EVALUACIÓN DE ALGUNAS CONDICIONES DE LA TRANSFORMACION

GENETICA DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) VARIEDAD WHITE

ALBATROSS UTILIZANDO Agrobacterium tumefaciens

ÁNGELA LORENA GARCIA PRIETO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA

BOGOTA ENERO DE 2007

 EVALUACIÓN DE ALGUNAS CONDICIONES DE LA TRANSFORMACION
GENETICA DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) VARIEDAD WHITE
ALBATROSS UTILIZANDO Agrobacterium tumefaciens

ÁNGELA LORENA GARCÍA PRIETO

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al titulo de

BIOLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
Bogotá, D.C
Enero de 2007
 NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 : “La Universidad no se hace

responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis.
Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y
por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
 EVALUACIÓN DE ALGUNAS CONDICIONES DE LA TRANSFORMACION
GENETICA DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) VARIEDAD WHITE
ALBATROSS UTILIZANDO Agrobacterium tumefaciens

ÁNGELA LORENA GARCIA PRIETO

APROBADO

--------------------------------------------
Director. Andrea Forero Ruiz. Bsc

------------------------------------------- -------------------------------------------
Ivonne Balzer Ph.D Ingrid Schuler García Ph.D
 EVALUACIÓN DE ALGUNAS CONDICIONES DE LA TRANSFORMACION
GENETICA DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) VARIEDAD WHITE
ALBATROSS UTILIZANDO Agrobacterium tumefaciens

ÁNGELA LORENA GARCÍA PRIETO

APROBADO

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Dra. Ángela Umaña M.Phill Dra. Andrea Forero Bsc.
Decana Académica Directora de Carrera
 AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a la Dra. Elizabeth Hodson por permitirme desarrollar este

trabajo dentro del proyecto Crisantemo. A la profesora Andrea Forero por sus
múltiples enseñanzas, comprensión y apoyo incondicional durante la realización
de este trabajo. A la Dra. Ingrid Schuler y demás profesores de la Unidad de
Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana por la confianza
depositada y sus oportunos consejos y sugerencias. A mis padres por su
paciencia y su infinito amor, a mi hermana por su gran compañía, a mi amiga
Gina Solano por su colaboración y apoyo moral y al resto de mis amigos y
demás personas que de una u otra forma me acompañaron durante la
elaboración de este trabajo.
 TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN 1
1. INTRODUCCION 2
2. REVISION DE LITERATURA 3
2.1. Taxonomía y Botánica 3
A. Familia Asteraceae 3
B. Especie 4
C. Posición taxonómica 5
2.2. Importancia económica 5
2.2.1. Cultivo y propagación 6
2.2.2. Problemas agronómicos . 8
2.2.3. Factores atmosféricos y fisiológicos limitantes 11
2.2.4. Manejo agronómico 12
2.3. Investigaciones en Crisantemo 13
2.4. Transformación genética 15
2.4.1. Transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens 16
A. Plásmido inductor de tumores 16
B. Proceso de infección 18
2.4.2. Manipulación genética con Agrobacterium tumefaciens 30
A. Genes quiméricos 31
B. Promotores de transcripción 32
C. Genes marcadores 32
D. Gen inhibidor de la poligalacturonasa 35
E. Expresión de los genes transferidos 36
2. 5. Regeneración de tejidos 38
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 41
3.1. Formulación del problema y justificación 42
3.2. Pregunta de investigación 42
4. OBJETIVOS 43
4.1. Objetivo general 43
4.2. Objetivos específicos 43
5. MATERIALES Y METODOS 44
5.1. Población de estudio y muestra 44
5.2. Establecimiento y multiplicación del material vegetal in Vitro 44
5.3. Transformación, cultivo y mantenimiento de las bacterias 45
5.4. Pruebas preliminares a la infección 47
5.4.1. Susceptibilidad de Agrobacterium tumefaciens al antibiótico 47
5.4.2. Susceptibilidad del tejido vegetal al glufosinato de amonio 48
5.5. Infección de discos de hoja de Dendranthema grandiflora vía Agrobacterium
tumefaciens 48
5.5.1. Diseño experimental 48
5.5.2. Infección y regeneración de discos de hoja 49
A. Protocolo infección 50
B. Inducción de Masas Proembrionicas y germinación de embriones 50
5.6. Detección de la transferencia y expresión de los genes marcadores 51
5.6.1. Detección de la transferencia del gen IPG 51
5.6.2. Detección de la expresión del gen β – gus 52
5.7. Recolección de información 52
5.8. Análisis de la información 53
6. RESULTADOS 54
6.1. Pruebas preliminares a la infección 54
6.1.1 Susceptibilidad de Agrobacterium tumefaciens al antibiótico 54
6.1.2 Susceptibilidad del tejido vegetal al glufosinato de amonio 54
6.2. Efecto del proceso de infección en la regeneración de los discos de hoja
Dendranthema grandiflora 56
6.2.1. Efecto de la dilución bacteriana y la cepa en la regeneración de los
discos de hoja de Dendranthema grandiflora 60
6.2.2. Efecto de la cepa bacteriana en la regeneración de los discos de
hoja de Dendranthema grandiflora. 61
6.2.3 Detección de la expresión del gen β-gus en discos de hoja de
 Dendranthema grandiflora 61
6.2.3. Efecto de la cepa y de la dilución bacteriana en la frecuencia de
inserción del transgen 62
7. DISCUSIÓN 64
7.1 Efecto del antibiótico en el control de Agrobacterium tumefaciens
y su posible efecto en la regeneración 64

7.2. Susceptibilidad del tejido vegetal al glufosinato de amonio 67

7.3. Efecto del proceso de infección en la regeneración de los discos
de hoja de Dendranthema grandiflora. 67
7.4. Efecto de la dilución bacteriana y la cepa en la regeneración de los
discos de hoja de Dendranthema grandiflora 69
7.5. Expresión del β-gus en discos de hoja y tejidos regenerados 71
7.6. Efecto de la cepa y la dilución bacteriana en la frecuencia de inserción
del transgen 73
8. CONCLUSIONES
9. RECOMENDACIONES
10. REFERENCIAS
11. ANEXOS
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Concentraciones requeridas por el tejido foliar adulto y concentraciones

críticas

Tabla 2. Principales hongos que atacan al crisantemo.

Tabla 3. Principales plagas que atacan al crisantemo.

Tabla 4. Genes que transportan los plásmidos Ti nopalinicos y octopinicos

(silvestres) y sus funciones en la planta y la bacteria.

Tabla 5. Genes marcadores utilizados en los sistemas de transformación.

Tabla 6. Variables y tratamientos para la transformación de discos de hoga de

Agrobacterium tumefaciens

Tabla 7. Frecuencias de regeneración de discos de hoja de Dendranthema

grandiflora

Tabla 8. Frecuencias de inserción después de la comprobación por PCR

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de los plásmidos Ti Nopalínicos y octopínicos silvestres

Figura 2. Modelo hipotético de la transferencia del T-DNA desde la célula

bacteriana a la célula vegetal

Figura 3. Arquitectura del aparato secretor tipo IV

Figura 4. Modelo de reparación de corte de doble cadena DSBR

Figura 5. Modelo de reparación de cadena sencilla o SSGR

Figura 6. Modelo dependiente de microhomologías

Figura 7. Plásmido PSCP2 x L1PSCP2

Figura 8. Plásmido p CAMBIA1301

Figura 9. Explantes de la prueba de glufosinato

Figura 10. Estructuras embriogénicas producidas en el tejido regenerado.

Figura 11. Discos de hoja de Dendranthema grandiflora en medio MS de

regeneración.

Figura 12. Plantas regeneradas de los explantes infectados.

Figura 13. Efecto del proceso de infección en la regeneración de los tejidos.

Figura 14. Efecto de la cepa en la regeneración de los discos de hoja de

Dendranthema grandiflora..

Figura 15. Patrones de expresión diferencial del gen gus en tejidos de

Dendranthema grandiflora

Figura 16. detección por PCR de la secuencia de 407 pb correspondiente al gen

pgip.
 RESUMEN

El trabajo realizado se encuentra enmarcado dentro del proyecto: Transformación

genetica de variedades colombianas de Crisantemo (Dendranthema grandiflora)
empleando Agrobacterium tumefaciens (Hodson et al. 2003-20006). Esta
investigación constituye una primera aproximación a la transformación genética de
variedades de Crisantemo de libre uso cultivadas en Colombia. Con el objetivo de
evaluar algunas condiciones implicadas en el proceso de transformación medidada
por Agrobacterium tumefaciens explantes de la variedad White fueron infectados
con las cepas de A. tumefaciens EHA105 XL1pSCP2, PGV2260 XL1pSCP2 y
PGV2260 pCAMBIA 1301 y dos diluciones bacterianas 1:20 y 1:50. El plásmido
XL1pSCP2 portaba el gen inhibidor de poligalacturonasas pgip aislado de la planta
de kiwi (Actinidia deliciosa) de cuya expresion se deriva una mayor tolerancia al
ataque de hongos y el gen de selección bar, el plásmido pCAMBIA llevaba también
el gen pgip y el gen reportero β-gus. Los explantes infectados, fueron sembrados en
medio MS de regeneración con los reguladores de crecimiento BAP 0.23 mg/L, AIA
2 mg/L y 2,4 –D 1 mg/L para inducir procesos de embriogénesis somática. Una vez
obtenidas las masas proembrionicas de los explantes infectados, estas fueron
transferidas a medio MS sin 2,4-D con el fin de permitir la maduración y la
germinación de los embriones. De los explantes infectados con la cepa PGV2260
pCAMBIA se obtuvo una mayor frecuencia de regeneración de plantas, mientras
que la mayor eficiencia de transformación registrada se obtuvo apartir de los tejidos
infectados con la cepa PGV2260 XL1pSCP2. Al infectar con la dilución 1:50 se
obtuvo un mayor porcentaje de regeneración, mientras que con la dilución 1:20 se
obtuvo una mayor pérdida del material por contaminación bacteriana. La expresión
del gen reportero β-gus fue evaluada por medio de tinciones histoquímicas,
encontrando expresion estable del transgen despues de 40 dias de la infección. Asi
mismo la inserción del trangen fue confirmada mediante una PCR, donde se produjo
la amplificacion de los fragmentos de 407 pb correspondientes al gen pgip. De lo
anterior se concluye que el protocolo de transformación establecido en este trabajo
empleando la cepa PGV2260 XL1PSCP2, permite obtener plantas de crisantemo
variedad white albatross con una inserción y expresión estable del transgen.
 1. INTRODUCCIÓN

La transformación genética de plantas dicotiledóneas usando Agrobacterium

tumefaciens ha sido ampliamente utilizada como una herramienta que permite el
mejoramiento genético de diferentes especies vegetales de importancia económica.
En el caso de especies ornamentales se ha logrado modificar el color, tamaño y
forma de las flores, así como la longevidad y la resistencia al ataque de agentes
patógenos, entre otras.
En crisantemo (Dendranthema grandiflora), especie ornamental de gran importancia
económica para Colombia, se han realizado diferentes estudios dentro de los cuales
se destacan los procesos de estandarización del sistema de propagación in vitro y la
transformación genética para la obtención de variedades con diferentes
características de trascendencia económica. Con el uso de las técnicas de
transformación ha sido posible obtener plantas con una mayor tolerancia a insectos
lepidópteros y al hongo Botrytis cinerea. En el presente estudio se evaluaron
algunas condiciones de infección con A. tumefaciens, que permitieron la
regeneración de plantas transformadas con el gen inhibidor de la poligalacturonasa
(pgip), el gen β-gus y el gen marcador bar, a partir de explantes de D. grandiflora
variedad White Albatros. Así mismo, se evaluó el proceso de regeneración de
plantas a partir de explantes infectados con Agrobacterium tumefaciens por medio
de la vía de embriogénesis somática. También se realizó la verificación molecular
de la inserción del gen marcador y del gen de interés en los tejidos vegetales
regenerados a partir de los explantes infectados.
Cabe mencionar que las construcciones génicas presentes en las diferentes cepas,
poseen el gen marcador bar, el gen inhibidor de la poligalacturonasa de cuya
expresión se deriva la resistencia al ataque de hongos y el gen reportero β- gus.
Este estudio constituye una primera aproximación a la transformación genética de
variedades de D. grandiflora cultivadas en Colombia con genes de tolerancia a
enfermedades fúngicas, con el fin de proporcionar una alternativa para el manejo y
control de estos problemas agronómicos que causan pérdidas importantes al sector
floricultor del país.
 2. REVISIÓN DE LITERATURA

El crisantemo (Dendranthema grandiflora) es originario de China y Japón, lugares

donde ha sido cultivado por cerca de 200 años. Su nombre proviene del griego krus
anthemon cuyo significado es flor de oro y actualmente es la especie más cultivada
en el mundo después de la rosa. El crisantemo es considerado una flor sagrada en
Japón y en el siglo XVII su cultivo se realizaba siguiendo los principios del
confucionismo, así mismo además del uso ornamental que tiene en china existen
algunas variedades comestibles y con propiedades medicinales. El crisantemo fue
introducido en Europa a través de Francia en el último tercio del siglo XVIII y las
variedades actualmente cultivadas son híbridos complejos de especies en su
mayoría originarias de china. (Texeira da Silva, 2003).

2.1. TAXONOMÍA Y BOTANICA

A. Familia Asteraceae

Familia compuesta principalmente de hierbas, arbustos y en algunas ocasiones

árboles y enredaderas. Son plantas productoras de resinas, alcaloides y fenoles.
Son dioicas o diclino-monoicas. Las hojas son alternas u opuestas, frecuentemente
en rosetas basales, pecioladas y en ocasiones auriculadas en la base aunque
también pueden ser opuestas y verticiladas, simples y enteras o dentadas y algunas
veces compuestas o diversamente divididas; estípulas ausentes.
Inflorescencia primaria indefinida, en capítulo o antodio, formado por muchas o
pocas flores, que se insertan en un receptáculo común convexo, plano o cóncavo,
desnudo o piloso, o cubierto de brácteas que protegen las flores. Flores pequeñas,
perfectas, en su mayoría entomófilas, pueden ser epiginas, simpétalas, o algunas
de ellas pistiladas o neutras o funcionalmente estaminadas, las perfectas y
funcionalmente estaminadas con un mecanismo de presentación del polen
especializado, las anteras connadas (o conniventes) en un tubo, el polen es liberado
al interior del tubo de las anteras y empujado hacia afuera por el crecimiento del
estilo; cabezuelas diversamente radiadas, discoidales, disciformes o liguladas, de
acuerdo con el tipo y disposición de las flores.
Cáliz ausente o rudimentario formando un característico vilano o papo en la cima del
ovario y fruto, o algunas veces ausente; vilano diversamente de 1-2 a muchas
escamas, aristas, o cerdas capilares o plumosas, o algunas veces escamas
connadas formando una corona, las piezas del vilano algunas veces en más de una
serie y de más de un tipo. Corola gamopétala. Androceo con tantos estambres como
lóbulos de la corola; filamentos insertos al tubo de la corola, alternos con los lóbulos,
libres o rara vez connados, anteras casi siempre provistas con un apéndice corto
apical, obtuso o a menudo sagitado en la base. Ovario ínfero, bicarpelar, unilocular,
con un solo óvulo basal. Estilo simple, largo, generalmente dividido en dos ramas
lineales o lanceoladas, que llevan papilas estigmáticas interiormente y pelos
colectores exteriormente. Fruto aquenio, ocasionalmente envuelto por una bráctea
involucral, o por todo el involucro. Semillas oleaginosas. La Familia cuenta con 1100
géneros y cera de 20000 especies. El género más numeroso es Senecio (1500),
luego viene en orden decreciente Vernonia (900), Hieracium (800), Eupatorium
(600), Centaurea (600), Coussinia (600), Cynareae, Helichrysum (500), Bacharis
(400,Astereae) y Artemisia(400). Es una familia cosmopolita, pero mejor
representadas en las regiones templadas y subtropicales que no están densamente
forestadas. (Gentry, 1993)

B. Especie Dendranthema grandiflora

Presenta hojas lobuladas o dentadas, ligulosas o rugosas de color variable entre el

verde claro y oscuro, pubescentes y aromáticas. La inflorescencia es en capitulo
formada por dos tipos de flores: Femeninas que son las radiales y hermafroditas que
son las concéntricas. El receptáculo es plano o convexo y esta rodeado de una
envoltura de brácteas. (Texeira da Silva, 2003)
C. Clasificación Taxonómica

Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Tribu: Anthemideae
Genero: Dendranthema
Especie: Dendranthema grandiflora

2.2. IMPORTANCIA ECONOMICA

El crisantemo es una de las especies ornamentales más cultivadas en el mundo y

su producción se encuentra fuertemente tecnificada en varios países europeos y
americanos siendo los principales productores Holanda, Inglaterra, Estados Unidos
y Colombia. Debido a que esta flor presenta gran demanda a nivel mundial, se han
realizado trabajos de mejoramiento genético con el fin de obtener un gran número
de variedades que satisfagan las necesidades del mercado. Gracias a esta gran
disponibilidad de variedades, el crisantemo ahora es vendido durante todo el año
como flor cortada o como flor en maceta.
Por otra parte, el sector floricultor Colombiano cuenta con aproximadamente 6.500
ha cultivadas para la producción de flores, de las cuales cerca del 98% se exporta,
situando al país como el segundo exportador a nivel mundial después de Holanda.
En Colombia dentro de las tres especies ornamentales más importantes por su nivel
de exportación, se encuentran en primer lugar el clavel seguido de la rosa y por
último el crisantemo. (Asocolflores, 2005)
Esta producción en el país ocupa cerca de 579 ha. Para el 2004 según datos de
Proexport se exportaron 3.500 toneladas de flores frescas de esta especie, lo que le
representó una ganancia de cerca de US$ 9.500.000. Los departamentos de
Antioquia y Cundinamarca concentran el mayor número de empresas productoras
de crisantemo, seguido por los departamentos del Cauca y Valle del Cauca.
(Proexport, 2005)

2.2.1. Cultivo y Propagación

El crisantemo presenta una serie de requerimientos climáticos y nutricionales para la

producción de flores de excelente calidad, como se describe a continuación.

-Luminosidad: Necesita 14 horas diarias de luz en promedio, ya que prolongados

períodos de oscuridad producen flores pequeñas y de tallos delgados. Sin embargo,
el fotoperíodo varía dependiendo de la variedad y de las necesidades del cultivador
para obtener la floración, ya que se ha establecido que con más de 15 horas diarias
de luz los crisantemos siguen en la fase vegetativa y por consiguiente con menos de
14 horas de luz se da inicio a la floración. (Arbos, 1992)
- Temperatura: Los requerimientos de temperatura también dependen de la
variedad cultivada, sin embargo, se acostumbra a que la temperatura en el día sea
de máximo 16°C y en las noches mínimo de 11°C. Muchas variedades pueden
requerir de un periodo de temperatura entre los 5°C y los 10°C para inducir la
floración, incluso si se les somete a un periodo de iluminación correspondiente al día
largo. Así mismo en la mayoría de las variedades temperaturas superiores a 16°C
retrasan la floración. (Arbos, 1992)
-Humedad relativa: Este factor es de gran importancia durante la fase vegetativa
de los crisantemos por tal razón se debe mantener entre el 65 y 75%, ya que si se
encuentra por debajo de este rango los tallos pueden quedarse cortos y retrasarse
la floración. Sin embargo, cuando empieza la aparición de los botones florales y se
inicia el proceso de pigmentación floral, se recomienda la disminución de la
humedad relativa para prevenir la aparición de hongos. (Arbos, 1992)
- Suelos y sustratos: Para lograr una buena calidad de flores, el suelo debe ser
poroso con una alta retención de humedad, inerte biológicamente, con buen
drenaje, buena capilaridad, alto contenido de materia orgánica y con un pH entre 6 y
7. (Arbos, 1992)
En la tabla 1 se especifican los requerimientos nutricionales para el crisantemo en el
tejido foliar adulto como la concertación critica de los mismos, siendo ésta la mínima
requerida por la planta para su supervivencia.

Tabla 1. Concentraciones requeridas por el tejido foliar adulto y concentraciones críticas

ELEMENTO CONCENTRACIÓN TEJIDO CONCENTRACIÓN CRITICA
MINERAL FOLIAR VEGETAL ADULTO (PPM) DE TEJIDO VEGETAL (PPM)
Nitrógeno 45000-60000 20000
Fósforo 4000-12000 2600
Potasio 35000-80000 27500
Calcio 15000-40000 4000
Magnesio 5000-15000 550
Azufre 3000-7500 2500
Hierro 100-300 35
Manganeso 50-300 4
Cobre 6-100 5
Cinc 15-200 7
Boro 30-100 20

Fuente: Arbos, 1992; Horts & Nelson, 1997.

La propagación vegetativa se lleva a cabo por medio de esquejes terminales de

aproximadamente 8 cm provenientes de plantas madres, las cuales han sido
cultivadas bajo condiciones de día largo para evitar la floración temprana. Estos
esquejes pueden colocarse directamente en medio para enraizamiento, proceso que
debe ir acompañado de fumigaciones para evitar la aparición de plagas. El
enraizamiento se realiza en invernaderos en bandejas de germinación o camas
según lo prefiera el floricultor; no obstante, el sustrato debe ser preferiblemente
poroso, siendo la turba o mezclas de esta con aserrín o cascarilla los más
frecuentemente utilizados. Así mismo debe ser previamente esterilizado. A este
sustrato generalmente se le adiciona un fertilizante de liberación controlada y calcio.
La temperatura óptima de enraizamiento debe mantenerse entre los 15°C y los 18°C
y el transplante puede hacerse a los 20 días después de haber sido colocados en el
medio de enraizamiento. El crisantemo requiere de grandes cantidades de agua por
lo que el suelo debe procurar mantenerse a su capacidad de campo y puede ser
regado por aspersión. (Arbos, 1992)
El crisantemo también puede propagarse por medio de semillas y haciendo uso de
las técnicas del cultivo in Vitro, siendo este método de gran utilidad cuando se
desean obtener nuevas variedades. El cultivo in vitro permite la obtención de plantas
homogéneas, un mayor numero de plantas que el obtenido por métodos
convencionales, el mantenimiento en espacios reducidos y en algunos casos la
posibilidad de producir nuevas variedades a partir de mutaciones inducidas. (Arbos,
1992)

2.2.2 Problemas Agronómicos

El crisantemo presenta una amplia susceptibilidad a enfermedades causadas por
diferentes agentes patógenos dentro de los que se encuentran insectos, bacterias,
hongos y virus los cuales encuentran las condiciones favorables para su
multiplicación en los invernaderos, a pesar de la tecnificación de los cultivos. Así
mismo, al ser esta una especie de exportación, muchos agentes causantes de
plagas y enfermedades se han dispersado en los continentes y al no existir
controladores biológicos naturales, el manejo de estos patógenos puede ser
dificultoso.
A continuación se hace un recuento de las principales enfermedades del
crisantemo, empezando por las causadas por bacterias, luego las producidas por
virus y en la tabla 2 se consignan las producidas por hongos.
- Erwinia chrysanthemi: esta bacteria es la causante de la enfermedad conocida
como tizón bacteriano y se desarrolla en ambientes con alta temperatura entre los
27-32°C y alta humedad relativa. Las hojas presentan la aparición de un color gris
seguido de marchitamiento. El tallo se debilita y aparecen lesiones por hidrólisis en
el tejido. (Arbos, 1992; Latorre, 1999)
- Agrobacterium tumefaciens: su presencia da lugar a la formación de tumores en
los tallos inmediatamente por debajo de la superficie del suelo y ocasionalmente en
las hojas. La presencia de estos tumores facilita la posterior colonización de hongos
lo que acelera el proceso de muerte celular de la planta. (Arbos, 1992)
-Pseudomonas cichorii: Produce la mancha foliar bacteriana en condiciones de
elevada humedad. Aparecen manchas circulares en las hojas que pueden crecer y
juntarse hasta destruirlas completamente. Las bacterias también pueden destruir los
pecíolos y los tallos y los botones florales mueren prematuramente. (Arbos, 1992)
-Virus de la aspermia del crisantemo o Chrysanthemum aspermy
cucumovirus: produce deformación de la inflorescencia, reducción en el tamaño de
las flores y cambios en el color de las mismas. Los síntomas no se presentan en
plantas de menos de un año pero después de este tiempo, empieza a hacer
presencia una serie de manchas foliares y reducción del crecimiento de las plantas.
(Arbos, 1992)
- Virus del mosaico del crisantemo o Chrysanthemum mosaic-b (Q) carlavirus
(CVB): Este virus es diseminado por pulgones y la sintomatología varía
dependiendo de la variedad que es infectada, las condiciones del cultivo y el estado
vegetativo de la planta; sin embargo, se presenta generalmente una caída de las
hojas y reducción del tamaño de la planta. (Arbos, 1992)

Tabla 2. Principales hongos que atacan el crisantemo

ENFERMEDAD HONGO PATÓGENO DAÑO CAUSADO
Botritis o podredumbre Botrytis cinerea Causa formación de
gris manchas grisáceas y
necróticas sobre las hojas
que se cubren de moho;
luego sigue con la
podredumbre de botones
florales, tallos y flores y por
último, el hongo coloniza la
base de la planta
contaminando esquejes y
formando una especie de
telaraña que cubre la planta.
Tizón del Brote Mycosphaerella ligulicola Su desarrollo se favorece en
condiciones de clima
húmedo y produce la
descomposición de los
botones florales y puede
infectar hasta el pedúnculo
Mancha foliar Septoria obesa Puede provenir de restos de
cosechas anteriores y se
disemina por el fluido del
agua. Causa la aparición de
puntos negros desde la base
de la planta hasta las hojas
 más superiores
Roya Puccinia chrysanthemi Produce pústulas
anaranjadas que aparecen
en los tallos y el envés de las
hojas .En la parte superior de
los foliolos aparecen
manchas cloróticas y en las
plantas senescentes
aparecen manchas negras
Roya blanca Puccinia horiana Presencia de moteados
cloróticos en el haz de las
hojas y pústulas
blanquecinas en el envés.
Necrosis foliar y defoliación
anticipada. Se favorece con
alta humedad ambiental
Oidio Erysiphe cichoracearum Presencia de un moho
blanco ceniciento sobre las
hojas y los tallos; finalmente,
los tejidos parasitados se
necrosan. Las conidias son
transportadas por el viento
Pudrición de la raíz Phytium spp. Se caracteriza por la
pudrición de la raíz o de la
parte basal del tallo en
condiciones de excesiva
humedad. El sistema
radicular se debilita
causando un atrofiamiento
en la planta y la aparición de
lesiones marrones en la base
del tallo por donde este
empieza a abrirse
Pudrición del tallo Rhizoctonia solani Enfermedad que también se
desarrolla en condiciones de
alta humedad y temperatura.
Las plantas presentan
marchitamiento en las horas
de más altas temperaturas y
el crecimiento es muy
limitado; los tallos se pudren
en la base de la planta
Verticilosis Vertillum dahliae Marchitez y clorosis de las
hojas basales. Necrosis del
tejido vascular. Se disemina
como microesclerocios por el
riego y por las labores
propias del cultivo
Fuente. Arbos, 1992 & Latorre 1999.
El crisantemo al ser cultivado en determinadas condiciones de temperatura y
humedad también favorece la aparición de ciertas plagas de insectos las cuales
están consignadas en la tabla 3.

Tabla 3. Principales plagas que atacan al crisantemo.

Orden Especie Nombre Daño causado
vulgar
Ortoptera Fornicula - Roen botones florales y tejidos jóvenes.
auriculata
Gryllotalpa Grillo real Se alimenta de las raíces de la planta.
vulgaris
Isanoptera Heliothrips - Las larvas forman galerías en hojas y
femoralis flores.
Trips tabaci - Causan manchas blanquecinas en hojas
y flores.
Homoptera Philoenus Cicadela Perfora lamina foliar y consume savia.
spumarius espumosa
Trialeurodes Mosca blanca Causa clorosis y retraso en la floración.
vaporiorum
Coleoptera Otiorrhynchus - Adultos se alimentan de hojas y las larvas
sulcatus de raíces
Cetonia aurata - Destruye estambres, pistilos y corola.
Lepidoptera Grapholita Tiña del La larva corta botones florales y excava
minutana crisantemo galerías a través del pedúnculo.
Pyrausta nubilalis - Larva forma galerías ascendentes en el
tallo.
Plussia gamma - Adulto masticador de follaje.
Agrotis ypsillon - Orugas devoran brotes y hojas.
Heteroptera Calocoris Chinche de Ataca botones florales y las flores
chenopodii tierra abiertas.
Diptera Diplosis - Larva causa tumores en tallos y raíces.
chrysanthemi
Diarthronomiza Mosquito de Agallas en botones terminales y tumores
hypogea las agallas en tallos y hojas.
Phytomiza Minador del Larva excava galerías en las hojas.
tricornis crisantemo
Lyriomiza trifolii Minador de Adultos se alimentan de las hojas y
crisantemo perforan las paredes para poner huevos.
Hymenoptera Melolontha Oruga blanca Devora raíces provocando
vulgaris marchitamiento
Fuente. Arbos, 1992 & Latorre 1999.

2.2.3. Factores atmosféricos y fisiológicos limitantes

El crisantemo al igual que cualquier planta cultivada esta sujeto a sufrir daños que
afectan su fenotipo y por consiguiente disminuyen su valor comercial. Por lo general
la aparición de este tipo de problemas se debe a una nutrición mineral
desequilibrada, a condiciones atmosféricas desfavorables o a errores en la
aplicación de diferentes tratamientos o en el manejo del cultivo como tal. (Arbos,
1992)
Los excesos de nitrógeno junto con los cambios bruscos de temperatura causan
pudrición en las flores, ya que las temperaturas diurnas elevadas activan y aceleran
la brotación mientras que el descenso de la temperatura en la noche lo detiene; por
otra parte, el exceso de nitrógeno aumenta la susceptibilidad a plagas,
enfermedades y fenómenos atmosféricos y produce una extensión en los periodos
vegetativos de las plantas. (Arbos, 1992)
Cuando se realizan riegos excesivos, aplicaciones de abono cuando ya no se es
necesario o hay precipitaciones considerables después de períodos de sequía,
ocurre una deformación de las flores y un reventón del capítulo floral. Excesos de
cal, deficiencias en oligoelementos, excesos de agua con la consiguiente pudrición
de las raíces, temperaturas demasiado bajas, poca luz y el exceso de fertilizantes,
producen la disminución de la clorofila generando coloraciones amarillentas. Las
plantas de crisantemo pueden sufrir quemaduras como consecuencia de la
utilización de productos fitotóxicos, el exceso de radiación solar o por la ocurrencia
de heladas. (Arbos, 1992)
El calor es uno de los principales factores que afectan el desarrollo de los cultivos
de crisantemo. La falta de calor causa pérdida de color, rotura de los botones y
retraso de la floración; un exceso de calor por su parte, disminuye el vigor de las
plantas así como crea microclimas propicios para el crecimiento y desarrollo de
plagas y enfermedades. (Arbos, 1992)

2.2.4. Manejo Agronómico

Para evitar pérdidas en los cultivos comerciales de crisantemo se han establecido

una serie de prácticas que pretenden tener un mejor control fitosanitario, así como la
obtención de flores de mejor calidad. Dentro de estas practicas se encuentran la
utilización de material vegetal sano, la desinfección de suelos ya sea por métodos
físicos (calor seco o desinfección al vapor) o químicos (aplicación de fungicidas,
bactericidas y otro agroquímicos), desinfección de los cultivos una vez se han
iniciado, como una medida preventiva y la rotación de los mismos. (Arbos, 1992)
Para el manejo de plagas y enfermedades se pueden utilizar mecanismos de control
biológico como la utilización de virus y bacterias que afecten determinados insectos
plaga como es el caso de los lepidópteros, así como el antagonismo producido por
ciertos hongos sobre hongos patógenos. También es conocido que ciertos insectos
y aracnidos pueden actuar como predadores o parásitos de otros insectos plaga.
(Arbos, 1992)

2.3. INVESTIGACIONES EN CRISANTEMO

El énfasis en las investigaciones en crisantemo ha sido dirigido a estudios de

regeneración hasta finales de los años 90; sin embargo, cuando se observó que el
crisantemo es susceptible a las infecciones por Agrobacterium tumefaciens los
estudios de transformación fueron priorizados frente a los de regeneración. (Texeira
Da Silva, 2003)
En cuanto a estudios de regeneración desde 1968 hasta el 2003 en los que se ha
trabajado con diferentes fuentes de explantes como segmentos nodales (Hill, 1968;
Bannier & Steponkus, 1976; Miyazaki et al. 1976; Miyazaki & Tashiro, 1978; Prasad
& Chatuverdi, 1988; Endo et al. 1990; Kaul et al. 1990; Lu et al. 1990; Rademarker &
de Jong, 1990; Bajaj et al.1992; Renou et al. 1993; De Oliveria et al. 1995; Fukai et
al. 1995; Rout et al. 1997; Fu et al. 1998; Kim et al. 1998; Takatsu et al.1998;
Annadana et al. 2000; Tanaka et al. 2000; Texeira Da Silva, 2003) , meristemos
apicales (Lazar & Cachita, 1982; Ahmed, 1986; Votruba & Kodytek, 1988), pedicelos
florales (Roest & Bokelmann, 1975; Fuji & Shimizu, 1990; Lemieux et al. 1990;
Ledger et al.1991; Renou et al. 1993; Mizutani & Tanaka, 1994; Kumar & Kumar,
1995; Tanaka et al. 1998), discos de hoja (Sutter & Langhans, 1981; Chen et al.
1985; Kueh et al.1985; Fukai et al. 1987; Rademarker & De Jong, 1990; May &
Trigiano, 1991; Shinoyama et al. 1997; Young et al. 1998; Lee et al. 1999; Jeong et
al. 2002; Kudo et al. 2002), embriones (Tanaka & Watanabe, 1972; Anderson et al.
1990) y yemas axilares (Dabin & Choiseg, 1983;) con diferentes combinaciones de
reguladores de crecimiento. Según los resultados obtenidos, en donde los
porcentajes de regeneración vistos como órganos obtenidos por explante van desde
0.01 hasta el 100%, se ha concluido que las respuestas de los tejidos en su mayoría
dependen de la variedad con la que se trabaja y que generalmente los segmentos
nodales presentan una mayor regeneración de brotes que los discos de hojas. (Gao
et al. 2001; Texeira da Silva, 2003)
En el Crisantemo se encuentran variedades con diferentes ploidías como resultado
del proceso natural de evolución, así como también de técnicas diseñadas para el
mejoramiento de las mismas. Dentro de estas técnicas se encuentran los
tratamientos con colchicina para duplicar la carga cromosómica y así obtener
plantas madre con una mayor fertilidad y la fluorofenilanelina que es usada
exitosamente en la reducción del número de cromosomas en las plantas. ( Texeira
da Silva, 2003)
El cultivo tradicional y ensayos de mutagénesis continúan siendo importantes en la
introducción de nuevos rasgos tales como un fotoperíodo modificado y diferentes
respuestas a la temperatura; la mutagéneis por medios físicos o químicos ha sido
utilizada en crisantemo para introducir variación genética. Estudios de diversidad
con RFLP en cpDNA se han llevado a cabo con el fin de diferenciar las poblaciones
del crisantemo silvestre (Fukai et al 2002). Así mismo se han utilizado otros
marcadores moleculares como RAPD y se han realizado análisis cladísticos y
citológicos para determinar relaciones de parentesco y establecer la sistemática del
grupo (Wolf, 1996). Por su parte, los estudios cromosómicos y con isoenzimas y
aloenzimas han permitido separar las especies de crisantemo y diferenciar las
variedades. (Fiebich & Henning, 1992; Suzuki et al. 2001)
La transformación genética via Agrobacterium tumefaciens ha sido una herramienta
utilizada para modificar determinadas características en diversas especies vegetales
y en las diferentes variedades de crisantemo. Uno de los trabajos realizados en
transformación es el de Takatsu et al. (1999) en el cual se realizó la transformación
mediada por A. tumefaciens de una variedad de crisantemo tipo spray con las
cepas C58 y MP90, las cuales portaban el gen de la quitinasa del arroz rcc2 cuya
expresión permite un incremento en la resistencia al ataque del hongo Botrytis
cinerea. Se obtuvieron 11 líneas transgenicas con la expresión del gen; no obstante
los niveles de resistencia variaban entre las líneas obtenidas; la detección de la
producción de la proteína RCC2 se realizo con pruebas ELISA.
Sherman et al. (1998) desarrollo un protocolo de transformación y regeneración de
las variedades Polaris, Hekla e Iridon de Crisantemo. El protocolo de regeneración
consistió en la inducción de embriones somáticos en medio MS de regeneración con
altas concentraciones de 2,4-D (0, 0.25, 0.5, 0.75 y 1.0 mg/L) y como fuente de
explantes discos de hoja; la inducción de la germinación de los embriones se llevó a
cabo en medio MS sin 2,4-D y la elongación de las plántulas se realizó en medio
con acido giberelico y altas concentraciones de citokininas. La transformación fue
realizada posteriormente con las plantas regeneradas utilizando la cepa EHA105
que llevaba el plasmado pBII21 con el gen nptII y β- gus. La confirmación de la
transformación se realizo por medio de tinciones histoquímicas y análisis por
southern.
En otros trabajos se ha logrado que otras plantas expresen los genes de la chalcone
sintetasa y una proteína anticongelamiento de Antirrhinum majus (Dolgov et al.
1997). Se ha modificado el crecimiento y la forma por la introducción del gen b1 del
fitocromo de tabaco (Zheng et al. 2001). Se cuenta con una variedad resistente al
ataque de lepidópteros al expresar la proteína Cry1 de Bacillus thuringensis.
(Dolgov et al. 1997) y solo pocos estudios existen en cuanto a resistencia del
crisantemo a virus y tiroides (Ishida et al. 2002; Toguri et al. 2003)

2.4. TRANSFORMACIÓN GENETICA

Una planta transformada genéticamente es aquella a la que se la ha introducido un

fragmento de DNA foráneo a su genoma el cual al ser expresado le confiere una
característica que antes no poseía.
Existen diferentes métodos para la introducción del DNA de interés a las células, los
cuales pueden ser pasivos al cambiar transitoriamente la permeabilidad de la
membrana celular o activos en donde se introduce el DNA directamente. Algunos de
estos mecanismos de transformación son el bombardeo de partículas, la
electroporación y los liposomas. Sin embargo Agrobacterium tumefaciens, una
bacteria gram negativa del suelo, realiza la transformación en condiciones naturales;
esta transformación al ser un mecanismo de transferencia de genes indirecto y
natural proporciona una mayor estabilidad en la integración y expresión del
transgen. (Lewin, 2001)
Agrobacterium tumefaciens en condiciones naturales infecta a las plantas que
presenten heridas, produciendo lesiones tumorales conocidas como la enfermedad
de agalla de corona. Para que la transformación se lleve a cabo se hacen
necesarios tres componentes genéticos, dos de los cuales se encuentran en el
plasmido Ti y uno se encuentra en el cromosoma bacteriano. Los componentes
encontrados en el plasmido Ti son la región vir y el T-DNA; en el cromosoma
bacteriano se encuentran los tres loci de virulencia chvA, chvB y pscA. En el
proceso de infección la bacteria transfiere una porción del plasmido Ti (inductor de
tumores) conocida como T-DNA al genoma de las células vegetales; la
transferencia, integración y expresión de los genes del T-DNA (oncogenes) hace
que las células transformadas se dividan y proliferen sin control y se formen los
tumores. (Azcon-Bieto, 2001)

2.4.1. Transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens

A. Plasmido inductor de tumores

El principio inductor de la producción de tumores reside en el plasmido Ti (inductor
de tumores), el cual es un replicón independiente dentro de la bacteria. Este
plasmido de doble cadena transporta genes que participan en diversas actividades
de la planta, incluyendo las necesarias para el proceso de transformación y para la
síntesis de opinas, derivados del aminoácido arginina que las bacterias utilizan
como fuente de carbono y nitrógeno y no son producidos por la planta. (Lewin,
2001).
El plásmido silvestre de Agrobacterium tumefaciens posee los genes para la
síntesis de Octopina de 194Kb o Nopalina de 213Kb, además de la región del T-
DNA y la región vir. Aunque estos plásmidos son similares también poseen regiones
no homólogas (Figura 1).
En la tabla 4 se resume el gen que se encuentra dentro del plásmido con su
respectiva función.
Figura.1. Estructura de plásmidos Ti nopalínicos y octapínicos.

Tabla 4. Genes que transportan los plásmidos Ti nopalínicos y octopínicos

(silvestres) y sus funciones en la planta y en la bacteria.

LOCUS FUNCIÓN PLASMIDO

TI
vir Transferencia del DNA dentro de la planta Nopalina y
Octopina
shi Inducción de brotes Nopalina y
Octopina
roi Inducción de raíces Nopalina y
Octopina
nos Síntesis de nopalina Nopalina
noc Catabolismo de la nopalina Nopalina
ocs Síntesis de octopina Octopina
occ Catabolismo de la octopina Octopina
tra Genes de transferencia bacteriano Nopalina y
Octopina
inc Genes de incompatibilidad Nopalina y
Octopina
oriV Origen para la replicación Nopalina y
Octopina
Fuente: Lewin, 2001
La región vir es la encargada de la transferencia del T-DNA del plasmido bacteriano
a las plantas, tiene una longitud de 40 kb y cuenta con 6 loci virA-G que requieren
ser activados por los compuestos fenólicos producidos por la planta herida. Los
fenoles más conocidos son la acetosiringona y la alfa-hidroxiacetosiringona, aunque
también se han identificado compuestos como las hidroxicianidas y monosacáridos
como la D-xylosa, D-galactosa y la D-glucosa que actúan sinergicamente con los
compuestos fenólicos para incrementar la activación de los genes vir. Por otro lado
cabe mencionar que la naturaleza química de los fenoles activadores de la región vir
varía dependiendo de la planta hospedera. (Forero, 1999; Lewin, 2001; Azcon-
Bieto, 2001; Joubert et al. 2002).
El T-DNA es la región del plásmido Ti que contiene los genes que van a ser
transferidos al genoma de las células vegetales y posee las cajas TATA y CAT,
propias de genomas eucariotas lo que permite que estos genes sean transcritos por
la maquinaria de la célula vegetal. (Grierson, 1991)
El tamaño de los plásmidos sin manipulación, generalmente es entre 10 y 30 Kb, así
que representa menos del 10% del plásmido en general. El T-DNA se encuentra
delimitado por dos secuencias homologas de 25 pb cada una, que conforman el
borde derecho y el borde izquierdo de la región del T-DNA. Estas secuencias
delimitan el T-DNA ya que son el blanco del complejo de endonucleasas borde-
especificas VirD1/VirD2, las cuales cortan el T-DNA del resto del plasmido Ti
(Gelvin, 2003).

B. Proceso de infección

- Reconocimiento de Agrobacterium tumefaciens por la planta.

Como primer paso para la transferencia del T-DNA, Agrobacterium tumefaciens se

debe adherir a la superficie de las células vegetales de la planta herida. En esta fase
la bacteria reconoce una serie de señales químicas emitidas por la planta como la
presencia de compuestos fenólicos y monosacáridos, así como condiciones de
bajos niveles de fosfato y de pH ácido. (Joubert et al. 2002)
Por otra parte, Agrobacterium tumefaciens posee ciertos carbohidratos de superficie
como lipopolisacáridos, polisacáridos capsulares, lipooligosacáridos y los β-
glucanos cíclicos que cumplen un papel esencial en el proceso infectivo. En el
cromosoma bacteriano se encuentra la familia de genes chv que son responsables
de la virulencia de las cepas, de esta forma su expresión permite el reconocimiento
de los tejidos vegetales por parte de la bacteria y su inmovilización en la superficie
de la célula vegetal; los genes de virulencia chvA, chvB y pscA están involucrados
en la síntesis, procesamiento y exportación de los compuestos anteriormente
mencionados. (Gelvin, 2000; Madigan et al. 2000; Briones, 2001; Pérez, 2003)
El β-glucano aparentemente modifica las paredes celulares bacterianas y actúa
como receptor bacteriano, mientras que como receptores de las células vegetales
se han propuesto moléculas tipo pectina o proteínas de unión ricoadhesinas o
vitronectinas. (Gelvin, 2000; Madigan et al. 2000; Briones, 2001)
Una vez A. tumefaciens llega a la superficie vegetal, empieza a sintetizar
microfibrillas de celulosa que permiten la fijación del inoculo en el sitio de la herida y
el acercamiento de un gran número de bacterias, formando grandes agregados en
la superficie celular. Agrobacterium puede infectar células vegetales
ineficientemente en ausencia de heridas por aperturas naturales como los estomas;
sin embargo, una infección eficiente normalmente requiere de una herida o de
células en división (Gelvin, 2000)
La transferencia del T-DNA se da después de la unión de la bacteria a las células
vegetales.

-Activación de la región vir.

Los genes vir como se había mencionado anteriormente, se encuentran en el

plasmido Ti y su activación que permite la transferencia del T-DNA está
específicamente inducida por xenobioticos derivados de las plantas como los
compuestos fenólicos y monosacáridos, los cuales son percibidos por
Agrobacterium tumefaciens como señales de susceptibilidad de la planta (Liu et al.
2001;Joubert et al. 2002)
El esquema regulatorio de la activación esta compuesto por las proteínas VirA y
VirG, las cuales presentan alta homología a los sistemas regulatorios de dos
componentes encontrados en una amplia variedad de procariotas. VirA es una
proteína histidina-kinasa de unión a membrana, la cual es critica para la captación
de señales. Múltiples señales están involucradas en esta vía reguladora y en la
mayoría de las cepas los compuestos fenólicos son absolutamente necesarios para
la expresión de la región vir. VirA contiene dos regiones de unión a las membranas,
un dominio periplásmico (P) y un largo dominio citoplasmático terminal C que a su
vez esta subdividido en los dominios de enlace, kinasa y receptor. El dominio de
enlace es el implicado en la percepción directa de los fenoles, a diferencia de los
monosacáridos que son percibidos por medio de la interacción del dominio
periplásmico de VirA con la proteína de unión a azucares ChvE; la percepción de los
azucares por parte de esta proteína optimiza la sensibilidad y la respuesta a los
compuestos fenólicos promoviendo la subsiguiente transfosforilación de la proteína
virG, que en su forma activa induce el inicio de la transcripción de los genes vir. No
obstante se han realizado estudios con el fin de encontrar proteínas VirG que
funcionen constitutivamente en ausencia de compuestos fenólicos inductores. (Liu et
al. 2001; Gelvin, 2003 Gao & Lynn, 2005)
La mayoría de las proteínas vir están directamente relacionadas en el
procesamiento del T-DNA desde el plásmido Ti y la transferencia de este desde la
bacteria hasta la planta. (Gelvin, 2000; Gelvin, 2003)
El mecanismo molecular de la acción de los fenoles sobre virA es el resultado de
que el residuo acídico de VirA pueda protonar el grupo carbonilo del compuesto
fenólico, así la resonancia electrónica permite la transferencia de electrones desde
el fenol al residuo acídico y subsecuentemente el fenol también pueda protonar el
residuo básico permitiendo así la autofosforilación de VirA y la de VirG. (Joubert et
al. 2002)
Otro factor importante en la activación de la expresión de los genes vir es el pH ya
que la activación óptima de esta región no ocurre en un pH neutro sino que requiere
un entorno ácido; esta dependencia de un pH ácido se atribuye a una mayor
expresión del gen virG mediada por el promotor P2, cuyo funcionamiento es
inducido en un entorno acido y por la percepción de esta condición por parte del
dominio periplásmico de VirA. Así mismo la respuesta al pH esta relacionada con la
percepción de monosacáridos por parte de la asociación de las proteínas ChvE-
VirA. El pH del entorno es un regulador crítico para el funcionamiento celular, el
control de diversas respuestas así como también desempeña un papel fundamental
en procesos de taxis, conversión de energía, simbiosis y patogénesis. (Gao &
Lynn, 2005)
También se ha visto que los fosfatos y la temperatura tienen efectos en la activación
de la expresión de los genes vir. Una baja concentración de PO4 puede incrementar
la expresión de virG ya que interviene con el funcionamiento del promotor P1 de
este gen y a elevadas temperaturas puede disminuir la inducción probablemente
por que se afecta la proteína VirA. (Liu et al. 2001)

- Transferencia del T-DNA

Una vez fosforilada la proteína VirG, se inicia la transcripción de los genes virD,
VirD1 y VirD2, cuyos transcritos presentan actividad de endonucleasa y se unen de
forma covalente al borde derecho del T-DNA, donde comienza la escisión de esta
región. Aparentemente existe una polaridad entre estos bordes siendo el borde
derecho de más importancia que el borde izquierdo. El establecimiento de esta
polaridad se da en primera instancia porque el borde derecho sirve de sitio de unión
covalente para la proteína VirD2. La proteína VirD2 se une por la tirosina 29 al
extremo 5´ de una de las secuencias del borde derecho, entre los nucleótidos 3 y 4
y realiza el corte de la cadena produciendo solo una hebra de T-DNA (T-Strand) que
es la que va a ser transportada desde la bacteria a las células vegetales; de esta
forma no es la secuencia por sí misma la que otorga la polaridad sino la unión de la
proteína al borde derecho. (Gelvin, 2003)
Se ha observado que la proteína VirD2 puede cortar una sola hebra de la secuencia
borde in Vitro, pero para realizar el corte en las dos cadenas se requiere tanto de la
proteína VirD2 como de la VirD1 tanto in vivo como in Vitro. (Gelvin, 2000)
Una vez se ha realizado el corte se forma el complejo T-DNA/VirD2 ya que VirD2
actúa como una proteína guía para la transferencia desde la bacteria hasta la
planta. Sin embargo, este complejo para ser movilizado necesita de la acción de las
otras proteínas de la región vir. Simultáneamente las proteínas de VirD4 y las 11
proteínas de VirB se acoplan para conformar un sistema para transferir el T-DNA.
Las proteínas VirD2 y VirE2 cumplen un papel esencial y tal vez complementario en
la transferencia del T-DNA y se ha propuesto que su unión con el T-DNA forman lo
que se denomina el complejo T (T-complex), el cual es la forma de transferencia del
T-DNA. (Duckely & Hohn, 2003; Gelvin, 2003)
La proteína VirE2 posee la capacidad de unirse al DNA de una sola cadena sin
necesidad de presentar especificidad a la secuencia de unión y de protegerlo de la
acción de nucleasas que puedan estar presentes tanto en la bacteria como en la
célula vegetal. Una vez esta proteína se une al DNA, el complejo formado se enrolla
formando una estructura de cuerda de teléfono; la formación de esta estructura se
debe a que se facilita el transporte a través del canal de transporte. (Duckely &
Hohn, 2003)
Diferentes estudios in vitro han demostrado que VirE2 posee la capacidad de formar
canales en las membranas, así que una de sus principales funciones puede
radicarse en la formación de poros en las células vegetales para facilitar el paso del
complejoT. Aparentemente la proteína VirE2 es transportada independientemente
del complejo T-DNA/VirD2 y se une a este en el citoplasma vegetal para cumplir su
función de protección contra nucleasas. Se ha visto que para el transporte de VirE2,
esta se asocia con la chaperona VirE1; la disociación de este complejo no se ha
definido si se realiza durante o después de la secreción de esta proteína desde
Agrobacterium tumefaciens. (Duckely & Hohn, 2003; Gelvin, 2000; Gelvin, 2003;
Tzfira et al. 2000) El proceso de transferencia del T-DNA se esquematiza en la
figura 2.
La presencia de la proteína VirD2, aparte de tener actividad endonucleasa y de
participar en la escisión del T-DNA, es esencial para la iniciación de la importación
nuclear. (Duckeley & Hohn, 2003)
VirD2 actúa como guía del T-DNA durante su exportación a la célula vegetal a
través del aparato secretor y en la integración en el genoma vegetal. Esta proteína
posee dos regiones de señales de localización nuclear (NLS) cuya función es dirigir
el T-DNA hacia el núcleo; de esta forma las NLS permiten una interacción con
proteínas vegetales como las α-importinas y las ciclofilinas. Las α-importinas son
componentes de la maquinaria de transporte nuclear de algunos organismos
eucariotas y las ciclofilinas parecen actuar como chaperonas de VirD2 al hacer que
esta última mantenga determinada estructura durante el proceso de transferencia e
integración del T-DNA. (Gelvin, 2000; Gelvin, 2003)
Otro proceso importante en la transferencia del T-DNA es la conformación del
aparato secretor por el cual va a ser exportado el T-DNA desde la bacteria.
Agrobacterium tumefaciens utiliza un sistema secretor tipo IV (T4SS) que trasloca
DNA y proteínas a través de la membrana y la pared celular de la bacteria. Este
sistema requiere de un complejo de proteínas transmembranales de al menos 10
componentes y libera los sustratos que transporta directamente en la célula
receptora gracias a la formación de un apéndice de superficie llamado T- Pilus, que
media el acercamiento de la bacteria a la célula vegetal. (Lai & Kado, 2000; Christie,
2004; Schröeder & Lanka, 2005)

Figura 2. Modelo hipotético de la transferencia del T-DNA desde la célula bacteriana a la

célula vegetal. Se observa en el citoplasma de la bacteria la proteína VirE2 con la
chaperonina VirE1 cuyo acople parece prevenir la unión de VirE2 al T-DNA y la posible
formación de un canal en la membrana de la bacteria. VirE2 es exportada a través del
sistema secretor tipo IV y subsecuentemente forma un canal en la membrana vegetal
permitiendo el paso del complejo VirD2/T-DNA y otras proteínas. Una vez en el citoplasma
vegetal VirE2 cubre el complejo VirD2/T-DNA permitiendo su transferencia al núcleo. Fuente
Duckely & Hohn, 2003.

El T4SS esta codificado por los operones virB y virD; el operon virB posee 11
genes, desde virB1 hasta virB11 y los productos de estos genes se conocen como
proteínas de apareamiento (Mpf = Mating pair formation); la mayoría de las
proteínas VirB forman canales membranales, otras conforman el T-Pilus y también
están las que funcionan como ATPasas para proporcionar la energía requerida en el
ensamblaje de los canales y en el proceso de transporte. (Christie, 2004)
En el operon virD se encuentra el gen virD4 que codifica para la proteína acopladora
VirD4 (CP) la cual actúa como un ligando, que promueve la unión entre el complejo
T-DNA/VirD2 con el aparato conformado por las proteínas VirB. (Gelvin, 2003;
Christie, 2004)
Todas las proteínas Mpf son necesarias para la exportación del complejo T-
DNA/VirD2. Las proteínas VirB4, VirB11 y VirD4 actúan como la unidad energética
del sistema ya que cada una de ellas posee la secuencia conservada de los motivos
Walker A y Walker B, que forman un sitio de unión a nucleótidos en las enzimas
nucleótido-hidrolasas o NTPasas; las NTPasas pueden convertir la energía química
liberada por la hidrólisis de nucleótidos en energía cinética necesaria para la
traslocación de diferentes sustratos a través del aparato secretor; VirD4 actúa como
el determinante específico en el proceso de reconocimiento del sustrato. (Schröeder
& Lanka, 2005)
Las proteínas VirB8, VirB9 y VirB10 forman el núcleo del complejo proteico del canal
secretor; VirB8 es la proteína perisplásmica núcleo para el ensamblaje del complejo
y es necesaria para la adecuada localización de VirB9 y VirB10 en la membrana
bacteriana; VirB10 percibe el estado energético de VirB11 y VirD4 y responde
abriendo o cerrando el canal para VirB9, la cual actúa como punto de anclaje del
complejo a la membrana externa de la bacteria. (Schröeder & Lanka, 2005)
VirB1 es una enzima glycolasa y su principal función es degradar la pared celular de
peptidoglicano; en Agrobacterium tumefaciens esta proteína es dividida en dos
mitades una con el extremo N- Terminal y otra con el extremo C-terminal; la mitad
que posee el extremo N-terminal es la porción que conserva la actividad
peptidoglicanasa y que alcanza la región periplasmica de la membrana. La mitad
con el extremo C-terminal es secretada al espacio exocelular y su función
permanece desconocida. (Schröeder & Lanka, 2005)
La proteína encargada de modular y controlar el canal de secreción frente a los
diferentes sustratos a transportar es VirB6, así como también esta involucrada en la
síntesis y elongación del T-Pilus. (Schröeder & Lanka, 2005)
La lipoproteína VirB7 se localiza en la región periplasmica de la membrana exterior y
es requerida para el ensamblaje estable de VirB4, VirB9, VirB10 y VirB11, así como
para la conexión del núcleo del complejo con el T-Pilus. El T-pilus esta compuesto
de subunidades cíclicas de VirB2 conocidas como T-pilinas; VirB2 es una cadena
polipeptídica de 121 aminoácidos que luego de ser procesada para convertirse en
la T-pilina posee solo 74 aminoácidos; la cadena de aminoácidos originales es
cortada entre el residuo Ala 47 y el Gln48 por una peptidasa señal y una vez
realizado el corte, la región amino-terminal de Gln48 se acopla con la porción
Carboxi-terminal del residuo Gly121 formando un péptido cíclico. Este proceso
culmina en la acumulación y transporte de la T-pilina cíclica a través del aparato
secretor formado por las demás proteínas del operon virB del cual es liberada en la
superficie de la membrana externa de la célula. (Lai & Kado, 2000)
El T-pilus es necesario para percibir y adherirse a una célula potencialmente
receptora, para lo cual se asocia con la adhesina VirB5 cuya función es unirse a los
receptores de las células a ser infectadas. Por último, la proteína VirB3 es una
segunda proteína externa de membrana que facilita el ensamblaje del complejo, sin
embargo su función no ha sido claramente elucidada. (Schröeder & Lanka, 2005) En
la figura 3 se muestra el esquema de la conformación del T4SS de Agrobacterium
tumefaciens.

Figura 3. Arquitectura del aparato secretor tipo IV. En rojo se encuentran el núcleo
energético del sistema; en azul están los componentes del núcleo del sistema; en gris se
representa la ubicación de las peptidoglicanasas y la porción correspondiente al T-Pilus se
muestra en amarillo. En la izquierda se encuentran las subunidades nombradas de acuerdo
al sistema de secreción VirB/VirD4 de Agrobacterium tumefaciens. Fuente Scröder & Lanka,
2005.
- Integración del T-DNA en el genoma vegetal

La transformación genética culmina con la integración del T-DNA al genoma vegetal.

En esta etapa tanto las proteínas Vir como diferentes factores de las plantas
desempeñan un rol crucial en el proceso. En el citoplasma de la célula vegetal el T-
DNA presumiblemente permanece como un complejo nucleoproteínico (el complejo
T) con una molécula de la proteína VirD2 unida covalentemente a su extremo 5´ y
numerosas moléculas de VirE2 cubriendo su longitud total, las cuales a su vez están
involucradas en el proceso de importación al núcleo y de integración. El complejo
pasa a través de los poros nucleares con ayuda de proteínas alfa-importinas como
la familia de α-carioferinas de las células vegetales, las cuales median directamente
la importación nuclear de proteínas que posean NLS. VirD2 por medio de la región
carboxi terminal de una de sus NLS, se asocia a la proteína AtKAPα y
aparentemente la fosforilación de un residuo de serina cercano a esta región,
potencia la importación nuclear del complejo. Por su parte VirE2 parece estar más
involucrada en el acercamiento del complejo hacia el núcleo de la célula hospedera
y facilitar la entrada al mismo. (Gelvin, 2000;Tzfira et al. 2000; Tzfira et al. 2004)
En cuanto a la integración del T-DNA al genoma vegetal, se han planteado diversos
modelos que pretenden explicar la forma en que el proceso se lleva a cabo, no
obstante todavía se desconocen muchos de los factores que intervienen y de cómo
interactúan entre ellos para lograr la integración. A continuación se exponen tres
modelos que han sido reportados en diferentes trabajos y que son referenciados en
el trabajo de Tzfira et al. (2004)

- Modelo de reparación de corte de doble cadena o DSBR (Double-

strand-break repair): La integración del T-DNA se inicia con la
producción de un corte de doble cadena en el DNA de la célula vegetal y
la conversión del T-DNA de cadena sencilla a cadena doble. Los
extremos del T-DNA y del DNA vegetal pueden ser digeridos por exo o
endonucleasas dejando extremos de cadena sencilla, que luego son
anillados entre ellos en regiones con presencia de microhomologías; las
cadenas sencillas que sobresalen después de la unión son removidas
por nucleasas y luego los extremos son ligados.
Figura 4. Modelo DSBR. i) se observa el corte sufrido por el DNA diana y la
consiguiente conversión del T-DNA en un intermediario de doble cadena. ii) los
extremos tanto del DNA diana como del intermediario del T-DNA son degradados
por exonucleasas y luego las porciones en cadena sencilla resultantes se anillan en
regiones que presentan microhomologías representadas por las barras de colores.
iii) las porciones sobresalientes después del anillamiento son removidas por endo y
exonucleasas y luego los extremos son reparados y ligados. Fuente Tzfira et al.
2004

- Modelo de reparación de corte de cadena sencilla o SSGR (Single-

strand-gap-repair): La integración comienza con la producción de un
corte en el DNA vegetal, en una sola hebra que luego es convertido en
un espacio por endonucleasas. Los extremos 5´y 3´ del T-DNA se anillan
a las regiones de microhomologías en el espacio de cadena sencilla del
DNA vegetal y las porciones sobresalientes del T-DNA son recortadas.
Una vez se ha anillado el T-DNA en la cadena superior se abre otro
espacio por acción de nucleasas con el fin de que se sintetice nuevo
DNA con la secuencia del T-DNA como molde.
Figura 5. Modelo SSGR. i) Se produce un corte en una hebra del DNA diana. ii)
Ambos extremos del T-DNA se anillan en regiones de homología con el DNA diana.
iii) Seguidamente se produce un degradación de la otra cadena del DNA diana y por
último iv) se repara el corte tomando como cadena molde el T-DNA insertado.
Fuente Tzfira et al. 2004

- Modelo dependiente de microhomologías: El primer paso consiste en

un anillamiento del extremo 3´ del T-DNA o de sus secuencias
adyacentes a una región con microhomologías en el DNA vegetal. La
porción sobresaliente del extremo 3´ es digerida y la hebra del DNA
vegetal con dirección 3´- 5´ es cortada; seguidamente se da el
anillamiento del extremo 5´ del T-DNA al DNA vegetal también en
regiones con microhomologías, mientras que la cadena 5´- 3´ es digerida
para que sea sintetizada otra vez, utilizando la secuencia del T-DNA
como molde.
 Figura 6. Modelo dependiente de microhomologías. I) se realiza el anillamiento del
extremo 3´ del T-DNA a una región de microhomología del DNA diana. ii)
Seguidamente la cadena del DNA diana es digerida iii) y el extremo 5´ del T-DNA se
liga al DNA diana, mientras se degrada la cadena complementaria del DNA blanco
en donde se inserto el T-DNA. iv) Por último se utiliza el T-DNA como molde para
sintetizar la cadena complemantaria. Fuente Tzfira et al. 2004

Aparte del mecanismo de integración en el genoma vegetal del T-DNA otros puntos
claves del proceso siguen en estudio con el fin de ser dilucidados, como por ejemplo
las regiones de inserción en el genoma vegetal, los factores de la célula hospedera
que influyen en el proceso e incluso, la posibilidad de que el T-DNA se integre por
mecanismos de recombinación homologa.
En un principio se creía que la inserción del T-DNA no era sitio específico y que el
T-DNA integrado parece estar distribuido aleatoriamente a través del genoma
vegetal, pero trabajos realizados recientemente han mostrado que existe una
tendencia a que el T-DNA se integre en regiones transcripcionalmente activas y que
la frecuencia de integración es uniforme a lo largo del genoma pero se reduce en las
regiones centroméricas; por otra parte la proteína virD2 parece interactuar con las
proteínas de unión a la caja TATA, lo que sugiere que la integración también puede
estar dirigida a regiones promotoras. (Somers & Makarevitch, 2004)
En las células somáticas la recombinación es un mecanismo básico para reparar los
daños sufridos por el DNA; los cortes de doble cadena son lesiones potencialmente
letales para las células que pueden ser reparados por procesos de recombinación
ilegitima como la unión de extremos (end-joining), en donde no se requiere de
secuencias homologas o por recombinación homologa; por lo tanto, cromatidas
hermanas, copias alélicas o secuencias ectópicas pueden ser usadas como moldes
de DNA, de lo cual surge la posibilidad de que el T-DNA se pueda integrar en el
genoma vegetal. (Vergunst & Hooykaas, 1999)
Diferentes estudios realizados demuestran que las enzimas de reparación de los
cortes de doble cadena en las células están involucradas en la integración de los
transgenes y que los cortes crean los sitios de integración, por lo que la frecuencia
de cortes de doble cadena está directamente relacionada con la frecuencia de
inserción del T-DNA. (Somers & Makarevitch, 2004; Tzfira et al. 2004)
En cuanto al papel de los bordes derecho e izquierdo en la integración, se ha
observado que el borde derecho se conserva más que el borde izquierdo después
del evento, debido a que sufre un menor número de deleciones a diferencia del
borde izquierdo. Esto posiblemente puede ocurrir gracias a que la proteína VirD2 se
encuentra unida covalentemente al extremo 5´ o borde derecho y de esta forma
influye en el mantenimiento de la fidelidad de la secuencia en el momento de la
integración. (Fu et al. 2005)
La integración puede inducir sustituciones de bases, inserciones, deleciones,
duplicaciones y translocaciones en el genoma vegetal, lo que posteriormente puede
desencadenar en el silenciamiento de los transgenes; así mismo, otros factores
como las enzimas de reparación del DNA, la estructura de la cromatina y las
proteínas de empaquetamiento del material genético pueden afectar el proceso de
integración. (Tzfira et al. 2004; Fu et al. 2005)

2.4.2. Manipulación Genética con Agrobacterium tumefaciens

Dada la capacidad natural de la bacteria de introducir material genético en el

genoma de las células vegetales, se generó la alternativa de utilizar este mecanismo
para introducir genes de interés en diferentes especies vegetales. Por tal razón
Agrobacterium tumefaciens ha sido extensivamente modificada por los
investigadores con el fin de permitir una adición y manipulación más rápida y
especifica de diferentes rasgos deseables en las plantas. (Walkerpeach & Velten,
1994)
Para tal propósito es necesario realizar un desarme del plásmido Ti natural y
modificarlo según los intereses de los investigadores. El primer paso consiste en
eliminar los oncogenes del T-DNA y sustituirlos por los genes de interés. El principal
propósito de los vectores de transformación cointegrados y binarios es la de ubicar
un gen de interés en el apropiado contexto genético y microbiano para promover
una transferencia y una integración eficientes en el genoma vegetal.
Los vectores binarios son aquellos en los que la región vir y el T-DNA residen en
plásmidos separados o en dos replicones diferentes y actúan en trans uno con
respecto al otro; la región vir se encuentra en el plasmido Ti desarmado de la cepa
de Agrobacterium tumefaciens y el T-DNA se encuentra en el otro plasmido vector.
El replicon junto con el T-DNA constituye el vector binario mientras que el replicon
que contiene los genes vir se conoce como ayudador (vir helper). El plásmido
ayudador con los genes vir generalmente posee una completa o parcial deleción de
la región del T-DNA confiriéndoles el carácter de cepas no virulentas a las cepas de
Agrobacterium que los llevan. (Gelvin, 2003)
Los plásmidos cointegrados se caracterizan porque en ellos se ha realizado una
clonación del gen de interés primero en un plasmido de Escherichia coli; esta
secuencia se ha de introducir en el plasmido desarmado de Agrobacterium entre los
bordes derecho e izquierdo del T-DNA. Cuando el plasmido de E. coli se transfiere a
Agrobacterium, el DNA de interés se integra en el T-DNA mediante recombinación
homologa. El resultado es un plasmido en donde el material genético foráneo se
sitúa en cis con los genes vir en el mismo plásmido. (Azcon, 2001; Gelvin, 2003)

A. Genes quiméricos o transgenes

Se considera un gen quimérico a la región codificadora de un gen foráneo, que ha
sido clonada con secuencias promotoras y terminadoras procedentes de otros
genes: estos módulos de expresión son una de las principales ventajas
proporcionadas con el advenimiento de la ingeniería genética ya que se pueden
elegir los adecuados promotores para la expresión de determinados genes en
tejidos muy especializados. (Forero, 1999).

B. Promotores de transcripción
Los promotores son regiones del DNA ubicadas corriente arriba de regiones
codificantes, las cuales contienen secuencias específicas para el reconocimiento y
unión con proteínas involucradas en el control del nivel y patrón de la expresión
génica.
Hasta el momento diferentes promotores han sido aislados de una amplia variedad
de organismos y se ha utilizados en los sistemas de ingeniería genética vegetal; ya
que los promotores afectan la transcripción tanto cualitativa como cuantitativamente,
el éxito en las tecnologías de transferencia genética depende en parte de la
escogencia del promotor. (Potenza et al. 2004)
La elección de la secuencia promotora utilizada en el transgen es dependiente de
los objetivos de la investigación que se esté realizando, por lo que se han
identificado promotores tejido-específicos, de expresión temporal y de expresión
constitutiva; siendo los últimos los más utilizados actualmente ya que presentan
altos niveles de transcripción y facilitan la expresión del gen en cualquier tejido. Tal
es el caso del promotor 35S aislado del virus del mosaico de la coliflor, el cual
puede dirigir altos niveles de expresión del transgen en especies monocotiledóneas
y dicotiledóneas. (Azcon, 2001; Potenza et al. 2004).
El otro elemento de importancia en los genes quiméricos son las secuencias
terminadoras, las cuales actúan como señalizadoras para la detención del proceso
de transcripción. La secuencia de terminación más utilizada es la proveniente del
gen de la nopalina sintetasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens.

C. Genes Marcadores
En las construcciones genéticas utilizadas en los sistemas de transformación, se
hace indispensable el uso de genes marcadores co-transformados con los genes de
interés que permitan seleccionar los tejidos transformados de los no transformados,
al ser introducidos en el genoma vegetal para expresar una proteína generalmente
con actividad enzimática que antes no se poseía. ( Brasileiro & Aragao, 2001)
Los genes marcadores de selección pueden dividirse en diferentes categorías
dependiendo de si confieren selección positiva o negativa y si la selección es
condicional o no condicional a la presencia de sustratos externos. Los genes
marcadores de selección positiva están definidos como aquellos que promueven el
crecimiento de los tejidos transformados y de los no transformados, mientras que
los genes de selección negativa permiten que las células transformadas adquieran
la habilidad de sobrevivir en medios con el agente de selección y las no
transformadas mueran. (Joersbo & Okkels, 1996; Miki & McHugh, 2004)
El gen de selección debe ser capaz de expresarse en cualquier tipo de célula y
tejido y en una amplia variedad de especies vegetales. Esta expresión debe ser
fácilmente distinguible de cualquier actividad endógena del tejido para diferenciar el
fenotipo de las células transformadas y no transformadas. (Brasileiro & Aragao,
2001)
En el grupo de genes marcadores que median una selección negativa, están los que
confieren resistencia a antibióticos y a herbicidas; algunos de los genes
pertenecientes a estos grupos se encuentran resumidos en la tabla 5.

Tabla 5. Principales genes marcadores utilizados en los sistemas de transformación.

GEN ORIGEN RESISTENCIA MECANISMO DE ACCIÓN
nptII Aislado del Antibióticos Codifica para la enzima neomicina
trasposon Tn5 de aminoglicosidos fosfotransferasa que cataliza la fosforilación
Escherichia coli como la dependiente de ATP del grupo 3´-hidroxilo
kanamicina del antibiótico aminoglicosido, lo que
permite que el ribosoma sea liberado de la
molécula de antibiótico y se reinicie la
síntesis de proteínas.
hpt Aislado de Antibiótico Codifica para la enzima higromicina
Escherichia coli Higromicina B fosfotransferasa, la cual cataliza la
fosforilización el grupo hidroxilo del
antibiótico higromicina inactivándolo.
crs1(gene Aislados de Herbicidas Codifican formas mutadas de la enzima
s ahas) mutantes de derivados de la acetohidroxi acido sintetasa que no son
Arabidopsis sulfonilurea y el reconocidas por los herbicidas. Al no ser
thaliana imidazoline reconocidas porestos, dichas enzimas
pueden seguir sintetizando aminoácidos
como la leucina, isoleucina y valina.
aroA Aislado de una Herbicida Codifica para una variación de la enzima 5-
cepa de Glifosato enolpiruvil-shikimato-3 fosfato sintasa
Salmonella (EPSPS) que muestra una afinidad muy
typhimurium reducida al glifosato. Una sobrexpresión de
esta enzima resulta en una alta actividad
enzimática que hace posible que la célula
 sobreviva incluso en la presencia del
herbicida.
bar Aislado de la Herbicidas como Codifica para la enzima fosfinotricina-N-
bacteria Basta, Ignite acetiltransferasa (PAT), que inactiva los
Streptomyces y Liberty herbicidas que poseen fosfinotricina (PPT);
hygroscopicus la detoxificación del herbicida ocurre a
través de la acetilación del grupo amino libre
del PPT, utilizando la acetil coenzima A
como cofactor, previniendo que el herbicida
se una a la enzima glutamina sintetasa (GS)
y así esta pueda seguir removiendo el
amonio toxico para la célula.
Fuente: (Brasileiro & Aragao, 2001; Miki & McHugh, 2004)

En cuanto a la selección positiva, ésta se realiza principalmente porque la célula

adquiere la capacidad de metabolizar algún componente externo presente en el
medio no toxico para las células o por un comportamiento fisiológico diferencial de
las células transformadas respecto a las no transformadas. Tal es el caso de genes
como el ipt el cual permite que la selección se realice por una regeneración
diferencial de brotes de los tejidos transgenicos al modificar los niveles endógenos
de reguladores de crecimiento. (Miki & McHugh, 2004)
Otros tipos de genes son utilizados en los vectores con el fin de confirmar eventos
de transformación y de mejorar la recuperación de tejidos transformados
permitiendo la detección visual de la característica conferida, de tal forma se puede
hacer una selección previa a la aplicación del agente de selección; estos genes
aunque no le proporcionan a la célula una ventaja selectiva, permiten monitorear los
eventos de transformación y se conocen como genes reporteros. (Miki & McHugh,
2004)
Uno de los genes reporteros más ampliamente utilizados es el gen uidA o gus el
cual codifica para la enzima β- glucoronidasa; ésta enzima utiliza el sustrato externo
5-bromo-4-cloro-3-indolyl glucoronido (X-gluc) para producir una coloración azul en
el tejido transformado, la cual permite una detección histológica del transgen; así
mismo, la enzima también puede reaccionar con el sustrato 4-metil umbeliferyl
glucoronido (MUG) generando la liberación de productos fluorescentes que permiten
medir la actividad enzimática. (Miki & McHugh, 2004)

D. Gen inhibidor de la poligalacturonasa

Las plantas como mecanismo de protección contra los patógenos presentan una
serie de barreras físicas, constituidas por las características particulares de la
anatomía vegetal y químicas principalmente metabolitos secundarios. Una
importante barrera física de las plantas es la pared celular vegetal compuesta por
polisacáridos. La pared celular primaria está constituida principalmente por
moléculas de celulosa y hemicelulosa embebidas en una matriz de pectina. De esta
forma una colonización e infección exitosa por parte de un patógeno radica en parte
de la capacidad que tenga de degradar esta barrera de pectina, ya que de esta
forma se debilita la célula vegetal y se exponen otros polímeros a la degradación.
(D’Ovidio et al. 2004; Shanmugam, 2004)
Una de las pectinasas más utilizadas en los procesos de patogénesis llevados a
cabo por hongos son las poligalacturonasas (PG), aunque estas enzimas también
están presentes en bacterias, nematodos, insectos e incluso algunas plantas. Las
PG presentan un alto grado de polimorfismo, ya que muchos hongos producen
isozimas que difieren en sus propiedades enzimáticas, peso molecular y regulación
así como en su actividad especifica, pH óptimo y preferencia de sustrato; esta
multiplicidad de isoformas le confiere a los patógenos la capacidad de desarrollar
infecciones en diferentes condiciones ambientales y hospederos así como también
les otorga la habilidad de escapar en cierta medida de las respuestas de defensa de
las plantas evitando que se pierdan las funciones de patogenicidad. Por otra parte
esta variedad entre las PG refleja la complejidad de la molécula de pectina en las
células vegetales y la necesidad de estas enzimas de degradar los esqueletos de
homogalacturano en una variedad de contextos estructurales. (D’ Ovidio et al. 2004;
Di Matteo et al. 2006)
Cuando se inicia la acción de las PG, en la pared celular de la planta comienza la
liberación de oligogalacturonidos (OG) de un tamaño de 10 a 15 moléculas; estas
sustancias activan una serie de mecanismos de defensa de las plantas, como la
acumulación de fitoalexinas, síntesis de lignina, etileno, β-1,3- glucanasas y la
producción de especies reactivas al oxigeno, así como la activación de genes cuyos
productos también están involucrados en la respuesta ante patógenos como los
genes codificantes para enzimas inhibidoras de poligalacturonasas (PGIP).
(D’Ovidio et al. 2004)
Las PGIP han sido reportadas en varias familias de dicotiledóneas y
monocotiledóneas y pueden inhibir un amplio rango de PG con un modo endógeno/
exógeno de degradación del sustrato. Las PIGPs de distintas plantas difieren en su
actividad inhibitoria, así como las PIGP aisladas de una misma planta pueden
inhibir PG de diferentes especies de hongos o diferentes formas de PG del mismo
hongo. Debido a que las PGIP son un complejo de proteínas y sus genes
codificantes han sido aislados de diferentes plantas, usualmente se consideran
como una familia de genes y al menos dos de estos fueron encontrados
simultáneamente en el arándano, el tomate y frutales como la pera y manzana. (De
Lorenzo et al. 2001)
Las PGIP son glicoproteínas con repeticiones ricas en leucina (LRR) asociadas a la
pared celular vegetal. La estructura típica de una PGIP se caracteriza por ser un
polipéptido de 292 a 315 aminoácidos con varios sitios potenciales de glicosilación.
Estas proteínas maduras poseen de 9 a 10 repeticiones modificadas de un péptido
de 24 aminoácidos ricos en leucina, que constituyen el motivo consenso LRR. Este
motivo adopta una configuración de β-strand/β- turn la cual es la responsable de la
interacción y unión con las diferentes PG; las variaciones que presenta esta
estructura del motivo LRR son las responsables del reconocimiento de las diferentes
PG por parte de las también diversas PGIP. (D’ Ovidio et al. 2004; Shanmugam,
2004)

E. Expresión de los genes transferidos

Las plantas están sometidas a una variedad de estímulos endógenos y ambientales
que pueden conllevar a cambios en la estructura o expresión del genoma. El
genoma vegetal también puede verse afectado por el proceso de transformación
genética; los genes introducidos pueden alterar la organización genómica, modificar
el número de copias de una secuencia determinada y afectar la expresión. Los
transgenes pueden silenciarse después de una corta o larga fase de expresión y en
ocasiones pueden silenciar al menos parcialmente, elementos homólogos
localizados en posiciones ectopicas del genoma. Algunas veces el silenciamiento
de los transgenes también propicia la resistencia contra algunos virus y otras veces
es la infección por virus lo que promueve el silenciamiento de transgenes
homólogos. Por otra parte, el silenciamiento probablemente resulta de la activación
de mecanismos de defensa que indican que las plantas poseen sistemas para
controlar la estructura del genoma y la expresión génica; el transgen por si mismo o
sus productos son percibidos como un estímulo endógeno que activa la maquinaria
de defensa. (Fagard & Vaucheret, 2000)
El silenciamiento genético puede presentarse en cuatro escenarios dependiendo del
elemento causante de este estado: 1) Un elemento puede promover en trans el
silenciamiento de otro elemento sin necesidad de sufrir el proceso, como por
ejemplo algunos transgenes y virus que silencian genes homólogos presentes en el
genoma; 2) Un elemento puede ser fuente de silenciamiento pero solo se afecta el
elemento fuente, en este caso el silenciamiento ocurre en cis y puede ser producto
por ejemplo de la inserción de un transgen en determinada estructura o zona del
genoma;3) Un elemento puede silenciarse él mismo y elementos homólogos
ectópicos, ocurriendo el silenciamiento en cis y trans; 4) Un elemento puede ser
silenciado por otro elemento que actúa en trans, como es el caso de transgenes,
genes endógenos y secuencias víricas que son silenciados sólo cuando están en
presencia de otros elementos homólogos silenciados. (Fagard & Vaucheret, 2000)
En las plantas, los genes o transgenes pueden ser silenciados por mecanismos
transcripcionales o post-transcripcionales. El silenciamiento transcripcional se
caracteriza porque se presenta un bloqueo en la transcripción y puede ocurrir tanto
en cis como en trans. Los elementos que actúan en cis causando silenciamiento
pueden ser conformaciones de heterocromatina cercanas al locus del transgen,
presencia de elementos metilados o particulares conformaciones de repeticiones del
transgen que crean nuevas regiones de heterocromatina. Por otro lado, los loci de
genes homólogos, transgenes ectopicos y virus con DNA nuclear, se consideran
elementos que actúan en trans ya que pueden producir una señal difusible como un
RNA aberrante que interactúe con el promotor del transgen blanco y
potencialmente imponer un estado epigénetico silente. (Fagard & Vaucheret, 2000)
El silenciamiento post-transcripcional por su parte es un mecanismo de degradación
especifica de moléculas de RNA mensajeras que no afecta la transcripción, pero sí
disminuye en una gran proporción la acumulación de mRNA en el citoplasma.
(Vaucheret et al. 2001)
2. 5 REGENERACIÓN DE TEJIDOS

Parte del éxito de los sistemas de transformación genética radica en la existencia de

un protocolo de propagación y regeneración que permita la recuperación de plantas
a partir de los tejidos transformados. Es bien conocida la capacidad de las células
vegetales de sufrir procesos de desdiferenciación para regresar al estado
meristemático y por su totipotencia regenerar una planta completa, en respuesta a
diferentes estímulos externos; de ésta forma la célula adquiere competencia para
expresar su potencial organogénico. La organogénesis es la formación de yemas en
tejidos somáticos y puede ser directa o indirecta; es directa cuando la formación del
brote adventicio o de la raíz ocurre sin una fase de callo (crecimiento anárquico y
aglomerado de células indiferenciadas) previa a diferencia de la organogénesis
indirecta que sí presenta esta fase. (Petri-serrano, 2005)

La regeneración de plantas en los cultivos in vitro no siempre se realiza por vía

organogénica; la morfogénesis se puede llevar a cabo también vía embriogénesis
somática en donde una célula somática se diferencia en un embrión que presenta
las mismas etapas de desarrollo de un embrión cigotico. La embriogénesis somática
también puede ser directa, si se produce del explante sin presentar una fase de
callo o indirecta si el tejido entra en esta fase. No obstante la diferenciación entre
estos tipo de embriogénesis es dificultosa ya que existe la posibilidad de que el
explante posea células embriogénicas predeterminadas que se desarrollen
posteriormente en masas proembrionicas, las cuales se encuentran en la misma
jerarquía de los callos. (von Arnold et al, 2002)

Existen cinco etapas en la regeneración de plantas por vía de embriogénesis

somática: i) la iniciación de los cultivos embriogénicos, en donde intervienen
diferentes factores como el estrés, variaciones en las concentraciones de
reguladores de crecimiento especialmente de auxinas y cambios epigenéticos,
induciendo la reprogramación genética para que se exprese el programa
embriogénico. Aparentemente existen dos mecanismos que determinan la formación
de células embriogénicas: la división asimétrica como consecuencia de la alteración
de la polaridad de las células y el pH a causa de las auxinas y la posibilidad de
controlar la expansión celular gracias a los polisacáridos de la pared celular y las
respectivas enzimas hidrolíticas. No obstante la capacidad para desarrollar
embriogénesis somática esta genéticamente determinada. ii) la segunda etapa es la
proliferación de cultivos embriogénicos donde una vez se haya iniciado la formación
de células embriogénicas éstas proliferan formando masas proembrionicas; en esta
etapa las auxinas son fundamentales para la proliferación, pero así mismo pueden
inhibir el desarrollo de estas masas en embriones propiamente dichos. iii) la tercera
etapa es la premaduración de los embriones somáticos en un medio carente de
auxinas lo que estimula la formación y desarrollo de los embriones somáticos. No
obstante, se debe tener en cuenta que los embriones no deben ser sometidos a
tratamientos para la maduración sin que hayan alcanzado el apropiado grado de
desarrollo. iv) La cuarta etapa es la maduración de los embriones en medios con
suplementos de acido abscícico (ABA) y otros estímulos como un potencial osmótico
reducido. v) La última etapa consiste en el desarrollo de las plántulas en medios
carentes de reguladores de crecimiento. Sólo los embriones maduros que presentan
una morfología normal y que han acumulado sustancias de reserva se desarrollan
en plantas normales. (von Arnold et al, 2002)

Como se ha mencionado anteriormente la embriogénesis somática presenta los

estadios característicos de la embriogénesis cigótica; primero se presenta una
división asimétrica, luego se da la formación sucesiva de las estructuras de corazón,
torpedo, cotiledonar y finalmente se produce la maduración del embrión. No
obstante existen diferencias obvias en los dos procesos; en la embriogénesis
somática no se produce la diferenciación del endospermo; no existe o es retardada
la formación del suspensor; el embrión no pasa por la fase de deshidratación y
dormancia y las células somáticas deben adquirir competencia embriogénica previa
al inicio de los embriones. (Fehér et al. 2003)

Una de las principales características del embrión somático es que constituye un

nuevo individuo con estructura bipolar (raíz y brote) capaz de originar una planta
completa. Así mismo tiene presenta autonomía frente al tejido generador e
histológicamente se plantea que no tiene conexión vascular con el tejido que le dio
origen, por lo que pueden ser separados fácilmente de este y presenta bandas
procambriales entre los ápices. ( Freire, 2003)
La embriogénesis somática además de ser útil en la propagación clonal y
vegetativa, puede servir como modelo en el estudio molecular, citológico, fisiológico
y de desarrollo propios del proceso de embriogénesis vegetal. La principal ventaja
de estos sistemas experimentales in Vitro es que las células embriogénicas están
accesibles para la manipulación por la mayoría de las técnicas celulares y
moleculares a diferencia de las células gaméticas y cigóticas, cuyo desarrollo se
realiza en los tejidos maternos. (Fehér et al. 2003)
 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del Problema y Justificación

A pesar del manejo tecnificado de los cultivos de crisantemo, esta especie presenta
una alta susceptibilidad a enfermedades causadas por diferentes hongos tales como
el tizón foliar, la roya polvillo, la cenicilla, la verticilosis y la roya blanca, siendo esta
última la que más perdidas causa a los floricultores. Estas perdidas se han
calculado entre los US $25.000 y US $100.000. Además el ataque de estas
enfermedades limita las exportaciones para Colombia al no cumplir con las normas
fitosanitarias que exigen los países importadores del producto.
Con base en lo anterior, el mejoramiento genético a través de la introducción de un
gen que confiera una mayor tolerancia al ataque de hongos como el gen inhibidor
de la poligalacturonasa, vía Agrobacterium tumefaciens, constituye una alternativa
para el control de este tipo de enfermedades. Por esta razón se hace necesario
evaluar algunas condiciones de infección que faciliten la estandarización de un
protocolo de transformación y regeneración que permita obtener resultados
favorables y que sea reproducible para la obtención de tejidos vegetales
transgénicos.
Este trabajo de investigación representa un aporte al conocimiento de la interacción
de Agrobacterium tumefaciens con el crisantemo y la respuesta a la regeneración in
vitro de los tejidos que han sido transformados, al tiempo que constituye un primer
estudio de transformación para variedades cultivadas en Colombia.
Debido a que en el proceso de transformación diferentes condiciones de infección
pueden llevar tanto a resultados positivos como negativos, es de gran importancia la
evaluación de diferentes factores involucrados en el proceso como la concentración
de bacteria o la cepa a utilizar.
3.2. Pegunta de Investigación

¿La frecuencia de transformación de explantes de crisantemo está determinada por

la cepa y la concentración de Agrobacterium tumefaciens utilizadas en el proceso
de infección?
 4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar algunas condiciones implicadas en el proceso de transformación genética

de crisantemo (Dendanthrema grandiflora), mediada por Agrobacterium
tumefaciens.

4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Evaluar el efecto del proceso de infección con Agrobacterium tumefaciens sobre la

regeneración de los explantes

- Determinar el efecto de la cepa bacteriana sobre el proceso de inserción del gen

pgip y regeneración de los discos de hojas de crisantemo.

- Evaluar el efecto de la concentración bacteriana en el proceso de infección y

regeneración de los discos de hoja de crisantemo

- Verificar la inserción del gen marcador en los tejidos vegetales regenerados a

partir de los explantes infectados.
 5. MATERIALES Y METODOS

5.1. Población de estudio y Muestra

La población de estudio la constituyeron plantas de Dendranthema grandiflora de la

variedad White Albatros. La muestra proviene de plantas establecidas in vitro a
partir de segmentos nodales de esquejes provenientes de los cultivos de la empresa
Americaflor S.A. De estas plantas se hicieron un máximo de tres subcultivos y se
mantuvieron en medio Murashigue & Skoog (MS) sin reguladores de crecimiento,
bajo condiciones de fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad,
humedad relativa del 70 % y con una temperatura de 21±2°C en el cuarto de
incubación del laboratorio de cultivo de tejidos de la Unidad de Biotecnología
Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.2. Establecimiento y multiplicación del material vegetal in vitro

Para el establecimiento del material vegetal se siguió el protocolo establecido por

Forero et al. 2003 (manuscrito en preparación) que comprende las siguientes etapas
de desinfestación y establecimiento de los tejidos. Primero se realizó una
separación manual de las hojas del esqueje. Luego los segmentos nodales se
sumergieron en una solución de fungicida (Benlate®) a una concentración de 1gr/L
durante 20 minutos en agitación constante. En seguida los segmentos fueron
transferidos a una solución de hipoclorito de Sodio al 1.25% y posteriormente en
Tween 20 al 1% durante 5 minutos, en agitación suave. Para finalizar, se realizaron
tres lavados consecutivos de 1, 3 y 5 minutos con agua destilada desionizada
estéril.
Los explantes fueron sembrados en medio de cultivo Murashige & Skoog 1962
(MS), 30g/L de sacarosa, pH 5.8, solidificado con agar 0.6% y libre de reguladores
de crecimiento y se incubaron a 21°C ±2°C con un fotoperíodo de 16 horas luz/8
horas de oscuridad. A partir de estos segmentos se dio inicio a los subcultivos a
partir de segmentos nodales.
5.3. Transformación, cultivo y mantenimiento de las Bacterias

Para el proceso de infección y transformación se utilizaron las cepas PGV2260 y

EHA105 de Agrobacterium tumefaciens que presentan resistencia a Rifampicina con
vectores binarios constituidos por el plásmido XL1pSCP2 que posee el gen
marcador bar y el gen inhibidor de la poligalacturonasa aislado de plantas de kiwi
(Actinidia deliciosa). Adicionalmente se trabajó con la cepa PGV2260 que contenía
el plasmido pCAMBIA 1301 que porta el gen β-gus para poder monitorear la
transformación de los tejidos vegetales.
El plásmido XL1pSCP2 (figura 7) presenta el gen aphIII de resistencia a
kanamicina por fuera del T-DNA. El T-DNA se inicia con la secuencia
correspondiente al borde derecho seguido del promotor 35S CaMV duplicado, luego
viene el gen inhibidor de la poligalacturonasa aislado de plantas de kiwi, la
secuencia de terminación nos y el gen de selección bar que confiere resistencia a
herbicidas y finaliza con la secuencia correspondiente al borde izquierdo. Entre los
diferentes constituyentes se localizan varias regiones de corte con enzimas de
restricción.

Figura 7. Mapa del plasmido XL1pSCP2

El plásmido pCAMBIA1301(figura 8) también presenta resistencia a kanamicina por
fuera del T-DNA y dentro de la secuencia del T-DNA presenta el gen β-gus y el gen
de resistencia a Higromicina.

Figura 8. Mapa del plasmido pCAMBIA 1301.

Las colonias se obtuvieron mediante siembras por agotamiento en medio YEB

sólido, con pH de 7.2 y autoclavado durante 25 minutos a 121°C. (Anexo2)
Las bacterias se preservaron en este mismo medio a 4°C siendo renovadas cada
mes y se hizo una colección de respaldo en glicerol a -70°C.
Para los procesos de infección de las colecciones mantenidas a 4°C se tomo una
colonia de cada cepa y se inocularon en 10 ml de medio YEB líquido con los
antibióticos de selección Rifampicina y Kanamicia ambos a una concentración de 50
mg/ml. Este cultivo se incubó en agitación a 28°C, 125 r.p.m. y completa oscuridad
durante 16 horas.

a. Construcción de cepas

La transformación de las cepas de Agrobacterium tumefaciens con los plásmidos

XL1pSCP2 y pCAMBIA1301 fue realizada previamente durante la fase incial del
proyecto crisantemo siguiendo los siguientes protocolos.
Con el propósito de introducir el plásmido XL1pSCP2 en las cepas EHA105 y
pGV2260 el primer paso a seguir fue la transformación de células de E. coli DH5α
por choque térmico siguiendo el protocolo de Wiley & Sons (1998) (Anexo3) y la
posterior selección de las colonias portadoras de los plásmidos se realizó en medio
YEB con kanamicina a una concentración de 50 mg/L.
Después de obtener las colonias resistentes a kanamicina se procedió a realizar una
cruza triparental en donde se colocaron las cepas de E. coli donadoras y la
portadora del plásmido de movilización (pKR2013) junto con las diferentes cepas de
Agrobacterium tumefaciens a transformar, siguiendo el protocolo propuesto por H.
Jones (2000) (Anexo4).
Las células de Agrobacterium tumefaciens transformadas fueron seleccionadas por
plaqueo en medio YEB sólido con los antibióticos de selección y cultivadas a
temperaturas de 28°c.
La transformación bacteriana se evaluo mediante aislamientos de DNA plasmidico y
PCR. Estas pruebas fueron realizadas en lafase inicial del proyecto principal.

5.4. PRUEBAS PRELIMINARES A LA INFECCION

5.4.1 Susceptibilidad de Agrobacterium tumefaciens al antibiótico

Con el objetivo de determinar cual concentración de antibiótico es la más adecuada

para eliminar Agrobacterium tumefaciens del medio y del tejido vegetal después de
la infección, se realizó un antibiograma en liquido y luego se efectuaron recuentos
en cajas de las unidades formadoras de colonias para cada concentración de
antibiótico evaluada.
En primera instancia se realizó un cultivo de las cepas EHA105 y PGV2260 en los
medios YEB y MS Líquidos con los antibióticos de selección durante 16 horas, a
28°C de temperatura y a 125 r.p.m.
De estos cultivos se tomaron inóculos para ser sembrados también en medio YEB y
MS líquido pero con las siguientes concentraciones de Moxalactam: 0, 50, 100, 200,
300 y 400 mg/L y se incubaron durante 16 horas a 28 °C y 125 r.p.m.
Seguidamente de cada concentración se realizaron 5 diluciones seriadas (10-2, 10-4,
10-6, 10-8, 10-10) en solución salina al 0.85%; las diluciones más altas fueron después
sembradas por técnica de microgota en cajas de medio YEB y MS sólido para
realizar los conteos e incubadas a 28°C en oscuridad por 24 horas.

5.4.2. Susceptibilidad del tejido vegetal al glufosinato de amonio

Para evaluar la susceptibilidad de los discos de hoja de crisantemo al glufosinato de

amonio, los explantes se cultivaron en medio MS de regeneración vía
embriogénesis somática con concentraciones de BAP 3mg/L, 2.4 D 1 mg/L y AIA 2
mg/L. Se evaluaron diferentes concentraciones de glufosinato de amonio ( 0, 1,
5,10,15, 20 y 25 mg/L), realizando lecturas semanales de la frecuencia de aparicon
de masas proembrionicas, germinación de embriones y la presencia de oxidación o
clorosis en los diferentes tratamientos.

5.5. INFECCION DE DISCOS DE HOJA DE Dendranthema grandiflora

VARIEDAD WHITE ALBATROSS CON Agrobacterium tumefaciens

5.5.1. Diseño experimental

Los discos de hoja de Dendranthema grandiflora fueron infectados con las cepas
PGV2260 XL1pSCP2, PGV2260 pCAMBIA13001 y EHA105 XL1pSCP2 con dos
diferentes concentraciones y sus posibles combinaciones como se registra a
continuación en la tabla 6:
 Tabla 6. Variables y tratamientos para la transformación de discos
de hoja de A. tumefaciens

Variable Nivel Tratamientos

A. Cepa A1. PGV2260 pCAMBIA1301 T1. A1-B1
A2. PGV2260 XL1pSCP2 T2. A1-B2
A3. EHA105 XL1pSCP2 T3. A2-B1
A4. Control (MS sin Bacteria) T4. A2-B2
B. Dilución B1. 1:20 T5. A3-B1
T6. A3-B2
B2. 1:50 T7. A4
(Control)

Se realizaron lecturas a los 15, 30 y 45 días después de siembra (DDS) registrando

la producción de masas proembrionicas (MPE), la germinación de embriones,
contaminación bacteriana y el porcentaje de oxidación en los explantes infectados
en cada tratamiento, con el fin de determinar el efecto de tratamiento sobre la
regeneración de los tejidos foliares. De los plantas regeneradas a partir de los
explantes infectados con la cepa PGV2260 pCAMBIA1301 se tomó material para
realizar la prueba histoquímica de expresión del gen gus con el fin de determinar la
inserción del gen reportero. Para hacer la misma verificación en los explantes
infectados con las otras cepas se realizo una PCR amplificando el gen pgip.

5.5.2. Infección y regeneración de discos de hoja

Para el proceso de infección, las bacterias previamente fueron incubadas durante 16

horas en medio YEB líquido con los antibióticos de selección rifampicina y
kanamicina cada uno en una concertación de 50 mg/L a 28°C, 125 r.p.m y en
completa oscuridad (OD600 = 0.4). Por otra parte, para obtener los explantes se
tomaron hojas de Dendranthema grandiflora y se les retiraron los bordes para
posteriormente ser infectados con las diluciones bacterianas, sometiéndolos a un
periodo de cocultivo de tres días; a continuación fueron transferidos a medio MS de
regeneración con Moxalactam a una concentración de 200mg/L (Antúnez de Mayolo
 et al. 2003). Así mismo se realizó un tratamiento control el cual consistía en la
inmersión de los explantes en medio MS liquido sin inoculo bacteriano.

a. Protocolo de Infección

1. Se realizaron diluciones 1:20 y 1:50 en medio MS líquido de cada cepa y se

sumergieron en ellas los explantes.
2. Las diluciones con los explantes inmersos, se sometieron a agitación suave en
completa oscuridad por 10 minutos a 100 r.p.m y 19°C

b. Inducción de masas proembrionicas y germinación de embriones

3. Después del tiempo en agitación los explantes se sacaron de la solución

bacteriana y fueron secados en papel filtro estéril.
4. Posteriormente fueron sembrados en medio MS de regeneración vía
embriogénesis somática con las siguientes concentraciones de reguladores de
crecimiento: BAP 0.23 mg/L, AIA 2 mg/L y 2.4 D 1 mg/ L (Sherman et al.1998). La
superficie de estos medios estaba cubierta con papel filtro estéril, con el fin de
disminuir el crecimiento bacteriano. El agente gelificante fue Bactoagar Difco ®
(Loubens et al. 1997) y las condiciones del tiempo de cocultivo fueron tres días
en oscuridad total, una humedad relativa del 70 % y una temperatura de 21±2°C.
5. Finalizado el tiempo del cocultivo se realizaron tres lavados en agua destilada
desionizada estéril con el fin de retirar el exceso bacteriano.
6. A continuación los explantes fueron sembrados en medio MS de regeneración con
las mismas concentraciones de reguladores de crecimiento mencionadas en el
punto 4 y con Moxalactam en una concentración de 200mg/l. El agente gelificante
fue Agar Sigma ®
7. Los explantes se mantuvieron en medio de regeneración con antibiótico hasta que
se evidencio la producción de masas proembrionicas con un fotoperíodo de 16
horas luz/8 horas de oscuridad, humedad relativa del 70 % y una temperatura de
21±2°C.
8. Las masas proembrionicas fueron retiradas del explantes y sembradas en medio
MS de regeneración sin 2,4-D para inducir la germinación de los embriones
somáticos.
9. Las plantas regeneradas fueron individualizadas y transferidas a medio MS sin
reguladores de crecimiento.
10. De las plantas regeneradas una muestra fue sembrada en medio MS con el
agente de selección glufosinato de amonio.

5. 6. DETECCION DE LA TRANSFERENCIA Y EXPRESION DE LOS GENES DE

INTERES

5.6.1. Detección de la transferencia del gen pgip

Se utilizo la técnica de PCR para la amplificación especifica de la secuencia de DNA

insertos en el genoma vegetal correspondientes al gen pgip aislado de plantas de
Kiwi; para tal propósito se realizaron extracciones de DNA siguiendo el protocolo de
extracción de DNAzol de Sigma ® (anexo 5) de las plantas regeneradas; el control
negativo provenía de muestras que no habían sido infectadas con Agrobacterium
tumefaciens. Los primers específicos para el gen ipg poseen las siguientes
secuencias: Forward 5´ ACCAATTTATCTGGCCCTGTCCCT 3´ y reverse 5 ´
AAGCTCTGCGGAAAGACCACCTTA 3´. Las condiciones de amplificación fueron
las siguientes: 1 ciclo a 94° C de desnaturalización (4 minutos), 35 ciclos de 94°C
(30 seg), 60°C (1 minuto) y 72° C (2 minutos) y por último un ciclo de 72° C por 7
minutos para extensión. La reacción se llevó a cabo en un volumen de 22.5 µl de
PCR Supermix ®, 0.1 µl de cada primer del gen pgip cuyas soluciones stock se
encontraban a una concentración de 100µM y 5 µl de DNA genómico
(aproximadamente de 5 – 20 ng) para un volumen final por cada muestra de 27.7 µl.
Los productos de la amplificación fueron visualizados en electroforesis en gel de
agarosa al 1% con tinción de bromuro de etidio.
5.6.2. Detección de la expresión del gen β-gus

Se evaluó la presencia y expresión del gen β-gus por tinciones histoquímicas de las
plantas regeneradas a partir de los explantes infectados con la cepa PGV2260
pCAMBIA1301. La tinción histoquímica (anexo 6) se evidencia por una reacción
colorimétrica detectable a simple vista; debido a que la enzima β-glucoronidasa
reacciono con el sustrato X-gluc se genero el color azul en los tejidos analizados.

Expresión transitoria del gen β-gus. Con el objetivo de monitorear el proceso de

transformación, se realizaron tinciones histoquímicas en explantes seleccionados al
azar después del periodo de cocultivo. Posteriormente se realizó la tinción en
muestras de las plantas regeneradas a partir de los explantes infectados, para
obtener una estimación del porcentaje de tejidos que mantenían una expresión del
transgen.

5.7. RECOLECCION DE INFORMACION

Las variables dilución bacteriana (1:20 y 1:50) y las cepas utilizadas (EHA105
XL1pSCP2, PGV2260 XL1pSCP2 y PGV2260 pCAMBIA1301) fueron medidas por
medio de lecturas periódicas de la aparición de masas proembrionicas, germinación
de embriones somáticos o regeneración de plantas y oxidación de cada tratamiento
(Anexo 7) y de la realización de las pruebas necesarias para detectar la inserción y
expresión de los genes pgip y β-gus en los tejidos regenerados a partir de los
explantes infectados. La producción de tejido indiferenciado (MPE) se midió según
el porcentaje que de estos tejidos se presentara en la superficie del explante y de
acuerdo con lo anterior se establecieron los niveles de regeneración, estando el
nivel 1 conformado por explantes con una producción de MPE del 25%, el nivel 2
por explantes con una producción de MPE del 50%, el nivel 3 por explantes con una
producción de MPE del 75% y el nivel 4 por explantes con una producción de MPE
del 100%.
5.8 ANALISIS DE DATOS

Después de haber registrado los datos de regeneración y transformación fueron

procesados por medio de un test de proporciones y una prueba X2 en tablas de
contingencia r x c, para determinar la proporción de producción de MPE por cada
tratamiento, por cada cepa y por cada dilución. La prueba de X2 se realizó para
hacer la comprobación del posible efecto de las cepas y la dilución en la
regeneración del tejido mediante la utilización del programa estadístico SAS.
 6. RESULTADOS

6.1. PRUEBAS PRELIMINARES A LA INFECCION

6.1.1. Susceptibilidad de Agrobacterium tumefaciens al antibiótico

De los cultivos en líquido de las cepas PGV2260 XL1pSCP2, PGV2260

pCAMBIA1301 y EHA105 XL1pSCP2 en medio YEB y MS con las diferentes
concentraciones de moxalactam (0, 50, 100, 200, 300 y 400 mg/L). después de 16
horas de incubación a 125 r.p.m. y 28°C se encontró que solo el control presentaba
crecimiento bacteriano mediante lecturas de turbidez (OD600 = 0.4). No obstante se
realizaron las siembras de las diluciones 10-6, 10-8, 10-10 de los cultivos en liquido, en
medio YEB y MS sólido por técnica de microgota encontrando que solo los controles
presentaron hasta 59 unidades formadores de colonia. Se escogió una
concentración de 200mg/L de moxalactam para la eliminación de Agrobacterium
tumefaciens, ya que según lo reportado en el trabajo de Antúnez de Mayolo et al.
(2003) esta concentración permitía una eliminación de la bacteria y una mejor
respuesta de regeneración de los tejidos infectados.

6.1.2. Susceptibilidad del tejido vegetal al glufosinato de amonio

Los discos de hojas de D. grandiflora presentan una alta susceptibilidad al agente

de selección glufosinato de amonio ya que de los explantes cultivados en las
diferentes concentraciones evaluadas (1, 5, 10, 15, 20 y 25 mg/L) después de 40
días de cultivo, solo el control presentó una respuesta positiva de regeneración con
una frecuencia de germinación de embriones somáticos del 71% y un promedio de
3.4 plantas producidas por explante, mientras que en los otros tratamientos el
agente de selección inhibió por completo su regeneración y se presentaron clorosis
y oxidación de los tejidos foliares cercanos al 100%.
 CONTROlL

1 mg/L 10 20
mg/L mg/L

5 mg/L 15 25
mg/L mg/L

Figura 9. Discos de hoja de Dendranthema grandiflora cultivados en

diferentes concentraciones de glufosinato de amonio (1-25 mg/L).
6.2 EFECTO DEL PROCESO DE INFECCION EN LA REGENERACION DE LOS
DISCOS DE HOJA DE Dendranthema grandiflora VARIEDAD WHITE
ALBATROSS.

El sistema de regeneración de los explantes infectados se realizó con el fin de

obtener plantas vía embriogénesis somática, utilizando las siguientes
concentraciones de reguladores de crecimiento: BAP 0,23 mg/L, AIA 2 mg/L y 2,4 D
1 mg/L como lo reporta Sherman et al. (1998) para otras variedades de crisantemo.
En este trabajo se evidenció la formación de estructuras correspondientes a las
diferentes fases que se presentan en los procesos de embriogénesis en el tejido
indiferenciado, como la aparición de masas proembrionicas, el estado globular, de
corazón y de torpedo (figura 10).

Figura 10. Estructuras embriogénicas producidas en el tejido regenerado.

No obstante, al carecer de evidencias más fuertes aportadas por el análisis de
cortes histológicos con microscopia electrónica, no puede garantizarse que las
plantas obtenidas sean producto exclusivo de esta vía de regeneración, ya que en
los explantes infectados también hubo producción de callos no embriogénicos
(Figuras 11 y 12).

Figura 11. Discos de hoja 20 días después de la

infección con Agrobacterium tumefaciens en
medio MS de regeneración.

Figura 12. Plantas Regeneradas de los explantes infectados después de tres meses.
Por otra parte se evaluó el efecto de los diferentes tratamientos en la regeneración
de los discos de hoja de Dendranthema grandiflora tomando como variables de
respuesta la producción de MPE (masas pproembrionicas) y la germinación de
embriones o regeneración de plantas. Se utilizó un test de comparación de
proporciones (Pagano & Gauvreau, 2000) para probar la hipótesis nula que
planteaba una igualdad en la proporción de MPE producidas en los diferentes
tratamientos respecto al control.
En cuanto a la producción de MPE todos los tratamientos tuvieron un nivel de
regeneración estadísticamente igual al control (Figura 13, Anexo 8).

Figura 13. Porcentaje alcanzado en la producción de MPE de los diferentes tratamientos a

los 45 DDS.

No obstante en cuanto a la producción de plantas por tratamiento en general se

obtuvieron frecuencia de regeneración muy bajas incluyendo el control por lo que se
deduce que el proceso de infección si afecto la regeneración de los explantes
infectados. Estos resultados se registran se registran en la tabla 7.
 Tratamiento Frecuencia de
Regeneración
Control 7,7%
T2 5,7%
T4 4,3%
T3 3,8%
T6 2,3%
T5 1,7%
T1 1,0%

Tabla 7. Frecuencia de regeneración de explantes de

Dendranthema grandiflora

A pesar que las tasas de regeneración son muy bajas según el test de proporciones
aplicado se observa una diferencia significativa (Anexo 9) en las frecuencias de
plantas producidas entre el control y los demas tratamientos (Figura 13). La mayoría
de los plantas se produjeron en explantes que presentaban un nivel 3 de
regeneración (75%) con un promedio de 4 plantas por explante; en algunos
explantes incluso fue posible individualizar hasta 12 plantas.
En la figura 13 tambien se muestra la comparación entre la frecuencia de
germinación de embriones (tomada como el numero de explantes que permitieron la
regeneración de plantas del total de explantes infectados) y el promedio de plantas
regeneradas por explante en cada tratamiento lo que indica que aunque en muchos
tratamientos la regeneración de plantas fue reducida al contar con un promedio alto
de producción de plantas por explantes se optimiza el protocolo de regeneración,
con el subsiguiente aumento de las posibilidades de obtener plantas transformadas.
6.2.1. Efecto de la dilución bacteriana en la regeneración de los discos de hoja
de Dendranthema grandiflora variedad white albatros.

Se determinó el efecto de la concentración bacteriana sobre la regeneración de

discos de hojas de Dendranthema grandiflora. Para tal fin se realizó un análisis de
X2 con tablas de contingencia de tipo r x c (anexo 10) (Pagano & Gauvreau, 2000).
Para una distribución X2 con 4 grados de libertad (p <0.0001) se obtuvo que la
presencia de bacteria si alteró significativamente la aparición de MPE y la
germinación de embriones, por lo tanto se concluye que sí hay un efecto de
tratamiento en la respuesta del tejido. La dilución que presento una mejor
producción de MPE con una respuesta regenerativa nivel 4 después del control
(45.97%), fue la dilución 1:50 (28.06%); la dilución 1:20 mostró el menor porcentaje
de regeneración en este nivel con un 25.97 %. El mejor porcentaje de germinación
de embriones (62,4%) se obtuvo en los explantes que fueron infectados con la
dilución 1:50 a diferencia de la dilución 1:20, la cual permitió solo la regeneración
del 36 % del total de plantas regeneradas.

6.2.2. Efecto de la cepa bacteriana en la regeneración de los discos de hoja de

Dendranthema grandiflora variedad white albatros.

Se determinó el efecto de las diferentes cepas utilizadas en la regeneración de los

discos de hoja de Dendranthema grandiflora (figura 14). Mediante la prueba de X2
con 6 grados de libertad y un p < 0.0001 (anexo 11) se determinó que las cepas
presentaron diferencias significativas en la respuesta regenerativa en cuanto a la
producción de MPE y germinación de embriones. La cepa que presentó una mejor
producción de MPE con una respuesta regenerativa nivel 4 (explantes con el 100%
de producción de MPE) después del control (45.97%) fue la cepa EHA105
XL1pSCP2 con un porcentaje de 31.49%, seguida de la cepa PGV2260 XL1pSCP2
(13.28%) y por último la cepa PGV2260 pCAMBIA1301 (9.25%).
La germinación de embriones en el control (28.13%) fue significativamente diferente
respecto a los explantes infectados con las diferentes cepas cuyo porcentaje de
germinación en su respectivo orden fue: PGV2260 pCAMBIA1301 con una
regeneración de plantas del 24. 3%, PGV2260 XL1pSCP2 con un 14.76 %.
y por ultimo la cepa EHA105 XL1pSCP2 con un 7. 29%.

Figura 14. Efecto de la cepa en la regneración de los discos de hoja de Dendranthema

grandiflora

En la figura 14 se registra que en cuanto a la producción de MPE la cepa EHA105

XL1pSCP2 presenta la frcuencia más alta, mientras que en cuanto al germinación
de embriones el porcentaje de esta cepa es el menor registrado. Con la cepa
PGV2260 p CAMBIA1301 los resultados fueron contrastantes ya que la frecuencia
de MPE fue muy reducido pero se obtuvo un mayor número de germinación de
embriones. La cepa PGV2260 XL1pSCP2 presento un comportamiento similar tanto
en la producción de plantas como en la germinación de los embriones.

6.2.3 Detección de la expresión del gen β-gus en discos de hoja de

Dendranthema grandiflora
Se monitoreo si en los tejidos regenerados se mantenía la expresión del transgen o
si correspondía a una expresión transitoria del mismo. Aunque las plantas
regeneradas a partir de los explantes infectados con la cepa PGV2260
pCAMBIA1301 presentaron coloración azul su nivel de expresión descendió en
comparación de la tinción realizada en los explantes después de tres días haber
sido infectados. En la primera tinción se presento un 80% de explantes con tinción
total y el 20 % presentaron tinción parcial. En las plantas regeneradas solo el 30 %
presento una tinción total del explante, lo que indica que el nivel de expresión inicial
se mantuvo en estos tejidos; el restante 70 % presentó tinción transitoria de la
muestra teñida. Según los datos obtenidos se observa una disminución en el nivel
de expresión a través del tiempo y del proceso de regeneración; no obstante a pesar
de presentar esta reducción la expresión es estable en los tejidos regenerados. En
la figura 15 se observan los diferentes patrones de tinción que presentaron los
tejidos.

Figura 15. Patrones de expresión diferencial del gen gus en tejidos de

Dendranthema grandiflora 45 días despues de haber sido infectados.

6.2.4. Efecto de la cepa y de la dilución bacteriana en la frecuencia de

inserción del transgen
Las frecuencias de transformación se calcularon a partir del numero de muestras
positivas para la amplificación por PCR divididas entre el numero total de explantes
infectados; de las frecuencias obtenidas se hizo la distinción entre cepas y dilución
bacteriana utilizada obteniendo los resultados consignados en la tabla 8.

Tabla 8. Frecuencias de inserción registradas después de la prueba de PCR

Cepa Dilución Frecuencia de Inserción

PGV2260 XL1pSCP2 1:20 2,4

1:50 2,4
EHA105 XL1pSCP2 1:20 0
1:50 1.2

De las plantas regeneradas de los explantes infectados con la cepa PGV2260

pCAMBIA1301 también se llevo a cabo la prueba de PCR, no obstante en ninguna
de las repeticiones realizadas se obtuvieron amplificaciones del transgen.
Como se muestra en la tabla 7 no se observa ninguna diferencia en las frecuencias
de inserción en las dos diluciones utilizadas en la cepa PGV2260 XL1pSCP2; por otra
parte los explantes infectados con la cepa EHA105 XL1pSCP2 solo presentaron
eventos de transformación con la dilucion 1:50. En la figura 16 se observan los
fragmentos de 407 pb correspondientes a la amplificación del gen pgip en el DNA
aislado de las plantas regeneradas.
1 M 2 3 4 5 6 7 8 9 10

407 pb

Figura 16. Detección por PCR de la secuencia de 407 pb correspondiente al gen pgip. M:
Marcador 1Kb (Invitrogen ®); Línea 1 control positivo para el gen pgip , 2 - 10 Muestras
positivas para la inserción del gen pgip.
 7. DISCUSIÓN

7.1 Efecto del antibiótico en el control de Agrobacterium tumefaciens y su

posible efecto en la regeneración

El desarrollo de un sistema de transformación también requiere de la selección en

un medio con antibiótico que permita controlar el crecimiento de Agrobacterium
tumefaciens sobre los tejidos después de la infección.
Para tal objetivo se utilizó en este trabajo el antibiótico Moxalactam ® ya que en
pruebas realizadas durante el trabajo de Antúnez de Mayolo et al. (2003) se
encontró que en todas las concentraciones utilizadas (100, 150, 200 y 300 mg/L)
hubo un control total del crecimiento bacteriano, lo que coincide con el antibiograma
realizado en este trabajo donde se evaluaron las concentraciones de 0, 50, 100,
200, 300 y 400 mg/L y solo en el control se presento crecimiento bacteriano.
No obstante, al transcurrir el tiempo en el medio de regeneración se presentó un
excesivo crecimiento bacteriano que ocasiono una gran perdida de explantes
infectados, incluso realizando lavados a los explantes después del periodo de
cocultivo para la eliminación del exceso de bacteria y renovando el medio de
regeneración continuamente.
Debido a lo anterior cabe mencionar que el moxalactam es una cefalosporina
perteneciente al grupo de antibióticos betalactámicos por poseer un anillo de esta
naturaleza. Este tipo de moléculas actúa impidiendo la síntesis de la pared celular y
causando un efecto autolítico en la célula bacteriana. No obstante, es bien conocido
que las bacterias han desarrollado un tipo de resistencia ante estas formas de
antibióticos, conocido como producción de enzimas betalactámicas, las cuales son
enzimas catalíticas de naturaleza proteica cuya producción está controlada por un
gen cromosómico o residente en un plásmido o algunos tipos de transposones, las
cuales actúan rompiendo el enlace amídico del anillo betalactámico, con lo que el
antibiótico pierde la capacidad de unirse a las enzimas dianas, conocidas como
PBP. (Daza-Pérez, 1998; Marín & Gudiol, 2002)
Recientes estudios han demostrado que la resistencia bacteriana no sólo surge
como respuesta al uso prolongado de determinados tipos de antibióticos, sino que
también puede ser el resultado de la interacción de otros factores como las
entidades genéticas. Estas están caracterizadas por poseer elementos distintos a
los genes, tales como la presencia de transposones e integrones y estar dirigidas
por diferentes interacciones que propician sus rearreglos y su permanencia en el
genoma; un ejemplo de lo anterior son los integrones de clase 1, cuyos genes
confieren resistencia a trimetropina, cloramfenicol, β-lactámicos, aminoglicósidos y
quinolonas. Por lo anterior, se puede considerar una posible adquisición de este tipo
de resistencia por las cepas utilizadas en este trabajo. (Walsh, 2006)
Los antibióticos presentan un efecto postantibiótico (EPA) consistente en la acción
residual del antibiótico sobre la bacteria, después de que las concentraciones del
mismo hayan descendido por debajo de la concentración mínima inhibitoria (CIM);
en el caso de los antibióticos betalactámicos el efecto postantibiótico es de corta
duración y su actividad bacteriostática disminuye en cuanto mayor es el inóculo
bacteriano. (Marín & Gudiol, 2002)
Teniendo en cuenta lo anterior, existe la posibilidad que Agrobacterium tumefaciens
haya adquirido un tipo de resistencia al antibiótico, ya sea porque desarrolló algún
tipo de β – lactamasas debido a la prolongada exposición a un mismo antibiótico o
porque existen en el genoma de estas cepas entidades que llevan consigo grupos
de genes de resistencia como se menciono anteriormente.
Se ha sugerido que el uso de acido clavulónico al poseer un núcleo similar al ácido
penicilánico compite por el sitio diana de las β – lactamasas potenciando la acción
del antibiótico. (Marín & Gudiol, 2002)
El crecimiento incontrolado de Agrobacterium tumefaciens en los medios de cultivo
después de la infección pudo deberse precisamente a que el inóculo bacteriano era
muy alto y el EPA del moxalactam muy reducido, por lo que facilito la proliferación
bacteriana. De hecho se observó que la dilución 1:50 fue la que permitió una mejor
regeneración de los tejidos después del control.
Por otro lado, aunque se referencia que el moxalactam no es fitotóxico y no afecta la
regeneración de los tejidos según el trabajo de Antúnez de Mayolo et al. (2003),
concentraciones por encima de 200mg/L limitaban la aparición de embriones
somáticos por explante, por lo tanto en este trabajo no se utilizó una concentración
mayor de antibiótico. No obstante puede ser necesaria una concentración mayor ya
que al estar en medio sólido su EPA es más corto y la CIM más alta.
Los componentes del medio de cultivo, también pueden influir en la actividad del
antibiótico; debido a que el medio MS presenta unas altas concentraciones de
solutos como la sacarosa lo que propicia un medio hipertónico respecto a las células
bacterianas y dada la actividad lipófila del antibiótico, la posterior lisis de las células
puede no darse. Adicionalmente al tener las bacterias gram-negativas una presión
osmótica menor, la acción lítica del antibiótico sobre Agrobacterium tumefaciens
puede ser más lenta y encontrarse relacionada con la cantidad de lipopolisacáridos
de las diferentes cepas. (Demain & Davies, 2002)
En cuanto al efecto de los antibióticos en la regeneración de los tejidos, es
conocido que los antibióticos suelen tener efectos tóxicos y su adición en el medio
de cultivo puede potenciar resultados negativos reflejados en variaciones en el peso
fresco de callos y brotes regenerados de Dendranthema grandiflora, aumentando el
efecto cuando se aumenta la concentración; las diferencias que se presentan en la
susceptibilidad de los tejidos vegetales a los antibiótico son dependientes al
genotipo de las especies y variedades trabajadas. (Texeira da silva et al. 2003)
Se ha reportado que los antibióticos exhiben efectos similares a los de los
reguladores de crecimiento en los tejidos; teniendo en cuenta los efectos
secundarios de los antibióticos el establecimiento de una adecuada proporción de
auxinas y citoquininas en los sistemas de regeneración es crucial para aumentar la
eficiencia de los protocolos de transformación mediada por Agrobacterium
tumefaciens y evitar una reducción en la eficiencia de germinación de los embriones
somáticos. (Lin, et al. 1995; Nauerby,et al. 1997; Antúnez de Mayolo et al. 2003)
En diferentes estudios realizados se ha determinado que los antibióticos más
utilizados para la eliminación de A. tumefaciens como la carbenicilina, el cefotaxime
y el moxalactam presentan como subproductos grupos fenil acéticos los cuales
presentan una alta similaridad molecular con las auxinas, cuyo efecto fisiológico
esta directamente relacionado con el alargamiento y la elongación celular. Por tal
razón los antibióticos pueden actuar como reguladores de crecimiento y su adición,
en muchas especies ha significado un aumento en la regeneración de tejido
indiferenciado, aunque el exceso de estímulos auxinicos puede resultar tóxico para
los tejidos vegetales y disminuir su potencial de regeneración (Lin, et al. 1995;
Nauerby,et al. 1997; Antúnez de Mayolo et al. 2003; Texeira da silva et al. 2003)
7.2. Susceptibilidad del tejido vegetal al glufosinato de amonio

En la prueba realizada se encontró una alta susceptibilidad de los tejidos vegetales

al glufosinato de amonio en donde solo el tratamiento control permitió la
regeneración de los tejidos. Se ha reportado que una extrema sensiblidad al agente
de selección puede afectar la regeneración de los tejidos transformados y se refleja
en la inhibición del crecimiento de los brotes. Por lo tanto la selección en etapas
avanzadas del desarrollo de los tejidos regenerados incrementa las posibilidades de
supervivencia al permitir la división de las células transformadas. (van Wordragen et
al. 1992)
No obstante aunque se realice la selección en medios con el agente de selección es
posible que el transgen haya pasado por diferentes porcesos de silenciamiento que
den como resultado falsos negativos, por lo que se hace necesaria otras
comprobaciones como detección del transgen por PCR y Southern Blott.

7.3. Efecto del proceso de infección en la regeneración de los discos de hoja

de Dendranthema grandiflora.

En la estandarización del protocolo de regeneración posterior a la infección con

Agrobacterium tumefaciens se buscó la obtención de plantas vía embriogenesis
somática, adicionando al medio de regeneración el regulador de crecimiento 2,4-
ácido diclorofenoxiacético (2-4, D). Esta vía de regeneración ha sido evaluada con
otras variedades de crisantemo, ya que se plantea la posibilidad de que la
embriogénesis somática al originar plantas a partir de una sola célula disminuya la
producción de quimeras consistentes en la obtención de tejidos transformados y no
transformados. (May & Trigiano, 1991; Pavingerova et al. 1994; Texeira da silva,
2003; Akasaka-Kennedy et al. 2004)
Al evidenciarse que en la variedad White Albatross se presentaron estructuras
embriogénicas se puede afirmar que el tejido vegetal presenta una buena capacidad
de respuesta ante estímulos hormonales que inducen la adquisición de
competencia, determinismo e inducción de embriones, ya que este tipo de
respuestas en crisantemo se ha reportado como dependiente de la variedad
utilizada (Fehér et al. 2003; Texeira da Silva, 2003 )
De otra parte, la adición de auxinas exógenas en este caso el 2,4 - D, puede
producir un aumento de los niveles de AIA endógenos y estas altas concentraciones
se asocian con una mayor respuesta embriogénica en varias especies. (Fehér et al.
2003)
No obstante ha sido reportado que una sobre exposición de los tejidos al 2,4 – D
inhibe la formación de brotes. (Bhattacharya et al. 1990; Fuji & Shimizu, 1990;
Sherman et al. 1998). Lo anterior puede deberse a que esta auxina según plantea
De Vries et al. (1996) estimula la hidrólisis de fosfatidilinositol, induce alteraciones
en el pH del citoplasma y la pared celular, provoca divisiones asimétricas y retarda
la maduración y germinación de los embriones.
Esto coincide con lo encontrado en este trabajo en donde se ratifica la necesidad de
separar las MPE del explante una vez se hayan generado (ya que el aumento del
espesor de las paredes celulares es un factor importante en el desarrollo de los
embriones) su posterior transferencia a un medio de regeneración libre del 2,4 –D y
con una menor concentración de los demás reguladores de crecimiento, aunque en
ocasiones medios de regeneración libres de estos compuestos permiten la
germinación de los embriones somáticos. (Aloni, 1995; Sherman et al. 1998)
Por otra parte el efecto del proceso de infección sobre la regeneración se vio
reflejado en la baja frecuencia de regeneración de plantas (Tabla 7). Cabe
mencionar que durante la infección de los tejidos los explantes se ven sometidos a
daño mecánico causado por la manipulación, lo que puede influir en la disminución
de su potencial de regeneración. La reducción en la capacidad de regeneración de
los explantes también obedece al grado de respuesta hipersensitiva que presenten
(Orlikowska et al. 1995). Así mismo la infección puede inducir respuestas en las
células periféricas que afectan sistemáticamente la regeneración de células
adyacentes o de células embriogénicas más distantes. Esta respuesta se puede ver
incrementada por la producción de fenoles que también afectan la regeneración,
más cuando el crisantemo se caracteriza por presentar una alta concentración
endógena de este tipo de compuestos (Orlikowska et al. 1995).
No obstante aunque la tasa de haya sido baja, cabe resaltar que en este trabajo se
obtuvo un promedio de regeneración de 4 plantas por explante lo que permite
concluir que el protocolo de regeneración utilizado es apropiado para la
regeneración de material infectado, comparado con trabajos previos en diferentes
variedades de crisantemo donde el porcentaje de obtención de órganos por explante
presenta un rango que va desde 0 hasta un 90% dependiendo de la variedad
trabajada y la fuente del explante. (Texeira da Silva, 2003)

7.4. Efecto de la dilución bacteriana y la cepa en la regeneración de los discos

de hoja de Dendranthema grandiflora

Una de las variables a evaluar en este trabajo fue el efecto de la dilución bacteriana
en la regeneración de los tejidos infectados. Se encontró que la presencia de
bacterias si altero la regeneración de los explantes respecto al control y que la
dilución 1:50 permitió una mejor respuesta de los explantes. La dilución 1:20 por su
parte presentó un porcentaje de regeneración más bajo y ocasionó más perdida de
material por contaminación bacteriana (datos no mostrados) disminuyendo así la
eficiencia del sistema de regeneración en el protocolo utilizado.
El uso de diferentes diluciones bacterianas es un ensayo para lograr una
optimización en la eficiencia de la transformación. No obstante como se ha
mostrado en diferentes estudios, generalmente se presenta un mayor porcentaje de
necrosis y muerte de los explantes en las más altas concentraciones bacterianas.
(Taskin, et al. 1999)
En el trabajo realizado por De Clercq et al. 2003 se realizaron pruebas de
inoculación con cultivos en diferentes fases de crecimiento logarítmico (fase
temprana y fase tardía), para determinar la incidencia de la fase de crecimiento del
cultivo bacteriano en la eficiencia de transformación y aunque no hubo un efecto
significativo entre las diferentes fases, las infecciones posteriores se realizaron con
cultivos en fases tempranas de crecimiento (12 horas de incubación), para disminuir
la concentración bacteriana y evitar un crecimiento incontrolado sobre el explante;
así mismo en esta fase al estar las células en crecimiento se potencia la acción del
antibiótico a diferencia de los cultivos en fase tardía, donde la mayoría de las células
ya presentan una síntesis completa de su pared celular. Por tal razón en este
trabajo los cultivos bacterianos se incubaron durante 16 horas a 28°C y 125 r.p.m, y
las diluciones se realizaron a partir de cultivos con densidades ópticas de 0.4 a
600nm de absorbancia.
Por otra parte, la presencia de bacteria en los explantes se considera como un
factor que puede influir en la regeneración de los explantes al activar diferentes
mecanismos de defensa por parte de los tejidos vegetales ante una señal de estrés
o una posible infección por parte de un patógeno. (Ditt et al. 2005)
Este tipo de respuestas incluyen la muerte localizada de la célula, la producción de
especies reactivas al oxígeno, rearreglos en el citoesqueleto, activación de
determinados grupos de genes, síntesis de proteínas y fortificación de la pared
celular por procesos de lignificación entre otros. (Buchanan et al. 2000)
De acuerdo con lo anterior la presencia de una concentración mayor de bacteria,
(que en este caso seria la dilución 1:20) y al estar las células vegetales más
expuestas al agente patógeno, ya que previo a la infección se realizaron cortes en
los bordes de los explantes, se puede presentar una hiperinducción de las
respuestas de defensa, con una mayor oxidación de los tejidos y posterior muerte
de los mismos, así como también una pérdida de competencia de regeneración en
las células vegetales por disminución en sus actividades metabólicas y cese del
ciclo celular.
La segunda variable a evaluar, fue el efecto de la cepa sobre la regeneración y la
transformación. Como primera respuesta de regeneración en este trabajo se tuvo en
consideración la aparición de tejido indiferenciado y según estos parámetros la cepa
que permite una mayor presencia de MPE es la EHA105 XL1pSCP2; no obstante
aunque en muchas ocasiones se considere la aparición de MPE como un paso
previo a la regeneración de plantas, los explantes que fueron infectados con esta
cepa presentaron el menor número de plantas regeneradas (7.29%). La cepa
EHA105 XL1pSCP2 probablemente originó un proceso de embriogéneseis somática
indirecta de baja frecuencia caracterizado porque se presenta un gran número de
explantes con callos embriogénicos con un número reducido de embriones
somáticos que no se desarrollan completamente y se mantiene en estado globular,
contrariamente a lo observado con la cepa PGV2260 pCAMBIA1301, en donde el
número de explantes con callos de competencia embriogenica fue menor, pero con
un mayor número de embriones somáticos por callo, proceso conocido como
embriogénesis somática indirecta de alta frecuencia(Freire, 2003) .Si se considera
que los explantes expuestos a esta cepa, dadas las condiciones anteriormente
mencionadas, estuvieron durante un mayor período de tiempo influenciados por los
reguladores de crecimiento del medio de regeneración y que el balance de auxinas-
citoquininas regula la regeneración adventicia, puede presentarse que aunque
exista una producción de MPE, estos son incapaces de regenerar plantas por
perdida de competencia (la cual puede ser causada por una exposición secuencial a
las auxinas y citoquininas) o porque el tejido indiferenciado empieza a ser
independiente de los reguladores de crecimiento o a habituarse a los mismos.
(Joyce et al. 2003)
Según los datos obtenidos la regeneración de plantas fue diferencial respecto a la
cepa utilizada. La cepa PGV2260 presentó un mayor porcentaje de plantas
regeneradas (39.06%); esta cepa también mostró una respuesta diferencial en
función del plásmido que portaba siendo el pCAMBIA1301 (24.3%) el que afecto en
menor medida la regeneración seguido del plásmido XL1pSCP2 (14,76%). Esta
cepa al exhibir una baja producción de tejido indiferenciado y al permitir una mayor
regeneración de plantas, proporciona una garantía adicional frente a la formación de
quimeras y en la disminución de la variación somaclonal que presentan los tejidos in
vitro durante fases prolongadas de procesos de callogénesis.

7.5 Expresión del gen β- gus en discos de hojas y tejidos regenerados

Según los resultados obtenidos el nivel de tinción de los explantes después de 3

días de cocultivo fue mayor que el de las plantas regeneradas, presentándose una
disminución del 50 % en los explantes que presentaron tinción total en la primera
prueba. En los protocolos de transformación estandarizados para diversas especies
vegetales, con diferentes construcciones y cepas se ha observado el mismo patrón
de respuesta a la tinción histoquímica, caracterizado por altos niveles de expresión
en el inicio del cocultivo y un descenso de la misma al transcurrir del tiempo lo cual
sugiere una interacción entre variados factores que determinan la eficiencia del
proceso de integración y expresión del transgen. (Narasimhulu et al. 1996; Nam et
al. 1997; Boase et al. 1998 ; Taskin et al. 1999)
El pico de expresión que se presenta generalmente entre las 18 y 36h después de
haberse iniciado el cocultivo del tejido vegetal con la bacteria y según se ha
reportado en diferentes trabajos se debe a una expresión transitoria de copias de
T-DNA no integradas en el genoma vegetal, que disminuyen a través del tiempo,
con lo que también desciende la expresión. (Narasimhulu et al. 1996; Nam et al.
1997; Texeira da Silva, 2003)
Para que las copias de T-DNA no integradas en el genoma puedan ser transcritas
algunos autores sugieren la presencia de un T-DNA de doble cadena que facilite la
unión de la RNA polimerasa II, lo que coincide con algunos modelos de integración
propuestos en donde el T-DNA antes de ser integrado adopta la conformación de
doble cadena. (Narasimhulu et al. 1996; Tzfira et al. 2004)
Por otro lado el descenso en los niveles de expresión también puede deberse a
posteriores procesos de silenciamiento genético de las copias insertadas en el
genoma vegetal.
Texeria da silva (2003) reporta que en diferentes variedades de crisantemo en las
que se han realizado eventos de transformación, la expresión del gen gus se
localiza en su mayoría en el borde del explante donde se han realizado los cortes y
en la región de la nervadura central explante. Así mismo es posible que las células
competentes para la transformación posean características en común con las
células con potencial de regeneración ya que se ha encontrado que las regiones
que presentan un mayor porcentaje de tejidos regenerados son las mismas en
donde se ha presentado la expresión del gen gus (Nam et al. 1997; Boase et al.
1998; Texeira da silva 2003)
Lo anterior coincide con los resultados encontrados en la variedad trabajada white
albatros, donde se puede observar (figura 10) un mayor nivel de expresión
transitoria en los bordes de los explantes; estos resultados incrementan las
posibilidades de obtener un mayor número de plantas transformadas con el
protocolo utilizado en este trabajo.
En las pruebas de PCR realizadas para confirmar la integración del transgen en el
genoma de Dendranthema grandiflora, se encontró que los tejidos regenerados que
resultaron positivos para la tinción histoquímica no amplificaron. Como se había
mencionado anteriormente la temprana expresión del T-DNA podrá deberse a la
expresión de copias que no necesariamente se han insertado en el genoma
vegetal. No obstante en el estudio realizado por Boase et al. (1998) con 4
variedades de Dendranthema grandiflora se encontró que todas las variedades
presentaban expresión del gen gus endógena cuando el pH del buffer fosfato de la
solución de incubación estaba en 4.5. Así mismo se ha encontrado expresión
endógena en otras variedades de crisantemo a un pH de 7 y en otras especies
vegetales como Lemna minor, Rheum rhaponticum, Pisum sativum, Triticum sativum
y Nicotiana tabacum en diferentes rangos de pH, lo cual sugiere que la actividad de
la enzima β- glucoronidasa está ampliamente distribuida en el reino vegetal. Por lo
anterior se debe considerar el probar diferentes pH con el fin de descartar si la
variedad white de Dendranthema grandiflora utilizada en este trabajo presenta
expresión endógena.
Aunque se presentó un descenso en los niveles de expresión del gen gus en las
plantas regenerados, un porcentaje considerable de estos tejidos siguió
presentando expresión lo que nos permite concluir que las condiciones utilizadas en
el protocolo estandarizado permiten la inserción estable del transgen en los tejidos
regenerados.

7.6. Efecto de la cepa y la dilución bacteriana en la frecuencia de inserción del

transgen.
En el proceso de transformación mediado por Agrobacterium tumefaciens existen
múltiples factores que de una u otra manera pueden ser determinantes en el
momento de obtener una planta transgénica. Uno de los pasos críticos en el
proceso de infección es la transferencia del T-DNA desde las células bacterianas a
las células vegetales y de esta fase depende en gran medida el éxito en los pasos
siguientes de la transformación.
De la combinación de variables cepa- dilución, la cepa PGV 2260 XL1pSCP2 no
presentó ninguna diferencia en las frecuencias de transformación en las dos
diluciones utilizadas. Lo anterior puede deberse a que en el proceso de
transformación es más relevante la virulencia de la cepa, es decir su capacidad de
transferir e integrar el T-DNA, que el número de células sobre el explante. Por otra
parte la cepa EHA105 XL1pSCP2 aunque permitió una mejor regeneración del
tejido, no se obtuvo los mismos resultados positivos en cuanto a la frecuencia de
transformación, donde solo la dilución 1:50 mostró frecuencias de transformación
del 1.4 %. Como se había mencionado anteriormente una alta concentración de
inoculo bacteriano puede conllevar a una muerte del explante, lo que sucedió en
este caso donde el tratamiento de la cepa EHA105 XL1pSCP2 con una dilución 1:20
solo presento un 38% de viabilidad de explantes y un 70 % de perdida por
contaminación por bacteria (datos no mostrados). En cuanto a la cepa PGV2260
pCAMBIA1301, pese a que no amplificó el transgen en la reacción de PCR, según la
tinción presentada por los explantes regenerados la expresión del gen gus muy
probablemente corresponde a una integración estable del transgen, ya que los
plantas regeneradas sobre los que se hizo la verificación molecular, se produjeron
aproximadamente 45 días después del periodo de cocultivo, tiempo suficiente para
que las posible copias del T-DNA que no fueron insertadas se hayan degradado.
Pese a lo anterior no se debe descartar la posible expresión endógena del gen gus.
Es conocido que la amplificación de ácidos nucleicos en la reacción de PCR puede
verse afectada por variados factores provenientes de diversas fuentes; los
inhibidores comunes incluyen varios componentes de fluidos corporales,
constituyentes alimenticios como el glicógeno, compuestos ambientales como
fenoles, componentes de las células bacterianas y contaminantes presentes en el
ambiente como DNA no blanco o derivados de los instrumentos de laboratorio como
por ejemplo el polvo de los guantes y trazas de celulosa. (Wilson, 1997)
Debido a que el protocolo de infección con las tres cepas y las diferentes diluciones
se realizo en las mismas condiciones se esperaría que las frecuencias de
transformación no fueran tan disímiles; no obstante en este punto existen muchos
factores que pueden intervenir y afectar la transformación, tal como lo referencia
DeClerq et al. 2002 en su trabajo, donde se muestra que cepas que en el proceso
de transformación de determinadas especies han mostrado altas frecuencias de
regeneración, en otras el resultado no es igual. Este puede ser el caso de la cepa
EHA105 de la cual se ha demostrado su eficiencia en la transferencia del T-DNA y
su integración en diferentes especies, no obstante en este trabajo esta cepa no
presento tales resultados.
En determinadas ocasiones las pocas frecuencias de inserción observadas pueden
corresponder a una resistencia a la infección dependiente del genotipo de algunas
especies vegetales o como resultado de deficiencias en la unión de la bacteria a las
células vegetales y en el subsiguiente proceso de transferencia e integración del T-
DNA. Así mismo se ha encontrado que entre variedades de una misma especie
también se presenta resistencia a la infección por parte de algunas de ellas, rasgo
que también es considerado como dependiente del genotipo (Nam et al. 1997;
Boase et al.1998; Texeira Da silva, 2003; Ditt et al. 2005)
La condiciones de iluminación durante el periodo de cocultivo parecen tener un
efecto en la eficiencia de la transformación aunque generalmente en los protocolos
esta fase se realiza en completa oscuridad, ya que se considera que la luz puede
suprimir la expresión de los genes dirigidos por el promotor 35S, hay una mayor
estabilidad del mRNA en oscuridad y se estimula la capacidad morfogenética de los
tejidos. (Zambre et al . 2003)
No obstante en el trabajo realizado por Zambre et al. (2003) se encontró una
correlación positiva entre la transferencia del T-DNA con la luz. Se ha demostrado
que la luz durante el período de cocultivo aumenta las concentraciones de algunos
compuestos fenolicos en Dendrobium sp. así como también influye en algunos
factores fisiológicos como los niveles de reguladores de crecimiento y la
proliferación celular que pueden hacer las células más competentes para la
transformación. De tal forma es conveniente probar diferentes intensidades
lumínicas con el fin de establecer si en D. Grandiflora la presencia de luz durante el
cocultivo provoca un incremento en las frecuencias de integración.
La activación de la región vir es imprescindible para lograr la transferencia del T-
DNA; generalmente esta activación se induce por la adición de compuestos
fenólicos durante el proceso de infección tales como la acetoseringona. Sin
embargo, la adición de este tipo de compuestos en especies vegetales con altos
niveles de fenoles endógenos parece no tener un efecto significativo en la activación
de esta región y la posterior transferencia del transgen, tal y como lo reporta Forero
(1999) en su trabajo de transformación con Pasiflora mollissima y por el contrario si
se ha encontrado que el exceso de estos compuestos puede causar necrosis de los
explantes. (De Clercq et al. 2002)
Teniendo en cuenta lo anterior y que el crisantemo también se caracteriza por
presentar un alto contenido de fenoles en este trabajo no se realizó la adición de
fenoles en el proceso de infección.
En el trabajo realizado por Kumar y Rajan (2005) se describe el efecto inductor de
las poliaminas sobre la región vir de Agrobacterium tumefaciens potenciando la
transferencia e integración del T-DNA a las células vegetales. Dado que en este
trabajo la adición de reguladores de crecimiento y su subsiguiente conversión de
poliaminas pudo influir de manera positiva en la transformación de los tejidos de
crisantemo infectados y obtener frecuencias de transformación favorables en
comparación con los trabajos reportados para crisantemo donde las frecuencias van
desde 0.09 % hasta 7.8% dependiente de la variedad y de la fuente de explante.
(Texeira da Silva, 2003)
 8. CONCLUSIONES

- Los discos de hoja de Dendranthema grandiflora son susceptibles a la

transformación con Agrobacterium tumefaciens.

- El protocolo de transformación establecido en este trabajo permite obtener tejidos

regenerados con una inserción y expresión estable del transgen.

- La dilución 1:50 permite una mejor regeneración de los tejidos y disminuye la

perdida de material por contaminación por bacteria.

- La mejor cepa utilizada para la transformación y la regeneración es la PGV2260

Xl1pSCP2.
 9. RECOMENDACIONES

Para hacer una optimización del anterior protocolo de transformación se

recomienda:

- Realizar infecciones con cultivos bacterianos que presentes diferentes etapas

de crecimiento para determinar su influencia en la frecuencia de transformación.

- Evaluar la influencia de la temperatura de infección y cocultivo en las

frecuencias de transformación.

- Utilizar antibióticos combinados con acido clavulonico como la timetina para

potenciar la actividad del antibiótico.

- Evaluar el proceso de tinción histoquímica a diferentes pH de la solución de

reacción para descartar la expresión endógena del gen β- gus.

- Evaluar si la exposición a la luz de los explantes durante el cocultivo

incremente las frecuencias de transformación.

- Evaluar por medio de otras técnicas como el southern blot e inoculaciones con
los hongosp atogenos para determinar si la integracion y expresion del transgen
se mantienes en las plantas regeneradas.
 11. REFERENCIAS

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 11. ANEXOS

Anexo 1. Composición medio MS

MEDIO DE CULTIVO MS
Compuesto Mg/l
NH4 NO3 1650
Macronutrientes KNO3 1900
CaCl . 2H2O 440
MgSO4 . 7H2O 370
KH2PO4 170
Compuesto Mg/l
MnSO4 . H2O 22.3
ZnSO4 .7H2 8.6
Micronutrientes Na2M0O4 . 2H2O 0.25
CuSO4 . 5H 2O 0.25
CoCl2 . 6H2O 0.025
H3BO3 6.2
Compuesto Mg/l
Vitaminas Tiamina HCl 0.1
Pirodoxina HCl 0.5
AcidoNicotínico 0.5
Compuesto Mg/l
Suplementos Kl 0.83
Glicina 2
Mio. Inositol 100
Fuente de Carbono Compuesto Mg/l
Sacarosa 30

Anexo 2. Composición Medio YEB

COMPUESTO CANTIDAD/GR
Extracto de carne 5gr
Extracto de levadura 1gr
Extracto de Peptona 5gr
Sucrosa 5gr
MgSO . H2O 493 mg

Al homogenizar la solución se ajusta al pH a 7.2 con NaOH 5M.

Cuando es sólido lleva 7,5 gr de BactoAgar por litro.
Anexo 3. Protocolo de transformación por choque térmico de células de E.
coli DH5α (One Shot Max Efficiency cells- Invitrogen ®). Tomado de Vector
Clonning Application . P. Jones. Ed Jonh Willey & Sons. UK, 1998. pp 14

1. Adicionar 1 µl de DNA plásmidico a 50 µl de células competentes.

2. Como control negativo añadir 1µl de agua estéril a 50 µl de células competentes y como
control positivo añadir 1µl de pUC19 a 50µl de células competentes.
3. Incubar en hielo por 30 minutos.
4. Someter a choque térmico a las células mediante la colocación de las mezclas
anteriores a 42° C durante un lapso de tiempo de dos minutos.
5. Incubar en hielo por 5 minutos
6. Añadir 1 ml de LB a cada mezcla e incubar por 60 minutos a 37°C.
7. Plaquear 50 µl de las células transformadas en placas de LB con el antibiótico
apropiado.
8. Incubar toda la noche a 37°C

Anexo 4. Protocolo cruza triparental . Tomado de Plant gene transfer and

expression protocols. H. Jones. Ed Humana Press 2000. pp 35

1. Inocular por separado en 5 ml de medio líquido con su respectivo antibiótico cada

una de las siguientes cepas: E. coli donaββdora ( cepa que porta el plásmido
binario), E. coli HB101 (pKR2013) y Agrobactrium tumefaciens (PGV2260 y
EHA105 )
2. Incubar a temperatura apropiada hasta que alcance la fase exponencial.
3. En un tubo estéril mezclar: 100 µl de la cepa donadora, 100 µl de HB101 y 300 µl de
Agrobacterium tumefaciens.
4. Tomar100 µl de la mezcla y colocarla sobre un disco de nitrocelulosa estéril
previamente colocado en una caja de petri con medio YEB sólido sin antibiótico.
5. Incubar a 28° toda la noche.
6. Tomar una asada de la mezcla del disco y estriar por agotamiento sobre medio
sólido YEB con el antibiótico apropiado.
7. Incubar a 28°C durante 48 horas o hasta que se observen colonias aisladas.
Anexo 5. Protocolo de extracción de DNA vegetal DNAzol reagent Invitrogen ®

1. Macerar 100 MG de tejido vegetal en 300 µl de reactivo Plant DNAzol.

2. Mezclar por inversión, incubar a 25°C por 5 minutos en agitación. Adicionar 300 µl
de cloroformo mezclar vigorosamente e incubar otros 5 minutos a 25° C. Centrifugar
por 1º minutos a 12000 g.
3. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y añadir 225 µl de etanol
puro. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
4. Centrifugar a 5000 g por 4 minutos. Descartar el sobrenadante.
5. Lavar el pellet con 300 µl de etanol al 70%. Incubar por 5 minutos y centrifugar por
5 minutos a 5000 g.
6. Repetir dos veces paso 5.
7. Remover el etanol e invertir los tubos por 2 minutos. Disolver el pellet de DNA en
um volumen adecuado de TE 1:10

Anexo 6. Protocolo utilizado para la tinción histoquímica. Jefferson, 1987

Protocolo tinción histoquímica Soluciones

1. Colocar el explante en la Solución de fijación: Formaldehído 0.3%,
solución de fijación. vacío por MES pH 5.6 10 mM, Manitol 0.3M.
2 minutos.
2. Incubar de 4-5 minutos a Buffer fosfato: Se deben preparar stocks
temperatura ambiente. de Na2 HPO4 y NH2PO4 para ser
Seguido de tres lavados con utilizadosen una solución 50 mM de
50 mM de NaPO4 pH 7.0 NaPO4 pH 7.0.
3. Adicionar la solución de
reacción. Vacío 10 minutos. Solución de reacción: El sustrato debe ser
4. Incubar a 37° C toda la noche. preparado inmediatamente antes de usarlo
5. Realizar un lavado com para que no pierda actividad. Para esto se
hipoclorito de sódio deben disolver 10 mg de X-Gluc en 100
µl de dimetil formamida y luego ser llevado
a 10 ml con NaPO4 pH 7.0.
Anexo 7. Formato de toma de datos

Anexo 8. Test de Proporciones de la lectura 3 mostrando las diferencias de

proporciones en cuanto a la producción de MPE en un nivel 3 ( 75%)

A. Comparación tratamientos 7 y 1.

. prtesti 150 0.2333 150 0.1733

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 150

y: Number of obs = 150
------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .2333 .0345322 .1656181 .3009819
y | .1733 .0309049 .1127275 .2338725
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .06 .0463421 -.0308288 .1508288
| under Ho: .0464714 1.29 0.197
------------------------------------------------------------------------------
diff = prop(x) - prop(y) z = 1.2911
Ho: diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

Pr(Z < z) = 0.9017 Pr(|Z| < |z|) = 0.1967 Pr(Z > z) = 0.0983

B. Comparación tratamientos 5 y 7.

. prtesti 150 0.2333 150 0.1533

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 150

y: Number of obs = 150
------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .2333 .0345322 .1656181 .3009819
y | .1533 .0294164 .0956448 .2109552
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .08 .045363 -.0089098 .1689098
| under Ho: .0455975 1.75 0.079
------------------------------------------------------------------------------
diff = prop(x) - prop(y) z = 1.7545
Ho: diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

Pr(Z < z) = 0.9603 Pr(|Z| < |z|) = 0.0793 Pr(Z > z) = 0.0397
C. Comparación tratamientos 7 y 4.

. prtesti 150 0.2333 150 0.0867

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 150

y: Number of obs = 150
------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .2333 .0345322 .1656181 .3009819
y | .0867 .0229758 .0416683 .1317317
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .1466 .0414772 .0653061 .2278939
| under Ho: .042332 3.46 0.001
------------------------------------------------------------------------------
diff = prop(x) - prop(y) z = 3.4631
Ho: diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

Pr(Z < z) = 0.9997 Pr(|Z| < |z|) = 0.0005 Pr(Z > z) = 0.0003Two

Anexo 10. Test de proporciones comparando las diferencias en cuanto a la

produccion de plantas

. prtesti 69 0.3768 69 0.2029

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .3768 .0583371 .2624614 .4911386
y | .2029 .0484142 .1080099 .2977901
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .1739 .07581 .0253152 .3224848
| under Ho: .0772418 2.25 0.024
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 2.251 z = 2.251 z = 2.251
P < z = 0.9878 P > |z| = 0.0244 P > z = 0.0122

. prtesti 69 0.2029 69 0.1304

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .2029 .0484142 .1080099 .2977901
y | .1304 .0405391 .0509448 .2098552
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .0725 .0631455 -.0512629 .1962629
 | under Ho: .0634464 1.14 0.253
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 1.143 z = 1.143 z = 1.143
P < z = 0.8734 P > |z| = 0.2532 P > z = 0.1266

. prtesti 69 0.2029 69 0.1159

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .2029 .0484142 .1080099 .2977901
y | .1159 .0385361 .0403706 .1914294
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .087 .0618787 -.0342799 .2082799
| under Ho: .0623203 1.40 0.163
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 1.396 z = 1.396 z = 1.396
P < z = 0.9186 P > |z| = 0.1627 P > z = 0.0814

. prtesti 69 0.2029 69 0.0725

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .2029 .0484142 .1080099 .2977901
y | .0725 .0312177 .0113144 .1336856
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .1304 .0576063 .0174938 .2433062
| under Ho: .058666 2.22 0.026
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 2.223 z = 2.223 z = 2.223
P < z = 0.9869 P > |z| = 0.0262 P > z = 0.0131

. prtesti 69 0.1304 69 0.0725

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .1304 .0405391 .0509448 .2098552
y | .0725 .0312177 .0113144 .1336856
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .0579 .0511661 -.0423836 .1581836
| under Ho: .0514029 1.13 0.260
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

 Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0
z = 1.126 z = 1.126 z = 1.126
P < z = 0.8700 P > |z| = 0.2600 P > z = 0.1300

. prtesti 69 0.1159 69 0.0725

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .1159 .0385361 .0403706 .1914294
y | .0725 .0312177 .0113144 .1336856
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .0434 .0495941 -.0538027 .1406027
| under Ho: .0497316 0.87 0.383
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 0.873 z = 0.873 z = 0.873
P < z = 0.8086 P > |z| = 0.3828 P > z = 0.1914

. prtesti 69 0.1304 69 0.0580

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .1304 .0405391 .0509448 .2098552
y | .058 .0281394 .0028478 .1131522
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .0724 .0493482 -.0243207 .1691207
| under Ho: .0497316 1.46 0.145
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 1.456 z = 1.456 z = 1.456
P < z = 0.9273 P > |z| = 0.1454 P > z = 0.0727

. prtesti 69 0.1304 69 0.0435

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .1304 .0405391 .0509448 .2098552
y | .0435 .0245563 -.0046294 .0916294
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .0869 .0473965 -.0059954 .1797954
| under Ho: .0479703 1.81 0.070
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 1.812 z = 1.812 z = 1.812
P < z = 0.9650 P > |z| = 0.0701 P > z = 0.0350
. prtesti 69 0.3768 69 0.2464

Two-sample test of proportion x: Number of obs = 69

y: Number of obs = 69

------------------------------------------------------------------------------
Variable | Mean Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
-------------+----------------------------------------------------------------
x | .3768 .0583371 .2624614 .4911386
y | .2464 .051876 .144725 .348075
-------------+----------------------------------------------------------------
diff | .1304 .0780662 -.0226069 .2834069
| under Ho: .0788514 1.65 0.098
------------------------------------------------------------------------------

Ho: proportion(x) - proportion(y) = diff = 0

Ha: diff < 0 Ha: diff != 0 Ha: diff > 0

z = 1.654 z = 1.654 z = 1.654
P < z = 0.9509 P > |z| = 0.0982 P > z = 0.0491

Anexo 11. Tabla de contigencia r x c efecto de la dilución bacteriana en la

regeneración

Procedimiento FREQ

Tabla de bacteria por MPE

bacteria MPE

Frequencia
Porcentaje
Pct fila
Pct col 100% 50% 75% Total

1_20 174 1086 809 2069

2.45 15.27 11.38 29.10
8.41 52.49 39.10
25.97 33.26 25.48

1_50 188 1640 1120 2948

2.64 23.07 15.75 41.46
6.38 55.63 37.99
28.06 50.23 35.28

control 308 539 1246 2093

4.33 7.58 17.52 29.44
14.72 25.75 59.53
45.97 16.51 39.24

Total 670 3265 3175 7110

9.42 45.92 44.66 100.00
Estadísticos para Tabla de bacteria por MPE

Estadístico DF Valor Probabilidad

Chi-cuadrado 4 506.1886 <.0001

Ratio chi-cuadrado de la verosimilitud 4 523.7675 <.0001
Chi-cuadrado Mantel-Haenszel 1 50.0227 <.0001
Coeficiente Phi 0.2668
Coeficiente de contingencia 0.2578
V de Cramer 0.1887

Anexo 12. Tabla de contingencia r x c efecto de la cepa en la regeneración de

los tejidos

Sistema SAS
Procedimiento FREQ

Tabla de cepa por MPE

cepa MPE

Frequencia‚
Porcentaje‚
Pct fila ‚
Pct col ‚100% ‚50% ‚75% ‚ Total

EHA105 ‚ 211 ‚ 1552 ‚ 1054 ‚ 2817

‚ 2.97 ‚ 21.83 ‚ 14.82 ‚ 39.62
‚ 7.49 ‚ 55.09 ‚ 37.42 ‚
‚ 31.49 ‚ 47.53 ‚ 33.20 ‚

control ‚ 308 ‚ 539 ‚ 1246 ‚ 2093

‚ 4.33 ‚ 7.58 ‚ 17.52 ‚ 29.44
‚ 14.72 ‚ 25.75 ‚ 59.53 ‚
‚ 45.97 ‚ 16.51 ‚ 39.24 ‚

pgv2260 ‚ 62 ‚ 307 ‚ 254 ‚ 623

‚ 0.87 ‚ 4.32 ‚ 3.57 ‚ 8.76
‚ 9.95 ‚ 49.28 ‚ 40.77 ‚
‚ 9.25 ‚ 9.40 ‚ 8.00 ‚

Pgv pCambiaP2 ‚ 89 ‚ 867 ‚ 621 ‚ 1577

‚ 1.25 ‚ 12.19 ‚ 8.73 ‚ 22.18
‚ 5.64 ‚ 54.98 ‚ 39.38 ‚
‚ 13.28 ‚ 26.55 ‚ 19.56 ‚
 Total 670 3265 3175 7110
9.42 45.92 44.66 100.00

Estadísticos para Tabla de cepa por MPE

Estadístico DF Valor Probabilidad

Chi-cuadrado 6 512.9164 <.0001

Ratio chi-cuadrado de la verosimilitud 6 531.6406 <.0001
Chi-cuadrado Mantel-Haenszel 1 1.3949 0.2376
Coeficiente Phi 0.2686
Coeficiente de contingencia 0.2594
V de Cramer 0.1899