Kuby Cap 6

capítulo 6
Interacciones
antígeno-anticuerpo:
principios
y aplicaciones
L a interacción antígeno-anticuerpo es una rela-

ción bimolecular parecida a la interacción enzima-
sustrato, con una diferencia importante: no conduce
a una alteración química irreversible en el anticuerpo ni en
el antígeno. La relación entre un anticuerpo y un antígeno
La tinción fluorescente del anticuerpo revela
inmunoglobulina intracelular. [H. A. Schreuder et al.,
1997, Nature 386:196; cortesía de H. Schreuder, Hoechst
Marion Roussel.]
incluye varias interacciones no covalentes entre el determinante

antigénico, o epítopo, del antígeno y el dominio de región variable
■ Potencia de las interacciones
(VH/VL) de la molécula del anticuerpo, en particular las regio- antígeno-anticuerpo
nes hipervariables, o regiones determinantes de complementa- ■ Reactividad cruzada
riedad (RDC). La minuciosa especificidad de las interacciones
antígeno-anticuerpo condujo al desarrollo de una diversidad de ■ Resonancia de plasmones superficiales
pruebas inmunológicas, que pueden utilizarse para detectar la ■ Reacciones de precipitación
presencia de anticuerpo o de antígeno. Los inmunoensayos han
sido de vital importancia en el diagnóstico de enfermedades, ■ Reacciones de aglutinación
la vigilancia del grado de respuesta inmunitaria humoral y la ■ Radioinmunoensayo
identificación de moléculas de interés biológico o médico.
Estas valoraciones difieren en su rapidez y sensibilidad; algunas ■ Ensayo de inmunosorbente ligado a enzima
son estrictamente cualitativas, otras son cuantitativas. En este ■ Western blotting
capítulo se examina la naturaleza de la interacción antígeno-
anticuerpo y se describen diversas pruebas inmunitarias que ■ Inmunoprecipitación
miden o aprovechan esta interacción. ■ Inmunofluorescencia
■ Citometría de flujo y fluorescencia
Potencia de las interacciones ■ Alternativas a las reacciones
antígeno-anticuerpo
antígeno-anticuerpo
■ Microscopia inmunoelectrónica
Las interacciones no covalentes que forman la base de la unión
antígeno-anticuerpo (Ag-Ab) incluyen enlaces de hidrógeno,
enlaces iónicos, interacciones hidrófobas e interacciones de van
der Waals (fig. 6-1). Puesto que estas interacciones son débiles a gencia que sustenta la especificidad exquisita que caracteriza las
nivel individual (comparadas con un enlace covalente), se nece- interacciones antígeno-anticuerpo.
sita un gran número de ellas para formar una interacción Ag-Ab
potente. Más aún, cada una de estas interacciones no covalentes
opera a una distancia muy corta, por lo general de alrededor de La afinidad de anticuerpo es una medida
1 107 mm (1 angstrom, Å); en consecuencia, una interac-
ción Ag-Ab potente depende de un ajuste muy estrecho entre el
cuantitativa de la fuerza de la unión
antígeno y el anticuerpo. Este ajuste requiere un grado alto de La fuerza combinada de las interacciones no covalentes entre un
complementariedad entre el antígeno y el anticuerpo, una exi- sitio de unión de antígeno único en un anticuerpo y un epítopo
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146 PARTE I I RESPUESTAS DE LAS CÉLULAS B Y T
ANTÍGENO ANTICUERPO constante de asociación, Ka (es decir, k1/k1 Ka), una medida
de afinidad. En inmunología, Ka se denomina constante de afi-
NH2 nidad. Como Ka es la constante de equilibrio para la reacción
CH2 OH ••• O C CH2 CH2 Enlace de de un sitio de unión del anticuerpo con el antígeno y como la
hidrógeno concentración molar de un sitio de unión individual es igual a
CH2 CH2 NH3+ –O la concentración del anticuerpo, Ka puede calcularse a partir
C CH2 CH2 Enlace de la relación de la concentración molar del complejo Ag-Ab
O iónico con las concentraciones molares de antígeno y anticuerpo no
unidos en equilibrio como sigue:
CH2
CH CH3 [Ag-Ab]
Interacciones Ka
CH3 CH3 hidrófobas [Ab][Ag]
CH3 CH CH2 El valor de Ka varía para diferentes complejos Ag-Ab y depende
Interacciones de tanto de k1, que se expresa en unidades de litros/mol/segundo
CH CH3 CH3 CH van der Waals (L/mol/s), como de k1, que se expresa en unidades de 1/s. Para
CH CH3 haptenos pequeños, la constante de velocidad hacia la derecha
puede ser en extremo alta; en algunos casos k1 puede ser tan
O alta como 4 108 L/mol/s, próxima al límite superior teórico
CH2 C +H
3N CH2 Enlaces iónicos de las reacciones limitadas por difusión (109 L/mol/s). Sin em-
O– bargo, para antígenos proteínicos más grandes k1 es más peque-
ña, con valores en el intervalo de 105 L/mol/s.
FIGURA 6-1 La interacción entre un anticuerpo y un antígeno La velocidad con que el antígeno unido deja un sitio de unión
depende de cuatro tipos de fuerzas no covalentes: 1) enlaces de a anticuerpo (es decir, la constante de velocidad de disociación,
hidrógeno, en los que dos átomos electronegativos comparten k1) tiene una función importante en determinar la afinidad del
un átomo de hidrógeno; 2) enlaces iónicos entre residuos de anticuerpo por un antígeno. El cuadro 6-1 ilustra el papel de
carga opuesta; 3) interacciones hidrófobas, en las que el agua
k1 para determinar la constante de asociación Ka para varias
fuerza la unión de grupos hidrófobos, y 4) interacciones de van
interacciones Ag-Ab. Por ejemplo, la k1 para el sistema DNP-l-
der Waals entre las nubes de electrones externos de dos o más
lisina es alrededor de un quinto de la del sistema de fluoresceína,
átomos. En un ambiente acuoso, las interacciones no covalentes
son en extremo débiles y dependen de la complementariedad cer-
pero su k1 es 200 veces mayor; en consecuencia, la afinidad
cana de las formas del anticuerpo y el antígeno. Ka del anticuerpo antifluoresceína por el sistema de fluoresceína
es unas 1 000 veces mayor que la del anticuerpo anti-DNP. Los
complejos Ag-Ab de afinidad baja poseen valores Ka entre 104 y
único es la afinidad del anticuerpo por ese epítopo. Los anti- 105 L/mol; los complejos de afinidad alta pueden tener valores
cuerpos de afinidad baja unen antígeno de manera débil y tiende Ka tan altos como 1011 L/mol.
den a disociarse con facilidad, en tanto que los de afinidad alta La disociación del complejo antígeno-anticuerpo tiene inte-
unen antígeno con más firmeza y la unión se mantiene por más rés para algunos propósitos:
tiempo. La relación entre el sitio de unión en un anticuerpo (Ab) Ag-Ab ERF Ag Ab
y un antígeno (Ag) monovalente puede describirse mediante la
ecuación La constante de equilibrio para esta reacción de disociación es
Kd, la constante de disociación, que es el recíproco de Ka:
k1
Ag Ab ERF Ag-Ab
k1 [Ab][Ag]
Kd 1/Ka
[Ab-Ag]
donde k1 es la constante de velocidad hacia la derecha (asocia-
ción) y k1 es la constante de rapidez hacia la izquierda (di- Los complejos muy estables tienen valores muy bajos de Kd; los
sociación). En términos bioquímicos, la relación k1/k1 es la menos estables tienen valores más altos. Aunque Kd no es la
Constantes de velocidad hacia la derecha y hacia la izquierda (k1 y k–1) y constantes

CUADRO 6-1
de asociación y disociación (Ka y Kd) para tres interacciones de ligando y anticuerpo
Anticuerpo Ligando k1 k1 Ka Kd
Anti-DNP -DNP-L-lisina 8 107 1 1 108 1 108

Antifluoresceína Fluoresceína 4 108 5 103 1 1011 1 1011
Antialbúmina sérica de bovino (BSA) Dansil-BSA 3 105 2 103 1.7 108 5.9 109
FUENTE: Adaptado de H. N. Eisen, 1990, Immunology, 3rd ed., Harper & Row Publishers.

INTERACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES C A P ÍT UL O 6 147
a) b)
Testigo: ausencia de anticuerpo Testigo
(el ligando se equilibra por igual en ambos lados)
100
A B A B
B
50
Concentración de ligando, M
A
Estado inicial Equilibrio
Experimental: anticuerpo en A Experimental

(en equilibrio más ligando en A por la unión de Ab)
100
A B A B
A
Ligando 50 D
Anticuerpo Ligando
radiomarcado
unido por
B anticuerpo
Estado inicial Equilibrio 2 4 6 8

Tiempo, h
FIGURA 6-2 Determinación de la afinidad del anticuerpo ción de radiactividad en ambos compartimientos. b) Gráfica de la
mediante diálisis de equilibrio. a) La cámara de diálisis contiene concentración de ligando en cada compartimiento con el tiempo.
dos compartimientos (A y B) separados por una membrana semi- En equilibrio, la diferencia en la concentración de ligando radiactivo
permeable. Se añade anticuerpo a un compartimiento y un ligando en los dos compartimientos representa la cantidad de ligando unido
radiomarcado al otro. Una vez en equilibrio, se mide la concentra- al anticuerpo.
constante de afinidad, por supuesto ésta, Ka, puede calcularse (es decir, la concentración del complejo Ag-Ab). Cuanto más
fácilmente a partir de Kd como sigue: Ka 1/Kd. alta la afinidad del anticuerpo, tanto más ligando se une.
La constante de afinidad, Ka, que antes se determinaba me- Puesto que se conoce la concentración de anticuerpo en la
diante diálisis de equilibrio, ahora se deduce por métodos más cámara de diálisis de equilibrio, la concentración de complejos
modernos, en especial resonancia de plasmones superficiales antígeno-anticuerpo puede determinarse por medio de [Ab-
(SPR, del inglés surface plasmon resonance), que se considera Ag]/n, donde n es el número de sitios de unión por molécula de
en una sección posterior. Dado que la diálisis de equilibrio ilus- anticuerpo. La constante de equilibrio o constante de afinidad,
tra importantes principios y para algunos inmunólogos sigue Ka, para un sitio de unión individual es
siendo el estándar contra el cual se evalúan otros métodos, se
describe aquí. En este procedimiento se utiliza una cámara de r
Kd [Ab-Ag]/[Ab][Ag]
diálisis que contiene dos compartimientos iguales separados c (n r)
por una membrana semipermeable. En un compartimiento se
coloca el anticuerpo y en el otro un ligando marcado radiacti- donde r es igual al cociente de la concentración de ligando unido
vamente que es lo bastante pequeño para pasar a través de una sobre la concentración total de anticuerpo, c es la concentración
membrana semipermeable (fig. 6-2). Entre los ligandos conve- de ligando libre y n sigue siendo el número de sitios de unión por
nientes se incluyen haptenos, oligosacáridos y oligopéptidos. En molécula de anticuerpo. Esta expresión puede reordenarse para
ausencia de anticuerpo, el ligando añadido al compartimiento B obtener la ecuación de Scatchard:
se equilibra en ambos lados de la membrana (fig. 6-2a). Sin em- r
bargo, en presencia de anticuerpo, parte del ligando marcado se c Kan Kar
une al anticuerpo en equilibrio, atrapando el ligando en el lado
del recipiente en que se encuentra el anticuerpo, en tanto que el Es posible obtener valores para r y c mediante la repetición de
ligando unido se distribuye por igual en ambos compartimien- la diálisis de equilibrio con la misma concentración de anticuer-
tos. De este modo, la concentración total del ligando es mayor po pero con diferentes concentraciones de ligando. Si Ka es una
en el compartimiento que contiene anticuerpo (fig. 6-2b). La di- constante, es decir, si todos los anticuerpos dentro de la cáma-
ferencia de concentración del ligando en los dos compartimien- ra de diálisis tienen la misma afinidad por el ligando, entonces
tos representa la concentración de ligando unido al anticuerpo una gráfica de Scatchard de r/c contra r da una línea recta con

a) Anticuerpo homogéneo b) Anticuerpo heterogéneo
#1 #3
4.0 4.0
#4
#2
3.0 3.0
Pendiente = –Ka
r Pendiente en r de 1/2 n = –K0
r
— × 108 — × 108
c c
2.0 2.0
1.0 Abscisa al origen = n 1.0 Abscisa al origen = n
2.0 1.0 2.0

r r
FIGURA 6-3 Las gráficas de Scatchard se basan en diálisis de dimérica, n 4. En esta gráfica el anticuerpo número 1 tiene afini-
equilibrio repetidas con una concentración constante de an- dad más alta que el anticuerpo número 2. b) Si el preparado de an-
ticuerpo y variable de ligando. En estas gráficas r equivale a los ticuerpo es policlonal y tiene una gama de afinidades, una gráfica de
moles de ligando unido/mol de anticuerpo y c es la concentración Scatchard produce una línea curva cuya pendiente cambia constan-
de ligando libre. A partir de una gráfica de Scatchard es posible ob- temente. La constante de afinidad promedio K0 puede calcularse
tener tanto la constante de equilibrio (Ka) como el número de sitios al determinar el valor de Ka cuando la mitad de los sitios de unión
de unión por molécula de anticuerpo (n), o su valencia. a) Si todos está ocupada (cuando r 1 en este ejemplo). En esta gráfica el an-
los anticuerpos tienen la misma afinidad, entonces una gráfica de tisuero número 3 tiene afinidad más alta (K0 2.4 108) que
Scatchard produce una línea recta con pendiente de Ka. La abscisa el antisuero número 4 (K0 1.25 108). Obsérvese que las cur-
al origen es n, la valencia del anticuerpo, que es 2 para la IgG y otras vas que se muestran en a) y b) son para anticuerpos divalentes
Ig divalentes. Para la IgM, que es pentamérica, n 10, y para la IgA como IgG.
pendiente Ka (fig. 6-3a). Conforme la concentración de ligan- cuantificar la capacidad de unión de un anticuerpo dentro de
do c no unido aumenta, r/c tiende a 0 y r tiende a n, la valencia, los sistemas biológicos (p. ej., la reacción de un anticuerpo con
igual al número de sitios de unión por molécula de anticuerpo. determinantes antigénicos sobre un virus o una célula bacteria-
La mayoría de los preparados de anticuerpos son policlona- na). La avidez es la constante de equilibrio, Keq, para la interac-
les y presentan una mezcla heterogénea de anticuerpos con una ción entre el anticuerpo intacto y el antígeno; la afinidad es la
gama de afinidades. Una gráfica de Scatchard de anticuerpo he- constante de equilibrio para la reacción entre un sitio de unión
terogéneo da una línea curva cuya pendiente cambia de manera individual del anticuerpo y el antígeno. En condiciones ideales
constante, lo que refleja esa heterogeneidad de anticuerpo (fig. la avidez será el producto de las afinidades de los sitios de unión
6-3b). Este tipo de gráfica de Scatchard permite hallar la cons- individuales de un anticuerpo. Para una molécula de IgG, que
tante de afinidad promedio, K0, determinando el valor de Ka tiene dos sitios de unión con afinidades idénticas, en condicio-
cuando la mitad de los sitios de unión a antígeno está ocupada. nes ideales la avidez sería
Ello se efectúa en forma conveniente al determinar la pendiente
[Ab-Ag]
de la curva en el punto en que la mitad de los sitios de unión a Avidez Ka Ka (Ka)2 Keq
antígeno está ocupada. [Ab] [Ag]
Esta ecuación representa un máximo teórico para la avidez; los
La avidez del anticuerpo incorpora valores reales de ésta siempre son varios órdenes de magnitud
menores que el producto de las afinidades. La diferencia se debe
la afinidad de múltiples sitios de unión principalmente a la geometría de la unión Ab-Ag. El sitio de
La afinidad de un sitio de unión no siempre refleja la verdade- unión de un anticuerpo en contacto con un epítopo individual
ra potencia de la interacción antígeno-anticuerpo. Cuando se de un antígeno puede estar orientado de manera óptima para el
mezclan antígenos complejos que contienen múltiples deter- mejor ajuste, mientras que la unión a epítopos múltiples en
minantes antigénicos repetidos con anticuerpos que incluyen el antígeno blanco puede requerir de una configuración geomé-
múltiples sitios de unión, la interacción de una molécula de trica un tanto tensa e interacciones de unión menos óptimas.
anticuerpo con una molécula de antígeno en un sitio incremen- A pesar de las barreras geométricas para el logro de los valores
ta la probabilidad de reacción entre esas dos moléculas en un teóricos máximos de avidez, la avidez es mayor que la afinidad.
segundo sitio. La fuerza de estas interacciones múltiples entre Así, una avidez alta a menudo puede compensar una afinidad
un anticuerpo y un antígeno multivalentes se denomina avidez. baja. Por ejemplo, con frecuencia los sitios de unión de las
La avidez es una medida más adecuada que la afinidad para moléculas de IgM (pentaméricas) secretadas tienen afinidad

significativamente más baja que los de la IgG, monomérica, pero Varios virus y bacterias poseen determinantes antigénicos
la alta avidez de la IgM, que resulta de su valencia más alta, le idénticos o similares a componentes normales de la célula hos-
permite unir antígeno de manera eficaz. De hecho, en el caso pedadora. Está demostrado que en algunos casos estos antígenos
de un antígeno con muchos epítopos repetitivos estrechamente microbianos estimulan anticuerpos que reaccionan de manera
espaciados, como los que se encuentran en la superficie de bac- cruzada con los componentes de la célula hospedadora y dan
terias y otros patógenos, una IgM con sitios de unión de menor por resultado una reacción autoinmunitaria que daña tejido. Por
afinidad puede unirse más firmemente que una IgM con sitios ejemplo, la bacteria Streptococcus pyogenes expresa proteínas de
de mayor afinidad. pared celular llamadas antígenos M. Se sabe que los anticuerpos
producidos contra antígenos M estreptocócicos reaccionan en
forma cruzada con varias proteínas miocárdicas y del músculo
esquelético, y participan en el daño cardíaco y renal consecutivo
Reactividad cruzada a infecciones estreptocócicas. La función de otros antígenos de
reacción cruzada en el desarrollo de enfermedades autoinmuni-
Aunque las reacciones Ag-Ab son muy específicas, en algunos tarias se estudia en el capítulo 16.
casos el anticuerpo estimulado por un antígeno puede reac- Ciertas vacunas también muestran reactividad cruzada. Por
cionar en forma cruzada con un antígeno no relacionado. Esta ejemplo, el virus de la viruela bovina, que causa la pústula va-
reactividad cruzada ocurre si dos antígenos diferentes compar- cuna, expresa epítopos que reaccionan en forma cruzada con el
ten un epítopo idéntico o muy similar. En el último caso la afini- virus variola, el agente causal de la viruela. Como se menciona
dad del anticuerpo por el epítopo de reacción cruzada suele ser en el capítulo 1, esta reactividad cruzada fue la base del método
menor que para el epítopo original. de Jenner en el que se utiliza virus de la viruela bovina a fin de
Con frecuencia se observa reactividad cruzada entre antíge- inducir inmunidad a la viruela.
nos polisacáridos que contienen residuos oligosacáridos simila-
res. Por ejemplo, los antígenos del grupo sanguíneo ABO son
glucolípidos que se expresan en los glóbulos rojos. Diferencias
sutiles en los residuos terminales de los azúcares unidos a estos Resonancia de plasmones
glucolípidos de superficie distinguen los antígenos de los gru-
pos sanguíneos A y B. Aunque los mecanismos de tolerancia superficiales
impiden la formación de anticuerpos contra los antígenos del Los métodos de diálisis de equilibrio para medir la afinidad de
propio grupo sanguíneo, una persona que carece de uno o am- anticuerpo han sido superados desde mediados del decenio
bos de estos antígenos tendrá anticuerpos séricos contra el o los de 1990 por la resonancia de plasmones superficiales (SPR, del
antígenos faltantes, inducidos no por la exposición a antígenos inglés surface plasmon resonance), que es mucho más sensible,
de los glóbulos rojos sino por la exposición a antígenos micro- práctica y rápida (fig. 6-4a). Además de permitir la medición
bianos de reacción cruzada presentes en las bacterias intestinales de constantes de afinidad, la SPR puede usarse para determinar
comunes. Estos antígenos microbianos inducen la formación de la rapidez de reacciones antígeno-anticuerpo e incluso puede
anticuerpos en personas que carecen de los antígenos de grupos adaptarse para medir concentraciones de anticuerpo. La SPR
sanguíneos similares en sus glóbulos rojos. (En quienes poseen funciona detectando cambios en las propiedades de reflectancia
estos antígenos, los anticuerpos complementarios se eliminarían de la superficie de un detector recubierto de antígeno cuando se
durante la etapa de desarrollo, en la que se desechan las células une a anticuerpo. Aunque la física subyacente a la SPR es bas-
productoras de anticuerpos que reconocen epítopos propios; tante compleja [y lo mejor para estudiarla es consultar las refe-
véase el cap. 16.) Aunque los anticuerpos de grupo sanguíneo rencias adecuadas (Rich y Myszka, 2003) y los sitios Web que se
son inducidos por agentes microbianos, reaccionan en forma enumeran al final del capítulo], el método es directo e ingenioso.
cruzada con oligosacáridos similares en glóbulos rojos extraños, Un haz de luz polarizada se hace pasar por un prisma hacia una
lo que constituye la base para las pruebas de tipificación sanguí- delgada película de oro (cubierta con antígeno del lado opuesto)
nea y explica la necesidad de grupos de sangre compatibles para y se refleja en la película hacia un detector colector de luz. Sin
las transfusiones sanguíneas. Un individuo del grupo A tiene embargo, a un ángulo único, parte de la luz incidente es absor-
anticuerpos anti-B, una persona del grupo B tiene anti-A y un bida por la capa de oro, y su energía se transforma en ondas de
individuo grupo O tiene anti-A y anti-B (cuadro 6-2). carga llamadas plasmones superficiales. A ese ángulo, llamado
ángulo de resonancia, es posible medir una caída abrupta en la
intensidad de la luz reflejada. El ángulo depende del color de
la luz, el espesor y la conductancia de la película metálica, y las
CUADRO 6-2 Grupos sanguíneos ABO propiedades ópticas del material cerca de las superficies de
Antígenos en Anticuerpos las capas de oro. El método de SPR aprovecha el último de estos
Grupo sanguíneo eritrocitos séricos factores: la unión de anticuerpos al antígeno adherido a la pas-
tilla tiene un efecto lo suficientemente intenso para producir un
A A Anti-B cambio detectable en el ángulo de resonancia. Se ha descubierto
B B Anti-A que el ángulo es proporcional al número de anticuerpos unidos.
AB AyB Ninguno Midiendo la rapidez con que el ángulo de resonancia cambia
durante una reacción antígeno-anticuerpo, es posible determi-
O Ninguno Anti-A y anti-B
nar la rapidez de esta reacción (fig. 6-4b). En la práctica, esto se

a) b)
Ángulo de resonancia,
Fuente de luz sensible a la unión Detector
polarizada de anticuerpo Etapas
I II III IV
Prisma Sin Ab. Se agrega Ab La La cámara se lava
No se al flujo. formación con solución
forman Se forman de amortiguadora.
Capa complejos complejos Ag-Ab complejos Los complejos
Unidades de resonancia
de oro Ag-Ab se Ag-Ab se disocian
estabiliza
Asociación Disociación
Ag⫹Ab Ag-Ab Ag-Ab Ag⫹Ab
Cámara Antígeno
de flujo inmovilizado Tiempo
FIGURA 6-4 Resonancia de plasmones superficiales (SPR). amortiguador a través de la cámara de flujo. No hay presentes com-
a) Una solución amortiguadora que contiene anticuerpo se hace plejos Ag-Ab, lo cual permite establecer un nivel de referencia. Etapa
pasar por una cámara de flujo, una de cuyas paredes contiene una capa II: se introduce anticuerpo en el flujo y se forman complejos Ag-Ab.
de antígeno inmovilizado. Como se explica en el texto, la forma- La pendiente positiva de esta curva es proporcional a la rapidez de
ción de complejos antígeno-anticuerpo en esta capa causa un cam- reacción hacia la derecha. Etapa III: la curva forma una meseta cuando
bio en el ángulo de resonancia de un haz de luz polarizada contra la cara todos los sitios capaces de unirse a la concentración prevaleciente
posterior de la capa. Un detector sensible registra los cambios en el de anticuerpo están ocupados. La altura de la meseta es directamen-
ángulo de resonancia a medida que se forman complejos antíge- te proporcional a la concentración de anticuerpo. Etapa IV: la celda
no-anticuerpo. b) Interpretación de un sensograma. Existen cuatro de flujo se lava con amortiguador que no contiene anticuerpo, y los
etapas en la gráfica de la respuesta del detector (expresada en uni- complejos Ag-Ab se disocian. La rapidez de disociación es propor-
dades de resonancia, que representan un cambio de 0.0001 grado cional a la pendiente de la curva de disociación. El cociente de las
en el ángulo de resonancia) contra tiempo. Etapa I: se hace pasar el pendientes (ascendente sobre descendente) es igual a k1/k2 = ka.
realiza haciendo pasar una solución con una concentración cono- La SPR puede usarse para caracterizar
cida de anticuerpo sobre la pastilla cubierta de antígeno. La gráfi-
ca de los cambios medidos durante el experimento de SPR contra
las especificidades de epítopo de grupos
el tiempo se denomina sensograma. En el curso de una reacción de anticuerpos
antígeno-anticuerpo, el sensograma asciende hasta que todos los La SPR tiene otros usos además de medir la afinidad o concen-
sitios capaces de unirse a antígeno (a una concentración dada) lo tración de anticuerpos. Supóngase que se tienen dos anticuer-
han hecho. Más allá de ese punto el sensograma describe una me- pos monoclonales distintos contra un antígeno como gp120,
seta. Los datos de estas mediciones pueden usarse para calcular la proteína de cubierta del VIH. ¿Se unen estos anticuerpos al
k1, la constante de velocidad de asociación para la reacción mismo epítopo o a epítopos diferentes de esta proteína clave?
La resonancia de plasmones superficiales constituye un pode-
Ab Ag ⎯→ Ab-Ag
k1 roso método para responder dicha pregunta. Los anticuerpos
que se unen a diferentes epítopos sobre un antígeno producen
Una vez que se ha alcanzado la meseta, puede hacerse pasar un sensograma característico cuando se colocan de manera se-
por la cámara solución sin anticuerpo. En estas condiciones riada en la cámara (fig. 6-5a). Los anticuerpos que se unen al
los complejos antígeno-anticuerpo se disocian, lo que permite mismo epítopo compiten entre sí por los sitios de unión, y cada
el cálculo de la constante de velocidad de disociación, k2. La me- uno bloquea la unión del otro, como lo demuestran las gráficas
dición de k1 y k2 hace posible determinar la constante de afini- de la figura 6-5b.
dad Ka, ya que Ka k1/k2. En una variación de este procedimiento, es posible usar sín-
La resonancia de plasmones superficiales también puede tesis química o hidrólisis enzimática juiciosa para generar un
usarse para medir la concentración de anticuerpo en una mues- conjunto de fragmentos de un antígeno y luego inmovilizar
tra. La cantidad de complejo antígeno-anticuerpo que se forma cada uno de estos fragmentos en una pastilla. Suponiendo que
sobre la pastilla es representada por la altura del sensograma, y los fragmentos de antígeno tienen la misma conformación tri-
esta medida es directamente proporcional a la cantidad de anti- dimensional que el antígeno nativo, pueden determinarse las
cuerpo en la solución que fluye por la cámara. Comparando con reactividades (o la falta de ellas) de anticuerpos y aislar los sitios
datos de referencia es posible determinar las concentraciones de de los epítopos en la molécula de antígeno original, un procedi-
anticuerpo. miento llamado mapeo de epítopos.

a) Ab1 y Ab2 se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno
Se agrega Se agrega Ab2
Ab1 Ab2 Ab1
Epítopos
Tiempo
b) Ab1 y Ab2 se unen al mismo epítopo
Se agrega Se agrega Se agrega Se agrega

Ab1 Ab2 Ab2 Ab1
Ab1 Ab2
Epítopos
Tiempo Tiempo
FIGURA 6-5 La SPR puede usarse para determinar si dife- reconocen el mismo epítopo del antígeno. En el primer sensogra-
rentes anticuerpos se unen al mismo epítopo o a epítopos ma, la adición de Ab1 revela una respuesta, y la inyección ulterior
diferentes. a) Ab1 y Ab2 reconocen diferentes epítopos del antí- de Ab2 no genera respuesta ulterior. En el segundo sensograma, la
geno. La inyección inicial de Ab1 causa un aumento desde el nivel adición de Ab2 revela primero una respuesta, pero la adición ulterior
basal hasta una meseta; la adición ulterior de Ab2 causa un au- de Ab1 no induce una respuesta ulterior. Este patrón indica que Ab1
mento hasta una segunda meseta más alta. Esto indica que Ab1 y y Ab2 se unen de manera competitiva, ya que ambos reconocen el
Ab2 reaccionan con diferentes epítopos en el antígeno, por ejemplo mismo epítopo en el antígeno; la unión de uno bloquea la unión
dos regiones espacialmente distintas de una proteína. b) Ab1 y Ab2 subsecuente del otro.
las reacciones antígeno-anticuerpo que producen un precipita-

Reacciones de precipitación do. En el cuadro 6-3 se compara la sensibilidad o cantidad míni-
ma de anticuerpo detectable por varios inmunoensayos.
El anticuerpo y el antígeno soluble que interactúan en una solu-
ción acuosa forman un retículo que por último se convierte en
un precipitado visible. Los anticuerpos que aglomeran antíge- Las reacciones de precipitación en gel
nos solubles se denominan precipitinas. Aunque la formación producen líneas de precipitina visibles
del complejo soluble Ag-Ab ocurre en el transcurso de minutos,
la del precipitado visible se lleva a cabo con mayor lentitud y a Los precipitados inmunitarios no sólo pueden formarse en solu-
menudo requiere uno o dos días para completarse. ción sino también en una matriz de agar. Cuando el antígeno y
La formación de un retículo de Ag-Ab depende de la valen- el anticuerpo se difunden uno hacia el otro en agar, o cuando el
cia tanto del anticuerpo como del antígeno: anticuerpo se incorpora dentro del agar y el antígeno se difun-
de hacia la matriz que contiene anticuerpo, se forma una línea
■ El anticuerpo debe ser bivalente; no se forma un precipitado visible de precipitación. Como en la reacción de precipitación
con fragmentos Fab monovalentes. en líquido, ocurre una precipitación visible en la región de equi-
■ El antígeno debe ser bivalente o polivalente; es decir, debe valencia, en tanto que no se observa precipitado visible en las
tener cuando menos dos copias del mismo epítopo o regiones de exceso de anticuerpo o antígeno. Es posible utilizar
presentar diferentes epítopos que reaccionan con distintos dos tipos de reacciones de inmunodifusión para determinar las
anticuerpos presentes en antisuero policlonal. concentraciones relativas de anticuerpos o antígenos, comparar
antígenos o determinar la pureza relativa de una preparación
Aunque en alguna época los principales tipos de valoración em- de antígeno. Éstos son la inmunodifusión radial (método de
pleados en inmunología fueron diversas modificaciones de la Mancini) y la inmunodifusión doble (método de Ouchterlony);
reacción de precipitación, se sustituyeron en gran parte por mé- ambos se efectúan en un medio semisólido como el agar. En la
todos más rápidos y que sólo requieren cantidades muy peque- inmunodifusión radial se coloca una muestra de antígeno en un
ñas de antígeno o anticuerpo porque son mucho más sensibles. foso y se deja difundir en agar que contiene una dilución conve-
Además, estos métodos modernos de valoración no se limitan a niente de un antisuero. Conforme el antígeno se difunde dentro

INMUNODIFUSIÓN RADIAL
Sensibilidad de diversos
CUADRO 6-3
inmunoensayos Difusión
de antígeno
Sensibilidad*
Prueba (µg de anticuerpo/ml)
Reacción de precipitación en líquidos 20–200 Anticuerpo

Reacciones de precipitación en gel incorporado Antígeno
en agar
Inmunodifusión radial de Mancini 10–50
Doble inmunodifusión de Ouchterlony 20–200
Inmunoelectroforesis 20–200
El precipitado
Electroforesis en cohete 2 forma un anillo
Reacciones de aglutinación
Directa 0.3 INMUNODIFUSIÓN DOBLE
Aglutinación pasiva 0.006–0.06 Anticuerpo Antígeno
Inhibición de la aglutinación 0.006–0.06
Radioinmunoensayo 0.0006–0.006
Ensayo de inmunosorbente ligado
a enzima (ELISA) ~0.0001–0.01
ELISA con quimioluminiscencia ~0.00001–0.01†
Inmunofluorescencia 1.0
Citometría de flujo 0.006–0.06
* Matriz de agar Precipitado
La sensibilidad depende tanto de la afinidad del anticuerpo usado para el
ensayo como de la densidad de epítopos y la distribución del antígeno.
†
FIGURA 6-6 Diagramas de la inmunodifusión radial (método
Obsérvese que la sensibilidad de las pruebas ELISA basadas en quimiolumi-
niscencia puede equipararse a la de RIA. de Mancini) y la inmunodifusión doble (método de Ouchter-
lony) en un gel. En ambos casos se forman complejos insolubles
FUENTE: Adaptado de N. R. Rose et al., eds., 1997, Manual of Clinical Labora-
tory Immunology; 5th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. grandes en el agar en la zona de equivalencia, visibles como líneas de
precipitación (regiones púrpura). En la inmunodifusión radial sólo el
antígeno (rojo) se difunde, en tanto que en la inmunodifusión doble
se difunden tanto el anticuerpo (azul) como el antígeno (rojo).
del agar, la región de equivalencia se establece y alrededor del
foso se forma un anillo de precipitación, un anillo de precipiti-
na (fig. 6-6, parte superior). El área del anillo de precipitina es en laboratorios clínicos para detectar la presencia o ausencia de
proporcional a la concentración de antígeno. La comparación proteínas en el suero. Una muestra de suero se somete a electro-
del área del anillo de precipitina con una curva estándar (que se foresis y los componentes séricos individuales se identifican con
obtiene al medir las áreas de precipitina de concentraciones co- antisueros específicos para una proteína o una clase de inmuno-
nocidas del antígeno) permite determinar la concentración en globulina determinada. Esta técnica es útil para determinar si un
la muestra de antígeno. En el método de Ouchterlony tanto el paciente produce cantidades anormalmente bajas de uno o más
antígeno como el anticuerpo se difunden radialmente desde los isotipos, características de ciertas enfermedades de inmunode-
fosos uno hacia el otro y por tanto se establece un gradiente de ficiencia. Asimismo puede mostrarse si un paciente produce en
concentración. Conforme la equivalencia se alcanza, se produce exceso cierta proteína sérica, como albúmina, inmunoglobuli-
una línea visible de precipitación, una línea de precipitina (fig. na o transferrina. El patrón inmunoelectroforético del suero de
6-6, parte inferior). individuos con mieloma múltiple muestra una gran cantidad
de proteína de mieloma. Como la inmunoelectroforesis es una
técnica estrictamente cualitativa que sólo detecta concentracio-
La inmunoelectroforesis combina nes de anticuerpo hasta cierto punto altas (mayores de varios
cientos de microgramos por mililitro), su utilidad se limita a la
electroforesis e inmunodifusión doble detección de anormalidades cuantitativas sólo cuando la des-
En la inmunoelectroforesis, la mezcla de antígeno se somete viación respecto de lo normal es notable, como en los estados de
primero a electroforesis a fin de separar sus componentes por inmunodeficiencia o los trastornos inmunoproliferativos.
carga. A continuación se cortan cuencos en el gel de agar parale- Una técnica cuantitativa relacionada, la electroforesis en
los a la dirección del campo eléctrico y se les añade antisuero. cohete, permite medir las concentraciones de antígeno. En este
Luego el anticuerpo y el antígeno se difunden uno hacia el otro método se somete a electroforesis un antígeno con carga nega-
y producen líneas de precipitación donde se encuentran en pro- tiva en un gel que contiene anticuerpo. El precipitado que se
porciones apropiadas (fig. 6-7). La inmunoelectroforesis se usa forma entre el antígeno y el anticuerpo tiene el aspecto de un

de anticuerpo inhibe las reacciones de precipitación, este exceso

también puede inhibir las reacciones de aglutinación; tal inhi-
Antígenos
bición se denomina efecto prozona. Ya que los efectos prozona
pueden encontrarse en muchos tipos de inmunoensayos, com-
prender la base de este fenómeno tiene importancia general.
Diversos mecanismos pueden causar el efecto prozona. Pri-
mero, a concentraciones altas de anticuerpo, el número de sitios
de unión de anticuerpo puede exceder en grado considerable
el de epítopos. Como resultado, casi todos los anticuerpos se
unen a antígeno sólo de manera univalente en lugar de mul-
tivalente. Los anticuerpos que se unen de manera univalente
no pueden enlazar en forma cruzada un antígeno con otro. Los
efectos prozona se diagnostican con facilidad al valorar una di-
versidad de concentraciones de anticuerpo (o antígeno). Con-
forme se diluye a una concentración óptima de anticuerpo, se
observan valores más altos de aglutinación o cualquier paráme-
Anticuerpo tro que se mida en la valoración que se utilice. El efecto prozona
también puede ocurrir por otra razón cuando se emplean anti-
cuerpos policlonales. Es posible que el antisuero contenga con-
centraciones altas de anticuerpo que se unen a antígeno pero no
inducen aglutinación; estos anticuerpos, llamados anticuerpos
incompletos, a menudo son de la clase IgG. A concentracio-
nes altas de IgG, las anticuerpos incompletos pueden ocupar la
mayor parte de los sitios antigénicos y bloquear así el acceso de
la IgM, que es una buena aglutinina. Este efecto no se presenta
con anticuerpos monoclonales aglutinantes. La falta de activi-
dad aglutinante de un anticuerpo incompleto puede deberse a
flexibilidad restringida en la región en bisagra, que dificulta que
el anticuerpo asuma el ángulo necesario para el enlace cruzado
óptimo de epítopos y dos o más antígenos particulados. De otra
manera la densidad de la distribución del epítopo o la localiza-
ción de algunos epítopos en bolsas profundas de un antígeno
FIGURA 6-7 Inmunoelectroforesis de una mezcla de antíge- particular pueden dificultar que los anticuerpos específicos para
no. Un preparado de antígeno (anaranjado) se somete primero
estos epítopos aglutinen ciertos antígenos particulados. Cuando
a electroforesis, que separa los antígenos componentes con base
es factible, la solución a ambos problemas consiste en probar an-
en la carga. Luego se añade antisuero (azul) a cuencos en uno o am-
ticuerpos diferentes que pueden reaccionar con otros epítopos
bos lados de los antígenos separados y se permite que se difundan;
con el tiempo se forman líneas de precipitación (arcos de color) en
del antígeno que no presentan estas limitaciones.
los que interactúan anticuerpo y antígeno específicos.
La hemaglutinación se utiliza
en la tipificación sanguínea
cohete, cuya altura es proporcional a la concentración de an-
tígeno en el foso. Una limitación de la electroforesis en cohete Para tipificar los glóbulos rojos (GR) o eritrocitos suelen llevarse
es la necesidad de que el antígeno tenga carga negativa para el a cabo reacciones de aglutinación (fig. 6-8). Dado que cada año
movimiento electroforético dentro de la matriz de agar. Algu- se realizan decenas de millones de determinaciones de grupo
nas proteínas, por ejemplo las inmunoglobulinas, no poseen la
suficiente carga para analizarse de manera cuantitativa por elec-
troforesis en cohete; tampoco es posible medir las cantidades de
varios antígenos en una mezcla al mismo tiempo.
Reacciones de aglutinación FIGURA 6-8 Demostración de hemaglutinación utilizando

anticuerpos contra glóbulos rojos de oveja (SRBC). El tubo tes-
La interacción entre el anticuerpo y un antígeno particulado tigo (10) sólo contiene SRBC, que se asientan en un “botón” sólido.
resulta en un agrupamiento visible llamado aglutinación. Los Los tubos experimentales 1 a 9 contienen un número constante de
anticuerpos que producen estas reacciones se denominan agluti- SRBC más diluciones seriadas al doble de suero anti-SRBC. El patrón
ninas. Las reacciones de aglutinación son similares en principio de diseminación en la serie experimental indica hemaglutinación
a las reacciones de precipitación; dependen del enlace cruzado positiva en el tubo 3. [Lousiana State University Medical Center/MIP. Cor-
de antígenos polivalentes. Del mismo modo en que un exceso tesía de Harriet C. W. Thompson.]

sanguíneo, éste es uno de los inmunoensayos más usados en el del patrón de diseminación característico de los glóbulos rojos
mundo. En la tipificación de antígenos ABO, en un portaobje- aglutinados en el fondo del foso, igual que el patrón que se ob-
tos se mezclan glóbulos rojos con antisuero contra los antígenos serva en las reacciones de aglutinación (fig. 6-8).
de grupo sanguíneo A o B. Si el antígeno se encuentra en las En años recientes ha habido un cambio de glóbulos rojos
células, éstas se aglutinan y forman un grumo visible en el por- a partículas sintéticas, como cuentas de látex, como matrices
taobjetos. Como verificación adicional, la sangre del donante para reacciones de aglutinación. Una vez que el antígeno se
se examina en busca de anticuerpos contra antígenos ABO. Si acopla a las cuentas de látex, el preparado puede utilizarse de
el sujeto no presenta anticuerpo contra sus propios antígenos inmediato o guardarse para uso posterior. El empleo de cuen-
ABO, las determinaciones de células y anticuerpo concuerdan, y tas sintéticas ofrece las ventajas de consistencia, uniformidad y
se confirma que la tipificación celular es correcta. Si los resulta- estabilidad. Más aún, las reacciones de aglutinación en que se
dos son discordantes y los ensayos de aglutinación indican que usan cuentas sintéticas pueden leerse con rapidez, a menudo
el donante tiene anticuerpos que reaccionan contra sus propios en el transcurso de los 3 a 5 min que siguen al mezclado de las
antígenos ABO, entonces hubo un error (es incorrecto el ensayo cuentas con la muestra en estudio. Ya sea que se basen en gló-
para células o anticuerpo) o el donante está produciendo anti- bulos rojos o en las cuentas sintéticas, más convenientes y ver-
cuerpos contra sí mismo, una manifestación de autoinmunidad sátiles, las reacciones de aglutinación son sencillas de realizar,
(véase el cap. 16). Las muestras que producen resultados discor- no requieren equipo costoso y detectan cantidades pequeñas
dantes en la verificación no se usan para transfusiones. de anticuerpo (concentraciones tan bajas como nanogramos
por mililitro).
La aglutinación bacteriana se emplea

para diagnosticar infecciones En la inhibición de la aglutinación, la ausencia
de aglutinación es diagnóstica de antígeno
Una infección bacteriana suele estimular la producción de an-
ticuerpos séricos específicos para antígenos de superficie en las Una variante de la reacción de aglutinación, llamada inhibición
células bacterianas. La presencia de dichos anticuerpos puede de la aglutinación, constituye un ensayo muy sensible para
detectarse mediante reacciones de aglutinación bacteriana. El cantidades pequeñas de antígeno. Las pruebas de inhibición de
suero de un paciente que se piensa que está infectado con una la aglutinación también permiten determinar si una persona
bacteria determinada se diluye en forma seriada en un conjunto utiliza ciertos tipos de drogas ilegales, como cocaína y heroína.
de tubos a los que se añade la bacteria. El último tubo que mues- Primero se incuba una muestra de orina o de sangre con anti-
tra aglutinación visible refleja el título de anticuerpo sérico del cuerpo específico para la droga que se sospecha. A continuación
paciente. El título de aglutinina se define como el recíproco de se añaden partículas recubiertas con la droga. Si el anticuerpo
la dilución sérica mayor que causa una reacción de aglutinación no aglutina las partículas ello indica que la muestra contiene un
positiva. Por ejemplo, si se realizan diluciones seriadas dobles de antígeno que reconoció el anticuerpo y sugiere que el individuo
suero y la dilución 1/640 muestra aglutinación pero la 1/1 280 utiliza la droga ilícita. Un problema con estas pruebas es que
no, entonces el título de aglutinación del suero del paciente es algunas drogas legales tienen estructuras químicas similares a
640. En algunos casos el suero puede diluirse hasta 1/50 000 y las de las ilícitas, pueden reaccionar de forma cruzada con el an-
aún mostrar aglutinación de bacterias. ticuerpo y producir una reacción positiva falsa. Por este motivo
El título de aglutinina de un antisuero puede usarse para es necesario confirmar una reacción positiva con un método no
diagnosticar una infección bacteriana. Por ejemplo, los pacien- inmunitario.
tes con fiebre tifoidea muestran un aumento significativo en el Las pruebas de inhibición de la aglutinación se usan con am-
título de aglutinación para Salmonella typhi. Las reacciones de plitud en los laboratorios clínicos para determinar si una perso-
aglutinación también constituyen un medio para tipificar bacte- na se expuso a ciertos tipos de virus que causan aglutinación de
rias. Por ejemplo, es posible distinguir diferentes especies de la glóbulos rojos. Si el suero de una persona contiene anticuerpos
bacteria Salmonella mediante reacciones de aglutinación con un antivíricos específicos, entonces los anticuerpos se unen al virus
grupo de antisueros de tipificación. e interfieren con la hemaglutinación por el virus. Esta técnica
suele emplearse en pruebas premaritales para determinar el
estado inmunitario de las mujeres con respecto al virus de la
La aglutinación pasiva es útil rubéola. El recíproco de la última dilución sérica que muestra
con antígenos solubles inhibición de hemaglutinación de rubéola es el título del suero.
Un título mayor de 10 (dilución 1:10) indica que una mujer es
La sensibilidad y la sencillez de las reacciones de aglutinación
inmune a la rubéola, en tanto que un título menor de 10 refleja
pueden extenderse a antígenos solubles con la técnica de hema-
falta de inmunidad y la necesidad de inmunización con vacuna
glutinación pasiva. En este método se preparan glóbulos rojos
de rubéola.
cubiertos con antígeno mediante la mezcla de un antígeno solu-
ble con los eritrocitos que se trataron con ácido tánico o cloruro
de cromo, porque ambas sustancias promueven la adsorción del
antígeno a la superficie de las células. El suero que contiene an-
ticuerpo se diluye de manera seriada en fosos de una placa de
Radioinmunoensayo
microtítulos y luego se añaden glóbulos rojos recubiertos con Una de las técnicas más sensibles para detectar antígeno o an-
antígeno a cada foso; la aglutinación se valora por el tamaño ticuerpo es el radioinmunoensayo (RIA). Fue desarrollada

originalmente en 1960 por dos endocrinólogos, S. A. Berson y alta afinidad por la inmunoglobulina G (IgG). Si el complejo
Rosalyn Yalow, para determinar las concentraciones de comple- Ag-Ab contiene un anticuerpo IgG, el complejo puede pre-
jos de insulina y antiinsulina en diabéticos. Aunque su técnica cipitarse mezclándolo con S. aureus muerto con formalina. Tras
fue recibida con algún escepticismo, pronto demostró su valor eliminar el complejo por cualesquiera de estos métodos es po-
para medir hormonas, proteínas séricas, fármacos y vitaminas a sible medir la cantidad de antígeno marcado libre que queda en
concentraciones de 0.001 microgramos por mililitro o menos. La el sobrenadante con un contador de radiación; la sustracción
importancia de la técnica se reconoció en 1977, unos años desde este valor de la cantidad total de antígeno marcado añadido
pués de morir Berson, por la adjudicación de un premio Nobel proporciona la cantidad de antígeno marcado unido.
a Yalow. Se han creado diversos RIA de fase sólida que hacen más fá-
El principio del RIA implica la unión competitiva de antí- cil separar el complejo Ag-Ab del antígeno no unido. En algu-
geno radiomarcado y antígeno no marcado a un anticuerpo de nos casos el anticuerpo se une por enlaces cruzados covalentes
alta afinidad. El antígeno marcado se mezcla con anticuerpo a cuentas de Sepharose. La cantidad de antígeno radiomarca-
a una concentración que satura los sitios de unión a antígeno do unido a las cuentas puede medirse después de centrifugar
del anticuerpo. En seguida se añaden en cantidades crecientes y lavar estas últimas. De modo alternativo el anticuerpo se
las muestras de antígeno no marcado de concentración desco- inmoviliza en fosos de poliestireno o policloruro de vinilo y
nocida. El anticuerpo no distingue el antígeno marcado del no la cantidad de antígeno marcado libre en el sobrenadante se
marcado, por lo que los dos tipos de antígeno compiten por determina en un contador de radiación. En otro método
los sitios de unión disponibles en el anticuerpo. Conforme se inmoviliza el anticuerpo en las paredes de los fosos de mi-
la concentración de antígeno no marcado aumenta, más antí- crotítulo y se determina la cantidad de antígeno unido. Ya
geno con la marca radiactiva es desplazado de los sitios de que el procedimiento sólo requiere cantidades pequeñas de la
unión. El decremento de la cantidad de antígeno radiomarcado muestra y puede realizarse en placas de microtítulo pequeñas
que se une al anticuerpo específico en presencia de la muestra de 96 fosos (un poco más grandes que una tarjeta de 3 5),
en estudio se mide para determinar la cantidad de antígeno que este procedimiento resulta muy adecuado para determinar la
esta última contiene. concentración de un antígeno particular en un gran número
Por lo general el antígeno se marca con un isótopo emisor de muestras. Por ejemplo, el RIA de microtítulo se utiliza con
de partículas como 125I, pero también suelen emplearse como amplitud para detectar la presencia de virus de hepatitis B (fig.
marcas isótopos de emisión como el tritio (3H). El antígeno 6-9). El RIA de la sangre del donante reduce mucho la inciden-
radiomarcado es parte de la mezcla de valoración; la muestra de cia de infecciones por hepatitis B en receptores de transfusio-
estudio puede ser alguna compleja, como suero u otros líquidos nes sanguíneas.
corporales, que contiene el antígeno no marcado. La primera
etapa para llevar a cabo un RIA es determinar la cantidad de
anticuerpo necesario para unir 50 a 70% de la cantidad fija
de antígeno radiactivo (Ag*) en la mezcla por valorar. Esta Ensayo de inmunosorbente
relación de anticuerpo con Ag* se eligió para asegurar que la
cantidad de epítopos que el antígeno marcado presenta siempre ligado a enzima
exceda el número total de sitios de unión de anticuerpo. En El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima, que suele co-
consecuencia, el antígeno no marcado que se agrega a la mezcla nocerse como ELISA (o EIA), es similar en principio al RIA
de estudio compite con el antígeno radiomarcado por el sumi- pero depende de una enzima en lugar de un marcador radiacti-
nistro limitado de anticuerpo. Incluso una cantidad pequeña de vo. Una enzima conjugada con un anticuerpo reacciona con un
antígeno sin marca añadido a la mezcla de antígeno marcado sustrato incoloro para generar un producto con reacción de co-
y anticuerpo en estudio origina un descenso en la cantidad de lor. Ese sustrato se denomina sustrato cromógeno. Para ELISA
antígeno radiactivo unido, y esta disminución es proporcional se utilizan varias enzimas, como fosfatasa alcalina, peroxidasa
a la cuantía del antígeno no marcado añadido. Con objeto de de rábano picante y -galactosidasa. Estas pruebas tienen sen-
determinar la cantidad de antígeno marcado unida, el complejo sibilidad comparable a los RIA y la ventaja de ser más seguras y
Ag-Ab se precipita para separarlo del antígeno libre (antígeno menos costosas.
no unido a anticuerpo) y se mide la radiactividad en el preci-
pitado. Puede generarse una curva estándar utilizando mues-
tras de antígeno no marcado de concentración conocida (en Existen múltiples variantes
lugar de la muestra de estudio), y a partir de esta gráfica es posi-
ble determinar con precisión la cantidad de antígeno en la mez-
de ELISA
cla de estudio. Se cuenta con algunas variaciones de ELISA que permiten la
Se han desarrollado varios métodos para separar antígeno detección cualitativa o la medición cuantitativa de antígeno o
unido de antígeno libre en RIA. Uno de ellos incluye la preci- anticuerpo. Cada tipo de ELISA puede usarse de manera cua-
pitación del complejo Ag-Ab con un antisuero antiisotipo se- litativa para detectar la presencia de anticuerpo o antígeno. De
cundario. Por ejemplo, si el complejo Ag-Ab contiene anticuer- manera alternativa, se realiza una curva estándar con base en
po IgG de conejo, entonces la IgG anticonejo de cabra se une a concentraciones conocidas de anticuerpo o antígeno, a partir de
la IgG de conejo y precipita el complejo. En otro método se uti- la cual es posible determinar la concentración desconocida
liza el hecho de que la proteína A de Staphylococcus aureus tiene de una muestra.

a) b)
Suero infectado [125I]HBsAg [125I]HBsAg Suero 70
no infectado
HBsAg no
marcado 60
[125I]HBsAg unido a anti-HbsAg, %

Anti-HBsAg
50
125I unido 125I unido
Parte aproximadamente lineal
de la curva
FIGURA 6-9 Radioinmunoensayo (RIA) de fase sólida para 40
detectar virus de hepatitis B en muestras de sangre. a) Fo-
sos de microtítulo se cubren con una cantidad constante de anti-
cuerpo específico para HbsAg, el antígeno de superficie en viriones 30
de hepatitis B. A continuación se añaden una muestra de suero y
[125I]HBsAg. Tras la incubación, el sobrenadante se extrae y la radiac-
tividad de los complejos antígeno-anticuerpo se mide. Si la muestra 20
está infectada, la cantidad del marcador unido es menor que en los
testigos con suero no infectado. b) Se obtiene una curva estándar
añadiendo concentraciones crecientes de HbsAg no marcado a una 10
cantidad fija de [125I]HBsAg y anticuerpo específico. La gráfica de
porcentaje de antígeno marcado unido contra concentración de an-
tígeno no marcado permite determinar la concentración de HBsAg
0
en muestras de suero desconocidas mediante el uso de la parte li- 1 2 3 4 5 6
neal de la curva. Concentración de HBsAg no marcado, ng/ml
ELISA indirecto ticuerpo inmovilizado. Después de lavar el foso, se agrega un

Por medio de ELISA indirecto puede detectarse anticuerpo o segundo anticuerpo ligado a enzima específico para un epíto-
determinarse de modo cuantitativo (fig. 6-10a). Suero o algu- po distinto del antígeno y se permite que reaccione con el an-
na otra muestra que contenga el anticuerpo primario (Ab1) se tígeno unido. Tras eliminar cualquier segundo anticuerpo libre
añade a un foso de microtítulo recubierto con antígeno y mediante lavado, se añade sustrato y se mide el producto de la
se permite que reaccione con el antígeno unido al foso. Después reacción de color.
de eliminar por lavado cualquier Ab1 libre, la presencia de an-
ticuerpo unido a antígeno se detecta mediante la adición de un ELISA competitivo
anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con enzima, que se une El método de ELISA competitivo es otra variante para medir
al anticuerpo primario. A continuación se elimina por lavado cantidades de antígeno (fig. 6-10c). En esta técnica se incuba
cualquier Ab2 libre y se añade un sustrato para la enzima. La primero anticuerpo en solución con una muestra que contiene
cantidad de producto de la reacción de color que se forma se antígeno. Después la mezcla de antígeno y anticuerpo se añade
mide con lectores espectrofotométricos de placa especializados, a un foso de microtítulo recubierto con antígeno. Cuanto más
que pueden medir la absorbancia de la totalidad de los fosos de antígeno se encuentra en la muestra, tanto menos anticuerpo
una placa de 96 fosos en segundos. libre está disponible para unirse al foso recubierto con antígeno.
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar La adición de un anticuerpo secundario (Ab2) conjugado con
la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmu- la enzima específico para el isotipo de un anticuerpo primario
nodeficiencia humana (VIH), el agente causal del síndrome de puede utilizarse para determinar la cantidad de anticuerpo pri-
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En esta prueba, proteínas mario unido al foso como en un ELISA indirecto. Sin embargo,
recombinantes de la envoltura y del núcleo del VIH se adsorben en la prueba competitiva cuanto más alta es la concentración de
como antígenos en fase sólida a fosos de microtítulo. Las per- antígeno en la muestra original tanto más baja es la absorción.
sonas infectadas con VIH producen anticuerpos séricos contra
epítopos en estas proteínas víricas. Por lo general, el ELISA in- Quimioluminiscencia
directo permite detectar anticuerpos séricos contra VIH desde La luz que se produce por quimioluminiscencia durante deter-
las primeras seis semanas de una infección. minadas reacciones químicas constituye una alternativa con-
veniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en
ELISA en sándwich ELISA. Las versiones de ELISA que recurren a la quimiolumi-
Es posible detectar o medir antígeno mediante ELISA en sánd- niscencia usan un sustrato luxógeno (que genera luz) en lugar
wich (fig. 6-10b). En esta técnica, el anticuerpo (en lugar del del sustrato cromógeno de las reacciones ELISA ordinarias. Por
antígeno) se inmoviliza en un foso de microtítulo. Se añade una ejemplo, la oxidación del compuesto luminol por H2O2 y la en-
muestra que contiene antígeno y se deja reaccionar con el an- zima peroxidasa de rábano picante (HRP) produce luz:

a) ELISA indirecto
E
E
S S
E
E
lavado lavado lavado
Foso recubierto Añadir anticuerpo Añadir anticuerpo Añadir sustrato (S)

con antígeno específico por medir secundario conjugado y medir el color
a enzima
b) ELISA en sándwich
E E E E S
lavado lavado lavado S
Foso recubierto Añadir antígeno Añadir anticuerpo Añadir sustrato

con antígeno por medir secundario conjugado y medir el color
a enzima
c) ELISA competitiva
E
S
lavado lavado
Incubar S
anticuerpo con
antígeno por Añadir mezcla Añadir anticuerpo Añadir sustrato
medir de Ag-Ab al foso secundario y medir el color
cubierto con conjugado
antígeno a enzima
FIGURA 6-10 Las variaciones en la técnica del ensayo de in- antígeno. El anticuerpo puede determinarse con ELISA indirecto (a),
munosorbente ligado a enzima (ELISA) permiten determinar en tanto que el antígeno puede determinarse por ELISA en sándwich
anticuerpo o antígeno. Cada prueba puede utilizarse de manera (b) o ELISA competitivo (c). En este último, que es un ensayo tipo in-
cualitativa o cuantitativa mediante la comparación con curvas es- hibición, la concentración de antígeno es inversamente proporcional
tándar elaboradas con concentraciones conocidas de anticuerpo o al color que se produce.
luminol H O determinado o un antígeno contra el que se dispone de un an-

Ab-HRP Ag ⎯→ Ab-HRP-Ag ⎯⎯⎯⎯⎯→
2 2
luz
ticuerpo específico (fig. 6-11). En este método las placas se re-
cubren con el antígeno (antígeno de captura) reconocido por el
La luz que se genera durante las reacciones luxógenas puede de- anticuerpo de interés o con el anticuerpo (anticuerpo de captu-
tectarse en virtud de su capacidad de exponer película fotográfi- ra) específico para el antígeno cuya producción se valora. Luego
ca. La medición cuantitativa de la emisión de luz puede hacerse se añade a las placas recubiertas una suspensión de la población
por medio de un luminómetro. La ventaja de las pruebas de qui- celular que se investiga y se incuba. Las células se asientan en la
mioluminiscencia sobre las cromógenas es la mejoría de la sen- superficie de la placa, y las moléculas secretadas reactivas a las
sibilidad. En general el límite de detección puede incrementarse moléculas de captura son unidas en la cercanía de las células
cuando menos 10 veces si se cambia de un sustrato cromógeno secretorias, lo que produce un anillo de complejos antígeno-an-
a uno luxógeno, y más de 200 veces cuando se adicionan agentes ticuerpo alrededor de cada célula que sintetiza la molécula de
de realce. De hecho, en condiciones ideales se detectan apenas interés. A continuación la placa se lava y un anticuerpo unido
5 1018 moles (5 attomoles) de antígeno blanco. a enzima específico para el antígeno secretado o para la especie
(p. ej., anticonejo de cabra) del anticuerpo secretado se añade y
Prueba ELISPOT deja unir. El revelado ulterior del ensayo por la adición de un
Una modificación de la prueba ELISA llamada ELISPOT per- sustrato cromógeno o luxógeno adecuado indica la posición de
mite la detección cuantitativa del número de células en una po- cada célula productora de anticuerpo o de antígeno como un
blación que produce anticuerpos específicos contra un antígeno punto de color o luz.

Foso recubierto Western blotting

con anticuerpos
anticitocina Es posible la identificación de una proteína específica en una
mezcla compleja de proteínas mediante una técnica conocida
como Western blotting, así denominada por su similitud con
S Secretor Southern blotting, que detecta fragmentos de DNA, y con Nor-
thern blotting, que detecta mRNA. En la Western blotting, una
Añadir NS No secretor mezcla de proteínas se separa por medios electroforéticos en un
población de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), un gel en placa con
células de prueba infusión de dodecilsulfato sódico (SDS), un agente de disocia-
ción (fig. 6-12). Las bandas de proteínas se transfieren a una
membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis, y las bandas
S NS individuales de proteína se identifican al inundar la membrana
Incubar a 37°C
de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radio-
marcado o unido a enzimas específico para la proteína de interés.
Los complejos Ag-Ab que se forman en la banda que contiene
Descartar células la proteína reconocida por el anticuerpo pueden visualizarse de
Lavar la placa diversos modos. Si un anticuerpo radiactivo se unió a la proteína
de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot)
exponiendo una placa de rayos X a la membrana, un procedi-
miento que se conoce como autorradiografía. Sin embargo, en los
procedimientos de detección que más se usan suelen emplearse
anticuerpos unidos a enzima contra la proteína. Tras la unión del
conjugado de enzima y anticuerpo, la adición de un sustrato cro-
Añadir anticuerpo mógeno que produce un producto de color intenso e insoluble
anticitocina ligado origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno
a enzima blanco. Puede lograrse una sensibilidad mucho más alta si se usa
Vista lateral un compuesto quimioluminiscente aunado a agentes de realce
CS E enzima adecuados para producir luz en el sitio del antígeno.
E E E CS
CS sustrato La técnica de Western blotting también puede identificar un
cromógeno anticuerpo específico en una mezcla. En este caso los antígenos
CP CP CP producto conocidos de peso molecular bien definido se separan mediante
coloreado SDS-PAGE y transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas
de antígenos conocidos se prueban luego con la muestra que
se sospecha contiene anticuerpo específico para uno o más de
Sitio de estos antígenos. La reacción de un anticuerpo con una banda
células secretoras
se detecta mediante el empleo de anticuerpo secundario radio-
marcado o ligado a enzima específico para la especie de los anti-
Vista superior cuerpos en la muestra en estudio. La aplicación más amplia de este
procedimiento es como prueba de confirmación de VIH, donde
la Western blotting se utiliza para determinar si el paciente tiene
anticuerpos que reaccionan con una o más proteínas víricas.
FIGURA 6-11 En la prueba ELISPOT, un foso se recubre con

anticuerpo contra el antígeno de interés, en este ejemplo una Inmunoprecipitación
citocina; luego una capa de una suspensión de la población ce-
La técnica de inmunoprecipitación tiene la ventaja de permitir
lular que se piensa que contiene algunos miembros que sinte-
el aislamiento del antígeno de interés para un análisis más am-
tizan y secretan la citocina se coloca en el fondo del foso y se
incuba. La mayoría de las moléculas de citocina secretadas por una
plio. Asimismo constituye una prueba sensible para la presencia
célula particular reacciona con los anticuerpos cercanos unidos al de un antígeno particular en un tipo de célula o tejido determi-
foso. Después del período de incubación, se lava el foso y se añade nado. Un extracto obtenido por rotura de células o tejidos se
un anticuerpo anticitocina marcado con enzimas. Tras eliminar por mezcla con un anticuerpo contra el antígeno de interés a fin de
lavado el anticuerpo no unido, se añade un sustrato cromógeno que formar un complejo antígeno-anticuerpo que se precipitará. Sin
forma un producto insoluble de color. Este último (púrpura) se pre- embargo, si la concentración de antígeno es baja (lo que a me-
cipita y forma una mancha sólo en las áreas del foso en que se nudo es el caso en extractos de células y tejidos), el ensamblaje
depositaron células que secretan citocina. El recuento de las man- de los complejos antígeno-anticuerpo en precipitados puede re-
chas de colores permite determinar cuántas células que secretaban querir horas e incluso días, y es difícil aislar la pequeña cantidad
citocina estaban presentes en la suspensión celular adicionada. de inmunoprecipitado que se forma.

a) Añadir la mezcla de b) Electroforesis Se cuenta con varias maneras de evitar estas limitaciones.
proteína tratada con en gel de Una consiste en unir el anticuerpo a un apoyo sólido, como una
SDS al recipiente de gel poliacrilamida cuenta sintética, que permite reunir el complejo antígeno-anti-
cuerpo mediante centrifugación. Otra es agregar un anticuerpo
secundario específico para el anticuerpo primario con objeto
–
de unir los complejos antígeno-anticuerpo. Si el anticuerpo se-
cundario se une a una cuenta, los inmunocomplejos pueden co-
lectarse mediante centrifugación. Una versión particularmente
ingeniosa de este procedimiento incluye el acoplamiento del
anticuerpo secundario a cuentas magnéticas. Después de que
Dirección los anticuerpos secundario y primario se unen, los inmunopre-
de la cipitados se colectan colocando un imán contra un lado del tubo
migración (fig. 6-13).
Antígenos Cuando se utiliza en conjunto con el marcado biosintético
proteínicos con radioisótopo, la inmunoprecipitación también permite de-
desnaturalizados
terminar si en realidad una célula o tejido sintetiza un antígeno
en SDS
particular. El radiomarcado de las proteínas que las células de
interés producen puede efectuarse cultivando las células en un
medio que contiene uno o más aminoácidos radiomarcados. Por
+
c) Remover el gel y lo general los aminoácidos que se usan para esta aplicación son
efectuar los más resistentes a modificaciones metabólicas, como leucina,
electrotransferencia cisteína o metionina. Después de que las células proliferan en el
medio radiactivo, se lisan y someten a un anticuerpo primario
específico para el antígeno de interés. El complejo Ag-Ab se co-
lecta mediante inmunoprecipitación, se limpia de aminoácido
radiomarcado no incorporado y otras impurezas por lavado, y
a continuación se analiza. El complejo puede cuantificarse en un
contador de centelleo para obtener una determinación cuantita-
tiva de la cantidad de proteína sintetizada. A menudo el análisis
adicional incluye la alteración del complejo, casi siempre con
Corriente SDS y calor, de manera que sea posible confirmar la identidad
eléctrica del antígeno inmunoprecipitado controlando que su peso mo-
lecular sea el esperado para el antígeno de interés. Esto se rea-
liza por separación del complejo alterado mediante SDS-PAGE
Hoja de y autorradiografía subsecuente para identificar la posición del
membrana
antígeno radiomarcado en el gel.
porosa
d) Unir el antígeno de
interés con anticuerpos
ligados a enzima
FIGURA 6-12 En la técnica de Western blotting, una mezcla

proteínica a) se trata con SDS, un detergente desnaturalizador
potente, b) luego se separa mediante electroforesis en un gel
de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) que discrimina los compo-
nentes según su peso molecular; los componentes de peso mo-
e) Añadir sustrato para lecular más bajo migran más rápido que los de peso molecular
activar la reacción más alto. c) El gel se retira del aparato y se aplica a una hoja de
de color nitrocelulosa o nylon que une proteínas, y las proteínas y el gel se
transfieren a la hoja mediante el paso de una corriente eléctrica. d)
La adición de anticuerpos unidos a enzima detecta el antígeno de
interés y e) la posición de los anticuerpos se observa mediante una
reacción ELISA que genera un producto insoluble de color intenso
el cual se deposita en el sitio de la reacción. De otra manera puede
utilizarse un ELISA quimioluminiscente para generar luz que se de-
tecta con facilidad al exponer una pieza de película fotográfica a la
blot (mancha).

a) b) c) d)
Anticuerpo
específico
Cuenta
magnética
Antígeno
A
Añadir anticuerpo Añadir anticuerpo Aplicar imán y

específico a secundario unido lavar para
extracto celular a cuentas eliminar
magnéticas material no unido
FIGURA 6-13 Los inmunoprecipitados pueden colectarse Ig de ratón no reactiva). c) La colocación de un imán contra el lado
utilizando cuentas magnéticas acopladas a un anticuerpo del tubo permite colectar con rapidez los complejos antígeno-anti-
secundario. a) El tratamiento de un extracto celular que contiene cuerpo. Después de lavar para eliminar cualquier material no unido,
antígeno A (rojo) con un anticuerpo anti-A de ratón (azul) da por los complejos antígeno-anticuerpo pueden disociarse y el antígeno
resultado la formación de complejos antígeno-anticuerpo. b) La estudiarse. d) Micrografía electrónica que muestra una célula con
adición de cuentas magnéticas a las que se unió antígeno antirratón cuentas magnéticas unidas a su superficie mediante anticuerpos.
de conejo se unen a los complejos antígeno-anticuerpo (y cualquier [Parte d, P. Groscurth, Instituto de Anatomía, Universidad de Zurich-Irchel.]
longitud de onda más larga que la fluoresceína, puede usarse

Inmunofluorescencia en pruebas de inmunofluorescencia de dos colores. Un
anticuerpo específico para un determinante se marca con
En 1944 Albert Coons mostró que era factible marcar los anti-
fluoresceína y un anticuerpo que reconoce un antígeno
cuerpos con moléculas que tienen la propiedad de la fluorescen-
distinto, con rodamina. La localización del anticuerpo
cia. Las moléculas fluorescentes absorben luz de una longitud de
marcado con fluoresceína es visible por su color verde
onda (excitación) y emiten luz de otra longitud de onda (emisión).
amarillo, fácil de distinguir del rojo que se emite donde
Si las moléculas de anticuerpo se marcan con un colorante fluo-
el anticuerpo marcado con rodamina se unió. La conjugación
rescente, o fluorocromo, los complejos inmunitarios que contie-
de fluoresceína a un anticuerpo y la de rodamina a otro
nen estos anticuerpos marcados con fluorescencia (FA) pueden
anticuerpo permite, por ejemplo, ver al mismo tiempo dos
detectarse por la emisión de luz de color cuando se excitan con
antígenos de membrana celular diferentes en la misma célula.
una luz de longitud de onda apropiada. Es posible observar de
manera similar moléculas de anticuerpo unidas a antígenos en ■ Ficoeritrina absorbe luz de manera eficiente (~30 veces
células o cortes de tejido. La luz emitida puede verse con un mi- más que la fluoresceína) y es un emisor brillante de
croscopio de fluorescencia, que está equipado con una fuente de fluorescencia roja, lo cual la hace de uso amplio como un
luz UV. En esta técnica, que se conoce como inmunofluorescen- marcador de inmunofluorescencia.
cia, suelen emplearse compuestos fluorescentes, como fluoresceí-
na y rodamina, pero también otras sustancias muy fluorescentes, La tinción con anticuerpo fluorescente de moléculas de la mem-
por ejemplo ficoeritrina, un pigmento de color muy intenso y brana celular o de cortes de tejido puede ser directa o indirec-
muy fluorescente obtenido de algas. Estas moléculas pueden con- ta (fig. 6-14). En la tinción directa el anticuerpo específico (el
jugarse con la región Fc de una molécula de anticuerpo sin afec- anticuerpo primario) se conjuga directamente con fluoresceína; en
tar la especificidad de éste. Cada uno de los fluorocromos que se la tinción indirecta el anticuerpo primario no se marca y se de-
mencionan a continuación absorbe luz en una longitud de onda tecta con un reactivo adicional marcado con fluorocromo. Se han
y emite luz a una longitud de onda más larga: desarrollado varios reactivos para la tinción indirecta. El más
usual es un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo for-
■ Fluoresceína, un colorante orgánico que es el marcador mado en una especie contra anticuerpos de otra especie, como la
más utilizado para procedimientos de inmunofluorescencia, inmunoglobulina antirratón de cabra marcada con fluoresceína.
absorbe luz azul (490 nm) y emite una fluorescencia La tinción de inmunofluorescencia indirecta tiene dos venta-
verde-amarillo intensa (517 nm). jas sobre la tinción directa. Primera, no es necesario conjugar el
■ Rodamina, otro colorante orgánico, absorbe en el intervalo anticuerpo primario con un fluorocromo. Puesto que la dotación
del verde y el amarillo (515 nm) y emite una fluorescencia de anticuerpo primario suele ser un factor limitante, los méto-
roja intensa (546 nm). Ya que emite fluorescencia en una dos indirectos evitan la pérdida de anticuerpo que suele ocurrir

Células con antígenos Anticuerpo primario

de membrana (mAg) contra mAg
Fl Fl
Fl
Fl Fl
Fl Fl Fl Fl
Fl Fl Fl Fl
Fl Fl Fl
Anticuerpo Anticuerpo Proteína A
primario antiisotipo
secundario
a) Método directo con anticuerpo b) Método indirecto con anticuerpo c) Método indirecto con proteína A
marcado con fluorocromo contra mAg antiisotipo marcado con fluorocromo marcada con fluorocromo
FIGURA 6-14 Tinción por inmunofluorescencia directa e indi-
recta de antígeno de membrana (mAg). Las células se fijan a un
portaobjetos de microscopio. En el método directo (a), las células se d)
tiñen con anticuerpo anti-mAg marcado con un fluorocromo (FI).
En los métodos indirectos (b y c), se incuban primero las células con
anticuerpo anti-mAg no marcado y luego se tiñen con un reactivo
secundario marcado con fluorocromo que se une al anticuerpo pri-
mario. Las células se observan bajo un microscopio de fluorescencia
para ver si se tiñeron. d) En esta micrografía, moléculas de anticuer-
po que llevaban cadenas pesadas se detectaron mediante la tin-
ción indirecta de células con un segundo anticuerpo conjugado con
rodamina. [Parte d, H. A. Schreuder et al. 1997, Nature 386:196. Cortesía de
H. Schreuder, Hoechst Marion Roussel.]
durante la reacción de conjugación. Segunda, los métodos indirec- sión (fig. 6-15). Cada vez que una célula pasa por el rayo láser,
tos aumentan la sensibilidad de tinción porque múltiples molécu- la luz del detector se desvía y esta interrupción de la señal láser
las del reactivo fluorocromo se unen a cada molécula de anticuerpo se registra. El láser excita las células que tienen un anticuerpo
primario, lo que incrementa la cantidad de luz que se emite en la marcado con fluorescencia unido a sus antígenos de superficie
localización de cada molécula de anticuerpo primario. celular, de modo que emiten luz que un segundo sistema de-
La inmunofluorescencia se ha aplicado para identificar varias tector localizado en ángulo recto con el haz láser registra. La
subpoblaciones de linfocitos, en especial las de células T CD4 y forma más sencilla del instrumento cuenta cada célula cuando
CD8. La técnica también es adecuada para identificar especies pasa por el haz láser, y registra el grado de fluorescencia que la
bacterianas, detectar complejos Ag-Ab en enfermedad autoin- célula emite; una computadora conectada al sistema genera grá-
munitaria, descubrir componentes del complemento en tejidos ficas del número de células como coordenadas y su intensidad de
y localizar hormonas y otros productos celulares teñidos in situ. fluorescencia como abscisas. Las versiones más complicadas
De hecho, una aplicación mayor de la técnica de anticuerpo del instrumento son capaces de seleccionar poblaciones de célu-
fluorescente es la localización de antígenos en cortes de tejido las en diferentes contenedores según su perfil de fluorescencia.
o en compartimientos subcelulares. Como puede utilizarse para El uso del instrumento para determinar qué población celular y
mapear la localización real de antígenos blanco, la microscopia cuántos de sus miembros unen anticuerpos marcados con fluo-
de fluorescencia es un instrumento potente para relacionar la rescencia se denomina análisis; el empleo del instrumento para
arquitectura molecular de los tejidos y órganos con su anatomía colocar células que tienen diferentes patrones de reactividad
macroscópica global. en contenedores distintos se denomina clasificación celular.
El citómetro de flujo tiene múltiples aplicaciones en proble-
mas clínicos y de investigación. Un uso clínico frecuente consis-
Citometría de flujo y fluorescencia te en determinar el grupo y el número de glóbulos blancos en
muestras de sangre. El tratamiento de muestras de sangre pro-
Las técnicas de anticuerpos fluorescentes descritas son instru- cesadas de manera apropiada con un anticuerpo marcado con
mentos cualitativos extremadamente valiosos, pero no propor- fluorescencia y el análisis citométrico de flujo permiten obtener
cionan datos cuantitativos. Este inconveniente se eliminó con el la siguiente información:
desarrollo del citómetro de flujo, que se diseñó para automati-
zar el análisis y la separación de células teñidas con anticuerpo ■ ¿Cuántas células expresan el antígeno blanco como un
fluorescente. El citómetro de flujo recurre a un rayo láser y un número absoluto y también como porcentaje de las células
detector de luz para contar células intactas aisladas en suspen- que pasan por el haz? Por ejemplo, si se utiliza un

anticuerpo fluorescente específico para un antígeno que se

Células teñidas con: encuentra en todas las células T, sería posible determinar
Anticuerpo anti-A + el porcentaje de células T en la población total de glóbulos
anticuerpo anti-B blancos. A continuación, empleando las capacidades de
Boquilla
ultrasónica
Anticuerpo anti-A clasificación celular del citómetro de flujo, podría aislarse la
Anticuerpo anti-B fracción de células T de la población de leucocitos.
vibratoria
Sin teñir
■ La distribución de células en la población de una muestra
conforme a las densidades de antígeno determinadas por la
Láser intensidad de fluorescencia. Por tanto es posible obtener una
encia medida de la distribución de la densidad de antígeno dentro
resc
Fluo de la población de células que poseen el antígeno. Ésta es
Pantalla de computadora
una característica potente del instrumento porque el mismo
– + Células A−B+ Células A+B+
tipo de células puede expresar diferentes niveles de antígeno
anticuerpo anti-B
Fluorescencia de
según su desarrollo o estado fisiológico.

Placas de desviación Células A−B− Células A+B− ■ El tamaño de las células. Esta información se deriva del
análisis de las propiedades de dispersión de la luz de
miembros de la población celular que se examina.
Fluorescencia de La citometría de flujo también permite analizar poblaciones
anticuerpo anti-A
celulares que se marcaron con dos o incluso tres diferentes an-
ticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, si una muestra de sangre
reacciona con un anticuerpo específico para células T marca-
do con fluoresceína y también con un anticuerpo marcado con
ficoeritrina específico para células B, es posible determinar de
manera simultánea el porcentaje de células B y T en un solo aná-
lisis. Son comunes numerosas variantes de estos análisis “mul-
Células A−B+ y A+B− Células A−B− Células A+B+ ticolores”, incluidos experimentos en que se utilizan muchos
“colores” a la vez.
FIGURA 6-15 Separación de células marcadas con fluoro-
cromo en el citómetro de flujo. En el ejemplo que se muestra, La citometría de flujo ocupa ahora una posición fundamen-
una población mixta de células se tiñó con dos anticuerpos: uno tal en la inmunología y la biología celular, y también constituye
específico para el antígeno de superficie A y el otro específico para un recurso clínico indispensable. El citómetro de flujo es uno
el antígeno de superficie B. Los anticuerpos anti-A se marcaron de los instrumentos esenciales para la detección y clasifica-
con fluoresceína (verde) y los anticuerpos anti-B con rodamina ción de leucemias en muchos centros médicos (véase el enfoque
(rojo). Las células teñidas se cargan en la cámara de muestra del clínico). La elección del tratamiento de la leucemia depende en
citómetro. Las células se expulsan, una a la vez, de una boqui- mucho de los tipos de células afectados, lo que determina que
lla pequeña vibratoria que genera microgotitas, cada una de las la identificación precisa de las células neoplásicas sea una parte
cuales contiene no más de una célula aislada. Conforme sale de esencial de la práctica clínica. Asimismo la medición rápida de
la boquilla, cada gotita recibe una carga eléctrica pequeña y la
subpoblaciones de células T, un indicador pronóstico importan-
computadora que controla el citómetro de flujo puede detectar con
exactitud cuando pasa una gotita generada por la boquilla a través
te en el SIDA, suele llevarse a cabo mediante el análisis cito-
del haz de luz láser que excita el fluorocromo. La intensidad de la métrico de flujo. En este procedimiento se utilizan anticuerpos
fluorescencia emitida por cada gotita que contiene una célula se monoclonales marcados contra los subtipos principales de cé-
vigila con un detector y se muestra en una pantalla de compu- lula T que llevan los antígenos CD4 y CD8 para determinar sus
tadora. Como la computadora sigue la posición de cada gotita, es po- proporciones en la sangre del paciente. Éste tiene un riesgo alto
sible determinar cuándo una gotita particular llegará entre las placas de infecciones oportunistas cuando la cifra de células T CD4
de desviación. La aplicación de una carga momentánea a las pla- disminuye por debajo de determinado nivel.
cas de desviación cuando una gotita pasa entre ellas hace posible
desviar el trayecto de una gotita particular hacia uno u otro vaso de
reunión. Ello permite seleccionar una población de células en subpo-
blaciones que tienen diferentes perfiles de marcadores de superficie. Alternativas a las reacciones
Cada punto representa una célula en la pantalla de la computado-
ra. Las células que caen en el panel inferior izquierdo tienen niveles de antígeno-anticuerpo
fondo de fluorescencia y se juzga que no reaccionaron con anticuer-
Como defensa contra los anticuerpos del hospedador, algunas
po anti-A o anti-B. Las que aparecen en el panel superior izquierdo
reaccionaron con anti-B, pero no con anti-A, y las del panel inferior bacterias desarrollaron la capacidad de elaborar proteínas que
derecho reaccionaron con anti-A pero no con anti-B. El panel supe- se unen a la región Fc de las moléculas de IgG con afinidad alta
rior derecho contiene células que reaccionan tanto con anti-A como (Ka ~ 108). Una de estas moléculas, que se conoce como proteí-
con anti-B. En los ejemplos que aquí se muestran, las subpoblaciones na A, se encuentra en las paredes celulares de algunas cepas de
AB —y AB— se seleccionaron cada una hacia tubos separados. Staphylococcus aureus, y otra, la proteína G, se presenta en las
La tinción con anticuerpos fluorescentes anti-A y anti-B permite dis- paredes de estreptococos de los grupos C y G. La clonación de
tinguir cuatro subpoblaciones: AB, AB, AB y AB. los genes para las proteínas A y G, y la generación de un híbrido

EN F OQ U E C LÍ N I C O te y precisa para inmunofenotipificación

utiliza la citometría de flujo y anticuerpos
Citometría de flujo y tipificación monoclonales. La disponibilidad de anti-
cuerpos monoclonales específicos para
de leucemias cada una de las calificaciones de antíge-
nos que se encuentran en diversos tipos
y subtipos de células hematopoyéticas
La leucemia es la proliferación incon- El diseño del tratamiento más apropiado hizo posible identificar los patrones de
trolable de una clona anormal de células para el paciente demanda conocer el tipo expresión de antígeno que son típicos
hematopoyéticas. De manera característi- de leucemia que padece. A este respecto, de linajes celulares, etapas de maduración
ca, las células leucémicas responden mal o dos preguntas son importantes: 1) ¿cuál y varios tipos distintos de leucemia. Casi
en forma inapropiada a señales regulado- es el linaje de las células anormales? y 2) todos los centros para cáncer están equi-
ras, muestran patrones de diferenciación ¿cuál es la etapa de maduración? Varios pados con citómetros de flujo que son ca-
aberrantes o incluso no se diferencian. Más métodos, inclusive el examen citológico paces de efectuar e interpretar los análisis
aún, en ocasiones suprimen el desarrollo de la morfología celular y las caracterís- de múltiples parámetros necesarios para
de células linfoides y mieloides normales. ticas de tinción, la inmunofenotipifica- suministrar perfiles útiles de marcadores
La leucemia puede surgir en cualquier eta- ción y, en algunos casos, un análisis de de superficie en poblaciones de células
pa de maduración de cualesquiera de los reordenamientos génicos, son útiles para tumorales. La determinación citométrica
linajes hematopoyéticos. Las leucemias lin- responder a estas preguntas. Uno de los de flujo de inmunofenotipos permite:
focíticas muestran muchas características más potentes de estos métodos es la in-
de células del linaje linfoide; otro grupo munofenotipificación, la determinación ■ Confirmar el diagnóstico
amplio, las leucemias mielógenas, tienen del perfil de marcadores de superficie ce- ■ Establecer el diagnóstico cuando no
atributos de miembros del linaje mieloi- lular seleccionados que muestra la célula es posible tener un juicio claro con
de. Aparte del linaje, muchas leucemias leucémica. Aunque aún no se encuentran base en la morfología o los patrones
pueden clasificarse como agudas o cró- antígenos específicos de leucemia, los de tinción citoquímica
nicas. Algunos ejemplos son la leucemia perfiles de los antígenos de superficie que
linfocítica aguda (ALL), la más frecuente se expresan con frecuencia permiten es- ■ Identificar perfiles de antígeno
de la niñez; la leucemia mielógena aguda tablecer el linaje celular y suelen ser útiles aberrantes que pueden ayudar a
(AML), que se encuentra más a menudo en para determinar las etapas de maduración detectar el retorno de la leucemia
adultos que en niños, y la leucemia linfocí- presentes en las poblaciones de células durante una remisión
tica crónica (CLL), que rara vez se observa leucémicas. Por ejemplo, una célula anor- ■ Mejorar la predicción del curso de la
en niños pero es la forma más común de mal que muestra inmunoglobulina de su- enfermedad
leucemia del adulto en el mundo occiden- perficie se asignaría al linaje de célula B
tal. Un cuarto tipo, la leucemia mielóge- y su etapa de maduración sería la de una
na crónica (CML), se presenta con mucho célula B madura. Por otra parte, una célula
mayor frecuencia en adultos mayores que que tiene cadenas pesadas citoplásmi-
en niños. cas pero carece de inmunoglobulina de su- Distribución de marcadores seleccionados en
El diagnóstico de leucemia se basa perficie sería una célula leucémica de algunos tipos de células leucémicas. Se mues-
en la detección de células anormales en linaje B, pero en etapa de maduración tran los perfiles de antígeno de superficie típicos
el torrente sanguíneo y la médula ósea. de célula pre-B. La tecnología más eficien- que se encuentran en muchas ALL y CLL.
ALL del linaje pre-B

(la ALL más frecuente) ALL de linaje T CLL de linaje B
CD8
CD4 (correceptor
(correceptor para MHC I)
CD10 CD1 MHC II CD44
para MHC II)
(una metaloproteinasa) (una molécula Ig (molécula de
similar a MHC adhesión)
MHC II
clase I)
CD23
(receptor CD19
CD2
de IgE de
(una molécula
afinidad baja)
de adhesión) CD5
CD19 CD20
CD34
(un correceptor (un marcador CD5 (marcador de
(marcador de
de célula B) CD7 de célula T) CD34 célula B)
precursores
hematopoyéticos) (marcador de algunas células T,
timocitos y células hematopoyéticas
pluripotentes)

de ambos, permiten elaborar una proteína recombinante, que se utilizan varios marcadores electrodensos, entre otros ferritina
conoce como proteína A/G, ya que combina características de y oro coloidal. El marcador electrodenso puede visualizarse al
ambas. Estas moléculas son útiles porque unen IgG de muchas microscopio electrónico como puntos negros pequeños. En el
especies distintas. Por ello pueden marcarse con fluorocromos, marcado con inmunooro, diferentes anticuerpos pueden conju-
radiactividad o biotina y emplearse para detectar moléculas de garse con partículas de oro de distintos tamaños, lo que permite
IgG en los complejos antígeno-anticuerpo que se forman du- identificar varios antígenos dentro de una célula por los tama-
rante las pruebas ELISA, RIA o las que se basan en fluorescencia, ños muy diferentes de las partículas de oro electrodensas fijadas
como la citometría de flujo o la microscopia de fluorescen- a los anticuerpos (fig. 6-16).
cia. Estas proteínas bacterianas que unen IgG también pueden
utilizarse a fin de formar columnas de afinidad para el aisla-
miento de la inmunoglobulina G (IgG).
La clara de huevo contiene una proteína llamada avidina, la RESUMEN
cual se une a la biotina, una vitamina esencial para la síntesis
de grasa. Se piensa que la avidina evolucionó como una defensa ■ Las interacciones antígeno-anticuerpo dependen de cuatro
contra roedores merodeadores de nidos en busca de huevos. La tipos de interacciones no covalentes: enlaces hidrógeno, en-
unión entre avidina y biotina es en extremo específica y de una laces iónicos, interacciones hidrófobas e interacciones de van
afinidad mucho más alta (Ka ~ 1015) que cualquier otra reacción der Waals.
antígeno-anticuerpo conocida. Una proteína bacteriana llamada ■ La constante de afinidad, que puede determinarse mediante
estreptavidina, que Streptomyces avidinii elabora, tiene afinidad el análisis de Scatchard, proporciona una medida cuantitativa
y especificidad altas similares. Muchos procedimientos inmu- de la fuerza de interacción entre un epítopo del antígeno y un
nitarios aprovechan la extraordinaria afinidad y la minuciosa sitio de unión individual de un anticuerpo. La avidez refleja
especificidad de la interacción de estas proteínas con la biotina. la fuerza total de las interacciones entre una molécula de anti-
El anticuerpo primario o secundario se marca con biotina y se cuerpo multivalente y una molécula de antígeno multivalente
deja reaccionar con el antígeno blanco; luego el anticuerpo no en múltiples sitios.
unido se elimina por lavado. A continuación la estreptavidina o ■ La resonancia de plasmones superficiales (SPR) permite la ca-
la avidina conjugadas con una enzima, fluorocromo o una mar-
racterización de la afinidad y la cinética de las interacciones
ca radiactiva se usan para detectar el anticuerpo unido.
antígeno-anticuerpo.
■ La interacción de un antígeno soluble y la precipitación de
anticuerpo en un medio líquido o en gel forman un precipita-
Microscopia inmunoelectrónica do de antígeno y anticuerpo (Ag-Ab). La electroforesis puede
combinarse con precipitación en gel en una técnica denomi-
La especificidad fina de los anticuerpos los convierte en podero- nada inmunoelectroforesis.
sos instrumentos para observar componentes tisulares intrace- ■ La interacción entre un antígeno particulado y un anticuerpo
lulares específicos mediante microscopia inmunoelectrónica.
aglutinante (aglutinina) produce agregación visible o aglu-
En esta técnica, un marcador electrodenso se conjuga con la
tinación, que forma la base de una serie de inmunoensayos
porción Fc de un anticuerpo específico para tinción directa o
simples, rápidos y sensibles.
con un reactivo antiinmunoglobulina para tinción indirecta. Se
■ El radioinmunoensayo (RIA) es un procedimiento muy sen-
sible y cuantitativo que utiliza antígeno o anticuerpo marcado
con radiactividad.
■ El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) de-
pende de una reacción de enzima y sustrato que genera un
producto de reacción de color. Las pruebas ELISA que re-
curren a la quimioluminiscencia en lugar de una reacción
cromógena son los inmunoensayos más sensibles con que se
cuenta.
■ La técnica de Western blotting separa una mezcla de proteí-
nas mediante electroforesis; a continuación las bandas de pro-
teína se transfieren electroforéticamente a nitrocelulosa y se
identifican con anticuerpo o antígeno marcado.
FIGURA 6-16 Inmunoelectromicrografía de la superficie de ■ La microscopia de fluorescencia que emplea anticuerpos mar-
una célula B de linfoma que se tiñó con dos anticuerpos: uno cados con moléculas fluorescentes permite observar antígeno
contra moléculas MCH clase II marcadas con partículas de oro
sobre las células o dentro de ellas.
de 30 nm y otra contra moléculas MHC clase I marcadas con
partículas de oro de 15 nm. La densidad de moléculas clase I ex- ■ La citometría de flujo constituye una tecnología extraordina-
cede la de la clase II en esta célula. Bar = 500 nm. [De A. Jenei et al., riamente potente para el análisis cuantitativo y la clasificación
1997, PNAS 94:7269-7274; cortesía de A. Jenei y S. Damjanovich, Escuela de de poblaciones celulares marcadas con uno o más anticuerpos
Medicina de la Universidad de Debrecen, Hungría.] fluorescentes.

Bibliografía f. A fin de que la precipitación ocurra, tanto el antígeno como

el anticuerpo deben ser multivalentes.
Bierer, B., et al. 2005. Current Protocols in Immunology. Wiley, New g. El análisis de una población celular mediante citometría
York. de flujo puede brindar al mismo tiempo información tan-
Harlow, E., and D. Lane. 1999. Using antibodies: A Laboratory Ma- to de la distribución por tamaño como del perfil de an-
nual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, tígeno de poblaciones celulares que contienen varios tipos
NY. diferentes de células.
Herzenberg, L. A., ed. 1996. Weir’s Handbook of Experimental Im- h. Las pruebas ELISA que recurren a la quimioluminiscencia
munology, 5th ed. Oxford, Blackwell Scientific Publications. son más sensibles que las cromógenas y las pruebas de pre-
cipitación lo son más que las de aglutinación.
Malmqvist, M. 1993. Surface plasmon resonance for detection and
i. La Western blotting y las pruebas de inmunoprecipitación
measurement of antibody-antigen affinity and kinetics. Current
son valoraciones cuantitativas útiles para medir las concen-
Opinion in Immunology 5:282.
traciones de proteínas en células o tejidos.
Rich, R. L., and D. G. Myszka. 2003. Spying on HIV with SPR. j. Suponga que tanto el anticuerpo A como el B reaccionan
Trends in Microbiology 11:124. con un epítopo C. Más aún, suponga que el anticuerpo A
Rose, N. R., et al. 1997. Manual of Clinical Laboratory Immunology. tiene una Ka cinco veces mayor que la de B. La fuerza de
American Society of Microbiology, Washington, DC. la reacción monovalente del anticuerpo A con el epítopo C
Wild, D., ed. 2005. The Immunoassay Handbook, 3rd ed. Elsevier, siempre será mayor que la avidez del anticuerpo B por un
Amsterdam. antígeno con múltiples copias del epítopo C.
2. Usted obtiene un preparado de albúmina sérica de bovino
(BSA) purificada de suero normal de bovino. Para determinar
Sitios útiles en la red si en el preparado de BSA quedan algunas otras proteínas séri-
cas decide utilizar inmunoelectroforesis.
http://pathlabsofark.com/flowcyttests.html
Explore los Pathology Laboratories of Arkansas para ver qué a. ¿Qué antígeno emplearía a fin de obtener el antisuero nece-
tipos de muestras se obtienen de los pacientes y qué sario para detectar impurezas en la preparación de BSA?
marcadores se utilizan para valorar poblaciones de linfocitos b. Suponiendo que el preparado de BSA es puro, dibuje el pa-
mediante citometría de flujo. trón inmunoelectroforético que cabría esperar si la valora-
ción se llevara a cabo con suero de bovino en un foso arriba
http://jcsmr.anu.edu.au/facslab/protocol.html de un cuenco que contiene el antisuero obtenido en a) y
En el sitio Australian Flow Cytometry Group Web, muy la muestra de BSA en un foso abajo del cuenco, como se
informativo, puede encontrarse una guía detallada y muestra a continuación:
cuidadosamente ilustrada para la interpretación de análisis
citométricos de flujo de muestras clínicas.
Preparado de BSA
http://www.rockefeller.edu/spectroscopy/
instruments_spr.php Suero bovino
Excelente definición de las unidades de la respuesta expresada
en la resonancia de plasmones superficiales.
3. Las etiquetas de cuatro frascos (A, B, C, y D) de conjugados
de hapteno y portador se perdieron accidentalmente. Sin em-
bargo, se sabía que cada frasco contenía 1) hapteno 1-porta-
Preguntas de estudio dor 1 (H1-C1), 2) hapteno 1-portador 2 (H1-C2), 3) hapteno
PREGUNTA DE ENFOQUE CLÍNICO El análisis de citometría de 2-portador 1 (H2-C1) o 4) hapteno 2-portador 2 (H2-C2). El
flujo para la detección y medición de subpoblaciones de leucoci- portador 1 tiene peso molecular de 60 000 Da y el portador 2
tos, inclusive los de la leucemia, suele realizarse mediante el uso uno mayor de 120 000 Da. Suponga que tiene un anticuerpo
de anticuerpos monoclonales. ¿Por qué es esto necesario? anti-H1 y un anticuerpo anti-H2, y un marcador con peso mo-
lecular de 100 000 Da. Utilice Western blotting para determi-
1. Indique si cada una de las afirmaciones siguientes es verdade-
nar el contenido de cada frasco y muestre los Western blots que
ra o falsa. Si piensa que una afirmación es falsa, explique por
cabría esperar de 1, 2, 3 y 4. Su respuesta también debe indicar
qué.
qué anticuerpo o combinación de anticuerpos se usó para ob-
a. La inmunofluorescencia indirecta es una técnica más sensi- tener cada blot (mancha).
ble que la inmunofluorescencia directa.
4. Indique con cuál de las pruebas siguientes es posible determi-
b. Casi todos los antígenos inducen una respuesta policlonal.
nar la concentración de una cantidad pequeña (250 ng/ml) de
c. Los anticuerpos anti-SRBC digeridos con papaína pueden
hapteno: a) ELISA (cromógena), b) método de Ouchterlony,
aglutinar glóbulos rojos de oveja (SRBC, sheep red blood
c) RIA, d) microscopia de fluorescencia, e) citometría de flujo,
cells).
f) inmunoprecipitación, g) microscopia inmunoelectrónica, h)
d. Los anticuerpos anti-SRBC digeridos con pepsina pueden
ELISPOT, i) ELISA quimioluminiscente.
aglutinar SRBC.
e. La inmunofluorescencia indirecta puede efectuarse usan- 5. El lector tiene una proteína de mieloma, X, cuyo isotipo se des-
do un fragmento Fab como el anticuerpo primario no conoce, y varias otras proteínas de mieloma de todos los isoti-
marcado. pos conocidos (p. ej., IgG, IgM, IgA e IgE.)

a. ¿Cómo produciría anticuerpos específicos de isotipo que a. ¿Cuál es el valor de K0 para cada antisuero?
pudieran utilizarse para determinar el isotipo de proteína b. ¿Cuál es la valencia de cada anticuerpo?
de mieloma, X? c. ¿Cuál de los antisueros podría ser un anticuerpo mono-
b. ¿Cómo podría emplear este anticuerpo antiisotipo para clonal?
medir la concentración de proteína de mieloma X en suero d. ¿Cuál de los antisueros usaría para su valoración? ¿Por
normal? qué?
6. Para cada antígeno o anticuerpo que se menciona en seguida, 10. Al preparar una demostración para su clase de inmunología,
indique un método de valoración apropiado y los reactivos una instructora purificó anticuerpos de IgG contra glóbulos
necesarios para la prueba. Tenga presente la sensibilidad de la rojos de oveja (SRBC) y llevó a cabo la digestión de algunos de
prueba y la concentración esperada de cada proteína. los anticuerpos en fragmentos Fab, Fc y F(ab)2. Colocó cada
preparado en un tubo distinto, marcó los tubos con un mar-
a. IgG en suero
cador hidrosoluble y los dejó en una cubeta con hielo. Cuando
b. Insulina en suero
la instructora volvió para su clase descubrió que las etiquetas
c. IgE en suero
se habían manchado y no eran legibles. Determinada a salvar
d. Componente C3 del complemento en membrana basal glo-
la demostración, marcó de nuevo los tubos 1, 2, 3 y 4, y prosi-
merular
guió. Con base en los resultados de la prueba que se describen
e. Anticuerpos anti-A contra antígeno de grupo sanguíneo A
a continuación, indique qué preparado contenía cada tubo y
en suero
explique cómo se identificó el contenido.
f. Contaminación de una hamburguesa con carne de caballo
g. Espiroqueta de sífilis en frotis de un chancro a. El preparado del tubo 1 aglutinó SRBC, pero no los lisó en
presencia de complemento.
7. ¿Cuáles de los siguientes no participan en la formación de com-
b. El preparado del tubo 2 no aglutinó SRBC, ni los lisó en
plejos antígeno-anticuerpo?
presencia de complemento. Sin embargo, cuando este pre-
a. Enlaces hidrófobos parado se añadió a SRBC antes de la adición de anti-SRBC
b. Enlaces covalentes completo, previno la aglutinación de las células por el anti-
c. Interacciones electrostáticas suero anti-SRBC completo.
d. Enlaces de hidrógeno c. El preparado del tubo 3 aglutinó SRBC y también lisó las
e. Fuerzas de van der Waals células en presencia de complemento.
d. El preparado del tubo 4 no aglutinó ni lisó SRBC y no inhi-
8. Explique la diferencia entre afinidad de anticuerpo y avidez de bió la aglutinación de SRBC por antisuero anti-SRBC com-
anticuerpo. ¿Cuál de estas propiedades de un anticuerpo indica pleto.
mejor su capacidad de contribuir a la inmunorreacción humo-
ral contra bacterias invasoras? 11. Considere la ecuación 1 y deduzca la forma de la ecuación de
Scatchard que aparece en la ecuación 2.
9. El lector desea desarrollar un inmunoensayo sensible para una
hormona que se presenta en la sangre a concentraciones de casi 1. S L SL
107 M. Se le ofrece una elección de tres antisueros diferentes 2. B/F Ka ([S]t B)
cuyas afinidades por la hormona se determinaron mediante donde S sitios de unión de anticuerpo; [S] concentra-
diálisis de equilibrio. Los resultados se muestran en las gráficas ción molar de sitios de unión de anticuerpo; L ligando (an-
de Scatchard. tígeno monovalente); [L] concentración molar de ligando;
SL complejo de sitio y ligando; [SL] = concentración molar
del complejo de sitio y ligando; B sustituye a [SL] y F a [L].
Sugerencia: sería útil comenzar escribiendo la ley de acción de
3 masa para la reacción que se muestra en la ecuación 1.
r/c × 105 ( ) ( )
60
r/c × 104 ( )
12. El lector toma un trabajo de verano en un laboratorio clínico

40
para ayudarse a pagar sus estudios. Ordena un estuche para
1 2 detectar anticuerpos contra hantavirus en suero por medio de
20
ELISA indirecto, pero cuando llega usted advierte que no tiene
instrucciones, sólo botellas rotuladas “reactivo A”, “reactivo B”,
1 2 etc. Es posible que varios pacientes se hayan expuesto a hanta-
r virus, y usted necesita usar el estuche para demostrarlo.
Para uso con la pregunta 12
Nulo − Testigo + Testigo 1:1 1:10 1:100 1:1 000 1:10 000 1:100 000
0.001 0.103 0.857 P1 1.002 0.562 0.352 0.202 0.096 0.005
0.006 0.056 0.952 P2 0.002 0.005 0.008 0.002 0.004 0.001
0.005 0.096 0.903 P3 0.568 0.203 0.086 0.079 0.082 0.045

a. ¿Cuáles de las siguientes sustancias quizá se incluyan en el

estuche como reactivos necesarios para realizar el ensayo? Ligando DNP IC50 (M)
1. Antígeno soluble testigo positivo
2. Anticuerpo primario contra hantavirus O2N
3. Sustrato
4. Anticuerpo secundario marcado por enzima contra el NIP HO CH2CO- 2 105 (15)
primario
5. Anticuerpo secundario marcado por enzima contra el I
virus
O2N
6. Placas recubiertas de antígeno
b. Usando el estuche, usted obtiene resultados para el suero
NP HO CH2CO- 3 104 (1)
de tres pacientes (P1-P3 en el cuadro de la página anterior).
¿Cuáles son los títulos de los sueros de los pacientes? (Dé un
título para cada uno de los tres pacientes.) ¿Cuál o cuáles de O2N
estos pacientes se expusieron, en su caso?
mNP CH2CO- 3 104 (1)
13. El investigador para el que usted trabaja acaba de descubrir un
nuevo receptor que se piensa es importante en el desarrollo de
la enfermedad de Alzheimer. Otros miembros del personal del pNP O2N CH2CO- 6 103 (0.05)
laboratorio han clonado el receptor y han transfectado el gen
en una línea celular para estudio ulterior. La tarea de usted es
clasificar las células transfectadas para eliminar las que no ex- HP HO CH2CO- Sin inhibición
presan el gen, y seleccionar una población de las que lo expre-
san en alto grado. Usted dispone de un anticuerpo de conejo
contra el receptor, un anticuerpo murino testigo que se une
a las células transfectadas, anticuerpos antimurinos de cabra
conjugados con fluoresceína, y anticuerpos anticonejo de siempre tendrá la máxima afinidad por NP comparado con
burro conjugados con rodamina. otros haptenos afines a NP. Explique.
b. ¿Ocurrió cambio de clase en respuesta a la inmunización?
a. Describa cómo diseñaría el experimento de FACS. Explique su respuesta.
b. Trace un histograma FACS representativo para los resulta- c. ¿Cuáles dos procesos contribuyeron al resultado que se ilus-
dos esperados, donde el eje x muestre la concentración de tra en la gráfica b?
fluoresceína y el eje y la concentración de rodamina. Inclu- d. Las células B de los ratones QM analizadas en este estudio
ya en su histograma el sitio donde colocaría las compuertas expresaron cadenas ligeras . ¿Qué puede decir acerca de
para la separación de las células. los sucesos ocurridos en la etapa de célula pre-B de la dife-
renciación de linfocitos B que condujeron a la producción
14. ¿Cuál es la ventaja de usar un ELISPOT contra un ELISA en
de anticuerpo con cadenas ligeras ?
sándwich estándar? ¿Cuáles son las semejanzas y diferencias
e. ¿Tienen las células B que expresan la cadena pesada codifi-
entre estos dos ensayos?
cada por VH 17.2.25 y la cadena ligera 1 el mismo idiotipo
que las células B que expresan IgG con cadena pesada codi-
ANALICE LOS DATOS Kanayama y colaboradores (J. Immunolo-
ficada por VH 17.2.25 y la cadena ligera 2?
gy 169:6865, 2002) crearon un ratón transgénico (ratón QM)
cuyo principal receptor de célula B (presente en 80% de todas
las células B del ratón) estaba constituido por cadenas pesadas
codificadas por VH 17.2.25 y cadenas ligeras 1 o 2. El recep-
a) Respuesta anti-IgG contra b) Afinidad relativa de la
tor de antígeno era específico para el hapteno 4-hidroxi-3-ni- pNP con el tiempo respuesta de anticuerpo
trofenilacetilo (NP). Los investigadores estimaron la afinidad anti-pNP con el tiempo
relativa de esas células B hacia otros haptenos relacionados con
Afinidad relativa (pNP4/pNP20)
Concentración relativa de IgG
NP usando los ensayos de inhibición competitiva (IC50 = con-

1.0 1.0
centración necesaria para competir por 50% de la unión a NP = experimentos = experimentos
(medida por ELISA)
radiomarcado) que se indican en el cuadro adjunto. También separados 0.8 separados

inmunizaron las almohadillas digitales de los ratones QM con
0.1 0.6
pNP-CGG (globulina de pollo) y luego obtuvieron sangre de
los ratones a diversos intervalos (véanse las gráficas más ade- 0.4
lante). Conteste las siguientes preguntas basándose en la infor-
mación presentada y en lo que ha aprendido en este libro. 0.2
a. Verdadero o falso: este idiotipo (receptor de antígeno) es 0.01 0.0

0 8 16 8 16
específico para el hapteno NP; por tanto, el receptor de Ig Día Día

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capítulo 6

L a interacción antígeno-anticuerpo es una rela-

incluye varias interacciones no covalentes entre el determinante

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 145 4/29/07 9:09:18 AM

Constantes de velocidad hacia la derecha y hacia la izquierda (k1 y k–1) y constantes

Anti-DNP -DNP-L-lisina 8 107 1 1 108 1 108

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 146 4/29/07 9:09:20 AM

Estado inicial Equilibrio

Experimental: anticuerpo en A Experimental

Estado inicial Equilibrio 2 4 6 8

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 147 4/29/07 9:09:21 AM

a) Anticuerpo homogéneo b) Anticuerpo heterogéneo

1.0 Abscisa al origen = n 1.0 Abscisa al origen = n

2.0 1.0 2.0

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 148 4/29/07 9:09:21 AM

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 149 4/29/07 9:09:22 AM

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 150 4/29/07 9:09:23 AM

a) Ab1 y Ab2 se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno

Se agrega Se agrega Ab2

b) Ab1 y Ab2 se unen al mismo epítopo

Se agrega Se agrega Se agrega Se agrega

las reacciones antígeno-anticuerpo que producen un precipita-

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 151 4/29/07 9:09:23 AM

Reacción de precipitación en líquidos 20–200 Anticuerpo

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 152 4/29/07 9:09:24 AM

de anticuerpo inhibe las reacciones de precipitación, este exceso

Reacciones de aglutinación FIGURA 6-8 Demostración de hemaglutinación utilizando

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 153 4/29/07 9:09:24 AM

La aglutinación bacteriana se emplea

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 154 4/29/07 9:09:25 AM

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 155 4/29/07 9:09:26 AM

[125I]HBsAg unido a anti-HbsAg, %

ELISA indirecto ticuerpo inmovilizado. Después de lavar el foso, se agrega un

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 156 4/29/07 9:09:27 AM

Foso recubierto Añadir anticuerpo Añadir anticuerpo Añadir sustrato (S)

Foso recubierto Añadir antígeno Añadir anticuerpo Añadir sustrato

luminol  H O determinado o un antígeno contra el que se dispone de un an-

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 157 4/29/07 9:09:27 AM

Foso recubierto Western blotting

FIGURA 6-11 En la prueba ELISPOT, un foso se recubre con

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 158 4/29/07 9:09:28 AM

FIGURA 6-12 En la técnica de Western blotting, una mezcla

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 159 4/29/07 9:09:28 AM

Añadir anticuerpo Añadir anticuerpo Aplicar imán y

longitud de onda más larga que la fluoresceína, puede usarse

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 160 4/29/07 9:09:29 AM

Células con antígenos Anticuerpo primario

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 161 4/29/07 9:09:30 AM

anticuerpo fluorescente específico para un antígeno que se

según su desarrollo o estado fisiológico.

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 162 4/29/07 9:09:31 AM

EN F OQ U E C LÍ N I C O te y precisa para inmunofenotipiﬁcación

ALL del linaje pre-B

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 163 4/29/07 9:09:31 AM

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 164 4/29/07 9:09:32 AM

Bibliografía f. A fin de que la precipitación ocurra, tanto el antígeno como

06 MAQ. CAP. 06-KINDT.indd 165 4/29/07 9:09:33 AM

12. El lector toma un trabajo de verano en un laboratorio clínico

Anti-DNP -DNP-L-lisina 8 107 1 1 108 1 108

luminol H O determinado o un antígeno contra el que se dispone de un an-