Microbiologia

Reporte de práctica 2: INDUCCIÓN DEL PROCESO DE

ESPORULACIÓN Y SU OBSERVACIÓN EN LA
NATURALEZA

SEMESTRE ENERO – JULIO 2024

6to semestre CNE y S- B
DOCENTE: FRANCISCA GARCIA ESPINOSA
Alumno: Yolanda Violeta del Carmen López Navarro

Objetivo:
El objetivo del experimento será la observación y el análisis de endosporas de
muestras ambientales.
 MARCO TEORICO
o Preparación de Agar Nutritivo:
El agar nutritivo es un medio de cultivo ampliamente utilizado en microbiología
debido a su capacidad para soportar el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos. La preparación del agar nutritivo implica la combinación de
ingredientes básicos como extracto de carne, peptona y agar, que proporcionan
nutrientes esenciales y un agente solidificante. El extracto de carne y la peptona
suministran carbono, nitrógeno y otros nutrientes necesarios para el crecimiento
bacteriano, mientras que el agar proporciona una matriz sólida para el crecimiento
de las colonias. Después de mezclar los ingredientes en agua destilada, la solución
se esteriliza mediante autoclave para eliminar cualquier contaminante microbiano y
se vierte en placas de Petri estériles, donde se solidifica para formar una superficie
plana y uniforme para el crecimiento de las bacterias.
o Siembra de Bacterias en Agar Nutritivo:
Una vez preparado el agar nutritivo, se procede a la siembra de bacterias. Esto
implica la transferencia de una muestra microbiana a la superficie del agar utilizando
técnicas asépticas para evitar la contaminación. Las técnicas de siembra pueden
variar según el propósito del experimento y la naturaleza de las bacterias en estudio.
Por ejemplo, la siembra en forma de rayas se utiliza para obtener colonias
individuales y separadas, mientras que la siembra en forma de gota se utiliza para
concentrar una gran cantidad de bacterias en un área pequeña. Después de la
siembra, las placas se incuban a la temperatura y durante el tiempo adecuado para
permitir que las bacterias crezcan y formen colonias visibles.
o Tinción de Bacterias:
La tinción de Gram es un procedimiento fundamental en microbiología que permite
diferenciar entre dos tipos principales de bacterias: gram positivas y gram negativas.
Este método se basa en las diferencias en la composición de la pared celular
bacteriana. Las bacterias gram positivas tienen una pared celular gruesa compuesta
principalmente de peptidoglicano, que retiene el colorante cristal violeta durante el
proceso de tinción, dando como resultado un color púrpura o azul oscuro. Por otro
lado, las bacterias gram negativas tienen una pared celular más delgada y están
rodeadas por una membrana externa lipídica, lo que permite que el colorante se
disuelva durante la etapa de decoloración con alcohol. Estas bacterias son luego
teñidas con un colorante de contraste, como la safranina, que las tiñe de color rosa
o rojo.
o Inclusión de Endosporas:
Las endosporas son estructuras de resistencia formadas por ciertas bacterias en
condiciones ambientales desfavorables. La tinción de endosporas es un
procedimiento especial diseñado para resaltar estas estructuras únicas. Uno de los
métodos más comunes es la tinción de Schaeffer-Fulton, que implica la aplicación
de calor para facilitar la entrada del colorante en las endosporas. Después de la
tinción con malachita verde, las endosporas aparecen de color verde bajo el
microscopio, mientras que el resto de la célula se tiñe con safranina, lo que permite
su visualización y diferenciación.
o Observación:
Una vez completadas las etapas de tinción, las placas se examinan bajo un
microscopio óptico para observar el crecimiento bacteriano, así como la morfología
y características de las colonias. Este análisis permite identificar las especies
 bacterianas presentes, evaluar su susceptibilidad a diferentes condiciones
ambientales y estudiar su comportamiento en respuesta a estímulos externos. La
combinación de técnicas de preparación de medios, siembra de bacterias, tinción y
observación microscópica constituye un enfoque integral para el estudio de la
microbiología y la comprensión de la diversidad y función de los microorganismos
en diferentes entornos.

MATERIALES

MATERIAL A SOLICITAR EN EL LABORATORIO (parte 1)

• Cajas Petri de dos divisiones (1 por equipo)

• Incubadora, 37 °C.
• Autoclave
• 2 Tubos de ensaye estériles
• 10 ml de solución salina isotónica estéril
• 1 probeta
• Matraz Erlenmeyer
• Caldo nutritivo
• Agar bacteriológico
• 1 Espátula
• Balanza analítica
• Charolitas para pesar
• Agua destilada
• 1 Mechero Bunsen
• 1 tripie
• 1 tela de asbesto o rejilla de calentamiento
• 1 Gradilla

MATERIAL NECESARIO POR EQUIPO (TRAER AL LAB)

• Muestra ambiental (tierra fértil).

• 1 bolsa de algodón en barra o almohadilla
• 20 palillos de madera delgaditos para hacer hisopos (tipo brocheta delgados)
• 1 jeringa de 3 o 5 ml estéril
• Papel estraza 1 metro o papel Kraft
• Marcador Sharpie
• Cinta de papel o cinta Masking tape
• Tijeras
• 1 charola (puede ser de peltre o aluminio) para calentar agua y meter el matraz E
• erlenmeyer
• Materiales de limpieza, franelas(2 o 3)
• Materiales de seguridad personal (lentes, cubre bocas, guantes estériles), bata

MATERIAL A SOLICITAR EN EL LABORATORIO (parte 2)

 • Asa de siembra.
• 2 Portaobjetos.
• Colorantes: verde malaquita al 5%, Safranina al 0.5%
• 1 Mechero bunsen
• 1 Mechero de Alcohol
• 2 varillas de vidrio para la tinción
• Piceta con Agua destilada
• Charola de tinción
• Pinzas para sujetar portaobjetos
• 2 papel filtro del tamaño del portaobjetos (Es para cubrirlo)

MATERIALES QUE DEBERÁ TRAER EL ALUMNO

• 1 plato cuadrado de unicel desechable

• Servilletas
• Torundas con alcohol
• Materiales de Limpieza y seguridad
• Pinzas de madera para sujetar ropa

MATERIAL A SOLICITAR EN EL LABORATORIO (parte 3)

• 1 Asa de siembra.
• 2 Portaobjetos.
• Charola de tinción
• Colorantes para tinción de Gram: cristal violeta, safranina, Lugol., Solvente orgánico
(alcohol/acetona, 1:1).

MATERIALES QUE DEBERÁ TRAER EL ALUMNO

• 1 plato cuadrado de unicel desechable

• Servilletas
• Torundas con alcohol
• Materiales de Limpieza y seguridad

DIAGRAMA DE FLUJO
 PROCEDIMIENTO

Protocolo (parte 1)

Día 1

1. Resuspender en solución salina muestras procedentes del suelo; homogeneizar

y sembrar en placa AN.
2. Sembrar en Agar Nutritivo estéril por la técnica siembra en césped, incubar a 37
°C. Se requieren 48-72 h con objeto de que la bacteria agote los nutrientes del
medio nutritivo e inicie el proceso de esporulación.(2 días)

Día 4

1. Realizar una tinción de Gram y otra específica de endosporas, de los

distintos tipos morfológicos de colonias que observemos en la placa.
2. Observar al microscopio y describir:
• La frecuencia de aparición de endosporas frente a las bacterias no
esporuladas
• Frecuencia de endosporas en el interior de las formas vegetativas en
comparación con las endosporas libres

Protocolo (parte 2)

1. Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre una gotita de
agua en el portaobjetos, dejar secar y fijar con la mínima cantidad de
calor
2. Añadir verde malaquita al 5%, cubriendo la muestra, cubrir con el papel
filtro y mantener 5 min sobre la llama del mechero (Preferente hacer una
llama con alcohol en torunda). [Evitar que el colorante hierva]
 3. Cuando comience a evaporarse («humear»), añadir más colorante.
4. Dejar enfriar por 5 min
5. Lavar el exceso con agua, suavemente.
6. Tinción simple con safranina (colorante de contraste). Colorear durante
30 s con solución acuosa de safranina al 0.5%.
7. Lavar el exceso con agua, suavemente
8. Secar, colocando en servilleta.
9. Observar al microscopio en objetivo 100X

.Resultados: Las endosporas se tiñen de verde y las células vegetativas de rojo

a rosado

Protocolo (parte3)

1. Fijación de la muestra.
2. Tinción simple con cristal violeta, 2 min (primer colorante).
3. Lavar en el chorro suave de agua
4. Añadir Lugol, 1 min (mordiente).
5. Lavar en el chorro suave de agua
6. Lavado con alcohol/acetona (agente decolorante).
7. Lavar en el chorro suave de agua
8. Tinción simple con safranina, 1 min (colorante de contraste).
9. Lavar en el chorro suave de agua
10. Secar cerca de la flama del Mechero
11. Observar al microscopio en objetivo 100X,

Resultado: las bacterias Gram Negativas se teñirán de rojo o rosa, y las Gram Positivas de
color Morado o Azules.

Imágenes Observaciones

Se realizó la preparación del caldo

nutritivo en un matraz Erlenmeyer, la
boquilla se envolvió en papel craft para
evitar la contaminación de este y la
esterilización efectiva
 Entre 4 mecheros fisher ( para evitar la
proliferación de bacterias ajenas a las
muestras) y después de una esterilización
del la mesa. Se depositó
el caldo nutritivo en una caja petri estéril,
y esperamos un momento para el secado
de el caldo en la caja petri

Procedemos a el sembrado de las

muestras en el agar nutritivo, con 3
técnicas diferentes parecidas al estriado,
con menos presencia de bacterias en
cada una. Todo esto aún entre los 4
mecheros fisher

Después de aproximadamente 5 días

después del sembrado, observamos la
reproducción de las bacterias en la caja
petri

Realizamos la tinsion de gram con el Asa

bacteriologíca y pusimos a evaporar el
agua cerca del mechero para que en el
portaobjetos solo quedara la muestra
 Realizamos el teñido y el resultante al
microscopio fue observa un color rojo
oxidado

Realizamos la tinción de endosporas

siguiendo el mismo procedimiento que
con la tinsion de gram después de
esterilizar el Asa directamente en el
mechero

Después del teñido el resultante en el

microscopio no dejó observar teñidas de
color verde a las endoesporas, entre el
color rosado de todas las bacterias
restantes

CONCLUSION
En conclusión, el proceso de preparación de agar nutritivo, siembra de bacterias, tinción y
observación microscópica es fundamental en el estudio de la microbiología. La capacidad
del agar nutritivo para soportar el crecimiento de una amplia gama de microorganismos lo
convierte en un medio de cultivo versátil y ampliamente utilizado en laboratorios
microbiológicos. La siembra adecuada de bacterias en el agar permite estudiar su
morfología, características de crecimiento y respuesta a diferentes condiciones
ambientales. La tinción de Gram y la tinción de endosporas son técnicas importantes para
diferenciar entre diferentes tipos de bacterias y resaltar estructuras de resistencia
específicas, respectivamente. La observación microscópica de las colonias bacterianas y
las células individuales proporciona información valiosa sobre la diversidad bacteriana y
su papel en diversos entornos. En conjunto, estos procesos constituyen una herramienta
esencial para la investigación microbiológica y la comprensión de la ecología microbiana,
la patogenicidad bacteriana y otros aspectos importantes relacionados con los
microorganismos.

Bibliográfias

Preparación de Agar Nutritivo

- Dawson, M. P. (2014)(EUA). Preparation of Nutrient Agar Plates Current
Protocols Essential Laboratory Techniques (México) (23 Febrero 2024)
(https://doi.org/10.1002/9780470089941.et0103s31).

Siembra de Bacterias en Agar Nutritivo y Tinsion

- ASM (American Society for Microbiology). (2020).(EUA) Bacterial Culture
Techniques (México)(23 febrero 2024) (https://asm.org/Protocols/Bacterial-
Culture-Techniques).