Protocolo Electroforesis SDS

PROTOCOLO ELECTROFORESIS SDS-PAGE UNIDIMENSIONAL
1. PREPARACIÓN DE MUESTRAS
BUFFER DE CARGA
COMPONENTE [] [] VOL. 7.2 VOL. 10
INICIAL FINAL mL mL
Tampón concentrador (pH - - 1.0 mL 1.39 mL
6,8)
Glicerol 100 % 11.11 % 0.8 mL 1.11 mL
SDS 10 % 2.2 % 1.6 mL 2.22 mL
Azul de bromofenol * 1% 0.055 % 0.4 mL 0.56 mL
2-mercaptoetanol * 99.9 % 11.1 % 0.8 mL 1. 11 mL
Agua destilada  - 2.6 mL 3.61 mL
* El 2-mercaptoetanol se agrega inmediatamente antes del uso.

* El azul de bromofenol se debe usar de una solución previamente preparada.
COMPONENTE 250 μL 500 μL 1000 μL 1.5 mL

Buffer de carga (sin mercapto) 222.2 μL 444.4 μL 888.8 μL 1.33 mL
2-mercaptoetanol 27.8 μL 55.6 μL 111.2 μL 166.8 μL
COMPONENTE 30 μL 60 90 μL
μL
Buffer de carga 10 20 μL 30 μL
μL
Muestra plasma seminal 20 μL 40 μL 60 μL
Para desnaturalizar las proteínas se puede realizar cualquiera de ambos procesos:
A. Termociclador (Se pierde muy poca muestra por evaporación)

 Programar el termociclador a 98 °C por 15 min con finalización de reacción a 4
°C.
 Tener en cuenta el volumen a programar de acuerdo al volumen en los tubos
eppendorf.
B. Ebullición
 Las muestras deben estar en tubos con tapa rosca para evitar la pérdida de
muestra por evaporación.
 Poner las muestras en ebullición por 15 min.
2. PREPARACIÓN DE GEL SEPARADOR
GEL SEPARADOR / RESOLVING GEL

COMPONENTE [] [] 1 GEL 5 2 GEL 10 3 GEL 15
INICIAL FINAL mL mL mL
Agua destilada - - 1.523 mL 3.046 mL 4.569 mL
Buffer Tris-HCl 1.5M (pH - - 1.250 mL 2.5 mL 3.750 mL
8.8)
Acrilamida / 35 % 15.05 2.150 mL 4.3 mL 6.450 mL
bisacrilamida %
SDS 10% 10 % 0.1 % 50 μL 100 μL 150 μL
APS 10% * 10 % 0.05 % 25 μL 50 μL 75 μL
Temed  - 7 μL 14 μL 21 μL
* El APS se prepara inmediatamente antes del uso. 0.1 g para 1 mL / 20 mg para 200 μL
Concentraciones de Acrilamida/Bisacrilamida
Para 50 mL
[ ] INICIAL 18.6% 23.26% 30% 35% 39.5% 40% 44.19% 48.84%
Acrilamida (g) 9.3 g 11.63 g 15 g 17.5 19.75 20 g 22.095 24.42 g

g g g
Bisacrilamida 0.246 0.308 g 0.399 0.465 0.525 0.53 0.587 g 0.649 g

(g) g g g g g
[ ] FINAL EN 8% 10% 12.9 15.05 17 % 17.2 19 % 21%
GEL % % %
SEPARADOR
* La preparación de Acrilamida/Bisacrilamida se puede almacenar en refrigeración por 1

mes.
3. PREPARACIÓN DE GEL CONCENTRADOR

GEL CONCENTRADOR / STACKING GEL
COMPONENTE [] [] 1 GEL (2 2 GEL (5 3 GEL (7
INICIAL FINAL mL) mL) mL)
Agua destilada - - 1.26 mL 3.15 mL 4.41 mL
Buffer Tris-HCl 0.5M (pH - - 0.5 mL 1.25 mL 1.75 mL
6.8)
Acrilamida / 40 % 4% 200 μL 500 μL 700 μL
Bisacrilamida
SDS 10% 10 % 0.1 % 20 μL 50 μL 70 μL
APS 10% 10 % 0.1 % 20 μL 50 μL 70 μL
Temed  - 4 μL 10 μL 14 μL
 Dejar polimerizar cada gel 20 a 30 min.
4. PREPARACIÓN DE BUFFER DE CORRIDA
COMPONENTE 10 X
1L 500 mL 250 mL
Tris-Base 25 mM 30 g 15 g 7.5 g
Glicina 192 mM 144 g 72 g 36 g
SDS 1% 10 g 5g 2.5 g
Ajustar el pH a 8.3 con HCl concentrado.
Para la corrida en electroforesis se debe diluir al 1X:
 Para 2 geles (800 mL) : 80 mL de buffer 10X y 720 mL de H20 destilada.

 Para 4 geles (1300 mL) : 130 mL de buffer 10X y 1170 mL de H20 destilada
Almacenar en refrigeración y se puede reusar hasta 3 veces.
CORRIDA DE ELECTROFORESIS:
 En cada pocillo puede entrar un volumen máximo de 30 μL, primero se debe cargar
20 μL, esperar que descienda la muestra y luego agregar de 5 μL en 5 μL.
 Se carga 5 μL del marcador molecular.
 Se realiza una precorrida a 150 V por 1 hr.
 Se deja corriendo a 80 V por 2 hrs y 5 min (depende de la concentración de
poliacrilamida en el gel).
5. PREPARACIÓN DE COLORANTE
COLORANTE
COMPONENTE 1L
Azul de Coomassie G- 0.5 g
250
Sulfato de cobre 1g
Metanol 95% 300 mL
Ácido acético glacial 100 mL
Agua destilada 600 mL
 Colorear el gel por 1 hr con movimiento constante. El tiempo puede aumentar de

acuerdo al uso repetitivo del mismo decolorante. Para asegurar su buen
funcionamiento prolongar el tiempo de coloración a 2hrs y 30 min si el colorante se
usó muchas veces.
6. PREPARACIÓN DE DECOLORANTE
DECOLORANTE
COMPONENTE 2L 1L
Ácido acético glacial 200 mL 100 mL
Metanol 95% 600 mL 300 mL
Agua destilada 1200 600 mL
mL
 Decolorar el gel por toda la noche con movimiento constante. El tiempo puede
aumentar de acuerdo a la decoloración. También es recomendable cambiar el
decolorante por lo menos 2 veces.

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* El 2-mercaptoetanol se agrega inmediatamente antes del uso.

COMPONENTE 250 μL 500 μL 1000 μL 1.5 mL

Para desnaturalizar las proteínas se puede realizar cualquiera de ambos procesos:

A. Termociclador (Se pierde muy poca muestra por evaporación)

GEL SEPARADOR / RESOLVING GEL

[ ] INICIAL 18.6% 23.26% 30% 35% 39.5% 40% 44.19% 48.84%

Acrilamida (g) 9.3 g 11.63 g 15 g 17.5 19.75 20 g 22.095 24.42 g

Bisacrilamida 0.246 0.308 g 0.399 0.465 0.525 0.53 0.587 g 0.649 g

* La preparación de Acrilamida/Bisacrilamida se puede almacenar en refrigeración por 1

3. PREPARACIÓN DE GEL CONCENTRADOR

 Dejar polimerizar cada gel 20 a 30 min.

4. PREPARACIÓN DE BUFFER DE CORRIDA

Para la corrida en electroforesis se debe diluir al 1X:

 Para 2 geles (800 mL) : 80 mL de buffer 10X y 720 mL de H20 destilada.

Almacenar en refrigeración y se puede reusar hasta 3 veces.

 Colorear el gel por 1 hr con movimiento constante. El tiempo puede aumentar de

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