad matemática de la ecuación, pequeños errores experimentales


pueden afectar enormemente a la inclinación de la linea (debido a que se grafican los
valores inversos) llevando a una asignación de valores de Km y Vmax equivocados. La
máxima utilidad que tuvo esta ecuación fue en la época en que no se disponía de
computadoras potentes que pudieran resolver los parámetros de la ecuación de
Michaelis-Menten.

3.5 MÉTODO DE FISKE – SUBBAROW

En está prueba el fosfato en medio ácido reacciona con ácido molibdico para generar
ácido fosfomolibdico. Este es un compuesto fácilmente reducible, por lo que reacciona
con ácido ascórbico generando ácido dehidroascorbato y óxidos de molibdato que
presentan coloración azul. Por ésta razón los fosfatos son cuantificables mediante
técnicas espectrofotométricas.

Se realizó la curva de calibración para un patrón de fosfatos, determinando la


absorbancia a 660 nm en función de la concentración de fosfatos. Esta curva de
calibración permitirá conocer, a través de una tendencia de los datos, la concentración
de fosfatos existente tanto en la emulsión como en una solución lecitina-buffer,
dependiendo de la absorbancia a 660 nm obtenida par cada una de estas en el tiempo.
Esta absorbancia se determinó sin réplica, posteriormente al método colorimétrico.
4 MARCO PRÁCTICO

4.1 MÉTODO DE FISKE - SUBBAROW PARA LA DETERMINACIÓN DEL


FÓSFORO INORGÁNICO:

Este método servirá para determinar la cantidad de fosfato inorgánico presente en una
muestra después de haber tratado al B-glicerolfosfato con fosfatasa alcalina.

FUNDAMENTO:
El fósforo inorgánico reacciona con el molibdato de sodio formando un complejo
amarillo de fosfomolibdato de sodio. Este es reducido por el ácido 1,2,4-
aminonaftolsulfónico, formándose un complejo de color azul cuya intensidad medida a
660 nm. es proporcional a la concentración de fósforo presente.

I. PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN (Absorbancia a 660nm


vs. Concentración de fósforo)
Como se indica en el siguiente cuadro, prepara varias soluciones de fósforo
de diferentes concentraciones a partir de un Standard de 8 ug/ml realizar las
reacciones para la determinación del fósforo.

TABLA: CONTENIDO DE LOS TUBOS

TUBO STANDARD DE
FÓSFOR (ug/ml)

BLANCO 0

1 8

2 16

3 24

4 32

5 40
Mezclar y dejar en reposo 10 minutos. leer a 660 nm en el espectrofotómetro usando
cubetas de 16 mm de diámetro contra el blanco. Procure hacer las lecturas antes de los
30 minutos de haber mezclado.

Factor =Abs/
TUBO Absorbancia (nm) Concentración (ug/ml)
conc

1 0.15 8 0.01875

2 0.3 + 0.15 16 +8 0.01875


+ 0.15 +8

3 0.45 + 0.15
24 +8
0.01875
+ 0.15 +8
4 0.6 32 0.01875

5 0.75 40 0.01875

2.25 120 0.01875

Cálculo del factor o de la relación ab:

5 5
∑ A=ab ∑ c
A partir de los datos calcular la constante ab ( 1 1 )

Cálculo del factor (Ab) para (1):

0.15
Ab= =0.01875
8

Cálculo del factor (Ab) para (2):

0.3
Ab= =0.01875
16

Cálculo del factor (Ab) para (3):

0.45
Ab= =0.01875
24

Cálculo del factor (Ab) para (4):


0.60
Ab= =0.01875
32

Cálculo del factor (Ab) para (5):

0.75
Ab= =0.01875
40

1) CURVA ESTÁNDAR

Graficar en papel milimetrado absorbancia vs/concentración de fósforo expresada como


ug de fósforo/tubo

CURVA STÁNDAR (FÓSFORO)

N° ug/mol Abs
moles

1 8 0.15

2 16 0.30

3 24 0.45

4 32 0.60

5 40 0.75

120 2.25

ABSORBANCIA
Ab=
CONCENTRACIÓN

2.25
Ab= =0.01875
120
5 CUESTIONARIO

1. ¿En qué se fundamenta la purificación de una enzima por Sephadex?

Su fundamento es parecido al de cromatografía de filtración molecular, llamada también


cromatografía de exclusión molecular, es una de las técnicas más sencillas de las
empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía
se realiza en columnas cilíndricas, por el cual las moléculas se separan en solución
según su peso molecular. Para el caso de las enzimas sucederá igual.

El sephadex, nombre comercial de partículas de gel de dextramo, su capacidad


separadora reside en su matriz consta de un gran número de esferas porosas
microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros
entrecruzados unidas entre si por enlaces químicos para formar una red tridimensional
porosa. En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal
que algunas enzimas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto
que otras (las suficientemente pequeñas e iguales) podrán pasar libremente.

El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio
(Fig. 1) quedando listo para su uso.
2. ¿Cuál es el valor de la velocidad en el casos 1? Según su ejemplo, busque su
velocidad máxima.

TUBO 01

Si el extracto enzimático pasa por purificación a través de una columna de filtración por
sephadex y se coge una de dos alícuotas que dan:

1) 2 veces la velocidad máxima.

Sería:

0.0071428 x 2= 0.0142856 milimoles P/min

3. ¿Qué es un sistema enzimático?

Evalúa el proceso de cambio de sustrato a producto a través de un preparado


enzimático. Los sistemas enzimáticos en general, están formados por la enzima
propiamente dicha (apoenzima), el sustrato o los sustratos un grupo proteico
(coenzimas) y sustancias activadoras.

Partes del sistema enzimático

Sustrato:
Es cualquier compuesto químico que subyace a otro y sobre el cual está en condiciones
de ejercer algún tipo de influencia.

Por otra parte, hace referencia a una capa o nivel de algo. Es una molécula sobre la cual
actúa una enzima, dicho de otra forma, las enzimas se encargan de catalizar las
reacciones químicas que involucran a su sustrato.
La unión entre enzima y sustrato forma un complejo.

La enzima:

Son proteínas complejas que producen cambios químicos específicos en algunas


sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas. Como por ejemplo: las enzimas
pueden convertir los almidones y azucares en sustancias que el cuerpo pueda utilizar.

La coagulación es otro ejemplo de las enzimas. Son esenciales para todas


las funciones corporales se encuentran en la saliva, estomago, intestinos cada órgano y
célula del cuerpo

Coenzimas:

Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas no proteicas que transportan grupos
químicos entre enzimas. A veces se denominan cosustratos. Estas moléculas son
sustratos de las enzimas y no forman parte permanente de la estructura enzimática.

Las coenzimas se consumen y se reciclan continuamente en el metabolismo; un


conjunto de enzimas añade un grupo químico a la coenzima y otro conjunto de enzimas
lo extrae. Por ejemplo, las enzimas como la ATP sintasa fosforilan continuamente la
adenosina difosfato (ADP), convirtiéndola en ATP, mientras que enzimas como las
quinasas desfosforilan el ATP y lo convierten de nuevo en ADP. (1)

4. ¿Qué son enzimas reguladoras? Diga 3 Tipos. ¿Qué es un inhibidor? y


¿Cuántos tipos de inhibidor conoce?

ENZIMAS REGULADORAS
Son catalizadores biológicos, que además de las propiedades que caracterizan a las
enzimas, presentan características que le confieren papeles reguladores del
metabolismo. Existen dos tipos:

Las enzimas alostéricas

En las enzimas alostéricas la unión de un sustrato a un sitio activo puede afectar las
propiedades de otros sitios activos en la misma molécula. Un posible resultado de
esta interacción entre subunidades es que la unión del sustrato resulte cooperativo, es
decir que la unión del sustrato en un sitio activo facilita la unión de los otros sustratos
en los sitios activos vecinos.

Control de las enzimas alostéricas.

Las enzimas alostéricas tienen dos tipos de control diferentes: Heterotrópico y


homotrópico, según la naturaleza del modulador.

 Enzimas homotrópicas.
El sustrato actúa, también como modulador. Estas enzimas contienen dos o más
centros de unión para el sustrato. La modulación dependerá de cuántos sean los
centros del sustrato que están ocupados.
 Enzimas heterotrópicas.
Son estimuladas o inhibidas por un modulador diferente a la del sustrato.

5. ¿Qué es un inhibidor? ¿Cuántos tipos de inhibidor conoce?

LOS INHIBIDORES IRREVERSIBLES

Otros inhibidores actúan de manera irreversible al producir modificación química de la


enzima. Estas modificaciones por lo general comprenden hacer o romper enlaces
covalentes con residuos aminoacilo esenciales para la unión a sustrato, catálisis o
mantenimiento de la conformación funcional de la enzima. Dado que estos cambios
covalentes son hasta cierto punto estables, una enzima que ha sido “envenenada” por un

inhibidor irreversible, como un átomo de metal pesado o un reactivo acilante,


permanece inhibida incluso después de eliminar del medio circundante el inhibidor que
resta.

INHIBICIÓN REVERSIBLE
Los inhibidores reversibles se combinan transitoriamente con el enzima, de manera
parecida a como lo hacen los propios sustratos. Algunos inhibidores reversibles no se
combinan con el enzima libre sino con el complejo enzima-sustrato.

Se distinguen tres tipos de inhibición reversible:

INHIBICIÓN COMPETITIVA

El inhibidor es una molécula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato,
de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, pero que no posee
ningún enlace susceptible de ser atacado por el enzima. El inhibidor forma con el
enzima libre un complejo enzima-inhibidor de características cinéticas análogas a las
del complejo enzima-sustrato, pero que, lógicamente, no puede descomponerse a
continuación para dar lugar al enzima libre y a los productos.

INHIBICIÓN ACOMPETITIVA

El inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su unión al sustrato, sino que
lo hace con el complejo enzima-sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima-
sustrato-inhibidor, que no se descompone posteriormente para dar lugar a los productos.

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

El inhibidor puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-
sustrato, interfiriendo en la acción de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a
un lugar del enzima diferente del centro activo provocando en la una alteración que
dificulta bien la formación del complejo enzima-sustrato o bien la descomposición de
éste para dar lugar a los productos.
Aunque podría pensarse que los distintos tipos de inhibición estudiados pueden
desempeñar algún papel en la regulación de la actividad enzimática, todo parece indicar
que no es así; la regulación de la actividad enzimática se lleva a cabo mediante
mecanismos que no se ajustan a ninguno de los modelos de inhibición estudiados y que
se describirán en el próximo apartado. El interés del estudio de la inhibición enzimática
reside más en su utilidad para comprender la estructura, mecanismos catalíticos y
especificidad de los enzimas, que en una importancia biológica real.
6 BIBLIOGRAFÍA

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https://temas-selectos-de-ciencias.blogspot.com/2017/11/lineweaver-burk.html
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Mayo 2023]. Disponible en:
https://repositorio.uniandes.edu.co/bitstream/handle/1992/25077/u627262.pdf?
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http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm
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ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO. TESIS
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8. Eugenomic - Inhibidor enzimático [Internet]. Eugenomic.com. [citado 28 Mayo
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10. Regulación alostérica [Internet]. Es.slideshare.net. [citado 28 Mayo 2023].
Disponible en: https://es.slideshare.net/cuentadropbox101/regulacin-alostrica
11. Murray R y col., Bioquímica de Harper. Manual Moderno, México, 1997, 14
edición.

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