UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL

DE HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE
FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos

aislados de las hojas de Psidium guajavaL.
"guayaba". Ayacucho-2013.

TESIS PARA OBTENER E L TÍTULO PROFESIONAL DE

QUÍMICO FARMACÉUTICA

PRESENTADO POR:
Bach.NALVARTE RUA, DALMA NERIA
AYACUCHO-PERÚ
2014
 A C T A D E SUSTENTACIÓN D E T E S I S

Bach. Dalma Neria N A L V A R T E R U A

R.D.N 075-2014-FCB-D
0

E n la ciudad de Ayacucho, siendo las 10:00 am del día 24 de julio de 2014, en el

local del Auditorio de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional de S a n Cristóbal de Huamanga, s e reunieron los miembros del jurado
evaluador, conformado por: Dr. Segundo Tomás Castro Carranza (Presidente),
Dr. Jesús De La C r u z A r a n g o (Miembro), Dr. Edwin Enciso Roca (Miembro), Mg.
Enrique Aguilar Felices (Asesor), Q.F. Hugo Luna Molero con la finalidad de
recepcionar la Tesis titulada " Actividad Antioxidante de los compuestos fenólicos
aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba", Ayacucho-2013,
presentado por la Bachiller en Farmacia y Bioquímica, Srta. Dalma Neria
Nalvarte Rúa para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutica.

El Sr. Decano, una vez visto los documentos sustentatorios de lo solicitado, y

estando conforme, s e invitó a la sustentante a dar inicio a la sustentación del
tema en un tiempo no mayor de 45 minutos, inmediatamente, la sustentante
inicio la exposición, concluida con la exposición, el Decano invito a los miembros
del jurado calificador a que realicen s u s interrogantes, pidan aclaración a lo que
vean por conveniente con la sustentante, concluida la sección de preguntas, las
mismas que fueron respondidas, el Decano invito a los asistentes y ala
sustentante a que abandonen momentáneamente el local con la finalidad de que
los miembros del jurado evaluador puedan discernir la calificación.

A continuación, los miembros hicieron su calificación con el siguiente resultado:

Jurado Evaluador Exposición Respuestas Promedio

Dr. Jesús De L a Cruz Arango 17.0 16.0 17.0

Dr. Edwin Carlos Enciso Roca 17.0 17.0 17.0

Mg. Enrique Javier Aguilar Felices 17.0 17.0 17.0

Q.F. Hugo Roberto Luna Molero 17.0 17.0 17.0
Dr. Segundo Tomás Castro Carranza 16.0 16.0 16.0
Promedio 17.0

De la calificación efectuada por los miembros del jurado calificador s e tiene el

promedio de Diecisiete (17.0) que e s Aprobado de lo cual dan fe los miembros
del jurado evaluador firmando al pie de la presente.
Acto seguido, invitaron a la sustentante y al público presente a ingresar al
ambiente para dar a conocer el resultado de la calificación, luego del cual se le
tomó el juramento de Ley.

Se culminó el acto siendo las 11:50 am del 24 de julio de 2014, firmando al pie
de la presente los miembros del jurado calificador como constancia del acto.

Miembro (Miembro Asesor)

Q.F. Hugotíoberto Luna Molero

Miembro - Secretario
 DEDICATORIA

A Dios, a mi madre y mis hermanos.

ü
 AGRADECIMIENTO

A la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga; por brindarme una

formación profesional.

A la Facultad de Ciencias Biológicas, y en especial a la Escuela de Formación

Profesional de Farmacia y Bioquímica.

A todos los Docentes de la Escuela de Formación Profesional de Farmacia y

Bioquímica quienes contribuyeron con mi formación académica. A mi asesor Mg.

Q.F. Enrique Javier Aguilar Felices por compartir sus conocimientos y dedicadas

orientaciones que hicieron posible el desarrollo y culminación de esta

investigación.

A todas las personas que colaboraron para la culminación del presente trabajo.

iii
 ÍNDICE GENERAL
Página
DEDICATORIA ii
AGRADECIMIENTO iii
ÍNDICE GENERAL iv
ÍNDICE DE TABLAS v
ÍNDICE DE FIGURAS vi
ÍNDICE DE ANEXOS vii
RESUMEN ix
I. INTRODUCCIÓN 1
II. MARCO TEÓRICO 4
2.1. Antecedentes 4
2.2. Psidium guajava L. "guayaba" 5
2.3. Compuestos fenólicos 8
2.4. Radicales libres 13
III. MATERIALES Y MÉTODOS 16
3.1. Ubicación del trabajo de investigación 16
3.2. Definición de población y muestra 16
3.3. Diseño metodológico para la recolección de datos 16
3.3.1. Recolección de muestra 16
3.3.2. Preparación del extracto etanólico 17
3.3.3. Tamizaje fitoquímico 17
3.3.4. Extracción de compuestos fenólicos 17
3.3.5. Identificación de compuestos fenólicos 17
3.3.6. Aislamiento de compuestos fenólicos 18
3.4. Determinación de la actividad antioxidante 19
3.4.1. Método de capacidad secuestradora del radical DPPH 19
3.5. Análisis de datos 21
IV. RESULTADOS 22
V. DISCUSIÓN 28
VI. CONCLUSIONES 32
VIL RECOMENDACIONES 33
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34
ANEXOS 38

iv
 INDICE DE TABLAS
Página

Tabla 1. Metabolitos secundarios del extracto etanólico de las hojas 23

de Psidium guajava L "guayaba". Ayacucho - 2013
Tabla 2. Características químicas de los compuestos fenólicos 24
aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba".
Ayacucho-2013
Tabla 3. Características cromatográficas de los compuestos 25
fenólicos aislados de las hojas de Psidium guajava L
"guayaba". Ayacucho - 2013
Tabla 4. Características espectrales de los compuestos fenólicos 26
aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba".
Ayacucho - 2013

v
 ÍNDICE DE FIGURAS

Página
Figura 1. Flavonoides aislados de Psidium guajava L 7
Figura 2. Estructura de los ácidos benzoicos 10
Figura 3. Estructura de los ácidos cinámicos 10
Figura 4. Núcleo básico de los flavonoides 11
Figura 5. Clasificación de flavonoides 12
Figura 6. Reacción de reducción del DPPH 19
Figura 7. Porcentaje de actividad secuestradora del radical libre 27
DPPH por efecto de los compuestos fenólicos aislados de
las hojas de Psidium guajava L "guayaba" en comparación
con el ácido caféico y la vitamina C. Ayacucho - 2013

vi
 INDICE DE ANEXOS
Página

Anexo 1. Certificado de identificación taxonómica de Psidium 39

guajava L. "guayaba". Ayacucho - 2013
Anexo 2. Flujograma de la obtención de los compuestos fenólicos de 40
Psidium guajava L "guayaba". Ayacucho - 2013
Anexo 3. Recolección de las hojas de Psidium guajava L "guayaba" 41
en la provincia de Huanta Ayacucho - 2013
Anexo 4. Equipo de rotavapor para la concentración del extracto 42
etanólico de Psidium guajava L "guayaba"
Anexo 5. Tubos de ensayo del tamizaje fitoquímico, reacción de 43
Shinoda y cloruro férrico del extracto etanólico de Psidium
guajava L. "guayaba". Ayacucho-2013
Anexo 6. Extracción líquido-líquido para la obtención de compuestos 44
fenólicos de Psidium guajava L "guayaba". Ayacucho -
2013
Anexo 7. Pruebas químicas de los compuestos fenólicos aislados de 45
las hojas de Psidium guajava L "guayaba". Ayacucho -
2013
Anexo 8. Cromatografía en capa fina de los compuestos fenólicos 46
aislados de Psidium guajava L. "guayaba" (I), ácido
clorogénico (II), quercetina (III) y ácido caféico (IV) revelado
con luz ultravioleta. Ayacucho - 2013
Anexo 9. Cromatografía en capa fina de los compuestos fenólicos de 47
Psidium guajava L "guayaba", revelados con cloruro férrico
al 5%. A y a c u c h o - 2 0 1 3
Anexo 10. Cromatografía en capa fina de los compuestos fenólicos de 48
Psidium guajava L. "guayaba", revelados con DPPH.
Ayacucho - 2013
Anexo 11. Cromatografía en capa fina y recuperación de fracciones de 49
Psidium guajava L "guayaba". Ayacucho - 2013
Anexo 12. Curva espectral de la fracción F 1 aislado de Psidium 50
guajava L "guayaba". A y a c u c h o - 2 0 1 3
Anexo 13. Curva espectral de la fracción F 2 aislado de Psidium 51
guajava L. "guayaba". Ayacucho - 2013

vii
Anexo 14. Curva espectral de la fracción F3 aislado de Psidium 52
guajava L "guayaba". Ayacucho - 2013
Anexo 15. Curva espectral del estándar de ácido benzoico. Ayacucho 53
-2013
Anexo 16. Curva espectral de la quercetina. Ayacucho - 2013 54
Anexo 17. Porcentaje de la actividad secuestradora del DPPH por 55
efecto de los compuestos fenólicos aislados de las hojas de
Psidium guajava L. "guayaba" en comparación con el ácido
caféico y la vitamina C. Ayacucho - 2013
Anexo 18. Análisis de varianza del porcentaje de la actividad 56
secuestradora del DPPH de los compuestos fenólicos
aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba".
Ayacucho - 2013
Anexo 19. Matriz de consistencia. Ayacucho - 2013 57

viii
 RESUMEN
Los compuestos fenólicos tienen propiedades biológicas como antiinflamatorias,
antihipertensivas y antioxidantes y se encuentran ampliamente distribuidas en
muchas especies vegetates. Como antioxidantes, los polifenoles pueden
proteger las células contra el daño oxidativo y por lo tanto limitar el riesgo de
varias enfermedades degenerativas asociadas al estrés oxidativo causado por
los radicales libres. E l presente trabajo de investigación se realizó con la
finalidad de determinar la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos
aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba", como objetivos identificar
los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de las hojas,
caracterizar mediante pruebas espectrales en el ultravioleta y evaluar la actividad
antioxidante de los compuestos fenólicos aislados de las hojas de Psidium
guajava L. "guayaba", sobre el radical libre del D P P H , durante los meses de
agosto del 2013 a enero del 2014. L a muestra fue recolectada en la provincia de
Huanta, departamento de Ayacucho, obteniéndose los compuestos fenólicos a
partir de un extracto etanólico, con solventes de diferente polaridad, realizándose
su identificación mediante ensayos cualitativos, cromatográficos y espectrales.
L a actividad antioxidante se realizó por el método de secuestramiento del radical
libre D P P H . S e identificó la presencia de azúcares reductores, lactonas y/o
cumarinas, flavonoides, fenoles y/o taninos y triterpenos. Los compuestos
fenólicos fueron caracterizados como ácido fenólico y flavonoides derivados de
la quercetina. L a actividad antioxidante fue de 98,30% a la concentración de 100
ug/mL, comparable al ácido caféico (100%) y el ácido ascórbico (100%). S e
concluye que los compuestos fenólicos aislados tienen actividad antioxidante.

Palabras clave: Psidium guajava L, compuestos fenólicos, antioxídante

ix
 I. INTRODUCCIÓN

A pesar del enorme progreso habido en los últimos años en el desarrollo de

nuevos fármacos, la mayoría de ellos siguen presentando efectos secundarios,

por lo que la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos más eficaces y seguros

sigue siendo una parte importante de la investigación farmacéutica. En este

sentido, el reino vegetal continúa siendo una fuente interesante de nuevos

agentes farmacológicos, ya que existen múltiples plantas medicinales que

poseen una gran diversidad de metabolitos secundarios con variadas

aplicaciones. Dado que nuestro país posee una enorme diversidad de plantas

medicinales debido a sus diferentes ecosistemas, representa en gran medida,

una rica fuente de alternativas de tratamiento de diversas enfermedades.

Diferentes estudios han mostrado que los radicales libres presentes en el

organismo humano causan daño oxidativo a diferentes moléculas, tales como

lípidos, proteínas y ácidos nucleicos y tiene que ver en la iniciación en algunas

enfermedades degenerativas. Actualmente el estudio de alimentos

1
con

propiedades antioxidantes ha aumentado considerablemente debido al interés

que se tiene sobre los efectos benéficos a la salud que previenen dichos

compuestos, tales como la prevención de cáncer, enfermedades

cardiovasculares y otras patologías de carácter inflamatorio. Además de que el

l
consumo frecuente de antioxidantes se relaciona con la disminución de otras

enfermedades como diabetes y enfermedades coronarias. 2

Los compuestos fenóücos son constituyentes importantes de la planta y les

otorga múltiples efectos benéficos, estos compuestos presentan una amplia

gama de actividades biológicas incluyendo la actividad antiinflamatoria,

antioxidante, anticancerígena, antihipertensiva y efectos protectores contra

enfermedades cardiovasculares, además pueden ejercer efectos antioxidantes

como el secuestro de radicales libres, donan moléculas de hidrogeno, barren

moléculas de superóxido, quelan metales de transición; todas estas propiedades

se deben principalmente al grupo hidroxilo presente en su anillo estructural. 1

Por otro lado, la ingesta de frutas y vegetales está asociada con bajas

incidencias de enfermedades degenerativas. Estos efectos protectores están

asociados a los compuestos antioxidantes que contienes los alimentos, frutas de

climas tropicales y subtropicales. Hay muchos estudios sobre la acción de

compuestos fenólicos en alimentos que previenen el cáncer y enfermedades

cardiacas. Estos compuestos son preferentemente oxidados en el medio

biológico y funcionan como nutrientes antioxidantes, protegiendo al organismo

contra el estrés oxidativo. 3

La guayaba es un fruto exótico proveniente de la región tropical y subtropical del

mundo. En la Amazonia peruana la guayaba es un fruto nativo, que es

ampliamente conocido por su alta calidad nutricional y por sus diversas

propiedades funcionales, entre las que se encuentran su actividad

antiinflamatoria, actividad analgésica, actividad antipirética, actividad

espasmolítica, actividad antibacterial y la actividad antioxidante 4

Por todas estas consideraciones y con el propósito de generar conocimiento

acerca de las propiedades de esta especie, es necesario conocer la actividad

2
antioxidante de los compuestos fenolicos aislados de las hojas de Psidium

guajava L. "guayaba", con los siguientes objetivos:

Objetivo General:

Evaluar la actividad antioxidante de los compuestos fenolicos aislados de las

hojas de Psidium guajava L. "guayaba".

Objetivos Específicos:

• Identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de

las hojas de Psidium guajava L "guayaba".

• Caracterizar los compuestos fenolicos de las hojas de Psidium guajava L.

"guayaba".

• Evaluar la actividad antioxidante de los compuestos fenolicos aislados de las

hojas de Psidium guajava L "guayaba", sobre el radical libre del D P P H .

3
 II. MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes

García y col en el año 2012 evaluaron la actividad antioxidante de los

compuestos fenólicos y flavonoides aislados de los extractos de seis colectas de

flores de Crataegus spp. La actividad antioxidante se midió con el método DPPH

(2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) y los flavonoides se identificaron con HPLC-MS. La

quercetina-3-O-glucósido, quercetina-3-O-ramnósido, quercetina 3-O-ramnosil-

(1-»6)-glucósido y quercetina 3-0-ramnosil-(1-»-2)-[ramnosil-(1-»-6)]-glucósido

fueron identificadas. Usando la prueba de DPPH con capacidad de barrido de

radicales, las recolectas 52 y 77 mostraron la mayor actividad antioxidante ( I C 50

= 431,1 ±27,2 y 555,4±8,0 ug mL' ).1 5

Gutiérrez y col en el año 2008 determinaron el contenido de fenoles totales y la

actividad antioxidante de los extractos de plantas usadas en la alimentación

animal. Los resultados de la actividad antioxidante indican que todos los

extractos fueron capaces de atrapar radicales DPPH de una manera

dependiente de la concentración. La actividad antioxidante de cada tipo de

planta expresada como concentración inhibidora media (IC ). Desmodium

50

molliculum mostró la más fuerte actividad antioxidante con una lC o de 221,30

5

ug/mL comparada con la Ipomea purpurea la cual presentó la más baja

4
capacidad de atrapar radicales D P P H con una I C 5 0 de 1963,36 ug/ml_. 6

Espinal en el año 2010 en estudios anteriores realizados en frutos y hojas de

guayaba se realizó la identificación y cuantificacion de los compuestos

polifenólicos asociados a la actividad antioxidante. E n estos estudios s e encontró

que los principales compuestos polifenólicos que contribuyen a la actividad

antioxidante de las hojas y de los frutos de la guayaba fueron la quercetina,

quercetin-3-glucósido, morina, y los ácidos protocatéquico, elágico, gálico y

clorogénico, siendo estos compuestos los patrones empleados para realizar la

identificación preliminar y la cuantificacion de los compuestos polifenólicos

presentes en el fruto de guayaba. 7

2.2 Psidium guajava L. "guayaba"

2.2.1 Clasificación taxonómica

DIVISIÓN MAGNOLIOPHYTA

CLASE MAGNOLIOPSIDA

SUB CLASE ROSIDAE

ORDEN MYRTALES

FAMILIA MYRTACEAE

GÉNERO : Psidium

ESPECIE Psidium guajava L.

N O M B R E COMÚN : "guayaba"

Fuente: Certificado emitido por el Herbariun Huamangensis de la Facultad de

Ciencias Biológicas (2013) (Anexo 1).

2.2.2 Descripción botánica

Árbol de 6 m, de tronco torcido y ramoso de corteza liza y parda; hojas verdes,

opuestas, pecíolo corto, elípticas, redondas en el ápice y en la base, múltiples

venas horizontales, provistas de glándulas oleíferas; flores actinomorfas,

5
blancas, solitarias o en pequeños grupos, que aparecen en las axilas de las

hojas, tienen 4-5 pétalos y numerosos estambres; fruto en baya redondeada con

el cáliz de la flor persistiendo, aromáticos, piriformes, cáscara amarilla, carnaza

rosada, por fuera firme, al centro suave, con pulpa jugosa y semillas color café,

redondas y duras. 8,9

2.2.3 Distribución

La familia Myrtaceae posee alrededor de 131 géneros y unas 4620 especies, el

género Psidium está ampliamente distribuido en regiones tropicales como

Panamá, Brasil, Colombia, Ecuador, y Perú. 10

En la Amazonia peruana la guayaba es un fruto nativo y no tiene plantaciones

establecidas. El árbol puede encontrarse silvestre o cultivado en tipos de

4

vegetación que van desde áreas cultivadas pasando por bosques de encino,

bosques de pino-encino, hasta la selva alta perennifolia. Los suelos donde se

desarrolla esta especie son principalmente poco drenados y calizos en altitudes

que van de 850 a 1700 m. 11

2.2.4 Composición química

Las hojas de esta planta contienen taninos y fenoles, flavonoides y triterpenos y

esferoides, así como de saponinas y compuestos aminados. Contiene, además,

ácido guajanoico, ft-sitosterol, uvaol, ácido oleanólico y ácido ursólico; ácido 2- a -

hidroxiursólico, morin-3-O- a -L-arabopiranosido, hiperina, miricetina-3-O- a - D-

glucósido, quercetin-3-O-fc-D-glucuronopiranosido, 1-O-galoil- a -D-glucosa. Se ha

informado la presencia de ácido ascórbico y de otros flavonoides, así como

azúcares reductores y alcaloides. 12

En estudios fitoquímicos realizados en el fruto se determinó la presencia de

polifenoles, taninos, terpenos, gücósidos esferoidales, antraquinonas; en la raíz se

encontró leucoantocianinas, esteróles y ácido gálico. La corteza contiene 10% de

elagitaninos ( 4 - 6 hexahidroxidifenilglucosa, telimagrandina f y El, peduncularina,

6
casuarinina, estaquicerina, estrictinitinina, casuarina). E l extracto etanólico de flores

contiene ácido oleanólico, ácido elágico, quercetina y glicósidos flavonoides

(guajaverina). 9

Quercetina Guajaverina

Figura 1. Flavonoides aislados de Psidium g u a / a v a 9,11

De Psidium guajava se aislaron una nueva benzofenona y un flavonol de naturaleza

galoil-glicósido, conjuntamente con 5 nuevos quercetin-glicósidos. S e ha informado

el aislamiento de 16 nuevos flavonoides y de 4 nuevos triterpenos. E n las hojas 12

también se determinó la presencia de flavonoides derivados de quercetina como

guajaverina y avicularina, debido a que en estudios realizados en la que se han

aislado flavonoides como la quercetina. 9

E n estudios anteriores realizados en frutos y hojas de guayaba de variedades

desconocidas s e realizaron la identificación y cuantificación de los compuestos

polifenólicos. E n estos estudios s e encontró que los principales compuestos

polifenólicos de las hojas y de los frutos de la guayaba fueron la quercetina,

quercetina-3-glucosido, morina, y los ácidos protocatéquico, elágico, gálico y

clorogénico. 13

2.2.5 Usos tradicionales

La decocción de hojas y corteza se usa por vía oral para tratar afecciones digestivas

(amebiasis, diarrea, disentería, cólico, dolor de estómago, parasitismo intestinal,

vómito), anemia, artritis, diabetes, hemorragia, hinchazón, asma y resfrío. La

decocción de raíz se usa para tratar hidropesía. La decocción por vía tópica en

7
baños y lavados para tratar enfermedades dermatomucosas (fístulas, leucorrea,

raspones, tinea, úlcera) y enjuagues para lengua inflamada. 9

2.3 Compuestos fenólicos

Son metabolitos secundarios producidas por todas las plantas, un grupo de

substancias que poseen en común un anillo aromático con uno o más

sustituyentes hidroxilos y que ocurren frecuentemente como glicósidos,

combinados con unidades de azúcar. Son relativamente polares y tienden a ser

solubles en agua; pueden ser detectados por el intenso color verde, azul o

negro, que producen cuando se les agrega una solución acuosa o alcohólica al

1 % de cloruro férrico. 14

Actualmente el, interés en los compuestos antioxidantes (fenólicos) ha

aumentado debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos

compuestos antioxidantes en la salud humana. Específicamente se han

encontrado varios efectos preventivos en diferentes enfermedades como la

prevención de cáncer, las enfermedades coronarias del corazón, los desórdenes

inflamatorios, la degeneración neurológica, envejecimiento, etc. Además estos

2

compuestos fenólicos son utilizados para tratar enfermedades relacionadas con

procesos inflamatorios y desordenes cardiovasculares debido a la actividad que

ejercen sobre el sistema circulatorio, mejorando la circulación periférica, la

movilización del colesterol y disminuyendo la fragilidad capilar. 15

Los compuestos fenólicos tienen una gran capacidad antioxidante, considerado

la actividad biológica responsable del efecto preventivo sobre algunas

enfermedades y el mecanismo por el que actúan reside en su capacidad para

captar radicales libres que se pueden generar en las células del cuerpo humano

y que son resultado de la combinación de muchos factores ambientales. Así, 16

los compuestos fenólicos intervienen como antioxidantes naturales de los

alimentos, por lo que la obtención y preparación de alimentos con un alto

8
contenido en estos compuestos, supone una disminución en la utilización de

aditivos antioxidantes de origen sintético. 17

2.3.1 Clasificación

Los polifenoles se pueden clasificar de muchas maneras debido a su diversidad

estructural. Según su estructura química tenemos dos grandes grupos:

Ácidos fenólicos

Derivados del ácido benzoico C6-C1 y derivados del ácido cinámico C6-C3. 18

Flavonoídes (C6-C3-C6)

Formados por dos grupos bencénicos unidos por un puente tricarbonado,

antocianos, isoflavonas, flavonas, flavononas, flavanoles y flavanonoles, taninos

condensados y lignanos. 18

2.3.2 Ácidos fenólicos

Estos compuestos tienen una función carboxílica y un grupo hidroxílico fenólico,

estos compuestos derivan del ácido benzoico (anisaldehido, vanillina, ácido

verátrico, ácido anísico, ácido gálico,) y del ácido cinámico (clorogénico, cafeico,

ferúlico y sináptico, p-cumarico, elágico). Algunos autores afirman que el ácido

19

elágico tiene como función detectar y restaurar células carentes del gen P53,

gen encargado de la apoptosis y del control de la proliferación celular

responsable del cáncer. 10

Los ácidos fenólicos tienen propiedades antisépticas urinarias, propiedades

antiinflamatorias de los derivados salicílicos. Inhiben la 5-lipooxigenasa de

granulocttos humanos, de ello resulta una inhibición en la formación de

hidroperoxidos y leucotrienos que podrían justificar el empleo en el tratamiento

de enfermedades inflamatorias o alérgicas. 20

Los ácidos fenólicos tienen gran importancia debido a su amplia actividad

biológica como son: antioxidantes, antivirales, antitumorales, antifúngicos,

antimutagénicos, hepatoprotectores, antiinflamatorias e inmunoestimulantes. La

9
actividad antioxidante de los ácidos fenólicos denominados ácidos de serie

cinámica son más activos que los derivados hidroxi del ácido benzoico debido a

que poseen grupos O H y carbonilo no unidos directamente al anillo bencénico. 21

• Ácidos fenólicos derivados del ácido benzoico

ácido p-hidroxibenzoico
ácido vaníllico
ácido gálico
ácido siríngico

Ácido p-hidroxibenzoico

Figura 2. Estructura de los ácidos benzoicos 1 9

Ácidos fenólicos derivados del

Ri R 2

ácido cinámico
O H ácido p-cumárico

OH H ácido caféico
COOH OCH H
3 ácido ferúlico

OCH 3 OCH 3 ácido sináptico

Ácido p-hidroxicínamico

19
Figura 3. Estructura de los ácidos cinámicos

2.3.3 Fiavonoides

El término fiavonoides denota un grupo muy amplio de compuestos polifenólicos

caracterizados por una estructura benzopirano, los cuales están ampliamente

distribuidos en el reino vegetal y se encuentran de forma universal en las plantas

10
vasculares, en forma de glicósidos. Químicamente, estas sustancias son de

naturaleza fenólica y se caracterizan por poseer dos anillos aromáticos

bencénicos unidos por un puente de tres átomos de carbono, con la estructura

general C6-C3-C6, los cuales pueden formar o no un tercer anillo. 22

Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que

protegen al organismo del daño producido por agentes oxidantes, como los

rayos ultravioletas, la polución ambiental, sustancias químicas presentes en los

alimentos, etc. Estos contienen en su estructura química un número variable de

grupos hidroxilo fenólicos que tienen excelentes propiedades de quelación del

hierro y otros metales de transición, lo que les confiere una gran capacidad

antioxidante. Por ello, desempeñan un papel esencial en la protección frente a

los fenómenos de daño oxidativo, y tienen efectos terapéuticos en un elevado

número de patologías, incluyendo la cardiopatia isquémica, la aterosclerosis o el

cáncer. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia

los radicales hidroxilo y superóxido, especies altamente reactivas implicadas en

el inicio de la cadena de peroxidación lipídica y se ha descrito su capacidad de

modificar la síntesis de eicosanoides (con respuestas anti-prostanoide y anti-

inflamatoria), de prevenir la agregación plaquetaria (efectos antitrombóticos) y de

proteger a las lipoproteínas de baja densidad de la oxidación (prevención de la

placa de ateroma). 23

3'

23
Figura 4. Núcleo básico de los flavonoides

11
2.3.4.1 Clasificación

Los flavonoides se clasifican en varios grupos de acuerdo con las variantes

estructurales que presentan: flavonas, flavonoles, flavanoles, isoflavonas y

antocianidinas. Como se muestra en la Figura 5.

Figura 5. Clasificación de flavonoides

2.3.4.2 Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos

El comportamiento antioxidante de los compuestos fenólicos parece estar

relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la lipoxigenasa y

captar radicales libres, aunque en ocasiones también pueden promover

reacciones de oxidación in vitro 2

Todos tienen en su estructura uno o más

anillos aromáticos con al menos un sustituyente hidroxilo. Su estructura química

es propicia para secuestrar radicales libres, debido a la facilidad con la que el

átomo de hidrógeno desde el grupo hidroxilo aromático puede ser donado a la

especie radical, y a la estabilidad de la estructura química resultante que soporta

un electrón desapareado. La actividad antioxidante de los polifenoles depende

del número y la localización de los grupos hidroxilo que contienen en su

estructura. 25

12
Para que un compuesto fenólico sea clasificado como antioxidante debe cumplir

dos condiciones básicas:

• Cuando se encuentre en una concentración baja con relación al sustrato

que va a ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidación o la

oxidación mediada por un radical libre.

• El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en

oxidaciones posteriores. 2

2.4 Radicales libres

Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón

desapareado, por lo que son muy reactivos, ya que tienden a captar un electrón

de otros átomos con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica. Una vez

que el radical libre ha conseguido sustraer el electrón (reducción) que necesita,

la molécula estable que lo pierde (oxidación) se convierte a su vez en un radical

libre por quedar con un electrón desapareado, iniciándose así una reacción en

cadena. Debido a que estas especies reactivas no poseen receptores

específicos, tienen una capacidad de agresión indiscriminada sobre células y

tejidos vivientes. Como producto de nuestro metabolismo se generan distintos

tipos de radicales libres, tales como: Especies Reactivas de Oxígeno (ERO: el

anión superóxido, el anión peróxido, el radical perhidroxilo, el radical hidroxilo) y

Especies Reactivas de Nitrógeno (ERN: óxido nítrico, radical peroxinítrito), entre

otros, cuya principal fuente son las mitocondrias, los lisosomas, los peroxisomas,

así como la membrana nuclear, citoplásmica y del retículo endoplásmico,

además cumplen numerosas funciones útiles en el organismo (de hecho, nuestro

propio cuerpo los fabrica en cantidades moderadas para luchar, por ejemplo,

contra las infecciones), pero en cantidades excesivas tienen el potencial de

dañar nuestras células y el material genético allí contenido. 26,27

13
Los radicales libres también son generados por factores como: la contaminación

ambiental, la exposición a radiaciones ionizantes, el tabaco, los medicamentos,

los aditivos químicos en alimentos procesados y algunos xenobióticos como

pesticidas, herbicidas y fungicidas, las cuales pueden ejercer su acción nociva

en el organismo. En condiciones fisiológicas normales, el organismo neutraliza

las ERO a través de varios mecanismos antioxidantes que involucran la

producción de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa, catalasa,

glutatión peroxidasa y otras, para prevenir el daño oxidante. 26

2.4.1 Formación de los radicales libres

a) Fuentes endógenas: Los radicales libres son elaborados continuamente

como un producto del metabolismo normal de cada célula e inactivados por un

conjunto de mecanismos (unos enzimáticos y otros de atrapamiento). Al elevarse

las concentraciones fisiológicas de las especies reactivas de oxígeno (ROS)

pueden acarrear importantes alteraciones funcionales. 28

b) Fuentes exógenas: los radicales libres se producen como respuesta a la:

Contaminación ambiental, la exposición a radiaciones ionizantes, luz ultravioleta,

ciertas drogas, toxinas fúngicas, pesticidas o xenobióticos, reactivos, solventes

industriales, componentes del tabaco, los medicamentos. 28

2.4.2 Especies reactivas del oxígeno (ERO)

El oxígeno molecular ( 0 ) tiene dos electrones no apareados en su orbital externo,

2

su reactividad resulta de esta propiedad biradical. Debido a su labilidad química,

puede dar origen a ERO, que son moléculas muy reactivas, tienen una vida media

corta, por lo que actúan cercano al sitio en que se forman. Su gran reactividad se

debe a que poseen electrones desapareados que les hace reaccionar con otras

moléculas orgánicas en procesos de óxido-reducción. 26,29

Las principales especies reactivas del oxígeno son:

• Radical hidroxilo (HO°)

14
• Peróxido de hidrógeno (H 0 ) 2 2

• Anión superóxido (0° ) 2

• Oxígeno singlete (°0 ) 2

• Peróxido (ROO ). 0 29

2.4.3 Estrés oxidativo

El estrés oxidativo es una condición que se manifiesta en el organismo cuando

la producción de sustancias altamente reactivas supera los mecanismos

antioxidantes y está relacionada con numerosas enfermedades como cáncer,

diabetes y alteraciones cardiovasculares. 26

2.4.4 Sistema de protección antioxidante

El sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustancias

que al estar presente en concentraciones bajas con respecto al sustrato

oxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación de este. Los

antioxidantes impiden que otras moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar-

interactuar más rápido con los radicales libres del oxígeno y las especies

reactivas del oxígeno que con el resto de las moléculas presentes, en un

determinado microambiente-membrana plasmática, citosol, núcleo o líquido

extracelular. 3 3
El antioxidante al reaccionar con el radical libre cede un electrón,

se oxida y se transforma en un radical libre débil no tóxico. 30

2.4.5 Clasificación de los antioxidantes

• Exógenos: vitamina E, vitamina C, beta caroteno, flavonoides, licopenos.

• Endógenos: glutatión, coenzima Q, ácido tioctico.

• Cofactores: cobre, zinc, manganeso, hierro, selenio. 27

15
 Ill MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Ubicación del trabajo de investigación

El presente trabajo de Investigación se llevó a cabo en los Laboratorios de

Farmacognosia y Farmacología del Área académica de Farmacia de la Facultad

de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional San Cristóbal de Huamanga,

durante los meses de agosto del 2013 a enero del 2014.

3.2 Definición de la población y muestra

Población: Hojas de Psidium guajava L. "guayaba" de la provincia de Huanta,

departamento Ayacucho.

Muestra: Un kg de hojas secas de Psidium guajava L. "guayaba".

3.3 Diseño metodológico para la recolección de datos

3.3.1 Recolección de la muestra

Se procedió a recolectar las hojas sanas y frescas de una sola planta de Psidium

guajava L. "guayaba", mediante un muestreo por conveniencia (Anexo 3), para

luego lavarlos con la finalidad de eliminar posibles contaminantes, después se

procedió al secado a medio ambiente durante siete días, después se trituró con

un molino; una parte de la planta con hojas y flor fue utilizada para la

identificación taxonómica en el Laboratorio de la Facultad de Ciencias Biológicas

(Anexo 6).

16
3.3.2 Preparación del extracto etanólico

Un kg de muestra seca y molida se maceró en frascos de color ámbar por un

período de una semana en nueve litros de alcohol de 96° cuyo volumen cubrió la

muestra. Durante el proceso se agitó mecánicamente el frasco para que el

alcohol se distribuya homogéneamente en la muestra. Luego se procedió a

filtrar, concentrar en un rotavapor y luego en una estufa a 40°C, hasta obtener un

extracto seco (Anexo 4).

3.3.3 Tamizaje fítoquímico

La identificación cualitativa de los principales grupos de metabolitos secundarios

se realizó mediante ensayos de coloración y precipitación 31

(Anexo 5).

3.3.4 Extracción de los compuestos fenólicos

El extracto etanólico seco se reconstituyó con agua destilada y se trató con 300

mi de éter de petróleo con la finalidad de eliminar grasas, ceras, pigmentos y

otros metabolitos que puedan interferir con la extracción de los compuestos

fenólicos. La extracción líquido-líquido se realizó con 300 mi de acetato de etilo

en un embudo de separación, para recuperar finalmente la fracción de acetato

de etilo donde se encuentra los compuestos fenólicos 3 2

(Anexo 6).

3.3.5 Identificación de compuestos fenólicos

Pruebas cualitativas.

• Reactivo de cloruro férrico: Se añadió unas gotas de cloruro férrico, sobre la

fracción de acetato de etilo.

• DPPH 2 mg%: Se añadió unas gotas de DPPH, sobre la fracción de acetato

de etilo.

• Permanganato de potasio: Se añadió unas gotas de permanganato de

potasio, sobre la fracción de acetato de etilo (Anexo 7).

17
Cromatografía en capa fina (CCF)

Sistema cromatográfico:

• Fase estacionaria: Placa cromatográfica 20 x 20 conteniendo Silicagel G 254

(Merck)

• Fase móvil: butanol: ácido acético: agua (4:1:5)

• Volumen de inyección: 20 pl

• Revelador: Luz ultravioleta, cloruro férrico y DPPH.

La fracción de acetato de etilo se disolvió en 0,5 mi de metanol y mediante un

capilar de vidrio, se aplicó en la parte inferior de la placa cromatográfica

previamente activada (fase estacionaria), se colocó la placa de C C F en la

cámara teniendo cuidado que el solvente butanol: ácido acético: agua (4:1:5) no

sobrepase a la muestra aplicada y dejándose que el líquido ascienda por

capilaridad. Posteriormente se procedió a sacar la placa cromatográfica teniendo

en cuenta que el solvente haya llegado hasta los 2 cm de la parte superior de la

placa, se dejó secar la placa de C C F al aire libre y se observó con la lámpara UV

CAMAG la presencia de fluorescencia (Anexo N° 8), finalmente se reveló con

cloruro férrico al 1% y DPPH y se observó la presencia de manchas (Anexo 9 y

10).

3.3.6 Aislamiento de los compuestos fenólicos

Sistema cromatográfico:

• Fase estacionaria: Placa cromatográfica 20 x 5 conteniendo Silicagel G 254

(Merck)

• Fase móvil: butanol: ácido acético: agua (4:1:5)

La siembra de la fracción de acetato de etilo se realizó en bandas con el

propósito de aislar los compuestos fenólicos, los cuales se evidenciaron en la luz

18
ultravioleta. Estas bandas fueron recuperados, disueltos en metanol y filtrados,

obteniéndose tres bandas (anexo 11).

Pruebas espectrales

Las bandas obtenidas fueron leídas en el espectrofotómetro ultravioleta

G E N E S Y S 6, en el rango de 200 a 500 nm, registrándose los máximos picos de

absorción.

3.4 Determinación de la actividad antioxidante

3.4.1 Método de la capacidad secuestradora del radical DPPH

Fundamento: El radical libre y estable DPPH, es una sustancia que mide la

capacidad de secuestro de cualquier compuesto con actividad antioxidativa. Se

caracteriza como un radical libre estable en virtud de la deslocalización del

electrón libre en toda la molécula, de manera que las moléculas no dimerisen,

como en el caso de la mayoría de otros radicales libres. La deslocalización

también da lugar a un color violeta oscuro, que se caracteriza por una banda de

absorción en solución de etanol a aproximadamente 517 nm. Cuando una

solución de DPPH se mezcla con la de una sustancia que puede donar un átomo

de hidrógeno, entonces esto da lugar a la forma reducida con la pérdida de este

color violeta. 33

DPPH amarillo
violeta

Figura 6. Reacción de Reducción del D P P H 33

19
Procedimiento:

Para el ensayo se utilizó lo siguiente:

• Una solución metanólica de DPPH de 20 ug/l.

• Una solución metanólica del extracto a una concentración de 300 ug/ml

(solución A)

• Una solución blanco de metanol: agua (2:1) para ajustar el

espectrofotómetro a cero.

• Un blanco de muestra con 0,75 mi de muestra (solución A) más 1,5 mi de

metanol.

• Un patrón de referencia con 1,5 mi de DPPH más 0,75 mi de agua destilada.

• La muestra, con 0,75 mi de solución A y 1,5 mi de DPPH obteniéndose una

solución final de 100 ug/ml.

• Inmediatamente se dejó a temperatura ambiente por 5 minutos y se realizó

la lectura de la absorbancia a 517 nm en el espectrofotómetro.

• Se diluyó la solución A (2) con metanol en una proporción de 1:1 para

obtener una solución final de 50 ug/m! (solución B) y luego en una

proporción de 1:9, para obtener una concentración final de 10 ug/ml

(solución C).

• Con la solución B y C se procedió igual que el anterior.

• Para la comparación, el estándar Vitamina C y ácido caféico, se preparó

siguiendo el mismo procedimiento que conlleva a lograr concentraciones de

100 ug/ml, 50 ug/ml y 10 ug/ml.

Para los cálculos del porcentaje de actividad antioxidante se empleó la siguiente

fórmula:

Ac - (Am - Ab)
AA% = — - x 100
Ac

20
Dónde:

AA%: porcentaje de actividad antioxidante.

Ac: Absorbancia del D P P H .

Am: Absorbancia de la muestra.

Ab: Absorbancia del blanco.

3.5 Análisis de datos

Los resultados de la actividad antioxidante se representaron en forma de gráficos

en función de las medias. L a s diferencias entre las medias fueron contrastadas

mediante el Análisis de Varianza Factorial (ANOVA) a un nivel de confianza del

9 5 % (p<0,05).

21
IV. R E S U L T A D O S

22
Tabla 1. Metabolites secundarios del extracto etanólico de las hojas de Psidium
guajava L "guayaba". Ayacucho - 2013

Meta bol ¡tos Ensayos Resultados Observaciones

secundarios

Azúcares Benedict ++ Precipitado rojo

reductores

Lactonas y/o Baljet ++ Precipitado rojo

cumarinas

Flavonoides Shinoda +++ Fase amílica de color rojo

intenso

Fenoles y/o Cloruro férrico +++ Coloración verde intensa

taninos

Triterpenos y/o Liebermann- Coloración verde oscura

estero id es Bu renard

Leyenda:
(+) : Leve
(++) : Moderada
(+++) : Abundante

23
Tabla 2. Características químicas de los compuestos fenolicos aislados de las
hojas de Psidium guajava L. "guayaba". Ayacucho - 2013

Características

Prueba de Prueba de
Fracción DPPH
FeCI 5% 3 KMn0 4

FeCI 3 KMnO* DPPH

Acetato +++ +++ +++

de etilo verde decolora,
decolora
oscuro precipita

Leyenda:
(+) : Leve
(++) : Moderada
(+++) : Abundante

24
Tabla 3. Características cromatograficas de los compuestos fenólicos aislados
de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba". Ayacucho - 2013

Fracción Revelador

Fluorescencia FeCI 3 DPPH

Acetato de etilo (violeta - púrpura) marrón Amarillo

Ac. clorogenico Celeste marrón Amarillo

Ac. Caféico Celeste marrón Amarillo

Quercetina Amarillo marrón Amarillo

25
Tabla 4. Características espectrales de los compuestos fenólicos aislados de las
hojas de Psidium guajava L "guayaba". Ayacucho - 2013

Fracción Sub-fracciones Ultravioleta (nm)

F1 (verde - celeste) 292 nm

Acetato de etilo

F2 (marrón - oscuro) 257 nm y 359 nm

F3 (violeta - púrpura) 259 nm y 356 nm

Acido benzoico 230 nm y 270 nm

26
 Concentración

• 100ug/m!

• 50ug/ml

I
D 10 ug/mi
Acido cafeíco Vitamina C Compuestos fenólicos

Tratamientos

Figura 7. Porcentaje de actividad secuestradora del radical libre DPPH por efecto
de fos compuestos fenólicos aislados de las hojas de Psidium guajava L
"guayava" en comparación con el ácido caféico y la vitamina C. Ayacucho - 2013

27
 V. DISCUSIÓN

Los procesos normales del organismo producen radicales libres (sustancias

químicas inestables) como el metabolismo de los alimentos, la respiración y el

ejercicio. Estos pueden producir daños oxidativos en diversas macromoléculas

biológicas, lo que puede propiciar el inicio de enfermedades degenerativas

como: cáncer, inflamación, cardiopatías, cataratas, etc. Por lo que, se ha

generado un gran interés hacia el papel que ejercen los antioxidantes. 34

Para la extracción de los compuestos fenólicos, se utilizó una secuencia de

disolventes con polaridad creciente. 35

De esta manera, se procedió a la

extracción de los compuestos fenólicos con diferentes solventes, primero con

etanol para la extracción de los metabolitos secundarios presentes en Ea planta,

segundo con el éter de petróleo para poder eliminar las resinas y grasas del

extracto, después se trató con acetato de etilo para extraer los compuestos

fenólicos presentes (Anexo 6).

1

En el tamizaje fitoquímico del extracto etanólico desarrollado según la técnica de

Lock de Ugaz 14
y Miranda , se reporta la presencia de los metabolitos
31

secundarios como: azúcares reductores, catequinas, lactonas y/o cumarinas,

flavonoides, fenoles y/o taninos, triterpenos y/o esteroides (Tabla 1 y Anexo 5), lo

cual coincide con lo reportado por Rodrígez. 12

Por lo que, asumimos que la

presencia de estos metabolitos secundarios podrían ser los responsables de su

28
capacidad antioxidante. Los metabolitos secundarios encontrados en

abundancia fueron: fenoles y/o taninos, flavonoides, azúcares reductores,

lactonas y/o cumarinas, los compuestos fenólicos pueden ser detectados por el

intenso color verde, azul o negro que producen cuando se le agrega el cloruro

férrico al 5 % . 14
E n la reacción de Shinoda para identificar flavonoides da una

coloración roja, el cambio de color de amarillo a rojo indica la presencia de

flavonas y flavonoles, color rojo presencia de flavanonas , así mismo, en la 15

reacción de cloruro férrico para identificar fenoles y/o taninos da una coloración

verde intensa y en concentraciones moderadas se encontró azúcares

reductores, lactonas y/o cumarinas, en la prueba de Benedict para los azúcares

reductores dan un precipitado de color rojo, la prueba de Baljet para identificar

lactonas y/o cumarinas dan un precipitado de color rojo.

E n las pruebas químicas realizadas de los compuestos fenólicos aislados (Tabla

2 y Anexo 7), fueron diferenciadas por las pruebas de cloruro férrico al 5 % , con

K M n 0 y D P P H , en la prueba química con F e C l a l 5 % se produjo un color verde

4 3

oscuro identificándose presencia de grupos fenólicos en abundante

concentración. L a prueba química con K M n 0 produce un cambio de coloración

4

y un precipitado intenso, este cambio de coloración del K M n 0 s e debe a que 4

ésta se reduce debido a la acción de los compuestos fenólicos. 19

E n la prueba

química con D P P H s e observa la decoloración del radical libre, debido a que el

radical libre tiene un electrón desapareado y es de color violeta decolorándose a

amarillo cuando reacciona con los compuestos fenólicos que pueden donar un

átomo de hidrogeno. 6 3 5
Dado que todas las reacciones son positivas podemos

afirmar que los compuestos fenólicos aislados de las hojas de Psidium guajava

L. tienen actividad antioxidante.

En la Tabla 3 y Anexo 8, s e observa la presencia de manchas fluorescentes de

color violeta-púrpura a la luz ultravioleta, de lo cual s e deduce que s e trata de un

29
compuesto fenólico, cuando se revela la misma placa con cloruro férrico al 1 % y

D P P H (Anexo 9 y 10), s e observan manchas de color marrón y amarillo a !a luz

visible. Esta mancha de color púrpura a la luz UV indican que se trata de

compuestos fenólicos. 14
Estudios realizados en Psidium guajava L. se

determinaron la presencia de flavonoides derivados de quercetina (guajaverina y

avicularina), un flavonol de naturaleza galoil-glicósido, conjuntamente con 5 nuevos

quercetin-glicósidos y se han aislado flavonoides como la quercetina. 9,12

Para la caracterización de los compuestos fenólicos s e utilizó la espectroscopia

ultravioleta, lográndose separar tres bandas a partir de la fracción de acetato de

etilo ( F 1 , F 2 y F3) (Anexo11). L a fracción F 1 que corresponde a un compuesto

fenólico con una fluorescencia verde-celeste y muestra una absorbancia máxima

en el espectro ultravioleta a 292 nm, la fracción F 2 corresponde a un compuesto

fenólico con una fluorescencia marrón-oscuro y muestra una absorbancia

máxima en el espectro ultravioleta a 257 y 359 nm, la fracción F 3 corresponde a

otro compuesto fenólico con una fluorescencia violeta-púrpura y muestra una

absorbancia máxima en el espectro ultravioleta a 259 y 356 nm (Anexo 12, 13 y

14).

L a quercetina en el espectro UV-Vis tiene picos de absorción de 259 - 356 nm

(Anexo 1 6 ) . 36
L a absorbancia de las fracciones F 2 y F 3 son similares al espectro

de absorción de la quercetina, por lo que podemos asumir que se trata de dos

flavonoides derivados de la quercetina, lo cual coincide con lo reportado por

Ordoñez y Rodríguez. 4,12

E l ácido benzoico tiene una absorbancia máxima en el

espectro ultravioleta a 230 y 270 nm (Anexo 15), que e s similar a la absorbancia

de la fracción F 1 . Por lo que, s e asume que se trata de un derivado del ácido

benzoico.

En la Figura 7, se muestra que los compuestos fenólicos aislados de las hojas de

Psidium guajava L. demostraron tener actividad antioxidante al captar el radical

30
libre D P P H . Esta capacidad antioxidante de estos compuestos se debe

principalmente a s u s propiedades redox, el cual les permite actuar como agente

reductor donante de hidrógeno, desactivadores de hidrógeno singlete o

quelantes de metales, además depende de su estructura con gran presencia de

dobles enlaces, y los propios grupos fenólicos, que según su número y posición

puede actuar como dadores de protones y reductores, le permite capturar

radicales libres y neutralizarlos sin alterar grandemente su estructura. 37

L a concentración de 10 ug/ml tuvo una actividad antioxidante del 95,29%, los de

50 ug/ml en un 96,60% y los de 100 ug/ml en 98,30%, y los estándares ácido

caféico y ácido ascórbico en 99,62% y 99,73%. Si comparamos los porcentajes

de captación de radicales libres de los estándares con los compuestos fenólico

aislados podemos decir que las concentraciones de 10 ug/ml, 50 ug/ml y 100

ug/ml de compuestos fenólicos tiene una actividad antioxidante ligeramente

inferior a los estándares. L a capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos

depende de su estructura molecular, la cual influye en la facilidad con la que un

átomo de hidrógeno de un grupo hidroxilo aromático puede ser donado a un

radical libre y en la habilidad de un fenol de soportar un electrón no apareado. 38

Por lo tanto, un nutriente tiene propiedades antioxidantes cuando e s capaz de

neutralizar la acción oxidante de la molécula inestable de un radical libre sin

perder su propia estabilidad electroquímica. 39

L a vitamina C es un poderoso

antioxidante hidrosoluble tiene la propiedad de reaccionar con el anión O " y el 2

radical O H , inhibe la oxidación de los lípidos, actúa contra las enfermedades

cardiacas, cáncer y otros trastornos degenerativos. 28,8

Con estos resultados obtenidos en el presente trabajo podemos afirmar que los

compuestos fenólicos aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba"

tiene actividad antioxidante.

31
 VI. CONCLUSIONES

1. Los compuestos fenólicos aislados de las hojas Psidium guajava L.

"guayaba" tienen actividad antioxidante.

2. El extracto etanólico de las hojas Psidium guajava L. "guayaba", presenta

metabolites secundarios como: azúcares reductores, cumarinas,

flavonoides, fenoles y taninos, triterpenos y/o esteroides.

3. S e aislaron tres compuestos fenólicos de las hojas de Psidium guajava L.

"guayaba", un ácido fenólico y dos flavonoides derivados de la quercetina.

4. Los compuestos fenólicos aislados de las hojas de Psidium guajava L.

"guayaba" en concentraciones de 10 ug/ml presentaron una actividad

antioxidante de 95,29%, de 50 ug/ml un 96,60% y de 100 ug/ml en un

98,30%, respectivamente.

32
 VII. R E C O M E N D A C I O N E S

1. Proseguir con el estudio de la actividad antioxidante de los compuestos

fenólicos aislados de las hojas de Psidium guajava L. "guayaba"

cuantificando cada uno de los componentes por cromatografía líquida de

alta eficiencia ( H P L C ) .

2. Realizar estudios de formulación de los compuestos fenólicos en distintas

presentaciones para su empleo como antioxidante.

33
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37
ANEXOS

38
 ANEXO 1

Tabla 5. Certificado de identificación taxonómica de psidium guajava L.

"guayaba" según el sistema de clasificación de Cronquist. A. Ayacucho - 2013

EL J E F E D E L HERBARIUM HUAMANGENSIS D E LA F A C U L T A D DE
C I E N C I A S BIOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
CRISTÓBAL DE HUAMANGA

C E R T I F I C A

Que, la Bach, en Farmacia y Bioquímica, Srta, Dalma Neria, NALVARTE RÚA,

ha solicitado la identificación de una muestra vegetal para trabajo de tesis.
Dicha muestra ha sido estudiada y determinada según el Sistema de Clasificación
de Cronquist. A. 1988. y es como sigue:

DIVISIÓN MAGNOLiOPHYTA
CLASE : MAGNOLIOPSIDA
SUBCLASE ROSIDAE
ORDEN MYRTALES
FAMILIA ; MYRTACEAE
GENERO Psidium
ESPECIE Psidium guajava L.
N.V. "guayaba"

Se expide la certificación correspondiente a solicitud de la interesada

para los fines que estime conveniente.

Ayacucho, 07 de Agosto del 2013

39
 ANEXO 2

Un kg de hojas s e c a s de Psidíum
guajava L. "guayaba"

Maceracion por 7 días en etanol al 96%

Extracto Etanólico

Suspensión en H 0 destilada
2

Desengrasado con
Éter de Petróleo

Marcha
Fitoquimica

Fracción Etérea Fracción desengrasada

Extracción con
Acetato de Etilo

Fracción acetato de etilo

COMPUESTOS FENÓLICOS Fracción Acuosa

Ensayos químicos
KMn0 4
Actividad
• FeCt 3 antioxídante
DPPH
Ensayos cromatográficas
• CCF
• Espectro UV

Figura 8. Flujograma de la obtención de los compuestos fenólicos de Psidíum

guajava L. "guayaba". Ayacucho - 2013

40
 ANEXO 3

Figura 9, Recolección de Jas hojas de Psidium guajava L. "guayaba" en la

provincia de Huarcta. Ayacucho - 2013

41
 ANEXO 4

Figura 10. Equipo de rotavapor para \a concentración del extracto etanófico de

Psidium guajava L. "guayaba". Ayacucho- 2G13

42
 ANEXO 5

Figura 11. Tubos de ensayo del tamizaje fitoqufmico, reacción de Shinoda y

cloruro férrico del extracto etanólico de Psidium guajava L"guayaba , Ayacucho -
n

2013

43
 ANEXO 6

Figura íZ. Equipo de extracción liquido - líquido para la obtención de los

compuestos fenólicos de Psidium guajava L. "guayaba". Ayacucho - 2013

44
ANEXO 7
 ANEXO 8

Figura 14. Cromatografía en capa fina de loa compuestas fenóJicos aislados de

Psidiüm guajáva L. "guayaba" (I), ácido clorogénico (li) quercetina (111) y ácido
r

caféico (IV) revelado con luz ultravioleta Ayacucho - 2013

46.
 ANEXO 9

Figura 15. Cromatografía en capa fina de los compuestos fenolieos de Psidium

guajava L "guayaba", revelados con cloruro férrico al 5%. Ayacueho - 2013
 ANEXO ta

Figura 16. Cromatografía en capa fina de los compuestos fenólicos de Psidium

guajava L "guayaba", revelados con DPPH. Ayacucho - 20t3

48
ANEXO 11
 ANEXO 12

Figura 18. Curva espectral de ta fracción F t aislado de Psidiiim guajava L.

"guayaba". Ayacuch©- 20t3

50
 ANEXO 13

Figura 19. Curva espectral de la fracción F2 aislado de Psidium guajava L

"guayaba". Ayacucho - 2013

51
 ANEXO 14

Figura 20. Curva espectral de la fracción F 3 aislado de Psidium guajava L.

"guayaba". Ayacucho - 2013

52
 ANEXO 15

Figura 21. Curva espectral del estándar de ácido benzoico. Ayacucho - 2013

53
ANEXO 16

54
 J

A N E X O 17

Tabla 6. Porcentaje de la actividad secuestradora del D P P H por efecto de los

compuestos fenólicos aislados de las hojas de Psidíum guajava L. "guayaba" en
comparación con el ácido caféico y la vitamina C . A y a c u c h o - 2 0 1 3

Estándares

Repeticiones Ácido caféico Vitamina C Compuestos fenólicos

100 50 10 100 50 10 100 50 10
ug/ml ug/ml ug/ml ug/mi ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml

1 100 100 100 100 99,60 99,60 98,04 96,47 95,29

2 100 100 99,60 100 99,60 99,60 98,43 96,47 95,29
3 100 100 100 100 99,60 99,60 98,43 96,86 95,29
Promedio 100 100 99.86 100 99,60 99,60 98,30 96,60 95,29

55
 ANEXO 18
Tabla 7. Análisis de varianza del porcentaje de la actividad secuestradora del
DPPH. De los compuestos fenóücos aislados de las hojas de Psidium guajava L
"guayaba". Ayacucho - 2013

Método único
Suma de Gl Media F Sig
cuadrados cuadrática
Captación Covariables Tratamientos 46.368 1 46.368 29.581 0.000
de
radical
libre (%) Efectos Concentración 8.205 2 4.103 2.617 0.095
principales (ug/ml)

Modelo 54.574 3 18.191 11.605 0.000

Residual 36.053 23 1.568
Total 90.626 26 3.486

a. Actividad secuestradora del DPPH (%) por concentración (ug/ml) con tratamientos
b. Todos los efectos introducidos simultáneamente

56
 ANEXO 19
Tabla 8. Matriz de consistencia. Ayacucho - 2013

TÍTULO PROBLEMA OBJETIVOS MARCO TEORICO HIPOTESIS VARIABLES METODOLOGIA

Actividad ¿Tendrá Psidium guajava L. Los Tipo de Estudio: Básico Descriptivo.

antioxidante actividad Objetivo general: "guayaba"; compuestos Variable Población: Hojas de Psidium guajava L "guayaba". Que de
de los antioxidante Árbol de 6 m de altura; hojas fenólicos Independiente: la provincia de Huanta, región Ayacucho.
Evaluar la actividad
compuestos los compuestos verdes, opuestas; flores aislados de compuestos Muestra:
antioxidante de los
fenólicos fenólicos blancas, solitarias o en las hojas de fenólicos aislados Un Kg de hojas s e c a s de Psidium guajava L. "guayaba".
compuestos fenólicos
aislados de aislados de las pequeños grupos, que Psidium de las hojas de
aislados de las hojas de
las hojas de hojas de aparecen en las axilas de las guajava L Psidium guajava L. Diseño metodológico para la recolección de los datos:
Psidium guajava L.
Psidium Psidium hojas, tienen 4-5 pétalos y "guayaba". "guayaba". • Recolección, identificación y selección de la
"guayaba".
guajava L. guajava L numerosos estambres; fruto en Posee Actividad muestra.
Objetivos Específicos:
"guayaba" "guayaba" a baya redondeada con el cáliz actividad antioxidante • Preparación del extracto etanólico.
Ayacucho- diferente • Identificar los metabolitos de la flor persistiendo, antioxidante a Indicador:
• Tamizaje fitoquímico
2013. concentración? aromáticos, piriformes, 2-10 diferente Concentración a:
secundarios presentes en • Extracción e identificación de los flavonoides
cm de largo, cáscara amarilla, concentración 10, 50 y 100
el extracto etanólico de las
carnaza rosada, por fuera ug/mL.
hojas de Psidium guajava Determinación de la actividad antioxidante:
firme, al centro suave, con
L "guayaba". Método de la c a p a c i d a d s e c u e s t r a d o r a del radical DPPH
pulpa jugosa y semillas color Variable (Aguilar, 2007). Actividad secuestradora del radical libre
café, 3-5 mm de largo, dependiente
• Caracterizar los redondas y duras. 8,9 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo, D P P H
Actividad Análisis Estadístico.
compuestos fenólicos de antioxidante. Los resultados de la actividad antioxidante serán
Psidium guajava L. U s o s Tradicionales: Indicador: representados en forma de gráfico de barras en función de
"guayaba". Como antiinflamatorio, golpes, • Porcentaje de las medias. L a s diferencias entre las medias serán
heridas, contra la diarrea, la actividad contrastadas mediante el Análisis de Varianza (ANOVA) a
• Evaluar la actividad disentería, dolor de estómago, secuestradora una nivel de confianza del 9 5 % (p<0,05).
antioxidante de los artritis, anemia. del D P P H .
compuestos fenólicos Estrés oxidativo
aislados de las hojas de Sistema de protección
antioxidante
Psidium guajava L.
C o m p u e s t o s fenólicos
"guayaba", sobre el radical Flavonoides: son pigmentos
libre del DPPH. naturales presentes en los
vegetales, desempeñan un
papel esencial en la protección
frente a los fenómenos de
daño oxidativo.

57