Asignatura: Microbiología Aplicada

Unidad Curricular: 1
Practica Nº04: Examen microbiológico de productos y dispositivos estériles: métodos de
filtración por membrana y de inoculación directa

1. Objetivo General
• Realizar la prueba de esterilidad en productos líquidos y dispositivos
médicos.

2. Objetivos Específicos
• Determinar la esterilidad de un dispositivo médico mediante el método de
inoculación directa.
• Determinar la esterilidad de un producto líquido mediante el método de
filtración por membrana o por inoculación directa.

3. Fundamento Teórico

El ensayo de esterilidad tiene por objeto determinar si existen contaminantes

microbianos que pueden estar presentes en los productos medicinales, biomédicos, sustancias
y todo aquel material que según las farmacopeas tienen como requisito ser estériles, ya sea
que hayan sido esterilizados en su envase final o que hayan sido preparados asépticamente.

Prueba de esterilidad
Se fundamenta en la detección de bacterias, hongos o levaduras que podrían encontrarse en
productos estériles y de esa manera asegurar su uso en humanos y animales. La cantidad de
productos a analizar por lote, así como la cantidad por envase, se detallan en las tablas del
anexo.
4. Parte Experimental

1. Equipos, medios de cultivo y materiales

• Equipos
EQUIPOS
Incubadora de microorganismos a 25 y 35 ºC
Cabina de Flujo Laminar
Equipo de protección personal (Mascarilla, guantes, cofia y mandil)
Bomba de vacío

• Materiales y Medios de Cultivo

Materiales y medios Indicaciones
TSB Tubos de 15 ml
TSB Frascos de 75ml
Caldo tioglicolato Tubos de 15 ml
Agua destilada estéril Frascos con 25ml
Membranas, portafiltros, pinzas, tijeras y
Equipo de filtración
matraces Kitasato
 2. Procedimiento
• Método de filtración por membrana
1. El proceso de filtración se realizará en la cabina de flujo laminar que ha sido
previamente desinfectada con alcohol al 70% y con luz UV.
2. Armar el equipo de filtración que debe ser estéril. La membrana que se usará
es de 47 mm de diámetro y 0.45 um de poro.
3. Filtrar el contenido del envase según lo especificado en la tabla “Cantidad
mínima a usar para cada medio” de la Farmacopea.
4. Lavar la membrana con 25 ml de agua destilada estéril.
5. Cortar la membrana con tijeras estériles y la primera mitad inocular en un tubo
con 15ml de caldo tioglicolato y la otra mitad en un tubo con 15ml de caldo TSB.
Estos tubos se dejan incubar durante 14 días a 35°C. Los tubos deben revisarse cada
día y anotar si hay turbidez.
6. En el día que se observe turbidez se debe hacer pase por estriación a los
siguientes medios con la finalidad de identificar a los microorganismos: TSA, agar
MacConkey y agar Manitol salado.
7. En caso de haber crecimiento en los medios en la caja hacer tinción Gram y
las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación.

• Método de inoculación directa

1. El proceso de inoculación directa se realizará en la cabina de flujo laminar
que ha sido previamente desinfectada con alcohol al 70% y con luz UV.
2. En un gatorade con 50 ml de TSB colocar el dispositivo método a investigar.
Este frasco junto con un control negativo (frasco solo con TSB) se incuban a 25°C
durante 14 días.
3. Los frascos deben revisarse cada día y anotar si hay turbidez. En el día que se
observe turbidez se debe hacer pase por estriación a los siguientes medios con la
finalidad de identificar a los microorganismos: TSA, agar MacConkey y agar Manitol
salado.
4. En caso de haber crecimiento en los medios en la caja hacer tinción Gram y
las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación.

3. Manejo de residuos, Tratamiento y etiquetado

Eliminar correctamente los desechos generados:
Todo material que haya tenido contacto con las bacterias depositarlo en el tacho de basura
con la funda roja. (guantes, mascarilla, toca, papel absorbente)
Material cortopunzante como: palillos e hisopos deben ser depositados en el contenedor de
cortopunzantes.
 4. Resultados

• Identificación de los productos

Nombre comercial del

producto
Lote
Fecha de elaboración
Fecha de caducidad

• Resultados de los días de Incubación

DIA DE INCUBACIÓN Método de filtración por membrana Método de inoculación directa

Crecimiento (+/-) Crecimiento (+/-)
TSB Tioglicolato TSB Tioglicolato
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

• Identificación de microorganismos

Medios de cultivo y Coloración Gram de las Pruebas bioquímicas Microorganismo/s

PRODUCTO descripción de las colonias realizadas y resultados identificado/s.
ANALIZADO colonias

Discusión de resultados y conclusiones:

Bibliografía
• USP. (2013). United States pharmacopeia 36-The national formulary 31.
Rockville, MD: United Book Press.

ANEXOS
Tabla 1. Cantidad de Producto a evaluar
 Tomado de la USP 41
Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar por cada medio

Tomado de la USP 41
Asignatura: Microbiología Aplicada
Unidad Curricular: 1
PRACTICA N° 05. Monitoreo microbiológico de Aire, Superficies y Manipuladores.

1. Objetivo General
• Realizar el monitoreo microbiológico de aire, superficies y manipuladores
dentro de la facultad y el laboratorio.

2. Objetivos Específicos
• Determinar el número de microorganismos presentes en el aire, superficies de
trabajo y manipuladores.
• Aplicar los diferentes tipos de muestreo para el análisis de superficies.
• Comparar los valores de microorganismos encontrados, con los límites
especificados en la farmacopea y en las normas de buenas prácticas de manufactura.

3. Fundamento Teórico
El control microbiológico ambiental es indispensable en la industria farmacéutica para
asegurar la calidad de los productos elaborados. El monitoreo ambiental no sólo se requiere
para la elaboración de productos estériles, sino también para los productos no estériles, donde
la contaminación microbiológica puede afectar seriamente la calidad de los productos
farmacéuticos, se deben establecer límites para cambios o aumentos significativos en el
número de unidades formadoras de colonias encontradas en el ambiente es decir establecer
niveles de alerta y de acción. Estos límites de acción y alerta deben establecerse después de
acumular suficientes datos a lo largo de un periodo extenso de monitoreo (idealmente
incluyendo cuatro cambios estacionales o un año completo).
El conteo de partículas y el conteo de microorganismos viables dentro de ambientes
controlados varían con la localización del muestreo y las actividades que se están
desarrollando durante el monitoreo.
El monitoreo ambiental en una industria farmacéutico consta de los siguientes análisis que
se encuentran detallados en las Tablas 1 y 2:
Tabla 1. Programas de Monitoreo Ambiental
Componente Comentarios
Agua La materia prima básica y principal dentro de la industria farmacéutica. El
control microbiológico del agua es uno de los componentes principales y
esenciales en el monitoreo ambiental.
Gases a presión Aire, gas, nitrógeno a, presión y todos los elementos asociados deben ser
monitoreados periódicamente.
Aire Este monitoreo incluye detección de partículas viables y no viables
Superficies Este monitoreo requiere el uso de medios de cultivo y toma de muestra
apropiados para los diferentes tipos de superficies
Operarios Monitoreo de vestimenta de laboratorio y manos por impresión de dedos
sobre placas de agar
Tomado Cerra, 2013
Tabla 2. Muestreo Microbiológico
Muestra Método Descripción
 Surface Air System y Reuter Centrifugal
Impacto sobre agar
Sampler
Aire
Placas Petri de 90mm de diámetro y 14 mm
Placas de sedimentación
de altura con tapa y agar especifico.
Pueden ser simplemente hisopados de
distintos materiales o kits comerciales que
Hisopados
incluyen hisopados más medios de transporte
y crecimiento
Superficies Pueden ser preparadas o comerciales como las
Placas de contacto
placas RODAC
Método que permite tomar muestras de gran
Lavado superficie de zonas que son inaccesibles o que
no se pueden desmontar
Este monitoreo permite evaluar el nivel de
Monitoreo de vestimenta de
destreza en técnicas asépticas por parte del
laboratorio y manos por
Operarios personal que trabaja en la manufactura de los
impresión de dedos sobre
productos farmacéuticos
placas de agar
Tomado Cerra, 2013
• Análisis del aire
Las partículas suspendidas en el aire pueden ser portadoras de bacterias, endosporas y hongos
que pueden contaminar la materia prima, las superficies y hasta el producto final. Si estos
microorganismos son patógenos pueden incluso ser un riesgo para el paciente si el producto
llega contaminado.
Existen distintos métodos para determinar la calidad microbiológica del aire: sedimentación,
filtración, choque en líquidos y precipitación electrostática.

• Monitoreo de superficies
En la evaluación de la calidad microbiológica de las superficies se emplean los métodos:
hisopado, esponja y placa de contacto RODAC (RODAC= Replicate Organism Detection And
Counting).
En el método de hisopado se pasa con un hisopo empapado en solución salina, la superficie
a investigar y que está limitada por una plantilla de superficie conocida. Los
microorganismos recogidos por el hisopo se recuperan en un volumen conocido de líquido
(solución salina o caldo nutritivo), que se siembra en medios determinados para el contaje e
identificación de los microorganismos.
Las placas RODAC tienen medios de cultivo (selectivos o no) que sobresalen de la base de
la caja Petri y que se ponen en contacto directo con la superficie a investigar, los
microorganismos se impregnan directamente y una vez incubadas las placas se tiene los
resultados.
El método de la esponja se utiliza para el análisis de superficies de mayor tamaño. Se frota
con una esponja estéril, previamente humedecida en una solución diluyente, el área
determinada en el muestreo. Los microorganismos recogidos por la esponja se recuperan en
un volumen conocido de líquido, que se siembra en medios determinados dependiendo del
tipo de microorganismo que se quiere aislar e identificar.
• Análisis de Manipuladores
El personal que está en contacto con el producto durante el proceso de manufactura, puede
ser una fuente de contaminación. El monitoreo del personal constituye un buen indicador del
nivel de seguimiento de las buenas prácticas de manufactura establecidas en el sitio de
trabajo. Es recomendable realizar este análisis al final de operaciones críticas, o cuando se
sospeche que los microorganismos contaminantes que se han detectado en el producto
podrían provenir del operador.
4. Parte Experimental
1. Equipos, medios de cultivo y materiales

• Equipo
EQUIPOS
Incubadora de microorganismos a 25 y 35 ºC
Micropipeta de 100-1000uL
Equipo de protección personal (Mascarilla, guantes, cofia y mandil)
• Materiales y Medios de Cultivo
Medio Observaciones
TSA PETRI
PETRI
SAB
RODAC
PETRI
PCA
RODAC
PETRI
EMB
RODAC
Manitol PETRI
MacConkey Petri
Placas petrifilm para
coliformes y Petrifilm
Staphylococcus
TSB Tubos
Solución salina Tubos
Hisopos largos de
algodón estériles

plantillas de aluminio
25cm2 estériles
• Reactivos

Reactivos
NaCl 0.85%
Alcohol antiséptico al 70º

2. Procedimiento

Análisis de aire por sedimentación para el recuento de microorganismos aerobios

mesófilos totales.
 1. Previo a la toma de muestras, evaluar las áreas de mayor riesgo para hacer el
muestreo y tomar en cuenta el esquema de muestreo: 1/1/1 (por una hora, a la altura
de un metro y al menos un metro de las paredes o cualquier obstáculo.
2. Etiquetar dos cajas de TSA, con el nombre de la zona a muestrear, el tiempo
que se va a muestrear y la identificación del grupo o alumno.
3. Destapar las placas de TSA en la zona a muestrear.
4. Pasado el tiempo de muestreo, tapar las placas e incubar durante 24 a 48 horas
a 30 o 35°C ± 1.
5. Contar las colonias formadas y reportar como: UFC/hora
6. Hacer una coloración Gram de las colonias bacterianas y si es necesario una
coloración de endosporas.

Análisis de aire por sedimentación para el recuento de mohos y levaduras.

1. Previo a la toma de muestras, evaluar las áreas de mayor riesgo para hacer el
muestreo.
2. Etiquetar dos cajas de SAB, con el nombre de la zona a muestrear, el tiempo
que se va a muestrear: 30 minutos y la identificación del grupo o alumno.
3. Destapar las placas de SAB en la zona a muestrear.
4. Pasado el tiempo de muestreo, tapar las placas e incubar durante 5 días a 25°C
± 1.
5. Contar las colonias formadas y reportar como: UFC/hora
6. Identificar mediante observación macroscópica y microscópica las colonias
encontradas.

Análisis de superficies planas con placas de contacto RODAC.

1. Preparar las placas RODAC con los diferentes medios de cultivo: una placa
de PCA, EMB y SAB. Se vierte el medio de cultivo en las placas de manera que para
preparar estas placas se procura que el agar sobresalga del borde de la placa para
facilitar el contacto con la superficie a examinar (Ver Figura)
2. Las superficies a muestrear deben ser planas.
3. Etiquetar cada placa con el nombre de la zona a muestrear y código del
alumno o grupo encargado.

FIGURA. Placa de contacto (el agar sobresale)

• Toma de muestra:
4. Abrir una a una las placas RODAC y presionar suavemente sobre la superficie
elegida (Ver Figura). Si la superficie ha sido desinfectada previamente, se debe
neutralizar el agente desinfectante previo al muestreo.
5. Tapar e incubar las placas con los medios de cultivo PCA y EMB. durante 24
a 48 horas a 30 o 35°C ± 1, y las placas con SAB incubar durante 3 a 5 días a 25°C ±
1.
 FIGURA. Análisis de superficies planas con placas de contacto

6. Contar las colonias formadas en cada uno de los medios de cultivo ensayados
y expresar el resultado como: UFC (unidades formadoras de colonias/25 cm2, que es
la superficie delimitada por la placa.
7. Hacer una coloración Gram de las colonias bacterianas y si es necesario una
coloración de endosporas.
8. Mediante observación macroscópica y microscópica identificar las colonias
encontradas en SAB.
9. Anotar las características de las colonias en todos los medios y consultar el
Manual MERCK para guiarse en la identificación de los microorganismos.

Análisis de superficies por hisopado.

1. Sumergir un hisopo estéril en el tubo con 5 ml de solución salina estéril
(diluyente).
2. Escurrir el exceso de líquido del hisopo apretándolo contra la pared del tubo
de ensayo.
3. Sacar el hisopo y volver a cerrar el tubo con solución salina cuidando de no
contaminarlo.
4. Mantener firmemente la plantilla estéril de aluminio de 25 cm2 sobre la
superficie a muestrear.
5. Sostener el hisopo entre el pulgar y el índice, de una manera tal que el hisopo
pueda ser rotado, para aumentar al máximo su capacidad de recoger microorganismos
(Ver Figura) Asegurarse de pasar el hisopo por toda la superficie delimitada primero
en sentido horizontal y luego vertical (Ver Figura).
6. Colocar nuevamente el hisopo con el extremo de algodón sumergido en la
solución salina. Si el tubo no se cierra puede partir el hisopo.
7. Tapar el tubo de ensayo y dejar reposar de 15 a 30 minutos de manera que los
microorganismos se liberen del algodón.
 FIGURA. Procedimiento para sujetar y rotar el hisopo

FIGURA . Procedimiento para pasar el hisopo en la zona de muestreo

• Siembra
1. Agitar enérgicamente el tubo que contiene el hisopo (se puede usar el vortex).
2. Sembrar por extensión 0,1 ml de la muestra anteriormente agitada en PCA,
EMB y SAB o en los medios que se designe para este ensayo según la disponibilidad.
Sembrar también 1ml en placas petrifilm.
3. Incubar durante 24 a 48 horas a 30 o 35°C ± 1. Solo las cajas de SAB se
incuban durante 3 a 5 días a temperatura ambiente.
4. Efectuar la lectura y registrar el número de UFC.
5. Hacer la coloración Gram de las colonias y la tinción de endosporas si es
necesario.
6. Mediante observación macroscópica y microscópica identificar las colonias
encontradas en SAB.
7. Observar las características de las colonias e identificar los microorganismos
aislados (consultar el Manual MERCK).

Análisis de manipuladores.
Muestreo de manos enguantadas (método I):
1. Etiquetar las placas designadas para el ensayo (Caja de Mac A Manitol).
 2. Destapar una a una las cajas e imprimir sobre el agar los cinco dedos de la
mano derecha o izquierda (Ver Figura).
3. Incubar los medios durante 24 a 48 horas a 37°C ± 1.
4. Observar las características de las colonias, hacer tinción Gram e identificar
los microorganismos aislados (consultar el Manual MERCK).

FIGURA. Muestreo de manos enguantadas (método 1)

Muestreo de manos sin guantes (método II):
1. Sumergir un hisopo estéril en el tubo con 10 ml de solución salina estéril
(diluyente).
2. Escurrir el exceso de líquido del hisopo apretándolo contra la pared del tubo
de ensayo.
3. Sacar el hisopo y volver a cerrar el tubo con solución salina cuidando de no
contaminarlo.
4. Pasar el hisopo en toda la superficie de la palma de la mano haciéndolo rotar.
5. Introducir nuevamente el hisopo en el diluyente, quitar el exceso de líquido
en la pared del tubo y pasarlo por entre los dedos.
6. Introducir nuevamente el hisopo en el diluyente, quitar el exceso de líquido
en la pared del tubo y pasarlo por entre las uñas.
7. Repetir la misma operación para la otra mano.
8. Ambos hisopos se colocan en el mismo tubo con diluyente, es decir se
consideran una sola muestra.
• Siembra
1. Agitar enérgicamente el tubo que contiene el hisopo.
2. Sembrar por extensión 0,1 ml de la muestra anteriormente agitada en los
medios que la profesora designe para este ensayo según disponibilidad. Sembrar
también 1ml en placas petrifilm.
3. Incubar durante 24 a 48 horas a 37°C ± 1.
4. Observar las características de las colonias e identificar los microorganismos
aislados (consultar el Manual MERCK).

3. Manejo de residuos, Tratamiento y etiquetado

Eliminar correctamente los desechos generados:
Todo material que haya tenido contacto con las bacterias depositarlo en el tacho de basura
con la funda roja. (guantes, mascarilla, toca, papel absorbente)
Material cortopunzante como: palillos e hisopos deben ser depositados en el contenedor de
cortopunzantes.
 4. Resultados.
Análisis de aire por sedimentación.

Lugar de muestreo

Área en m2

REPOSO O ACTIVIDAD

Medio de cultivo

Aerobios mesófilos y/o mohos

y levaduras (UFC/hora)
Características de las colonias
Examen microscópico
Microorganismo identificado

Análisis de superficies.

Superficie muestreada
Superficie regular o irregular
Método de muestreo

Medio de cultivo

UFC/ cm2 (para superficie regular)

Características de las colonias

Examen microscópico
Microorganismo identificado
Análisis de manipuladores.

Sitio corporal muestreado

Método de muestreo

Medio de cultivo

UFC/ (sitio corporal seleccionado)

Características de las colonias

Examen microscópico
Microorganismo identificado

5. Discusión de resultados y conclusiones:

Buscar normas y comparar con los valores y microorganismos encontrados en la

práctica.

Bibliografía

• Cerra, H., Fernández, M. C., Horak, C., Lagomarsino, M., Torno, G., &
Zarankin, E. (2013). Manual de microbiología aplicada a las industrias farmacéutica,
cosmética y de productos médicos.