ARTÍCULO ORIGINAL REVISTA COLOMBIANA

DE CIENCIA ANIMAL
Rev Colombiana Cienc Anim 2016; 8(1):37-43.

ACTIVIDAD HIDROLÍTICA DE AISLADOS BACTERIANOS CON

POTENCIAL APLICACIÓN EN EL TRATAMIENTO DE EFLUENTES
DE FRIGORÍFICO

HYDROLYTIC ACTIVITY OF BACTERIAL ISOLATES WITH POTENTIAL

APPLICATION FOR TREATMENT OF SLAUGHTERHOUSE EFFLUENTS

RODAS M. ELKIN,1,2 M.Sc, BOTELLO S. WILMAR,1,2* Ing.

1
Universidad Estadual Paulista, Jaboticabal (UNESP),Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias, SP, Brasil.
2
Fundación Universitaria de San Gil-Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería. Yopal, Colombia.

Key words: Abstract

hydrolytic bacteria, Slaughterhouse effluents are characterized by high concentrations of proteins, fats
extracellular enzymes, and polysaccharides. The degradation of these compounds to their monomeric
treatment of slaughterhouse constituents is performed by the action of extracellular enzymes produced
wastewater. and secreted by hydrolytic bacteria (HB). Accordingly, the activity of these
microorganisms increased the degradation rates of the organic fraction present
in this waste. In the present study, a total of 15 bacteria producing extracellular
enzymes were isolated and selected to provide a rate of enzymatic activity ≥ 2.0. Of
these 15 isolates, 7 had proteolytic activity (46.6%), 3 amylolytic (20%), 3 cellulolytic
(20%) and 2 lipolytic (13.4%). Additionally, antagonistic effect was evidenced among
some of the selected isolates, indicating a possible competitive disadvantage under
natural conditions. We conclude that the HB obtained show a promising potential
for optimizing treatment systems waste water from the slaughterhouse industry.

Palabras Clave: Resumen

Bacterias hidrolíticas, Los efluentes de la industria frigorífica se caracterizan por presentar altas
enzimas extracelulares, concentraciones de proteínas, grasas y polisacáridos. La degradación de estos
tratamiento de aguas compuestos a sus constituyentes monoméricos es realizada por la acción de
residuales de frigorífico. enzimas extracelulares, producidas y secretadas por bacterias hidrolíticas (BH). En
consecuencia, la actividad de estos microorganismos favorece el aumento de las
tasas de degradación de la fracción orgánica presente en este tipo de residuos. En
el presente estudio, un total de 15 bacterias productoras de enzimas extracelulares
fueron aisladas y seleccionadas al presentar un índice de actividad enzimática ≥
2,0. De estos 15 aislados, 7 presentaron actividad proteolítica (46,6%), 3 amilolítica
(20%), 3 celulolítica (20%) y 2 lipolítica (13,4%). Adicionalmente, fue evidenciado
efecto antagónico entre algunos de los aislados seleccionados, indicando su
INFORMACIÓN posible desventaja competitiva en condiciones naturales. Se concluye que las BH
Recibido: 05-07-2015;
Aceptado: 20-01-2016. obtenidas evidencian un potencial promisorio para la optimización de sistemas de
Correspondencia autor: tratamiento de aguas residuales procedentes de la industria frigorífica.
wbotello@unisangil.edu.co

ISSN on line 2027-4297 2016© http://www.recia.edu.co 37

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Introducción Diversos estudios han analizado el efecto de la

incorporación de consorcios de BH en sistemas de
Los efluentes generados en la industria frigorífica son tratamiento de efluentes industriales con diferente grado
típicamente tratados mediante sistemas que involucran de éxito (MOHAN et al., 2005: ČATER et al., 2015;
operaciones físicas, químicas y biológicas (MUÑOZ MARTIN-RYALS et al., 2015). Dichos estudios ponen
2005; PABÓN y GÉLVEZ, 2009; LIU et al., 2015). de manifiesto a nivel experimental, que la actividad de
Estos procesos tienen la finalidad de dar cumplimiento estos microorganismos puede conferir ventajas en la
a las directrices establecidas por la normatividad partida de sistemas de tratamiento, aumento de las
ambiental, y garantizar que los efluentes tratados eficiencias de remoción y mejor recuperación de gases
puedan ser vertidos en sistemas hídricos receptores de interés energético (como por ejemplo hidrógeno y
sin generar riesgos a nivel ambiental y sanitario. metano) generados en los procesos de estabilización
Dada la composición característica de los efluentes anaerobia (CAVALEIRO et al., 2010; MARONE et al.,
residuales de frigorífico, representada principalmente 2012).
por la presencia de altas concentraciones de grasas,
proteínas y polisacáridos (PALATSI et al., 2011), la fase No obstante, es indispensable garantizar que dichos
biológica es de especial interés para la estabilización inoculantes presenten elevado potencial hidrolítico y
de este tipo de residuo. En dicha etapa es aprovechada que puedan permanecer y establecerse en el sistema
la actividad metabólica microbiana para reducir la de tal forma que se garantice su actividad y viabilidad.
concentración de materia orgánica presente (CHAN La alteración de estos factores puede ocasionar una
et al., 2009). El proceso inicia con el fraccionamiento escasa o nula eficiencia del proceso de incorporación
(hidrólisis) de biopolímeros hasta sus constituyentes de microorganismos al sistema, debido a la falta de
monoméricos (como por ejemplo aminoácidos, ácidos especies bacterianas con rutas metabólicas claves en
grasos y monosacáridos), lo cual se logra por acción dicha transformación (HERRERO y STUCKEY 2014).
de enzimas extracelulares denominadas hidrolasas En este estudio fue realizado el aislamiento de bacterias
(CUNHA et al., 2010). Estas enzimas son secretadas productoras de enzimas extracelulares (proteasas,
al medio por bacterias hidrolíticas (BH), las cuales lipasas, celulasas y amilasas), asociadas a un sistema
se pueden clasificar en tres categorías: 1) bacterias de tratamiento de aguas residuales de frigorífico. Fue
proteolíticas, productoras de proteasas; 2) bacterias estimada la actividad hidrolítica y el efecto antagónico
sacarolíticas, productoras de celulasas y amilasas; de cada uno de los aislados seleccionados. Este
y 3) bacterias lipolíticas, productoras de lipasas trabajo constituye un primer paso para la generación
(GERARDI, 2003). La actividad concertada de estas de un consorcio bacteriano altamente eficiente en
bacterias permite la generación de moléculas solubles, la degradación la fracción orgánica de efluentes
que pueden ser utilizadas como fuente de carbono y procedentes de industrias frigoríficas.
energía y constituyen un sustrato biodisponible para
otro tipo de comunidades microbianas presentes, dando Materiales y Métodos
continuidad al proceso de degradación y estabilización
(ARNOSTI, 2011). La hidrólisis, en consecuencia, Muestreo y obtención de aislados bacterianos. Para
constituye una fase crítica y limitante de la tasa de la colección de la muestra fue seleccionado un sistema
degradación de efluentes con alta carga orgánica, y el de tratamiento de aguas residuales establecido en el
éxito del proceso de tratamiento está estrechamente Frigorífico “La Frontera”, ubicado en el municipio de
relacionado con el crecimiento, estabilidad y potencial Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia. Fue
de las BH (VAVILIN et al., 2008; FACCHIN et al., 2013). colectada una muestra de 500 ml de lodos activados
contenidos en un reactor aerobio. La recuperación de
Un enfoque que puede tener gran potencial para aislados bacterianos con características hidrolíticas fue
aumentar la eficiencia de la fase hidrolítica es realizada mediante el establecimiento de diluciones
la inoculación de microorganismos que hayan seriadas y siembra en superficie en los siguientes
sido aislados y seleccionados para el tratamiento medios de cultivo: a) Plate count suplementado
de compuestos específicos presentes en aguas con leche descremada al 1% p/v para la selección
residuales (VAN DER GAST et al., 2004; HERRERO y de bacterias actividad proteolítica (BAP); b) Medio
STUCKEY, 2014). La adición de aislados bacterianos mineral con la siguiente composición (g/l): (NH4)2SO4
con actividades metabólicas específicas recibe el 3.2; K 2 HPO 4 2.0; KH 2 PO 4 1.2; MgSO 4 7H 2 O 0.5;
nombre de bioaumentación (HERRERO y STUCKEY, CaCl2 0.2; NaCl 0.2; agar-agar 20.0. El medio fue
2014). Al respecto, los microorganismos utilizados en suplementado con 1% de almidón soluble o con 1%
este proceso deben ser eficientes en la degradación de carboximetilcelulosa como única fuente de carbono,
de contaminantes, además de ser compatibles, para la selección de bacterias con actividad amilolítica
competitivos y persistentes con las comunidades (BAA) o celulolítica (BAC), respectivamente; y c) Agar
nativas presentes en dichos sistemas de tratamiento tributirina (g/l): 1,3% caldo nutritivo, 1% tributirina y 2%
(YU y MOHN, 2002). 38
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agar-agar para el aislamiento de bacterias con actividad Resultados

lipolítica (BAL). (BEN-GIGIREY et al., 2000). Las
condiciones de incubación fueron de 48 h a 37ºC para el Aislamiento y selección de bacterias con actividad
aislamiento de BAP, BAA y BAL y de 7 días a 37ºC para hidrolítica. En la Fig. 1 se indica el número total de BH
la recuperación de BAC. La selección de los aislados fue seleccionadas en relación con el número de BH con IE
realizada a partir de las colonias que mostraron halos ≥ 2,0 para cada uno de los sustratos evaluados. Puede
de hidrólisis luego del periodo de incubación (tanto para evidenciarse una mayor frecuencia de selección de
la actividad proteolítica y lipolítica), o su crecimiento en bacterias proteolíticas (32,7%), seguida por amilolíticas
los medios de cultivo, en el caso de aislados con posible (27,3%), celulolíticas (21,8%) y lipolíticas (18,2%). De
potencial amilolítico y celulolítico. estos aislados iniciales, un total de 15 presentaron un
IE ≥ 2,0, distribuidos de la siguiente manera: 7 con
Actividad hidrolítica. La estimación de la actividad actividad proteolítica (46,6%), 3 amilolítica (20%), 3
hidrolítica fue realizada de manera semicuantitativa celulolítica (20%) y 2 lipolítica (13,4%).
empleando el índice enzimático (IE). Este índice
correlaciona el diámetro de los halos de hidrolisis
(Dh) con el diámetro de la colonia (Dc), y fue estimado
mediante la siguiente ecuación: IE= Dh/Dc (HANKIN
et al., 1975). Según LEALEM y GASHE (1994),
microorganismos con una eficiente producción de
enzimas extracelulares presentan IE ≥ 2,0. Teniendo en
cuenta este criterio fue realizada la selección BH con
mayor producción de enzimas extracelulares. Para ello,
cultivos axénicos de cada uno de los aislados fueron
inoculados sobre los medios establecidos en la etapa
anterior. Las pruebas fueron realizadas por triplicado y
las condiciones de incubación fueron de 37oC por 48 Figura 1. Número total de BH obtenidas para cada uno de
horas. En el caso de la actividad amilolítica, los halos de los sustrataos evaluados. BAP: Bacterias con
actividad proteolitica; BAA: Bacterias con actividad
hidrólisis fueron revelados con la adición de 5 ml de lugol
amilolítica; BAC: Bacterias con actividad celulolítica;
después del periodo de incubación, y para la estimación BAL: Bacterias con actividad lipolítica. IE: Índice
de la actividad celulolítica, los halos de hidrólisis fueron enzimático.
revelados mediante la técnica de coloración con rojo
congo (TEATHER, M. et al, 1982). Caracterización de los aislados bacterianos productores
de enzimas hidrolíticas. En la Tabla 1 se relaciona la
Caracterización de los aislados seleccionados y caracterización y los IE estimados para cada uno de
efecto antagónico. Las BH que presentaron IE ≥ 2,0 los aislados seleccionados. De acuerdo con estos
fueron analizadas mediante la técnica de tinción de
Gram, con la finalidad de establecer su morfología y Tabla 1. Actividad semicuantitativa de hidrolasas producidas
tipo de pared celular. Adicionalmente, fue establecido por los aislados seleccionados.
su efecto antagónico mediante una variación del método Actividad Aislado Morfología Gram Dh1 (mm) Dc2 (mm) IE3
descrito por ÇADIRCI y ÇITAK (2005). Discos de papel AP1 Bacilo + 10 3 3,3
de filtro estériles de 0,5 cm de diámetro (sensidiscos) AP3 Bacilo + 10 3 3,3
fueron impregnados con cada uno de los aislados a
AP4 Bacilo - 21 5 4,2
evaluar (cultivados previamente 12 h en caldo nutritivo
Proteolíca AP6 Coco + 13 3 4,3
a 37 ºC). Los discos inoculados fueron dispuestos
AP10 Bacilo - 15 5 3,0
sobre placas conteniendo agar nutritivo previamente
AP13 Bacilo + 18 4 4,5
inoculadas de forma masiva con cada uno de los
AP15 Bacilo - 12 5 2,4
aislados a evaluar, de tal forma que se enfrentaran entre
AA5 Bacilo + 17 5 3,4
sí cada uno de los aislados seleccionados. Todos los
cultivos empleados fueron ajustados al estándar 0,5 Amilolítica AA9 Bacilo + 13 3 4,3

de turbidez de la escala de MacFarland (KONEMAN AA11 Bacilo + 15 5 3

et al., 2008). El efecto antagónico se evaluó midiendo AC1 Bacilo - 12 3 4

el diámetro de cada uno de los halos alrededor de los Celulolítica AC4 Bacilo + 13 5 2,6
sensidiscos. La presencia de un halo de inhibición AC5 Bacilo + 12 5 2,4
≥5 mm fue considerada como actividad antagónica AL1 Bacilo + 20 5 4,0
Lipolítica
positiva. AL2 Bacilo + 15 5 3,0
1
Dh: Diámetro del halo de degradación; Dc: Diámetro de la colonia; IE: Índice
2 3

enzimático (IE=Dh/Dc).

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resultados, de los 15 aislados obtenidos 11 fueron bacterianos seleccionados. En la Tabla 2 se relaciona el

identificados como gram positivos (73,3%) y 4 como efecto antagónico presente entre las BH seleccionadas
gram negativos (26,7%), predominando en la mayoría una vez fueron confrontadas entre sí. Como puede
de ellos la morfología bacilar (80%). Los aislados AP13, observarse, AA11 presentó clara actividad antagónica
AA9, AC1 y AL1 presentaron los mayores IE en cada sobre AP6, AP13, AA9 y AC4. Estos resultados sugieren
uno de los grupos enzimáticos evaluados con valores que la susceptibilidad presentada por dichos aislados
de 4,5, 4,3, 4,0 y 4,0 respectivamente (Tabla 1, Fig. 2). representaría una posible desventaja competitiva
en programas de bioaumentación, debido a la
Efecto Antagónico. Esta prueba se realizó con el fin incompatibilidad que presentan con los otros aislados
de establecer la compatibilidad entre los aislados bacterianos.

Figura 2 Detección de halos de hidrólisis en BH con mayor IE para cada uno los sustratos evaluados. a) Actividad proteolítica
(Prueba positiva: Aislado AP13); b) Actividad amilolítica (Prueba positiva: aislado AA9) ; c) Actividad celulolítica
(Prueba positiva: aislado AC1); d) Actividad lipolítica (Prueba positiva: aislado AL1).

Tabla 2. Efecto antagónico establecido entre los aislados seleccionados.

Testigo2
Aislado
AP10

AP13

AP15

AA11

AC1

AC4

AC5
AP1

AP3

AP4

AP6

AA5

AA9

AL1

AL2

AP1 - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AP3 0 - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AP4 0 0 - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AP6 0 0 0 - 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
AP10 4 3 0 0 - 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0
Efecto antagónico (mm)1

AP13 0 0 0 2 0 - 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AP15 1 2 0 3 0 0 - 0 0 0 0 2 1 1 0
AA5 1 0 0 1 0 4 0 - 0 0 0 2 2 0 3
AA9 0 0 0 0 0 4 0 0 - 0 0 0 0 0 2
AA11 1 0 0 7 0 6 0 0 5 - 0 6 0 2 0
AC1 1 4 0 0 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0 0
AC4 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0
AC5 1 1 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 - 0 1
AL1 0 0 0 2 0 1 0 0 0 2 2 0 0 - 0
AL2 0 1 0 0 0 0 0 0 3 0 0 1 0 0 -
1
El efecto antagónico fue determinado a través de la medición de los halos de inhibición de crecimiento (Dhi) del aislado testigo (mm); 2El testigo
de cada prueba corresponde a cada aislado inoculado de forma masiva sobre el medio, confrontado con el total de aislados evaluados. Valores
en rojo corresponden a Dhi ≥ 5 mm. 40
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Discusión selección de bacterias con actividades metabólicas

específicas. Otros aspectos que deben ser tenidos en
En este estudio fueron aisladas y seleccionadas bacterias cuenta, tales como la compatibilidad, la persistencia
con alta producción de enzimas extracelulares. El criterio y la competitividad con las demás poblaciones nativas
utilizado para la selección de estas bacterias se basó presentes en el hábitat (YU y MOHN, 2002). En ese
en la determinación del índice de actividad enzimática sentido, ese efecto fue evaluado indirectamente a
(IE≥ 2,0) (LEALEM Y GASHE, 1994). De los 15 través de pruebas de antagonismo entre los aislados
aislados obtenidos, 7 presentaron actividad proteolítica bacterianos que fueron seleccionados. De acuerdo a
(46,6%), 3 amilolítica (20%), 3 celulolítica (20%) y 2 los resultados obtenidos, se pudo establecer que AP6,
lipolítica (13,4%). La frecuencia de recuperación de un AP13, AA9 y AC4 fueron inhibidos por AA11 (tabla 2).
mayor porcentaje de microorganismos proteolíticos se Esto sugiere que estos aislados podrían no ser eficientes
correlaciona probablemente con un mayor contenido de en programas de bioaumentación debido a los efectos
proteínas en este tipo de aguas residuales (PALATSI antagónicos producidos por las poblaciones nativas
et al., 2011). No obstante, la aparente baja proporción presentes y/o por los propios aislados seleccionados
de bacterias lipolíticas detectada (13,4%) podría ser (HERRERO Y STUCKEY, 2014).
un indicativo de futuras reducciones en la eficiencia
del proceso biológico ocasionadas por acumulación En general, este estudio proporciona una estrategia
de grasa (PERLE et al., 1995). Este fenómeno ya ha para la selección de microorganismos degradadores
sido reportado en procesos biológicos para tratamiento de compuestos específicos como las proteínas, grasas
de aguas aeróbicos y anaeróbicos (PERLE et al., y polisacáridos como principales constituyentes de
1995; LEFEBVRE et al., 1998; VIDAL et al., 2000). efluentes residuales de la industria frigorífica. No
En este aspecto, estrategias de bioaumentación con obstante, futuros estudios relacionados con estrategias
consorcios microbianos lipolíticos han sido establecidas de bioaumentación deben ser realizados a fin de evaluar
de manera satisfactoria para el tratamiento de aguas la eficiencia las BH obtenidas en la biodegradación de la
residuales con elevadas concentraciones de grasa fracción orgánica de efluentes de la industria frigorífica.
(AZHDARPOOR et al., 2014). De forma similar, otros
estudios de bioaumentación para el tratamiento de Conclusión
aguas con alto contenido de proteína (ICHIDA et al.,
2001; LOPERENA et al., 2009) y otros compuestos En este estudio fueron recuperados aislados bacterianos
(HU et al., 2008; PARK et al., 2008; CHEN et al., 2015) productores de enzimas extracelulares para la
han sido exitosos y demuestran la importancia de una degradación de compuestos orgánicos tales como
adecuada selección de bacterias en función de los proteínas, polisacáridos y lípidos. Dichos aislados
contaminantes a ser tratados. presentan un potencial promisorio para futuras
investigaciones relacionadas con el desarrollo de
La mayoría de los aislados bacterianos seleccionados procesos de bioaumentación, los cuales busquen
fueron considerados como buenos productores de optimizar la eficiencia del tratamiento de efluentes
enzimas extracelulares ya que presentaron valores de generados por industria frigorífica.
IE entre 2,4 y 4,5 (tabla 1). Esto demuestra su potencial
hidrolítico con relación a los principales compuestos Agradecimientos: Expresamos nuestro agradecimiento
presentes en este tipo de aguas residuales (proteínas, a la Universidad Francisco de Paula Santander por ser
grasas y polisacáridos). No obstante, la selección de el ente financiador de este proyecto, y al apoyo técnico
microorganismos para su aplicación en procesos de del frigorífico “La Frontera”.
bioaumentación no solo involucra el aislamiento y la

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