Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE

CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

AS
IC
G
LO
O
BI
AS
CI
EN

Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad

promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de
CI

Capsicum annuum cv. Piquillo

DE

TESIS PARA OPTAR

CA

EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO

TE

AUTOR
IO

Br. Asmat Ortega, Cristian Daniel

BL

ASESORA
BI

Dra. Chaman Medina, Mercedes Elizabeth

TRUJILLO-PERÚ
2020

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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado:

AS
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el reglamento de

IC
Grados y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de

G
Trujillo pongo a vuestra consideración y criterio el presente informe de tesis

LO
titulado: “Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad
promotora de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum

O
cv. Piquillo”, con el cual cumplo con uno de los requisitos indispensables para
obtener el Título Profesional de Biólogo.

BI
AS
CI
EN

Trujillo, marzo de 2020

CI
DE
CA
TE
IO

Br. Cristian Daniel Asmat Ortega

BL
BI

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JURADO DICTAMINADOR

AS
IC
Dra. Marlene René Rodríguez Espejo

G
PRESIDENTE

LO
O
BI
AS
CI
EN

Dr. Carlos Helí Quijano Jara

CI

SECRETARIO
DE
CA
TE
IO
BL

Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina

BI

VOCAL

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DE LA ASESORA

La que suscribe, docente asesora de la tesis titulada: “Identificación

molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal
aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo” deja constancia que esta

AS
tesis ha sido desarrollada y revisada en conformidad a los objetivos planteados en
el perfil académico acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.

IC
G
Por lo tanto, autorizo al Br. Cristian Daniel Asmat Ortega a continuar con los
trámites correspondientes.

LO
O
BI
AS
CI
EN
CI

Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina

DE

ASESORA
CA
TE
IO
BL
BI

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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador,

declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos
formales y fundamentales; siendo aprobado con mención honrosa, la cual
amerita su publicación.

AS
IC
G
LO
O
Dra. Marlene René Rodríguez Espejo

BI
PRESIDENTE AS
CI
EN
CI
DE

Dr. Carlos Helí Quijano Jara

CA

SECRETARIO
TE
IO
BL
BI

Dra. Mercedes Elizabeth Chaman Medina

VOCAL

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DEDICATORIA

AS
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EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL

A mis padres.
BI

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AGRADECIMIENTOS

AS
IC
G
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BI
AS
CI
EN
CI

A Dios, a Víctor y a Noemí.

DE

A la Dra. Mercedes Chaman por su asesoría.

CA

Al Ph. D. Eric Mialhe y a su equipo colaborador de INCABIOTEC S.A.C.

TE
IO

A la Dra. Valeria Maia y a su equipo colaborador del CPQBA-UNICAMP.

BL

Al Blgo. Bryan Cruz Valderrama y a la Blga. Rosita Chang por su apoyo.

BI

Al bibliotecario Carlos Ortiz Mallorca por la atención y apoyo.

A demás familiares, amigos y colegas que apoyaron esta investigación y por

razones de espacio u omisión involuntaria, no fueron mencionados.

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EN
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DE
CA
TE
IO

«There is no knowledge that is not power»

BL

—Ralph Waldo Emerson

BI

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RESUMEN

La agricultura es una de las principales actividades económicas de la sociedad

humana, sin embargo, la producción y rendimiento agrícola se ve disminuida
por diversos tipos de estrés. Frente a este problema, se está utilizando

AS
microrganismos promotores de crecimiento vegetal como alternativa

IC
biotecnológica con impacto medioambiental mínimo. Se identificó aislados

G
bacterianos de la rizósfera del cultivo de Capsicum annuum cv. Piquillo

LO
mediante análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s. Dichas bacterias fueron
aisladas mediante diluciones seriadas y cultivo en medio sólido en placas a

O
BI
partir de muestras de suelo rizosférico. Luego, se realizó la extracción de ADN
genómico a partir de cultivos puros de los aislados, secuenciamiento y análisis
AS
bioinformático. Finalmente, se determinó aquellos aislados con potencial
CI

capacidad promotora de crecimiento vegetal en base a referencias

EN

bibliográficas correspondientes a cada género o especie identificada. Se

CI

determinó siete aislados a nivel de género: Ca2 y Ca5 corresponden a

Staphylococcus sp.; mientras que, Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 y Ca11 corresponden a
DE

Bacillus sp. Además, se identificó cinco aislados a nivel de especie: Ca1

CA

corresponde a Streptomyces roseolilacinus, Ca6 a Staphylococcus arlettae,

Ca7 a Staphylococcus xylosus, Ca9 a Bacillus firmus y Ca12 a Bacillus humi. Se
TE

concluye que de los doce aislados identificados, siete correspondientes al

IO

género Bacillus y uno a la especie Streptomyces roseolilacinus presentan

BL

potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal.

BI

Palabras clave: Capsicum annuum, identificación molecular, capacidad

promotora de crecimiento vegetal, rizobacterias

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ABSTRACT
Agriculture is one of the major economic activities of human society, however,
agricultural production and yield is diminished by various types of stress. To
face this problem, plant growth-promoting microorganisms are being used as

AS
a biotechnological alternative with minimal environmental impact. Bacterial
isolates from the rhizosphere of Capsicum annuum cv. Piquillo were identified

IC
by genomic analysis targeted to the 16s rDNA gene. Bacteria were isolated

G
LO
from rhizospheric soil samples by serial dilutions and cultured in solid medium
agar plates. Then, genomic DNA extraction from pure cultures of each isolate,

O
sequencing and bioinformatic analysis were performed. Finally, isolates with

BI
potential plant growth-promoting capacity were determined based on
AS
bibliographic references corresponding to each identified genus or species.
CI

Seven isolates were determined at a genus level: Ca2 and Ca5 match to
EN

Staphylococcus sp.; while, Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 and Ca11 match to Bacillus sp.
Besides, five isolates were identified at a species level: Ca1 matches to
CI

Streptomyces roseolilacinus, Ca6 to Staphylococcus arlettae, Ca7 to

DE

Staphylococcus xylosus, Ca9 to Bacillus firmus and Ca12 to Bacillus humi. It is

concluded that from the twelve identified isolates, seven that that match to
CA

the genus Bacillus and one of the species Streptomyces roseolilacinus have
TE

potential plant growth-promoting capacity.

IO

Keywords: Capsicum annuum, molecular identification, plant growth-

BL

promoting capacity, rhizobacteria

BI

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ABREVIATURAS

UNT: Universidad Nacional de Trujillo.

PGPR: Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (Plant Growth-

Promoting Rhizobacteria).

AS
TSA: Agar triptona de soya (Tryptic soy agar).

IC
G
Agar R2A: Agar 2A de Reasoner (Reasoner’s 2A agar).

LO
UFC: Unidad formadora de colonias.

O
DNA: Ácido desoxirribonucleico.

BI
AS
DNAr: Ácido desoxirribonucleico ribosomal.
CI

DMSO: Dimetilsulfóxido.
EN

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.

CI

CPQBA: Centro Pluridisciplinario de Investigaciones Biológicas, Químicas y

Agrícolas
DE

UNICAMP: Universidad Estatal de Campinas

CA
TE
IO
BL
BI

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ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………...1

AS
II. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………………………………………..3

IC
III. RESULTADOS……………………………………………………………………………………………………………….6

G
LO
IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………………………………16

O
BI
V. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………….20
AS
VI. RECOMENDACIONES…………………………………………………………………………………………………21
CI
EN

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………………………………………22

CI

ANEXOS………………………………………………………………………………………………………………………….29
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Tabla 1. Descripción morfológica de colonias y celular de los aislados bacterianos

evaluados. .............................................................................................................................. 6

Tabla 2. Identificación molecular de los aislados bacterianos evaluados mediante análisis

AS
genómico dirigido al gen ADNr 16s. .................................................................................... 14

IC
Tabla 3. Aislados bacterianos identificados con potencial capacidad promotora de

G
crecimiento por comparación con literatura científica. ...................................................... 15

LO
Figura 1. Tinción de Gram de los aislados bacterianos.. ....................................................... 7

O
BI
Figura 2. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca1.. ......... 8
AS
Figura 3. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca2.. ......... 9
CI

Figura 4. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca3.. ......... 9
EN

Figura 5. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca4.. ......... 9
CI

Figura 6. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca5.. ....... 10
DE

Figura 7. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca6.. ....... 10
CA

Figura 8. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca7.. ....... 11
TE

Figura 9. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca8.. ....... 11
IO

Figura 10. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca9.. ..... 12
BL

Figura 11. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca10.. ... 12
BI

Figura 12. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca11.. ... 13

Figura 13. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca12.. ... 13

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I. INTRODUCCIÓN

La agricultura es una de las principales actividades económicas de la sociedad

humana. Sobre esta actividad recae la provisión de alimentos, vestimenta, y
generación de materias primas utilizadas como fuente de energía; sin

AS
embargo, en la actualidad, los cultivos agrícolas son severamente afectados

IC
por diversos tipos de estrés ambiental, los cuales constituyen algunos de los

G
factores limitantes para el rendimiento agrícola. Una de las principales causas

LO
de dicho problema es la incidencia de plagas y enfermedades, las cuales

O
requieren el uso de gran cantidad de agroquímicos contaminantes para su

BI
control efectivo. Frente a este desafío, se está desarrollando tecnologías que
involucran la promoción del crecimiento vegetal presentando riesgos mínimos
AS
de contaminación ambiental (1,2).
CI
EN

Una de estas tecnologías involucra la utilización de bacterias que habitan la

CI

rizósfera de diversos cultivos vegetales de interés agrícola. Dentro de dicho

grupo de bacterias, las rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (en
DE

inglés, plant growth-promoting rhizobacteria “PGPR”) son aquellas capaces de

CA

estimular el crecimiento vegetal mediante la mejora de la absorción de agua

y nutrientes, el control biológico directo de agentes patógenos, y la activación
TE

de mecanismos de defensa y de resistencia a estrés. Especies rizobacterianas

IO

principalmente de los géneros Bacillus, Pseudomonas y Rhizobium son

BL

idóneas para la promoción del crecimiento vegetal con un impacto mínimo en

BI

el medioambiente. A la fecha, se ha identificado diversas especies bacterianas

con esta capacidad, las cuales se han consolidado mundialmente como
productos agrícolas biológicos que han logrado reemplazar parcial o
totalmente a los tradicionales productos agroquímicos contaminantes (1,3).

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Los avances en tecnologías de biología molecular han favorecido la

identificación de PGPR nativas, específicas de determinados cultivos y
ecosistemas, con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal
(1,3,4). La identificación de estos microorganismos mediante análisis
genómico dirigido al gen ADNr 16s se ha consolidado como una herramienta

AS
muy útil en la determinación rápida y precisa de especies una vez que se

IC
cuenta con las secuencias génicas de referencia en bases de datos (5). Dicho

G
análisis ha sido utilizado de manera generalizada para establecer relaciones

LO
filogenéticas entre microorganismos procariotas. Este hecho ha tenido un

O
impacto significativo en la elaboración de modelos evolutivos y taxonomía

BI
bacteriana; en efecto, las ediciones vigentes de tratados en sistemática
AS
bacteriana están necesariamente basadas en la información provista por el
análisis de secuencias de ADNr 16s (6).
CI
EN

En estudios similares específicos de la rizósfera de C. anuumm se ha reportado

CI

bacterias de diversos taxones y principalmente aislados grampositivos, tal

DE

como Asaff et al., (2017) quienes reportaron bacterias de las clases

Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli y del filo Actinobacteria
CA

mediante análisis metagenómico dirigido al gen ADNr 16s, Datta et al. (2010)
TE

reportaron veinte bacterias grampositivas, asimismo, Veerapagu et al. (2018)

reportaron dos PGPR gramnegativas y una grampositiva. En este contexto, la
IO

presente investigación se planteó como objetivo identificar aislados

BL

bacterianos con potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal

BI

aislados a partir de muestras de suelo provenientes de la rizósfera de cultivos

de Capsicum annum cv Piquillo mediante análisis genómico dirigido al gen
ADNr 16s.

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II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 Material biológico
Los aislados bacterianos fueron obtenidos a partir de muestras de suelo
rizosférico procedentes de la provincia de Virú, región de La Libertad

AS
(08°24’18” S, 78°51’18” W, ver anexo 1) provistas por el Laboratorio de
Fisiología Vegetal de la Escuela de Ciencias Biológicas de La Universidad

IC
Nacional de Trujillo (UNT).

G
LO
2.2 Aislamiento de rizobacterias mediante técnicas microbiológicas

O
tradicionales

BI
El aislamiento de las rizobacterias fue llevado a cabo en el Laboratorio de
AS
Bacteriología de la Escuela de Microbiología y Parasitología de la UNT. Las
CI

muestras de suelo rizosférico fueron tamizadas, mezcladas y homogenizadas

EN

hasta obtener alícuotas de 10 g, cada una de las cuales fue añadida a un

matraz que contenía 90 ml de solución salina fisiológica estéril, el cual fue
CI

agitado hasta que el contenido tenga una apariencia homogénea.

DE

Posteriormente, se extrajo una alícuota de 1 ml (10 -1) que fue sucesivamente

colocada en tubos de ensayo que contenían 9 ml de diluyente (10 -2) hasta
CA

obtener un factor de dilución de 10-5. Luego se tomó alícuotas de 0.1 ml de

TE

cada tubo y se cultivó de manera independiente en placas Petri con medios

de cultivo TSA (Tryptic Soy Agar) y R2A (Reasoner's 2A Agar) de pH 7.8, las
IO

cuales fueron incubadas a 30 ± 5 °C hasta observar la aparición de colonias de

BL

bacterias (aproximadamente cinco días); luego, se aisló colonias con diferente

BI

morfología hasta obtener cultivos puros corroborados mediante tinción de

Gram. Se aisló doce cultivos puros, los cuales fueron rotulados como: Ca1,
Ca2, Ca3, Ca4, Ca5, Ca6, Ca7, Ca8, Ca9, Ca10, Ca11 y Ca12. Éstos aislados

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fueron caracterizados morfológicamente mediante descripción de sus

colonias y forma celular; finalmente, fueron conservados en un cepario (7).

2.3 Extracción de ADN genómico bacteriano y PCR dirigida al gen ADNr 16s
Se extrajo ADN genómico a partir de cultivos puros de los aislados utilizando

AS
el protocolo establecido por Van Soolingen et al., (1991) (8); posteriormente,

IC
el producto de extracción fue visualizado en un fotodocumentador después

G
de realizar la electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con SYBR Safe en

LO
DMSO (Invitrogen) utilizando ADN de fago Lambda como estándar (ver anexo

O
3). La amplificación y secuenciación del gen 16s de ADNr a partir de ADN

BI
extraído de cada aislado fueron llevadas a cabo utilizando los primers 10f (5'-
AS
GAGTTTGATTCAGGCCCTG-3') y 1100r (5'-GTTGTGAGGGTTGGGG-3') de
acuerdo con el protocolo descrito por Belgini et al., (2014) (9). El programa de
CI

amplificación de PCR consistió en un ciclo de 95 °C durante 2 min, 30 ciclos de

EN

94°C durante 1 min, de 55 °C durante 1 min y de 72 °C durante 3 min; por

CI

último, un ciclo de elongación final de elongación final de 72 °C durante 3 min.

DE

Los resultados de amplificación también fueron corroborados en gel de

agarosa al 1% teñido con SYBR Safe (ver anexo 4). Luego, los productos de PCR
CA

fueron purificados en minicolumnas utilizando el kit GFX PCR DNA and Gel
TE

Band Purification Kit (GE Healthcare), corroborados en gel de agarosa 1%

teñido con SYBR Safe (ver anexo 5) y posteriormente tratados para
IO

secuenciamiento de tipo Sanger en un secuenciador automatizado ABI 3500XL

BL

(Applied Biosystems) con los primers 10f y 1100r en las instalaciones del
BI

laboratorio de Microbiología de la División de Recursos Microbianos del

Centro Pluridisciplinario de Investigaciones Biológicas, Químicas y Agrícolas
(CPQBA) de la Universidad Estatal de Campinas (UNICAMP).

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2.4 Análisis bioinformático de secuencias de ADNr 16s

El montaje de dos secuencias parciales de dicho gen (forward y reverse) en
una sola secuencia consenso (contig), fue realizada en el programa BioEdit
(10). Luego, dichas secuencias consenso fueron comparadas con las
secuencias de organismos tipo de la base de datos EZBioCloud

AS
(https://www.ezbiocloud.net/) y RDP (Ribosomal Database Project,

IC
Wisconsin, USA https://rdp.cme.msu.edu/). Las secuencias fueron alineadas

G
utilizando el programa CLUSTAL X (11) y su análisis filogenético fue realizado

LO
en el software MEGA 7 (12). Las distancias evolutivas fueron calculadas en

O
base a las disimilitudes por pares de secuencias según el modelo de

BI
sustitución de ADN de Kimura (13) y la reconstrucción filogenética fue llevada
AS
a cabo en base al algoritmo Neighbor-Joining (NJ) (14) con valores bootstrap
calculados a partir de 1000 réplicas.
CI
EN

2.5 Selección de bacterias con potencial capacidad promotora de

CI

crecimiento vegetal
DE

Se determinó la potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal de

cada aislado bacteriano mediante comparación de sus características
CA

determinadas frente a la información actual disponible en la literatura

TE

científica (1,3,15–25).
IO
BL
BI

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III. RESULTADOS
La tabla 1 muestra la descripción morfológica de las colonias y de células de
los doce aislados bacterianos obtenidos de la rizósfera de Capsicum annuum
cv Piquillo. Todos los aislados presentan morfología celular grampositiva, siete

AS
presentan morfología de bacilos, cinco, de cocos y una presenta morfología
filamentosa (Fig. 1).

IC
G
Tabla 1. Descripción morfológica de colonias y celular de los aislados bacterianos

LO
evaluados.

O
Aislado bacteriano Morfología de las colonias Morfología celular

BI
Ca1 Blancas, superficie lisa y borde circular regular Filamentosas
AS grampositivas

Ca2 Blanquecinas, superficie lisa y borde circular Cocos grampositivos

regular
CI

Ca3 Blanquecinas, superficie rugosa y borde regular Bacilos grampositivos

EN

Ca4 Blanquecinas, superficie papilada, borde Bacilos grampositivos

CI

lobado.

Ca5 Blancas, superficie lisa y borde circular regular. Cocos grampositivos

DE

Ca6 Traslúcidas brillantes, superficie lisa y borde Cocos grampositivos

CA

regular.

Ca7 Blanquecinas, superficie lisa y borde regular Cocos grampositivos

TE

circular.

Ca 8 Blanquecinas, superficie lisa y de borde irregular Bacilos grampositivos

IO
BL

Ca 9 De color crema, superficie lisa y de borde Bacilos grampositivos

irregular
BI

Ca10 Opacas, superficie lisa y de borde regular Bacilos grampositivos

Ca11 Traslúcidas, pequeñas, superficie lisa y de borde Bacilos grampositivos

regular

Ca 12 Traslúcidas, superficie lisa y de borde regular Bacilos grampositivos

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AS
IC
G
LO
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL

Figura 1. Tinción de Gram de los aislados bacterianos. A. Ca1. B. Ca2. C. Ca3. D. Ca4. E. Ca5. F. Ca6. G. Ca7. H. Ca8. I. Ca9. J. Ca10. K.
BI

Ca11. L. Ca12. Las micrografías fueron tomadas en microscopio óptico Nikon Eclipse E200 a 1000X de aumento.

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Las figuras 2-13 muestran los árboles filogenéticos basados en las secuencias
de DNAr 16S de cada aislado (1000 réplicas, valores mostrados como
porcentaje). Los códigos de las accesiones en el GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) son listados antes del nombre de cada especie.

AS
IC
G
LO
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE

Figura 2. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca1.
Actinoalloteichus cyanogriseus fue utilizado como grupo externo.
IO
BL
BI

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AS
IC
G
LO
Figura 3. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca2.

O
Macrococcus bovicus fue utilizado como grupo externo.

BI
AS
CI
EN
CI
DE

Figura 4. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca3.
CA

Salirhabdus euzebyi fue utilizado como grupo externo.

TE
IO
BL
BI

Figura 5. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca4.
Salirhabdus euzebyi fue utilizado como grupo externo.

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AS
IC
G
Figura 6. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca5.
Macrococcus bovicus fue utilizado como grupo externo.

LO
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA

Figura 7. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca6.
Macrococcus bovicus fue utilizado como grupo externo.
TE
IO
BL
BI

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AS
IC
G
LO
O
BI
Figura 8. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca7.
AS
Macrococcus bovicus fue utilizado como grupo externo.
CI
EN
CI
DE
CA
TE

Figura 9. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca8.
IO

Calditerricola satsumensis fue utilizado como grupo externo.

BL
BI

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AS
IC
G
LO
O
BI
AS
CI

Figura 10. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca9.
Calditerricola satsumensis fue utilizado como grupo externo.
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Figura 11. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca10.
Salirhabdus euzebyi fue utilizado como grupo externo.

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AS
IC
G
LO
O
BI
AS
CI

Figura 12. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca11.
Listeria monocytogenes fue utilizado como grupo externo.
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Figura 13. Análisis filogenético de secuencias parciales de ADNr 16s del aislado Ca12.
Listeria monocytogenes fue utilizado como grupo externo.

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La tabla 2 muestra la identificación molecular de cada aislado bacteriano

anteriormente caracterizado a nivel morfológico y denominado como Ca1-
Ca12. En base al análisis filogenético, se determinó siete aislados a nivel de
género: Ca2 y Ca5 corresponden a Staphylococcus sp.; mientras que, Ca3, Ca4,
Ca8, Ca10 y Ca11 corresponden a Bacillus sp. Además, se identificó cinco

AS
aislados a nivel de especie: Ca1 corresponde a Streptomyces roseolilacinus,

IC
Ca6 a Staphylococcus arlettae, Ca7 a Staphylococcus xylosus, Ca9 a Bacillus

G
firmus y Ca12 a Bacillus humi.

LO
Tabla 2. Identificación molecular de los aislados bacterianos evaluados mediante

O
análisis genómico dirigido al gen ADNr 16s.

BI
Aislado bacteriano Identificación Molecular
AS
Ca1 Streptomyces roseolilacinus
CI

Ca2 Staphylococcus sp.

EN

Ca3 Bacillus sp.

Ca4 Bacillus sp.
CI

Ca5 Staphylococcus sp.

DE

Ca6 Staphylococcus arlettae

Ca7 Staphylococcus xylosus
CA

Ca 8 Bacillus sp.
TE

Ca 9 Bacillus firmus
Ca10 Bacillus sp.
IO

Ca11 Bacillus sp.

BL

Ca12 Bacillus humi

BI

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Tabla 3. Aislados bacterianos identificados con potencial capacidad promotora de

crecimiento por comparación con literatura científica.

Potencial Identificación Referencias bibliográficas

PGPR Molecular

AS
Ca1 Dhananjaya Pratap & Harikesh Bahadu, 2016;
Choudhary & Varma, 2016; Francis et al., 2010; Qi

IC
Streptomyces
et al., 2019; Shrivastava et al., 2015; Sousa &
roseolilacinus

G
Olivares, 2016; Vurukonda et al., 2018; Chewning

LO
et al., 2019; Nakashima et al., 2009
Ca3 Bacillus sp.

O
BI
Ca4 Bacillus sp.
Dhananjaya Pratap & Harikesh Bahadu, 2016;
Ca 8 Bacillus sp. AS
Choudhary & Varma, 2016; Shrivastava et al.,
Ca 9 Bacillus firmus
2015; Sansinenea, 2019; Tiwari et al., 2019;
CI

Ca10 Bacillus sp.

Mendis et al., 2018; Yadav et al., 2011.
Ca11 Bacillus sp.
EN

Ca12 Bacillus humi

CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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IV. DISCUSIÓN
La descripción morfológica de los doce aislados bacterianos mostrada en la
tabla 1 y en la figura 1 indicaría una eminente presencia de bacterias
grampositivas en la rizósfera del cultivo de Capsicum annuum del cual

AS
provinieron las muestras. Dentro de la diversidad de especies de PGPR, se ha
reportado ampliamente la presencia de bacterias gramnegativas como por

IC
ejemplo Psedomonas, Burkholderia, Serratia, Achromobacter, Azospirillum y

G
Rhizobium debido a que son más fáciles de aislar y cultivar en laboratorio;

LO
además, éstas han sido más estudiadas a nivel molecular debido a la

O
importancia de algunas bacterias patógenas de los mismos géneros

BI
mencionados en ámbitos de salud pública y veterinaria (15,26). No obstante,
AS
en estudios similares a la presente investigación, se ha reportado diferentes
CI

cantidades tanto de aislados rizobacterianos gramnegativos como de

EN

grampositivos; por ejemplo, Khan et al. (2018) reportaron la presencia de once

aislados rizobacterianos gramnegativos de un total de catorce en el cultivo de
CI

Brassica oleracea (27), Patel y Mehta (2014) reportaron quince aislados

DE

rizobacterianos grampositivos de un total de 25 en el cultivo de Solanum

melongena (28), e Islam et al. (2016) reportaron un total de diez PGPR aisladas
CA

de Cucumis sativus, las cuales fueron todas grampositivas. Adicionalmente, la

TE

presencia de bacterias grampositivas se ha reportado en suelo de cultivos que

crecen en condiciones áridas al igual que en las muestras de suelo de la
IO

presente investigación (18)

BL

En estudios similares específicos de la rizósfera de C. anuumm, Datta et al.

BI

(2010) reportaron a la totalidad de bacterias aisladas de la rizósfera como

grampositivas, asimismo, Veerapagu et al. (2018) reportaron dos PGPR
gramnegativas y una grampositiva. La elevada presencia de bacterias
grampositivas en el suelo rizosférico tiene fundamento en el hecho de

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presentar una pared celular más gruesa que las gramnegativas, ello les
permite resistir a condiciones físicas adversas; también se fundamenta en el
hecho de que algunas presentan capacidades para formar endosporas, como
por ejemplo aquellas pertenecientes al género Bacillus, lo cual les permite
proliferar en ecosistemas afectados por diversos tipos de estrés biótico y

AS
abiótico (3,18,29). Finalmente, algunas PGPR grampositivas, como los del

IC
género Streptomyces, presentan capacidad de producir antibióticos, así, éstas

G
proliferan desplazando a otras rizobacterias inhibiendo su crecimiento

LO
(1,15,18).

O
El análisis filogenético basado en secuencias de DNAr 16s mostrado en las

BI
figuras 2-13, provee una aproximación confiable para la identificación
AS
molecular de cada aislado rizobacteriano. La identificación molecular de
CI

especies bacterianas mediante análisis dirigido al DNAr 16s se ha establecido

EN

como una herramienta rápida y eficaz en estudios de taxonomía. El ADNr 16s

es un polidesoxirribonucleótido de 1500 pb; si bien es una secuencia muy
CI

conservada en procariotas, ésta presenta regiones hipervariables

DE

denominadas V1-V9, las cuales permiten la diferenciación de algunas especies

a nivel taxonómico. Cabe resaltar también que las ediciones actuales de
CA

tratados de sistemática bacteriana como el Bergey’s Manual of Systematic

TE

Bacteriology (https://www.springer.com/gp/book/9780387950433) basan su

IO

estructuración en base al análisis molecular de ADNr 16s (6).

BL

Considerando en conjunto el análisis filogenético llevado a cabo en la presente

BI

investigación y la descripción morfológica correspondiente a cada aislado

rizobacteriano, se ha logrado identificar a siete aislados a nivel de género: Ca2
y Ca5 corresponden a Staphylococcus sp.; Ca3, Ca4, Ca8, Ca10 y Ca11
corresponden a Bacillus sp.; además, se identificó cinco aislados a nivel de
especie: Ca1 corresponde a Streptomyces roseolilacinus, Ca6 a Staphylococcus

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arlettae, Ca7 a Staphylococcus xylosus, Ca9 a Bacillus firmus y Ca12 a Bacillus

humi (Ver Tabla 2). La presencia de aislados correspondientes a Bacillus,
Staphylococcus y Streptomyces estaría en concordancia con lo descrito por
Asaff et al., (2017) quienes reportaron mayor abundancia de bacterias
pertenecientes a la clase Bacilli (a la cual corresponde Bacillus y

AS
Staphylococcus) y al filo Actinobacteria (al cual corresponde Streptomyces) en

IC
la rizósfera de C. anuumm mediante análisis metagenómico dirigido al gen

G
ADNr 16s (30); asimismo, está en concordancia con la presencia de especies

LO
de Bacillus y Streptomyces descrita ampliamente en suelos rizosféricos

O
(18,31–33). Sin embargo, según nuestro conocimiento, hasta la fecha no se ha

BI
reportado la presencia de especies de Staphylococcus en suelo rizosférico del
AS
cultivo de C. anuum.
CI

En particular, los estudios que reportan rizobacterias del género

EN

Staphylococcus son aún escasos, Lopez et al., (2019) reportaron

Staphylococcus asociado a la rizósfera de manglares de las especies Avicennia
CI

germinans, Laguncularia racemosa y Rhizophora mangle (34), también Leiva

DE

et. al, (2013) reportaron a la PGPR Staphylococcus vitulinus como

solubilizadora de fosfatos asociada a la rizósfera de Theobroma cacao (35). No
CA

conocemos acerca de reportes de PGPR de las especies S. arlettae y S. xylosus;

TE

sin embargo, la primera ha sido reportada como rizobacteria de plantaciones

IO

de “cardamomo” con capacidad para degradar residuos del insecticida fipronil

(36), y la segunda ha sido reportada en la rizósfera de Solanum tuberosum
BL

(37).
BI

Las PGPR del género Bacillus son las más extensamente estudiadas por su
capacidad promotora de crecimiento. Los mecanismos por los cuales
promueven el crecimiento vegetal incluyen la producción de fitohormonas,
solubilización de fosfatos, producción de sideróforos, producción de toxinas

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plaguicidas, antibiosis e inducción de resistencia sistémica (22,23). La especie

B. firmus ha sido descrita como como promotor de crecimiento vegetal
actuando como agente biocontrolador de nemátodos (24). Asimismo, la
especie B. humi ha sido reportada como promotor de crecimiento vegetal con
capacidad de degradar materia orgánica en suelos moderadamente ácidos

AS
(25).

IC
Las especies del género Streptomyces han sido aisladas de suelos y estudiadas

G
LO
por su capacidad para producir compuestos, nematicidas, antifúngicos y
antibacterianos de amplio espectro, por lo tanto, son alternativas ecológicas

O
para el control de plagas y enfermedades así como la promoción del

BI
crecimiento vegetal al favorecer la asimilación de nutrientes mediante la
AS
regulación de la producción de fitohormonas (15–20). La especie S.
CI

roseolilacinus ha sido descrita como promotora de crecimiento vegetal al ser

EN

capaz de producir un compuesto nematicida e inhibidor de la enzima

tirosinasa, una enzima clave en la síntesis de melanina en microorganismos,
CI

animales y plantas. La melanina es un compuesto que confiere protección a

DE

microorganismos frente a compuestos vegetales (21), es por ello que la

utilización de inhibidores de la tirosinasa tiene una importante aplicación en
CA

agricultura mediante el control de fitopatógenos (16,21).

TE

Todo lo mencionado anteriormente sugiere que los siete aislados

IO

identificados correspondientes al género Bacillus y el correspondiente a la

BL

especie S. roseolilacinus presentan potencial capacidad promotora de

BI

crecimiento vegetal.

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V. CONCLUSIONES

Del total de doce aislados bacterianos identificados de la rizósfera de

Capsicum anuum L. cv Piquillo, siete aislados del género Bacillus, que incluyen
a B. firmus y B. humi, y uno correspondiente a Streptomyces roseolilacinus

AS
presentan potencial capacidad promotora de crecimiento vegetal.

IC
G
LO
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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VI. RECOMENDACIONES

Se sugiere evaluar la capacidad promotora de crecimiento vegetal de los

aislados bacterianos identificados en plantas a nivel de laboratorio e

AS
invernadero.

IC
G
LO
O
BI
AS
CI
EN
CI
DE
CA
TE
IO
BL
BI

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2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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last=Kloepper&atitle=Induced systemic resistance and promotion of
BL

plant growth by Bacillus

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spp.&title=Phytopathology&volume=94&issue=11&date=2004&spage=
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ANEXOS

AS
IC
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CI
DE

Anexo 1. Mapa de la zona de procedencia de las muestras de suelo rizosférico de

Virú, La Libertad (S 08°24’18”, W 78°51’18”) provistas por el Laboratorio de
Fisiología Vegetal de la Universidad Nacional de Trujillo. El mapa fue realizado en el
CA

Software QGIS versión 3.10.2. DC Desierto costero, Urb Zona urbana, Agri Zona
agrícola, EM Estación de Muestreo. Imagen tomada de Asmat, C. y Mialhe, E.; 2020
TE

(38)
IO
BL
BI

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CA

Anexo 2. Parámetros fisicoquímicos de las muestras de suelo provistas por el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Universidad
Nacional de Trujillo para el aislamiento de aislados bacterianos. Imagen tomada de Cruz Valderrama, B. y Chaman Medina, M; 2019
TE

(29).
IO
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BI

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CA

Anexo 3. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con SYBR Safe de cada muestra
TE

de ADN genómico de los aislados. El ADN del fago λ (50 ng) fue utilizado como
estándar. 1. Ca1. 2. Ca2. 3. Ca3. 4. Ca4. 5. Ca5. 6. Ca6. 7. Ca7. 8. Ca8. 9. Ca9. 10.
IO

Ca10. 11. Ca11. 12. Ca12. C-. Control negativo.

BL
BI

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CI

Anexo 4. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con SYBR Safe del producto de
EN

amplificación por PCR del gen de ADNr 16s de cada aislado. Cada producto
amplificado provino de muestras de ADN genómico puras o diluidas en
CI

determinadas proporciones (v/v). M. Marcador de peso molecular de 1Kb (250-

10000 bp GeneRuler Thermo Scientific™). 1. Producto amplificado de ADN de Ca1
DE

diluido en 1:30. 2. Ca2 diluido 1:5. 3. Ca2 diluido en 1:10. 4. Ca2 diluido en 1:20. 5.
Ca3 diluido en 1:25. 6. Ca4. 7. Ca4 diluido en 1:5. 8. Ca5. 9. Ca5 diluido en 1:5. 10.
Ca6 diluido en 1:10. 11. Ca7 diluido en 1:10. 12. Ca8 diluido en 1:30. 13. Ca9. 14.
CA

Ca10 diluido en 1:5. 15. Ca10 diluido en 1:10. 16. Ca11 diluido en 1:10. 17. Ca11
diluido en 1:50. 18. Ca12 diluido 1:5. 19. Ca12 diluido 1:10. 20. Ca1. 21. Ca2. 22. Ca3.
TE

23. Ca6. 24. Ca10. 25. Ca8. 26. Ca9. 27. Ca7. 28. Ca8. 29. Ca9 diluido en 1:10. 30.
Ca11. 31. Ca11 diluido en 1:5. 32. Ca12. C-. Control negativo de PCR. CE. Control
IO

negativo de extracción de ADN.

BL
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Anexo 5. Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con SYBR Safe de la purificación

de productos amplificados previa a secuenciamiento de tipo Sanger. Cada producto
purificado provino de muestras amplificadas del gen de ADNr 16s puras o diluidas
TE

en determinadas proporciones (v/v). λ. ADN del fago lambda utilizado como

estándar (50 ng). M. Marcador de peso molecular de 1Kb (250-10000 bp GeneRuler
IO

Thermo Scientific™). 1. Ca1. 2. Ca1 diluido 1:5. 3. Ca2. 4. Ca2 diluido en 1:5. 5. Ca3.
6. Ca3 diluido en 1:5. 7. Ca3 diluido en 1:10. 8. Ca4. 9. Ca4 diluido en 1:5. 10. Ca4
BL

diluido en 1:10. 11. Ca5. 12. Ca5 diluido en 1:5. 13. Ca5 diluido en 1:10. 14. Ca6. 15.
Ca6 diluido en 1:5. 16. Ca7. 17. Ca7 diluido en 1:10. 18. Ca7 diluido 1:30. 19. Ca8. 20.
BI

Ca8 diluido 1:10. 21. Ca9. 22. Ca9 diluido en 1:5. 23. Ca9 diluido en 1:10. 24. Ca9
diluido en 1:30. 25. Ca10. 26. Ca10 diluido en 1:5. 27. Ca10 diluido en 1:10. 28. Ca10
diluido en 1:30. 29. Ca10 diluido en 1:50. 30. Ca11. 31. Ca11 diluido en 1:5. 32. Ca11
diluido en 1:10. 33. Ca11 diluido en 1:30. 34. Ca12. 35. Ca12 diluido en 1:5. 36. Ca12
diluido en 1:10. 37. Ca12 diluido en 1:30. C-. Control negativo.

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Anexo 6. Tamaño de secuencia de ADNr 16s de cada aislado bacteriano evaluado y

porcentaje de similitud con la accesión de GenBank más emparentada.

Aislado Tamaño de % de similitud con Código de accesión de

bacteriano secuencia accesión más GenBank más
ADNr 16s emparentada emparentada

AS
Ca1 627 pb 100 AB184167

IC
Ca2 833 pb 99.76 AY953148

G
Ca3 893 pb 99.89 ASJC01000029

LO
Ca4 665 pb 100 CP002905

O
BI
Ca5 667 pb 99.85 AY953148

Ca6 906 pb
AS
100 AB009933.1

Ca7 730 pb 99.73 MRZO01000018

CI
EN

Ca 8 831 pb 100 AJ276351.1

Ca 9 800 pb 95.89 D16268.1

CI

Ca10 657 pb 96.26 D16268.1

DE

Ca11 986 pb 100 JJMH01000057

CA

Ca 12 985 pb 97.15 AJ726210.1

TE
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Anexo R.R N°384-2018/UNT

RECTORADO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
DECLARACIÓN JURADA

AS
Los autores suscritos en el presente documento DECLARAMOS BAJO JURAMENTO que somos
los responsables legales de la calidad y originalidad del contenido del Proyecto de Investigación

IC
Científica, así como, del Informe de Investigación Científica Realizado.

G
Título: Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de crecimiento
vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo

LO
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA INFOME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA

O
PROYECTO DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ( ) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN (PREGRADO) ( )

BI
(PREGRADO) TESIS DE PREGRADO (X)

PROYECTO DE TESIS DE PREGRADO ( ) TESIS DE MAESTRÍA ( )

AS
PROYECTO DE TESIS DE MAESTRÍA ( ) TESIS DE DOCTORADO ( )
CI

PROYECTO DE TESIS DE DOCTORADO ( )

EN

Equipo investigador integrado por:

N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD DEP. CATEGORÍA CÓDIGO AUTOR

ACADÉMICO DOCENTE DOCENTE COAUTOR
CI

ASESOR ASESOR ASESOR

NÚMERO DE
DE

MATRÍCULA
ESTUDIANTE
1 Asmat Ortega, Cristian Ciencias Ciencias - 1030400111 Autor
Daniel Biológicas Biológicas
CA

2 Chaman Medina, Ciencias Ciencias Principal 2684 Asesora

Mercedes Elizabeth Biológicas Biológicas
TE

Trujillo, 19 de setiembre de 2020

IO
BL

…………………………………………… DNI 71433953

BI

FIRMA

…………………………………………… DNI 17912678

FIRMA

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Anexo R.R N°384-2018/UNT

RECTORADO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
CARTA DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN DE TRABAJO
DE INVESTIGACIÓN EN REPOSITORIO DIGITAL RENATI-SUNEDU

AS
Trujillo, 19 de setiembre de 2020

IC
Los autores suscritos del INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA

G
TITULADO: Identificación molecular de bacterias con potencial capacidad promotora de

LO
crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de Capsicum annuum cv. Piquillo

AUTORIZAMOS SU PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO DIGITAL INSTITUCIONAL, REPOSITORIO

O
RENATI-SUNEDU, ALICIA-CONCYTEC, CON EL SIGUIENTE TIPO DE ACCESSO:

BI
A. Acceso abierto ( X )
B. Accesso restringido ( )
AS
C. No autorizo su publicación ( )
CI

Si eligió la opción restringido o NO autoriza su publicación sírvase a justificar

_____________________________________________________________________________
EN

_____________________________________________________________________________
CI

ESTUDIANTE DE PREGRADO: TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ( ) TESIS (X)

ESTUDIANTE DE POSTGRADO: TESIS DE MAESTRÍA ( ) TESIS DE DOCTORADO ( )

DE

DOCENTE: INFORME DE INVESTIGACIÓN ( ) OTROS ( )

Equipo investigador integrado por:

CA

N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD DEP. CATEGORÍA CÓDIGO AUTOR

ACADÉMICO DOCENTE DOCENTE COAUTOR
TE

ASESOR ASESOR ASESOR

NÚMERO DE
MATRÍCULA
IO

ESTUDIANTE
1 Asmat Ortega, Cristian Ciencias Ciencias - 1030400111 Autor
BL

Daniel Biológicas Biológicas

2 Chaman Medina, Ciencias Ciencias Principal 2684 Asesora
Mercedes Elizabeth Biológicas Biológicas
BI

…………………………………………… DNI 71433953

FIRMA
…………………………………………… DNI 17912678
FIRMA

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