TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE LA ZONA OLMECA

INGENIERIA EN AGRONOMÍA

Asignatura:

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA

Tema 2.- Métodos y técnicas de cultivo

microbiano
 2.1 DEFINICION Y TIPOS
DE MEDIOS DE CULTIVOS
 DEFINICION
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de
crecimiento y otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Como
por ejemplo virus, células, tejidos vegetales o pequeñas
plantas.
 TIPOS DE MEDIO DE CULTIVOS
Se han clasificado en base a su uso o su función:
 Medios selectivos
 Medios diferenciales
 Medios selectivo - diferenciales
 Medios de mantenimiento
 Entre otros
 Medio selectivo
Permite: Aislar tipo de bacterias en particulares
Sustancias usadas: Antibióticos, sales
Ejemplos: Agarsal, agar – celulosa

Medios diferenciales
Permite: Distinguir diferencias a nivel metabólico
Ejemplo: Lactosa
 Medios selectivos – diferenciales
Permite: Seleccionar bacterias + obtener información
Ejemplos: Agar – manitol – sal + rojo de fenol

Medios de mantenimiento
Permite: Mantener
- Viabilidad
- Características fisiológicas
de un cultivo bacteriano
Ejemplo: Glucosa
2.1.1PREPARACION DE
MEDIOS DE CULTIVO
 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
MATERIALES
- AGAR
- ESPATULA

- PROBETA

- BALANZA

- TRIPIE CON
MECHERO

- CAJAS PETRI
- MATRAZ CON
TAPON
 PROCEDIMIENTO
• Se inicia pesando el agar siguiendo
las indicaciones del fabricante

• En un matraz se vertiera el agua

destilada e inmediatamente el agar

• Mezclar bien asta que se obtenga

una suspensión homogénea

• Calentar solamente agitando frecuentemente

y hervir durante un minuto

• Esterilizar las placas en autoclave a 121°C

durante 15 minutos
• Después que el medio haya sido
esterilizado se dejara temperar para
evitar agua de condensación en las cajas Petri

• Rotular las cajas Petri para llevar el

control de lotes a vaciar

• Con placas totalmente estériles se verterá

el medio de cultivo en las cajas Petri dejar
gelificar a temperatura ambiente

• Una vez gelificado estará listo para

utilizarse o para almacenar el medio
de cultivo se guarda en refrigeración.
 2.2
Morfología
microscópica

Espirilos y
Cocos Bacilos espiroqueta
s

Forma esférica, Pueden disponerse Son cilíndricas,

su tamaño va aislados, adosados a lo Forma de helicoidales, finas y
de 0.6 a 1 largo y adheridos por espiral móviles, con un tamaño
micrómetro sus extremos y tomar que oscila entre 5 y 250
apariencias de letras µm de longitud.
chinas.
2.2.1 Preparaciones
en fresco
Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en
la muestra de estudio y la presencia de otros elementos, como son
leucocitos, células, eritrocitos, cristales, etcétera, que puedan ser de
gran ayuda en la valoración de las muestras. Y se prepara de la
siguiente manera:

Es una técnica fácil de realizar, en la que la muestra a examinar se

sitúa entre un portaobjetos y cubreobjetos. Si la muestra proviene de
una muestra sólida, se debe de emulsificar en una gota de agua
destilada o solución salina; si el material es líquido, se deposita
directamente entre el porta y cubreobjetos.
 Tipos de preparaciones
• Preparación del frotis:

La extensión de la muestra sobre el portaobjetos se hará de

diferentes formas, dependiendo de la procedencia de la muestra
a examinar. Si es líquida, se deposita una pequeña cantidad del
material en el centro del portaobjetos y se extiende con otro
portaobjetos hasta conseguir una capa fina y homogénea.
• Secado:
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la
preparación, cuando está seca la superficie pasa de ser
brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar
ligeramente la parte inferior del portaobjetos (sin quemar).
• Fijado:
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y
tiene como objetivo no permitir que la muestra de estudio se
pierda (o se barra) en el proceso de tinción.
 2.2.2 Tinciones
• En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeños para
observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.
• Estos microorganismos difieren en características tales como forma
de nutrición, estructura, tamaño, composición entre otros aspectos; es por
ello que se emplea el estudio microscópico el facilita notablemente
la observación; principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con
colorantes o tintes los cuales facilitan también la observación de
ciertas estructuras celulares.
• En este informe vamos a distinguir la estructura intracelular de algunos
microorganismos, tal es el caso de la sarcina, Klecciela, Bacilo Serium entre
otros. Desarrollamos los métodos de tinción y damos a conocer
un análisis de los resultados obtenidos en la práctica.
Mecanismos de Coloración:
• La coloración celular y tejidos son una combinación de fenómenos
físicos y químicos de absorción: los fenómenos físicos de absorción,
capilaridad y ósmosis participan en cierto grado. La afinidad de
colorantes básicos por los tejidos ácidos y viceversa indican que hay
reacción química.
Los Colorantes:
• Son compuestos, orgánicos que contienen radicales cromóforos esto es
que producen color y grupo de anxocromos que forman sales
los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son cromóforos. Los radicales
hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los cromóforos
imparten la propiedadcromógena al colorante y los anxocromos
permiten que el colorante se una con la fibra o tejido.
Tinciones:
• Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en
estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de
microorganismos.
Tipos de Tinción:
• Tinción Simple: utiliza un solo colorante.
• Tinción de Gram:
Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol,
Safranina 30 seg)
• Tinción Ácido Resistente:
Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral
reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante
primario color rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el
ácido y toman el color azul.
• Tinción de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materias núcleos de la células.
• Tinción de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
• Tinción de Cápsula:
Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos encapsulados creando resistencias.
• Tinción de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.
• Endósporas:
Son unos cuerpos resistentes que se producen en el interior de la célula los cuales contienen los
componentes necesarios para conservar la vida.
Las esporas pueden situarse en el centro de la célula o en situaciones excéntricas cerca de un
extremo de la misma.
• Levaduras:
Son esféricas, elípticas y cilíndricos, su tamaño varía notablemente. Son hongos cuya forma
corriente y dominante de crecimiento es unicelular.
• Las Cápsulas:
Son estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las células de algunas especies.
Sarcina:
Son anaerobios obligados y son extremadamente ácido – tolerantes que pueden fermentar azúcares
y crecer a pH inferior a 2.
Este género comprende 2 especies de bacterias que se dividen en tres planos perpendiculares para
producir paquetes de 8 en una célula.
• Bacillus Cereus:
La mayoría se encuentra en el suelo o en partículas de polvo en
suspensión y son uno de los organismos del género Bacillus que pueden
ser aislados fácilmente.
Puesto que los formadores de esporas pueden aislarse selectivamente a
partir del suelo, alimentos o de otro material dejando las muestras a 80
ºC durante 10 minutos.
Los bácillus suelen crecer en medios sistemáticos que contengan
azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, etc, como única fuente
de carbono y amoníaco como única fuente de nitrógeno.
• Análisis de Resultados:
Existe varios tipos de tinciones de las cuales estudiamos:
• Tinción de Gram
• Tinción simple
• Tinción de esporas
• Tinción de Gram:
Dividida en Gram positivo y Gram negativo, en el caso de los
gram (+) la muestra fue sarcina, puesto que una tonalidad
violeta fijada en su estructura determina la presencia de la
misma puesto que fijó en su estructura el cristal violeta.
Y en el gran (-) utilizamos salmonella identificada por la
presencia de muchas estructura un poco triangulares de
color rojo.
En la muestra de la práctica anterior 3 eran gran positivo por
su coloración morada.
• Tinción Simple:
Estudia levaduras, en este experimento se usa un solo colorante que fue
azul de metileno, donde observamos que las levaduras tenían cocos.
Estas células bacterianas difieren desde el punto de vista químico de su
medio exterior y por eso se tiñen contrastando con su alrededor.
• Tinción de Esporas:
La bacteria es una estructura muy pequeña, sin embargo, por medio de
esta tinción pudimos observar la estructura interna de la célula
bacteriana, particularmente las endosporas, en este experimento se
utiliza una tinción simple debido a que la misma permite que se coloree
toda la célula excepto la espora que se observa de un tamaño bien
aceptable.
 ACTIVIDADES
• Investigar y aplicar técnicas actuales para el aislamiento, purificación,
propagación, identificación y conservación de microorganismos.
•
1) Rhizobium sp. a partir de nódulos de leguminosas,
2) Tinción diferencial o coloración de Gram (1884); 3) Determinación
del número más probable de bacterias mediante el conteo en la
cámara de Neubauer; 4) Metarhizium anisopliae: 5) Bauveria
bassiana; 6) Rizobacterias (Plant Growth Promoting Rhizobacteria
por sus siglas en ingles PGPR); Ejmplo: Azospirillum, Pseudomona
putida, Bradyrhizobium japonicum, Sinorhizobium meliloti;
Verticillium dahliane
2.3 Aislamiento y características para la
identificación de microorganismos
1.- Métodos basados en criterios morfológicos
Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por
muchos años a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen
rasgos anatómicos tan diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su
clasificación, pero con respecto a los microorganismos, éstos lucen bajo el
microscopio tan similares que se dificulta su clasificación..
2.- Métodos basados en tinción diferencial
Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología de una
bacteria, examinando una lámina que fue sometida a un proceso de
tinción diferencial. Estos criterios morfológicos encabezan las primeras
etapas del proceso de identificación bacteriana
3.- Métodos basados en pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para
diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el
microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de
enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos
colorea- dos, etc.
4.- Métodos basados en tipificación con fagos
La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana
sensible es sumamente específica, ya que el proceso de adsorción se
encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la
célula bacteriana.
5.- Métodos basados en ensayos serológicos
Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de
inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo,
y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en
muestras puras o en muestras biológicas.
• Estos métodos son muy útiles en diversas situaciones:
• Si a través de un sistema miniaturizado basa- do en pruebas bioquímicas se
determinó que la bacteria causante de la infección es un miembro del género
Salmonella utilizando una batería de antisueros contra el antígeno O presente en
el lipopolisacarido de las bacterias gram negativas, es posible identificar a la
Salmonella aislada hasta el nivel de serotipo (poli O, A, B, C, D, etc.).
• La inmunofluorescencia ha resultado ser sumamente útil en casos de
infecciones de diferente origen. Puede utilizarse para la identificación del
microorganismo aislado o presente en una muestra biológica. En el método
directo se fija la muestra problema a una lámina y se pone en contacto con el
antisuero específico marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o
fluoresceína).
• En caso de una infección viral, los virus no
pueden ser identificados mediante pruebas
bioquímicas, pero si pueden ser identificados
en diferentes fluidos biológicos utilizando
inmunoensayos, tales como el ELISA
(Enzymelinked immunoabsorbent assay), el
cual, a manera general, utiliza anticuerpos
monoclonales específicos para el antígeno a
identificar, marcados con una enzima.
• En un ensayo de ELISA tipo sándwich, los
anticuerpos específicos para el antígeno, se
colocan sobre los pozos de una microplaca,
posteriormente se añade la muestra donde se
quiere determinar la presencia del agente
(bacteria, virus, protozoario).
• 6.- Métodos basados en biología molecular
• El método que se está utilizando ampliamente en los laboratorios de
diagnóstico es el PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica
generalmente para la identificación de microorganismos que no
pueden ser cultivados por los métodos convencionales.
El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n número de ve-
ces:

• 1.- Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura,

la cual rompe los enlaces de hidrógeno que mantiene unidos a las cadenas de
ADN.

• 2.- Adición de cadenas cortas de polinucleótidos, denominados cebadores, que

se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del
fragmento de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5’ ---3’ y otro
a la cade- na 3’—5’.

• 3.- Disminución de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con
las cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de bases.

• 4.- Adición de la ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos (ATP, GTP, TTP, CTP) y
demás cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la cadena complementaria
2.3.1 Aislamiento por la técnica de diluciones y
estría cruzada.
• Técnica por Dilución
• Mediante el uso de esta técnica de simple ejecución y fácil
interpretación, se pueden evaluar diferentes grupos bacterianos
según el medio de cultivo que contenga el frasco.
Es aplicable para evaluar bacterias heterotróficas, aerobias totales
(BAT), bacterias reductoras de sulfato (BRS), anaerobias heterotróficas
totales (BAnT), etc.
• ESTRÍA CRUZADA EN TRES SECTORES
• Es la técnica más utilizada para aislar a los microorganismos en una
placa de agar.
• Se coloca la muestra y se realiza un barrido con un asa de inoculación
hasta lograr separar colonias individuales de la cepa de interés.
• Procedimiento
• Pasos:
• Esterilizar el asa en la flama del mechero o incinerador.
• Enfriar el asa en un extremo de la placa de agar.
• Tomar la muestra con el asa.
• Estriar la superficie del medio, sin romper el agar.
• Esterilizar y enfriar el asa.
• Estriar el segundo sector, cruzar tres de las estrías con el primer sector para arrastrar
microorganismos.
• Esterilizar y enfriar el asa.
• Estriar el tercer sector de forma similar al segundo.
• Esterilizar el asa al termino del procedimiento.
 2.3.2 MORFOLOGIA COLONIAL

• Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una
o varias células. El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al
microbiólogo identificar las bacterias porque las especies forman a menudo
colonias con una forma y aspecto característico.
Morfología
Margen
Forma • Entero
• Puntiforme • Ondulado
• Circular y ovalada
• Lobulado
• Filamentosa
• Erosionado
• Irregular
• Filamentoso
• Rizoide
• Fusiforme
• rizado

Elevación
• Plana
• Elevada
• Convexa
• Pulvinada
• Umbonada
• Montañosa
• Crateriforme
Morfología y crecimiento de las colonias
2.3.3 Pruebas bioquímicas y serológicos
• Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar
bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo
es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de
compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc.
 2.4 ¿Qué son las cepas bacterianas?

Una cepa es un conjunto de células homogéneas, o clones, que deriva de la

reproducción de una célula inicial única, seleccionada y aislada. También
suele referirse a las cepas como colonias puras de bacterias.
 Conservación a corto, mediano y largo plazo

A corto plazo, un método común es el subcultivo; que consiste en el repique periódico del cultivo en
un medio nutritivo fresco. Una vez desarrollados los cultivos, se mantienen a 4⁰C durante lapsos que
van entre 15 días y dos meses.
Para mediano plazo, hablando de 2 a 5 años, se puede utilizar la desecación en diferentes soportes
(arena, sílica, gel) donde se detiene el crecimiento debido a la eliminación del agua disponible; así
como el almacenamiento en tierra, parafina líquida o suspensión en agua estéril.
Para largo plazo se utiliza la congelación, ya sea en un ultra congelador o mediante nitrógeno líquido
y la liofilización. Estas son las mejores técnicas ya que minimizan al máximo el riesgo de cambio
genético y las mantienes viables por 10 años o más.
 La conservación de cepas microbianas

• Método de elección o de conservación a largo plazo

– Conservación por congelación
– Conservación por liofilización

• Métodos Alternativos
– Conservación por transferencia periódica
– Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar esteril
Conservación por congelación

La crioconservación consiste en la conservación de los

microorganismos a temperaturas inferiores a cero grados centígrados.
Se basa en la paralización del metabolismo celular por la disminución
del agua disponible.

Objetivos de la crioconservación
- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores
-La temperatura de almacenamiento
-El estado fisiológico de la célula
- Mantenimiento de la estabilidad
- Mantenimiento de la pureza
Bibliografía

Rodríguez Salazar, N. (2018) Morfología bacteriana, identificación

microscópica y macroscópica. Recuperado de: https://www.paradais-
sphynx.com/ciencias-naturales/morfologia-bacteriana-microscopica-
macroscopica.htm#morfologia-bacteriana-microscopica
Mahon, C. and Manuselis G. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiolgy.
Second Edition. W.B. Saunders Company. USA
ELABORACIÓN DE PREPARACIONES MICROSCÓPICAS. (s.f.). Recuperado
12 septiembre, 2018, de
https://biologiacomociencia.weebly.com/elaboracioacuten-de-
preparaciones-microscoacutepicas.html