TEMA:

"EVALUACION DE LA CRIOCONSERVACION DE EMBRIONES BOVINOS (Bos Taurus) POR DOS

METODOS DE DESCENSO DE TEMPERATURA

RESUMEN

La crio conservación es considerada la técnica de elección para los embriones bovinos producidos
in vivo. Durante el procedimiento de congelación, las células embrionarias sufren cambios
importantes asociados a la formación de hielo intracelular o extracelular que pueden disminuir la
sobrevida poscriopreservación. Para poder minimizar estos problemas, se recurrirá al uso de
"sustancias crio protectoras", así como a tasas de descenso térmico controladas mediante la
utilización de máquinas congeladoras programables de alto costo.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la viabilidad de los embriones post descongelados. Se
utilizaron 10 embriones específicamente mórulas compactas de tipo 1; los cuales se obtuvieron de
5 vacas donadoras de raza Holstein.

INTRODUCION

La Biotecnología en el mundo actual ha ido avanzando de a poco con los descubrimientos, nuevas
investigaciones que se realizan por la necesidad de mejorar la economía ganadera. La producción
de embriones in vitro ofrece nuevas perspectivas para la aceleración del progreso genético y la
utilización de bajas temperaturas para conservar esos embriones se la ha convertido en una
herramienta indispensable para consolidar y aumentar el impacto de estas tecnologías. La crio
conservación y almacenamiento de embriones a bajas temperaturas presenta ventajas tanto
desde el punto de vista biológico como desde el comercial. Las posibilidades de aplicación de la
tecnología in vitro son múltiples y presentan un elevado interés en el caso del ganado bovino. La
tecnología reproductiva in vitro se encuentra actualmente en un estado de desarrollo avanzado;
La biotecnología en la reproducción ha ido de poco dando buenos resultados en las distintas
ganaderías obteniendo resultados satisfactorios para el ganadero usando hembras de alto valor
genético como donadoras de embriones.

Anatomía del Aparato Reproductor de la Vaca.

Ovarios.(2)
Oviductos.(2)
Cuernos Uterinos.(2)
Útero.
Cérvix.
Vagina.
Vestíbulo.
Vulva
El Ciclo Estral

Con el tiempo, ocurren muchos cambios en el aparato reproductor, en respuesta a distintos

niveles de hormonas. En una hembra no gestante, estos cambios ocurren cada 18 a 21 días. Esta
periodicidad se llama ciclo Estral.
El ciclo estral se puede dividir en 4 etapas:
Proestro.
Estro.
Metaestro.
Diestro.
Cada una de estas etapas es una subdivisión de la fase folicular y luteal del ciclo. La fase folicular
incluye proestro y estro mientras que la fase luteal incluye metaestro y diestro.
Proestro = formación de folículos ovulatorios + secreción de estrógenos.
Estro = receptividad sexual + aumento de la secreción de estrógenos.
Metaestro = formación de Cl + comienzo de secreción de progesterona.
Diestro = secreción sostenida de progesterona.

Foliculogenesis.
Permite obtener un folículo pre ovulatorio o de Graff a partir de los folículos primordiales. Estos
folículos, están formados por ovocito rodeado de una capa de células foliculares planas y por
mecanismos intraovaricos.

Folículos primordiales: Se encuentran en gran número en el ovario antes del nacimiento.

Folículo primario: El oocito se encuentra rodeado por una simple capa de célula cuboidales o
poliédricas.

Folículo secundario. El oocito está rodeado por varias capas de células poliédricas o cuboidales,
momento en el cual, las células de la granulosa desarrollan receptores para FSH y estrógenos.

Folículo terciario: El oocito está rodeado por varias capas de células granulosas y el antro folicular
está formado.

Folículo de Graff: Se forma como resultado de la acumulación de fluido folicular y hace que se
extienda el antro, el oocito se ubica en la periferia del folículo y se rodea por una acumulación de
células de la granulosa. Debido a su talla, el folículo de Graff maduro, emerge desde el ovario a la
superficie en forma de ámpula.

Ovogénesis
 La ovogénesis es el proceso de formación, crecimiento y maduración de los gametos femeninos.
Comienza a partir de la vida fetal con la división mitótica de las ovogonias y posterior
transformación en ovocitos. A partir de esta célula, comienza el proceso de meiosis que permite
obtener una célula haploide capaz de ser fecundada

Morfología de un Embrión.

Después de su liberación, el ovocito es "atrapado" por las fimbrias del infundíbulo y dirigido al
interior del oviducto a través de la actividad ciliar. El ovocito bovino, fertilizado o no, es una célula
de 150-190 ml de diámetro, incluyendo a la zona o membrana pelúcida, una capa acelular
glicoproteína de 12 a 15 ml de espesor producida por el ovocito

Mórula Compacta

Sus blastómeros están unidos y constituyen una masa compacta que ocupa sólo el 60-70% del
espacio perivitelino. Las blastómeras se juntan y forman una masa celular sólida. El embrión ocupa
aproximadamente un 60% del espacio perivitelino.
Blastocisto Temprano

se caracteriza por el comienzo del transporte de fluido en las células trofoectodérmicas y por la
formación de una cavidad (blastocele) en el interior del embrión, dando la apariencia de un anillo
de sello. El Bt ocupa 70-80% del espacio perivitelino.

Blastocisto

existe una marcada diferenciación entre las células del trofoblasto, que constituyen una pared
que se adosa a la zona pelúcida y la masa celular interna (o disco embrionario) más oscura. La
única diferencia entre los estados de Blastocisto temprano y Blastocisto es básicamente el tamaño
de la cavidad.

Blastocisto Expandido
El diámetro aumenta considerablemente (1,2 a 1,5x), con el consecuente adelgazamiento de la
zona pelúcida a 1/3 de su espesor original. La presión creciente del Blastocisto en crecimiento
provoca la ruptura de la zona pelúcida, a través de la cual comienza su protrusión. Los embriones
recuperados en este estadio se pueden colapsar temporalmente, esto se caracteriza por una
pérdida completa o parcial del blastocele.

Blastocisto Protruido

Los embriones han abandonado la zona pelúcida. Su forma puede ser esférica, con un blastocele
bien definido ("burbuja") o colapsado. La identificación en este estadio puede ser dificultosa para
el operador inexperto. Los Bp pueden ser igualmente transferidos, sin embargo, los embriones
desprovistos de la zona pelúcida son extremadamente frágiles y pegajosos,

La Crioconservación

Gracias a los avances desarrollados a nivel mundial en el campo de la reproducción asistida, es

factible obtener un incremento en el número de embriones obtenidos de una hembra donante.
Con la ayuda de tratamientos hormonales superovulatorios, se logra la preñez y el nacimiento de
las crías al transferirlos a receptoras sincronizadas. De esta manera, se alcanza un mayor número
de descendencias a partir de un animal con excelentes cualidades, tanto productivas como
genéticas. (g) El uso de la criopreservación de embriones dentro del proceso de transferencia de
embriones, brinda una herramienta de suma utilidad, ya que a través de esta técnica podemos
conservar durante un prolongado período de tiempo un embrión de excelente calidad, que
permite utilizarlo cuando y donde se produzcan las condiciones favorables para lograr la preñez de
las receptoras, o ser usada en algún lugar lejano de donde fue colectado.
Etapas del Proceso de Crioconservación

Hay 4 etapas:
a) Suspensión de los embriones en soluciones a la que se les ha adicionado crioprotectores.
b) Enfriamiento en condiciones tales que eviten la formación de cristales intracelulares cuando se
sumergen en nitrógeno líquido (-196 º C).
c) Entibiamiento de los embriones a temperaturas fisiológicas para reasumir las funciones.
d) Remoción de los crioprotectores (dependiendo del criopreservante del que se trate).

Crioprotectores

Un crioprotector es un compuesto químico que permite la mantención de un tejido o de células

por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los crio protectores difieren en la
velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al cristal de agua que confieren y por la
toxicidad química que pueden tener sobre las células. El grado de protección a las células está
directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor
afinidad, menor el agua disponible para la cristalización dañan.

En la congelación de embriones se utilizan dos tipos de crioprotectores:

Permeables o intracelulares: De bajo peso molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2
propanodiol, etilenglicol (EG)

Permeables o intracelulares: De alto peso molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa,

ficol, dextrano sorbitol, sacarosa, lactosa, trealosa

Técnicas de Crioconservación de Embriones

CRIOPRESERVACIÓN EN EQUILIBRIO
Deben lograr un "equilibrio" entre la tasa a la cual el agua sale de la célula (deshidratación) y la
tasa a la cual ese agua es incorporada a los cristales de hielo extracelular.

Tradicional
Los crioprotectores utilizados en esta técnica son normalmente permeables. Los más
frecuentemente utilizados son: glicerol y etilenglicol. Este fenómeno se debe a la
hiperosmolaridad inicial de la solución extracelular y a que los embriones son mucho más
permeables al agua que a los crioprotectores;
Estándar

La técnica de congelación estándar posibilitó a obtener el primer ternero nacido de la

transferencia de un embrión congelado. En la técnica de congelación estándar la exposición de los
embriones al medio de congelación debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 °C), en un
solo paso, de 10 a 30 minutos de duración.

De un paso

Desde el momento en que se demostró que la sacarosa podía ser utilizada para retirar el
crioprotector de los embriones, surgió la posibilidad de diseñar una técnica de extracción que se
adaptara al trabajo en condiciones de campo. Para evitar que durante la extracción del
crioprotector el embrión esté en contacto con el medio externo, implementaron el denominado
método de congelación de embriones en un paso

De Transferencia Directa. Una versión de la técnica de un paso, es la llamada técnica de

transferencia directa, en el cual se emplean crioprotectores altamente permeables tales como el
etilenglicol o el 1,2 propilenglicol. En tal sentido, las pajuelas son descongeladas y el embrión es
transferido directamente al útero de las receptoras. Como estos crioprotectores son altamente
permeables, los embriones que son congelados y descongelados sufren un daño osmótico muy
leve cuando son transferidos directamente a un ambiente osmótico (útero)

CRIOPRESERVACIÓN NO EQUILIBRADA

El término no equilibrada, se usa para describir la criopreservación por procedimientos en los

cuales las células y los tejidos no están en equilibrio con las altas concentraciones de
crioprotectores permeables y no permeables, antes de un enfriamiento rápido.

Rápida

Esta técnica es usada para describir la criopreservación de células que han sido parcialmente
deshidratadas antes de ser sometidas a una tasa de enfriamiento rápido.

Vitrificación

La vitrificación es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar órganos, tejidos y

embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado crioprotectores en alta concentración. Al
ser enfriada no cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del estado líquido a un estado sólido no
estructurado similar al vidrio, tomando de ahí su nombre

Selección de Vacas Donadoras

El valor de la donadora puede ser definido de acuerdo a diferentes criterios según los
beneficiarios. Sin embargo, en el caso de la aplicación práctica de la técnica para el mejoramiento
genético del ganado, debemos escoger a las vacas más productivas como donadoras. Además,
estas vacas, deben de cumplir con los siguientes requisitos:
a. No presentar enfermedades hereditarias.
b. Tener excelente historial reproductivo y salud.
c. Alto valor en el mercado.
d. Ciclos estrales regulares.
e. No tener enfermedades que afecten la fertilidad.
f. No ser demasiado viejas

Selección de Vacas Receptoras

Para los programas de transferencia de embriones, se debe realizar una detallada selección de
receptoras, con el fin de obtener las mayores tasas de preñez posibles.
Los parámetros de selección incluyen:
Condición corporal. Peso.
Habilidad materna.
Evaluación reproductiva y estado sanitario.
En este último punto las futuras receptoras de embriones deben estar vacunadas contra
brucelosis y recibir dos dosis de vacuna contra enfermedades reproductivas.

Protocolo de Superovulación con Folltropin

Colección de Embriones (Transcervical)

 Mediante un sencillo lavado de útero de la donadora, empleando para ello una solución salina a la
que se adiciona suero sanguíneo y antibióticos. Primeramente se le aplica anestesia epidural en la
base de la cola para evitar las contracciones del recto y que permita la manipulación del útero.
El momento indicado para realizar la colección es entre el día 6 a 7 de iniciado el estro debido al
tipo de estructuras que se encuentran en estos días considerando de que los embriones pasan del
oviducto al cuerno uterino en el cuarto o quinto día. Después de la colección embrionaria las
donadoras reciben una inyección de prostaglandinas F2 a 25 mg con el objeto de inducir la
regresión de los cuerpos lúteos, evitar una posible gestación.

Calificación de Embriones

La clasificación y evaluación de los embriones son sin duda los procedimientos más difíciles, Los
embriones se buscan con un estereomicroscópio en magnificación 10-15X. Teniendo el medio en
una caja de Petri se pone una placa cuadriculada bajo esta para facilitar la búsqueda y
clasificación. Luego de haber encontrado el último embrión se busca una o dos veces más para
descartar que alguna futura cría se nos haya quedado en el medio.

Calificación de Embriones según la Calidad.

La evaluación la damos de acuerdo a sus características morfológicas. Estas características son

subjetivas y pueden variar de un técnico a otro. Las características que debemos tener en cuenta
para calificar un embrión son:
Forma esferoide del embrión.
Color y textura de la masa celular.
Diferencia de tamaño entre los blastómeros.
Número y nivel de compactación de los blastómeros.
Tamaño del espacio perivitelino.
Presencia de blastómeros sueltos o separados.
Presencia o ausencia de vesículas.
Forma y estado de la zona pelúcida.
Apariencia clara y neta de los blastómeros.
Tonalidad oscura y uniforme.
Uniformidad de la membrana celular.
Proporcionalidad entre el embrión y el espacio perivitelino.
Integridad de la zona pelúcida.
Ausencia de vacuolas en el embrión y bridas celulares en el espacio perivitelino.
Ausencia de detritus celulares adheridos a la zona pelúcida.
Compactación de los blastómeros entre sí

Grados o códigos de calidad de los embriones, el rango para la calidad de los embriones es de 1-4:

Animales:
Donadoras: 5 Vacas de alto valor genético que cumplan con un buen manejo alimenticio, sanitario,
no presenten enfermedades hereditarias, tengan un excelente historial reproductivo y que no
sean demasiado viejas.

MANEJO DEL ENSAYO

La investigación se realizó en 5 vacas donadoras de las cuales se estuvo un total de 39 embriones

los mismos que fueron mórulas tempranas, mórulas compactas, blastocitos y blastocitos
expandidos.

Aplicación de Tratamientos.

Tratamiento # 1 Se realizó la Crioconservación a 0.3 °C por minuto a 5 embriones específicamente

mórulas compactas.
Tratamiento # 2 Se realizó la Crioconservación a 0.7 °C por minuto a 5 embriones específicamente
mórulas compactas. La congelación se realizó a los 10 embriones, siendo todas mórulas compactas
de Tipo 1, esperando tener éxito en la viabilidad de embriones post descongelados.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

Embriones Recolectados Calificados Según su Madurez

de las cinco vacas que fueron seleccionadas como donadoras se puede apreciar que de tres de
ellas se obtuvo la mayoría de mórulas compactas, teniendo un total de 39 embriones
recolectados; los mismos que fueron clasificados según su madurez. Obtuvimos un total de 28
mórulas compactas, 7 blastocitos, 3 blastocitos expandidos y una mórula temprana. Teniendo en
cuenta que lo q más se recolectó fueron mórulas compactas seguido de blastocitos.

Embriones Recolectados Calificados Según su Calidad

puede observar la clasificación de los embriones según la calidad; en el mismo se puede apreciar el
número de embriones recolectados que fueron 39, seguido de un total de 29 embriones de Tipo 1
que significa que estos son excelentes para poder crioconservarlos, luego tenemos 5 embriones de
tipo 2 (regular) y 5 embriones de tipo 4 (degenerados). Fiona 0732 fue la vaca que mayor número
de embriones de tipo 1 se recolecto, seguido de Fiona 0354 que se obtuvo 6 embriones y
finalmente Fiona 0728 y Fiona 0706 que tuvieron 5 embriones cada una.

Viabilidad de los Embriones.

nos indica todos los resultados que se llevó a cabo en esta investigación, donde el T1 fue el que
tuvo mayor viabilidad con los embriones post descongelados siendo el 40% y un 10 % de
mortalidad lo que indica que con la crioconservación a 0.3 °C por minuto se pudo obtener mayor
viabilidad por que sobrevivieron 4 embriones, un embrión muerto y ningún embrión anormal.
Mientras que en el T2 se obtuvo un porcentaje de 20% de viabilidad, 20% de mortalidad y 10 % de
embriones anormales; lo que indica que con la crioconservación a 0.7 °C por minuto no se pudo
obtener viabilidad ya que a este tratamiento solo 2 embriones fueron viables.

CONCLUSIONES

De acuerdo a nuestros resultados arribamos a las siguientes conclusiones:

• El protocolo de congelación lenta 0.3 °C por minuto tuvo mayor efectividad producido in vivo.

• Los embriones producidos in vivo muestran una mayor tolerancia a los procesos de
criopreservación practicados en nuestro estudio.

• Al evaluar la interacción entre el método de criopreservación y modo de obtención de los

embriones, concluimos que el método de congelación lenta y los embriones producidos in vivo son
los más eficientes.

RECOMENDACIONES

• Al momento de implementar un programa de crio conservación de embriones tanto producidos

in vivo como in vitro, se recomienda que se emplee el protocolo de congelación lenta.

• Se recomienda realizar otras investigaciones para evaluar tasas de gestación y compararlas con
los resultados obtenidos in vivo.
• En el caso de los embriones producidos in vitro es recomendable ensayar nuevos protocolos de
criopreservación que aporten resultados superiores para favorecer la comercialización a gran
escala de este tipo de embriones.

BIBLIOGRAFIA