En Zimas

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ENZIMOLOGÍA DIAGNÓSTICA

Análisis bioquímico
Laboratorio clínico y biomédico

I - DEFINICIÓN Y ESTRUCTURA biológicos, laquinicos


no : sonsustancias que favorecen que se

- (ej exoquinasa
produzca reacción aumentando la velocidad :

Las enzimas son catalizadores que funcionan aumentando la velocidad de las


reacciones químicas (de 106 a 1012 veces en comparación con las reacciones no catalizadas).

La determinación de enzimas en el laboratorio es muy frecuente y puede servir para


el diagnóstico, tratamiento o pronóstico de una enfermedad. cancer de colon e hígado >
-

en el rbosoma
re
Las enzimas se sintetizan en las células y están presentes en todos los tejidos,
aunque no todos los tejidos tienen las mismas enzimas ni en igual cantidad. Es precisamente
el conocimiento de su función y ubicación en los tejidos lo que permite utilizarlas como
verdaderos marcadores de ciertas patologías. La determinación en plasma o en otro líquido
En la orna NO & biológico de una enzima o de un grupo de enzimas nos informa sobre el tejido o células de
porque no se
filtra las que provienen. Se la célula está dañada aumenta la permeabilidad de la membrana y libera
>
- se de
en los
glomercios de la
sangre
Las enzimas son proteínas de alto peso molecular: en condiciones normales no se
filtran en los glomérulos renales. Poseen todas las propiedades de las proteínas, incluida la
posibilidad de desnaturalizarse, en cuyo caso pierden su actividad. También pueden
&
ionizarse según el pH del medio, por lo que se puede aprovechar esta cualidad para hacer
una electroforesis.
ph ácido a + 40 pierde la estructura tercara
o

en un

# Algunas enzimas son proteínas conjugadas. En este caso, a la porción proteica la


llamamos APOENZIMA y a la no proteica la llamamos COFACTOR. El conjunto se llama
HOLOENZIMA, que es la que tiene actividad catalítica.
enzimáticos
Los cofactores pueden ser: Activadores
a) compuestos inorgánicos o iones metálicos (Zn++, Fe++, Mg++, etc.). Se les llama
activadores enzimáticos.
b) compuestos orgánicos, como el NAD, NADP o el piridoxal-5-fosfato. En este
caso se llaman coenzimas.

parte orgánica
↑ lleva el
cofactor
es
catalización enzimática velocidad que
#
menor se
La apoenzima lleva cabo la a
que
-Apo
a
:

E velocidad
-nzimas a
mayor
naturaleza inorgánica
conjugadas / metálicos de
Activadores enzimáticos
: cones

cofactor Genzimas compuestos inorgánicos


Parte
:

inorgánica
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
En el laboratorio clínico las enzimas interesan desde 3 aspectos:
1º) Como componentes presentes en las muestras, ya que su detección puede ayudar al
diagnóstico de ciertas enfermedades (enzimología diagnóstica),
2º) como reactivos útiles para analizar otras sustancias (técnicas enzimáticas), exoquinasa o GGP
3º) como responsables de diferentes trastornos metabólicos congénitos (enzimopatías).
Y
II – FUNCIÓN genecetonuria

in[
- Las enzimas catalizan reacciones en las que se transforman una o más moléculas de
SUSTRATO (S) en una o más moléculas de PRODUCTO (P). S E P
- El sustrato debe ser previamente activado para que la reacción se lleve a cabo. La cantidad
de energía necesaria para activar al sustrato se llama energía de activación. En muchas
técnicas de laboratorio esta energía se aporta en forma de calor.
- Las enzimas funcionan como catalizadores biológicos y disminuyen la energía de
activación. Permiten así que la reacción se haga a la temperatura normal del cuerpo, sin un
aporte extra de calor.

-Energaden
se

La enzima se enzima
une al sustrato y
forma un complejo enzima-
sustrato (ES). Una vez que se
efectúa la ↓ catálisis, el
sustrato se transforma en
Con la
producto y la enzima
enzima permanece
sin cambio y queda en libertad
para catalizar otras reacciones.
La reacción general es:

E + S O
E-S P+E
b
Esne
e E + P
enzima saturada Compleo
La
enzima

enzima
-

se une
sustrato
al sustrato
y
Las propiedades de las enzimas son:
Imp se satura porque
tiene el
-

- son eficaces en muy pequeñas cantidades sitio ocupado


- no se alteran ni se consumen durante la reacción
- aceleran la velocidad de la reacción química pero no alteran la constante de
equilibrio ya que no cambia la cantidad de producto formada a partir del sustrato.
- son específicas para cada sustrato o grupo de sustratos La cerradura es la enzima y la
. Grados de
llave el sustrato Cada
.
enzima para cada sustrato
- La enzima tiene una o varias regiones llamadas SITIOS ACTIVOS por donde se une al especfundad
sustrato. Es la parte principal de la enzima. El resto de la molécula sirve como soporte
estructural a fin de mantener la configuración de los componentes del sitio activo.
- Sólo los sustratos compatibles con el sitio activo pueden enlazarse con la enzima. De este
modo, cada enzima cataliza sólo determinadas reacciones, porque puede unirse sólo a
determinados sustratos.
- La mayoría de las enzimas presentan especificidad absoluta (catalizan sólo una reacción
específica con un sustrato específico) pero otras muestran especificidad de grupo (varios
sustratos con estructura similar pueden reaccionar con la enzima). Algunas son específicas
de un determinado enlace y otras son estereoespecíficas y sólo reaccionan con ciertos
isómeros ópticos.
el
Hay 2000 enzimas
que trabajan en
2
cuerpo
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

III – ISOENZIMAS

Existen formas moleculares de una determinada enzima que pueden catalizar una
misma reacción química. Estas formas diversas de una misma enzima se llaman isoenzimas.

Con técnicas apropiadas se pueden separar las isoenzimas de una enzima. Por
ejemplo:
- como muchas isoenzimas presentan variaciones de carga, pueden separarse por
técnicas electroforéticas.
- también pueden separarse por sus diferencias a la inactivación por calor
(podemos provocar que se inactiven aplicando calor, pero cada isoenzima se
inactiva a una temperatura distinta).
- adsorción selectiva a diferentes soportes
- incubación con diferentes sustratos o con inhibidores selectivos

La ventaja de las determinaciones de isoenzimas es que cada una proviene de un


tejido distinto y podemos así detectar el tejido u órgano afectado.

IV - CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS

La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica elaboró unos


principios generales de nomenclatura y clasificación de enzimas. El nombre de la enzima
tiene 2 partes: la primera nombra al sustrato y la segunda termina en "asa" e indica el tipo
de reacción que cataliza.

Sin embargo, se tiende a utilizar cada vez más un código para cada enzima. Consta
de las siglas EC y de 4 números separados por puntos. Esos 4 números significan, en este
orden, lo siguiente:
o Primer número: la clase de enzima (hay 6 posibles clases)
o Segundo número: subclase
o Tercer número: subsubclase
o Cuarto número: número de serie específico de la enzima.

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Ejemplo: LDH (LACTATO DESHIDROGENASA)
Código: EC 1.1.1.27
Primer nº: 1. Indica que la clase es oxidorreductasa
Segundo nº: 1. Indica subclase oxidasa
Tercer nº: 1. Indica que la subsubclase es citocromo oxidasa
Cuarto nº: 27. El número de esta enzima dentro de la subsubclase.

Las 6 CLASES de enzimas son:


1- Oxidorreductasas: catalizan reacciones de oxidación y reducción entre 2 sustratos. Se
transfieren electrones.
2- Transferasas: transfieren grupos (amino, fosfato, etc.) de una molécula a otra.
3- Hidrolasas: rompen enlaces (C-O, C-N, C-C, etc.) en un medio acuoso.
4- Liasas: rompen enlaces eliminando grupos químicos de una molécula. Se forman
entonces dobles enlaces.
5- Isomerasas: un isómero se transforma en otro.
6- Ligasas: catalizan la unión entre 2 moléculas.

V - ENZIMAS PLASMÁTICAS

Todas las enzimas se sintetizan en el interior de las células (en los ribosomas) y la
mayor parte de ellas realizan sus funciones intracelularmente. Sin embargo, en sangre se
puede detectar la actividad de diversas enzimas que, para su estudio, se clasifican en 3
grupos:

1- Enzimas plasma-específicas: cumplen su función en sangre. Son producidos en el hígado


y se secretan a la circulación en forma inactiva. Un ejemplo de enzimas de este tipo son las
que intervienen en la coagulación y en la fibrinolisis.

2- Enzimas secretados: realizan su función en líquidos extracelulares, como los jugos


digestivos. Ejemplos de enzimas de este tipo son las enzimas digestivas (amilasa, tripsina,
etc.). Una pequeña parte puede pasar a sangre.

3- Enzimas intracelulares “escapados”: en condiciones normales se encuentran en la sangre


en muy pequeña cantidad y en niveles constantes. Proceden de la renovación de los tejidos.
Este último grupo es el que más interesa desde el punto de vista diagnóstico ya que en
determinadas situaciones patológicas su actividad aumenta o disminuye, bien por fallos en
su síntesis o por variaciones en el número de células que las producen.

Los factores de los que dependen los cambios en la actividad enzimática sérica son:

1º) Los que afectan a la liberación de las enzimas desde las células:
Las enzimas permanecen en las células donde se han sintetizado porque la
membrana plasmática no permite su salida en masa. Esta membrana es parte
metabólicamente activa de la célula y su integridad depende de la producción de energía de
la misma. Por eso, si hay un trastorno en el metabolismo celular se deteriora la membrana y,
si la lesión es irreversible, la célula muere.

a) Al deteriorarse la membrana, se altera su permeabilidad y salen primero las


pequeñas moléculas, después las moléculas algo mayores (como las enzimas) y, por último,
si la célula se necrosa, sale todo el contenido celular. Las enzimas del citosol (líquido

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
citoplasmático) salen antes que las enzimas intramitocondriales. Estas últimas necesitan una
lesión mayor para salir a la circulación.

b) Cuando hay una sobreproducción de una enzima aumenta el escape al líquido


extracelular, aunque la membrana celular permanezca íntegra, debido a que la salida de las
enzimas también está condicionada por el gradiente de concentración que se establece entre
el interior y el exterior de la célula.

c) Por último, si el número de células productoras de una enzima aumenta, por


ejemplo por un tumor, aunque el escape enzimático sea el normal para cada célula, el total
liberado se verá incrementado.

2º) Los que afectan a la entrada en sangre:


Cuando las enzimas salen de las células pasan primero al líquido intersticial y de ahí
al torrente circulatorio, según la irrigación de este tejido. Por ejemplo, el hígado es un
órgano muy vascularizado y con capilares muy permeables, por lo que cualquier escape
enzimático se reflejará pronto en los niveles séricos. Por el contrario, los capilares del
músculo esquelético son poco permeables y, por tanto, las enzimas alcanzan más
difícilmente la circulación general.

3º) Los que afectan a la depuración de las enzimas de la sangre:


La mayor parte de las enzimas no pasan el glomérulo renal y son inactivadas en
plasma. Después son captadas por las células del sistema reticuloendotelial donde son
degradadas. La vida media de una enzima varía desde pocas horas a varios días. El
promedio es de 24 a 48 horas, pero puede variar, por ejemplo debido a alteraciones del
funcionamiento renal.

VI - CINÉTICA ENZIMÁTICA

VI.1- CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO


Las enzimas reaccionan ofreciendo su sitio activo al sustrato con el cual se acoplan y
forman un complejo enzima-sustrato. Después se libera el producto transformado sin que en
esta reacción se altere la enzima, que queda libre para fijar otra molécula de sustrato. La
actividad enzimática es una medida de la conversión de sustrato en producto.

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

Si mantenemos
constantes las condiciones de la
reacción (pH, temperatura,
cofactores y concentración de
enzima) la velocidad de la
reacción aumenta a medida que
aumentamos la concentración de
sustrato, hasta que llegamos a una
velocidad máxima a partir de la
cual la velocidad es constante
aunque siga aumentando la
concentración de sustrato.
Esto se explica porque al
aumentar mucho la cantidad de
sustrato, la enzima se satura (no
quedan moléculas de enzima
disponibles para unirse al sustrato
ya que todas están ocupadas) y se
alcanza la mayor velocidad de reacción que es posible.
Después, a medida que se consume el sustrato, se acumulan productos que pueden
ser inhibidores y también empieza a hacerse notar la reacción en sentido inverso. Por tanto,
la velocidad de reacción disminuye haciéndose además dependiente de la concentración de
sustrato.

La CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) es la concentración de sustrato en


moles/litro con la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Esta
constante es característica de cada reacción enzimática, y nos informa sobre la afinidad de la
enzima por su sustrato. Si una enzima tiene una Km elevada, la mitad de la velocidad
máxima se alcanzará con una concentración alta de sustrato, lo cual quiere decir que la
afinidad de la enzima por ese sustrato es baja y la velocidad de la reacción es lenta. Si, por
el contrario, una enzima tiene una Km baja, la mitad de la velocidad máxima se alcanza con
poca concentración de sustrato, lo que indica que la enzima tiene mucha afinidad por el
sustrato y la velocidad de la reacción está siendo rápida.

A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción es directamente


proporcional a la cantidad de sustrato. Se dice entonces que la reacción sigue una
CINÉTICA DE PRIMER ORDEN. Es la primera fase de la curva.

Si sigue aumentando la concentración de sustrato, llega un momento en que la


velocidad de la reacción es independiente del sustrato, ya que se ha alcanzado la velocidad
máxima. Se dice entonces que la reacción sigue una CINÉTICA DE ORDEN CERO. Es
la segunda fase de la curva. Cualquier incremento de sustrato ya no aumenta más la
velocidad. Esto ocurre porque todas las moléculas de enzima están saturadas.

Al efectuar determinaciones de la actividad enzimática en el laboratorio, LAS


REACCIONES DEBEN TENER CINÉTICA DE ORDEN CERO, para que la
velocidad de la reacción no dependa de la concentración de sustrato, sino sólo de la
concentración de enzima (que es precisamente lo que en el fondo queremos saber).

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Enzimología diagnóstica

En la práctica, si mantenemos constante la temperatura y el pH para que no se afecte


la enzima, con una concentración de sustrato que sea unas 10 veces superior a la Km
(constante de Michaelis), o más, podemos estar seguros de que la reacción va a ser de
cinética de orden cero. La mayoría de los reactivos comercializados para análisis enzimático
incluyen una concentración de sustrato de al menos 100 veces el valor de Km, para evitar
que el sustrato se agote durante la reacción.

Ecuación de Michaelis-Menten: v = Vmax · [S] / Km + [S]

Si S es mucho mayor que Km, el valor de Km se hace despreciable y entonces se


podría transformar la ecuación así: v = Vmax · [S] / [S] = Vmax. Es decir, la velocidad a la
que se está produciendo la reacción es la máxima y la cinética es de orden cero. Esto es lo
que queremos cuando estamos provocando esta reacción en el laboratorio.

VI.2.- OTROS FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:

1) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA:
Este debe ser el único factor limitador para que una determinación enzimática en el
laboratorio sea válida. La velocidad de reacción aumenta cuando la concentración de
enzima es mayor y se reduce cuando es menor. Sin embargo, el valor de Km es
independiente de la concentración de enzima.

Si la concentración de enzima es muy alta, llega un momento en que no hay sustrato


disponible para ocupar a todas las moléculas de enzima. Se agota el sustrato antes de que
finalice la observación de la reacción. En ese momento la reacción deja de ser lineal
(cinética de orden cero) y no refleja la actividad enzimática. Este momento es el límite de
linealidad de una determinación enzimática.

La mayoría de las determinaciones enzimáticas necesitan varias lecturas a tiempos


determinados (monitorización) que nos confirmen que la reacción no ha perdido la
linealidad.

2) TEMPERATURA:
La velocidad de las reacciones aumenta a medida que la temperatura aumenta, hasta
que se alcanza un valor óptimo. Si se sobrepasa, la enzima se desnaturaliza, pierde
actividad y la velocidad disminuye.

La desnaturalización comienza a temperaturas superiores a 40ºC, variando según la


enzima. Es irreversible. La mayoría de los análisis enzimáticos se hacen a 25, 30 ó 37 ºC.

Por otro lado, en muestras congeladas y recongeladas varias veces, las enzimas pueden
perder su actividad.

Es muy importante que todas las soluciones requeridas para un test enzimático sean
mantenidas a la temperatura prescrita para el test. La solución tampón y otras soluciones
que no dependen de la temperatura, se mantienen en un baño María a la temperatura del test.
Otras soluciones, tales como soluciones de coenzimas y enzimas, se conservan en un baño
de hielo y se llevan a la temperatura del test cada vez en porciones pequeñas.

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Análisis bioquímico
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3) pH:
Cada enzima tiene un pH al que
su actividad es máxima. La mayoría
tienen un pH óptimo entre 6 y 8. Hay
que añadir soluciones tampones a las
muestras en las que se quiere hacer una
determinación enzimática, para evitar
que el pH varíe.

4) ACTIVADORES ENZIMÁTICOS:
Hay sustancias que incrementan la velocidad de la reacción. En general, son iones
metálicos (como Mg++, Fe++, etc.). Es necesario que estén presentes para que funcionen
aquellas enzimas que los requieran. Si no están presentes, la actividad enzimática no será
óptima. Las coenzimas como NAD y NADP funcionan igual que los activadores.

Un exceso de complementos inorgánicos puede inhibir la reacción, por lo que las


concentraciones deben ser fijadas cuidadosamente.

5) INHIBIDORES:
Son sustancias que inhiben la actividad de determinadas enzimas y que pueden
variar la velocidad de la reacción o el valor de Km.

Existen inhibidores naturales en los tejidos y en el suero, pero que no suelen afectar
significativamente los tests enzimáticos en el laboratorio. Sólo en la orina se han detectado

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inhibidores que interfieren en la determinación cuantitativa de ciertas enzimas, por lo que se
recomienda dializar la orina antes de proceder a la determinación enzimática.

Algunos anticoagulantes inhiben reacciones enzimáticas. Los inhibidores también


pueden introducirse accidentalmente en la solución reactiva. Los más frecuentes son los
restos de detergentes empleados en la limpieza del material de vidrio así como los
inhibidores que se forman en soluciones NADH y NADPH. Por ello deben prepararse
siempre soluciones de coenzima frescas.

Inhibición competitiva: Cuando el inhibidor se une en el centro activo de la enzima


impidiendo que el sustrato se una a él. Si aumenta la concentración de sustrato, podemos
desplazar al inhibidor, por lo que evitamos la inhibición de la enzima. La velocidad máxima
es la misma con o sin inhibidor, pero necesitamos más concentración de sustrato para llegar
a ella y que la cinética sea de orden cero. El valor de Km es más alto.

Varia km

trato
máxima
No la velocidad
doe
sintube

#ma
-

wF
hI
sin inhibidor Con inhibidor

Inhibición no competitiva: Cuando el inhibidor se une reversiblemente a un punto diferente


del centro activo pero con su actuación lo modifica lo suficiente que, aunque se puedan unir la
enzima y el sustrato, la catálisis no se produce o la velocidad de ésta disminuye. La velocidad
máxima de la reacción queda disminuida, y esto no se puede contrarrestar aunque
aumentemos la cantidad de sustrato. El valor de Km no cambia sustancialmente. Un
ejemplo de inhibidores no competitivos son algunos detergentes que contaminan el material
de vidrio del laboratorio (¡por eso hay que enjuagar bien!).

↓ Velocidad máxima
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Inhibición alostérica: Cuando el inhibidor se une en un punto también diferente al centro
activo pero con su actuación lo modifica de tal manera que impide la unión de la enzima y el
sustrato.

Envenenadores: Son moléculas que se unen irreversiblemente al centro activo de la enzima


impidiendo permanentemente que esta actúe. Muchos tóxicos y venenos tienen este modo
de actuación.

VII - DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

VII.1.- MÉTODOS

El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostración in vitro de la


actividad catalítica que una enzima tiene in vivo. No nos interesa la cantidad o
concentración (que no se puede medir directamente con los métodos habituales) ni el peso
de la enzima, sino su ACTIVIDAD.

La actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de


sustrato que se transforma en producto por unidad de tiempo, en condiciones definidas y
controladas. Si no ponemos sustrato, la enzima no actúa porque no hay reacción y no
podremos detectarla aunque estuviera en grandes cantidades en la muestra.

Según la forma de medir la velocidad de las reacciones enzimáticas hay 3 tipos de métodos:

1) MÉTODOS A PUNTO FINAL O A TIEMPO FIJO: Se determina la cantidad de


sustrato transformado en un tiempo definido, después de detener la reacción. El
tiempo elegido para la incubación tendrá que estar necesariamente en la zona que
corresponda a una velocidad constante.

2) MÉTODOS DE PUNTOS MÚLTIPLES: Se va detectando a intervalos regulares


de tiempo el cambio (aumento o disminución) de alguno de los compuestos que
participan en la reacción, a medida que ésta se va produciendo.

El aumento o disminución de la absorbancia por unidad de tiempo es


directamente proporcional a la actividad enzimática, que es lo que se quiere
medir en la muestra. Con el método espectrofotométrico de puntos múltiples, se
hace una lectura basal y después varias lecturas más a intervalos iguales de
tiempo, a medida que se va desarrollando la reacción enzimática. En esas
lecturas se va observando cómo va disminuyendo o aumentando la absorbancia
de una forma constante. Las diferencias entre cada lectura y la anterior
(incrementos de absorbancia) deben ser iguales a lo largo de la reacción.

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

3) MÉTODOS DE MONITORIZACIÓN
CONTINUA: El espectrofotómetro va conectado
a un registrador que detecta de manera continuada
el cambio de la concentración de alguno de los
compuestos que participan en la reacción a lo
largo de un intervalo de tiempo determinado.

Los dos últimos tipos de métodos son


preferibles siempre que las características de los
reactivos y del aparataje lo permitan. Tienen la
ventaja de que permiten identificar el momento a
partir del cual la velocidad deja de ser constante.

VII.2.- MUESTRAS

Generalmente, la determinación de la actividad


enzimática se realiza mejor en suero que en
plasma, ya que los anticoagulantes utilizados más
frecuentemente inhiben la actividad de muchas de
ellas.

Las enzimas séricas se encuentran también en


el interior de los hematíes, pero en
concentraciones muy superiores, por lo que las
muestras hemolizadas no pueden utilizarse para la
determinación de actividad enzimática, ya que los
valores resultarán falsamente elevados.

VII.3.- UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La unidad de actividad enzimática es el katal/litro, que equivale a un mol de


sustrato catalizado por segundo. Sin embargo, en la mayoría de los laboratorios se sigue
usando la unidad/litro de actividad enzimática (U).

1 U = 1 micromol de sustrato catalizado por minuto (a 25ºC y pH y concentración de


sustrato controlados).

1 U = 16´7 · 10-9 katales = 16´7 nanokatales.

VII.4.- MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS PARA LA


DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Aunque se pueden utilizar diversos procedimientos para medir las variaciones en la


concentración del sustrato, cofactor o producto, el método que más se utiliza en el
laboratorio clínico es la espectrofotometría UV-V. Para ello, la reacción enzimática ha de
producir un cambio en la absorbancia de alguno de los componentes de la reacción.

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Si la reacción enzimática no contiene un componente con absorbancia a una
determinada longitud de onda, se puede acoplar otra reacción usando el producto de la
primera reacción como sustrato de la segunda. Se pueden encadenar así 2 o más reacciones.

Los métodos que más se utilizan miden la variación de la concentración de los


cofactores NADH o NADPH, ya que ambos presentan un máximo de absorción a 340 nm
que no poseen las formas oxidadas NAD y NADP.

Por tanto, si en una reacción enzimática se forma NAD o NADP, se observará una
disminución de la absorbancia a medida que se va efectuando la reacción. Si se forma
NADH o NADPH, se observará que aumenta la absorbancia a medida que va progresando
la reacción.

Según el número de reacciones químicas implicadas, nos podemos encontrar 3


casos:

1) Métodos simples. En la reacción catalizada por la enzima que queremos


determinar interviene un compuesto con absorbancia detectable. Por ejemplo:

Lactato + NAD LDH


Piruvato + NADH.
(La reacción en el sentido indicado ocurre si se lleva a cabo a pH 8´9. La reacción inversa se hace añadiendo
un tampón de pH 7´5).

La actividad de la LDH se determina midiendo el aumento de absorbancia por


unidad de tiempo a 340 nm, debido a la formación de NADH.

2) Métodos con reacción indicadora: si no hay ningún componente de la reacción


catalizada por la enzima que queremos determinar que presente cambios de absorbancia, se
enlaza con una segunda reacción, que será la reacción indicadora. Por ejemplo:

REACC. PRINCIPAL: Alanina + alfacetoglutárico ALT


glutamato + pirúvico
REACC. INDICADORA: Pirúvico + NADH LDH
Láctico + NAD

En este método para determinar la actividad de la ALT, el pirúvico que se obtiene en


la reacción principal se utiliza como sustrato de una reacción en la que interviene el NADH.
Como las reacciones son equimoleculares, la variación en la concentración de NADH por
unidad de tiempo es directamente proporcional a la actividad de la primera enzima.

12
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
3) Métodos con reacción auxiliar y reacción indicadora: se utilizan cuando no se
puede acoplar directamente la reacción principal con la indicadora. Por ejemplo:

REACC. PRINCIPAL: Fosfato de creatina + ADP CK


creatina + ATP
REACC. AUXILIAR: Glucosa + ATP HK
glucosa-6-fosfato + ADP
REACC. INDICADORA: Glucosa-6-P + NADP G6PDH
6-fosfogluconato + NADPH

Para determinar la actividad de la CK, se mide el incremento de absorbancia del


NADPH en la tercera reacción.

Para que no limiten la velocidad de la primera reacción, las enzimas de las


reacciones auxiliares e indicadoras han de tener mayor actividad que la enzima que se va a
medir y, por eso los reactivos deben llevar concentraciones en exceso de estas enzimas. En
caso contrario, la falta de estas enzimas frenaría el proceso y se obtendría un valor erróneo
de la actividad de la enzima que se analiza.

En algunos casos, antes de empezar a medir la absorbancia, hay que dejar unos
minutos de incubación previa de la mezcla de reacción para activar la enzima a medir (por
ejemplo, la CK) o para eliminar una reacción paralela que pueda interferir (por ejemplo, el
piruvato sérico podría falsear la actividad de la ALT y para evitarlo se deja tiempo para que
se transforme previamente en láctico).

VII.5.- CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Para calcular la actividad enzimática se aplica la fórmula:

A 1 Vt
   10 6
Actividad (en U/l) =  ·d t Vm

A = incremento de la absorbancia
= coeficiente de extinción molar del NADH. Se mide en l / mol x cm.
d = anchura de la cubeta de medida (longitud de la trayectoria luminosa en centímetros).
Vt = volumen total de mezcla
Vm = volumen de la muestra que se quiere analizar

Para unas determinadas condiciones del test, los factores , d, volumen de reactivo y
volumen de muestra son constantes, y por tanto se resumen en un FACTOR válido para
cada técnica (siempre que se mantengan las mismas condiciones). La fórmula queda
entonces así: Actividad enzimática (en U/l) = A x factor

Hoy en día, los aparatos destinados a la medida de actividad enzimática son capaces
de conservar en memoria los factores correspondientes a cada técnica que realizan. Miden el
incremento de absorbancia y lo multiplican por el factor.

Además, también señalan si ha existido algún problema en la cinética de la reacción


(generalmente esto ocurre porque se ha agotado el sustrato y se pierde entonces la linealidad
de la reacción o cinética de orden cero).

Si no aparece NADH o NADPH en la reacción indicadora, puede calcularse la


actividad enzimática con una solución patrón:

13
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Ax 1 Vt
 Cp  
Actividad enzimática = Ap t Vm

VIII - LAS ENZIMAS COMO REACTIVOS

Además de determinar la actividad de ciertas enzimas en líquidos biológicos (en


suero, sobre todo), las enzimas pueden ser suministradas comercialmente (cristalizadas o
altamente purificadas) para la determinación de la concentración de un determinado
sustrato o bien como enzimas auxiliares en tests enzimáticos de reacciones apareadas.

Los métodos enzimáticos son muy específicos y ampliamente utilizados para


determinaciones de rutina como glucosa, urea, colesterol, etc.

A- ENZIMAS COMO REACTIVOS DE UN SOLO USO (ENZIMAS EN SOLUCIONES


ACUOSAS):
Se emplean sistemas comercializados de reacción en los que se encuentran todos los
componentes necesarios para que tenga lugar una reacción determinada. Lo único que no
está es el sustrato, ya que eso es lo que queremos medir y por lo tanto está en la muestra
problema.
Por ejemplo: para medir la concentración de glucosa usamos el método de la glucosa
oxidasa. Esta enzima cataliza la reacción:
Glucosa + oxígeno + H2O GOD
glucónico + H2O2
Podemos aparear en el laboratorio una segunda reacción que es:
2 H2O2 + cromógeno POD
compuesto coloreado + 4 H2O

El reactivo comercial contiene todas las enzimas necesarias (glucosa oxidasa y


peroxidasa) y los sustratos necesarios (el cromógeno) excepto la glucosa, que es el sustrato
que queremos medir en la muestra problema. La primera reacción se produce sólo si hay
sustrato en la muestra problema. Las enzimas y sustratos del reactivo están en unas
concentraciones definidas para que la reacción ocurra en condiciones óptimas.

Al añadir al reactivo el suero problema, que suponemos que contiene glucosa, se


desencadena la reacción. Como al final se forma un compuesto coloreado, leemos en el
espectrofotómetro ese color.

Hay 2 procedimientos básicos para determinar la concentración de un analito con reactivos


enzimáticos:

1) A punto final:
Se basan en dejar que se desarrolle toda la reacción, de manera que todo el sustrato
se transforme en producto. La denominación de métodos de equilibrio es más correcta, ya
que la reacción cesa cuando se alcanza el equilibrio. Por ello, es preferible utilizar
reacciones en las que el punto de equilibrio se alcanza cuando prácticamente todo el sustrato
se ha convertido en producto. Cuando esto no sucede, el equilibrio se puede desplazar
donde se desee añadiendo otras reacciones que se encarguen de eliminar uno de los
productos de la primera reacción. Por ejemplo, cuando se mide la concentración de lactato
por medio de la reacción de la LDH, el piruvato formado puede eliminarse haciéndolo
reaccionar con hidrazina.

14
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
El tiempo necesario para que se transforme una determinada cantidad de sustrato en
producto es inversamente proporcional a la cantidad de enzima presente. Por eso, los
métodos de equilibrio pueden necesitar grandes cantidades de enzima como reactivo, a fin
de evitar largos tiempos de incubación.

2) Cinéticos:
En este tipo de métodos se mide la velocidad con que se ha producido la reacción
determinando la cantidad de cambio producido en un tiempo definido. Con ello, se suele
necesitar menos cantidad de enzima como reactivo y el tiempo suele acortarse.

Generalmente son métodos cinéticos a dos puntos, porque se mide la absorbancia en


el momento cero y al cabo del periodo fijado. Son métodos más exactos que los de
equilibrio pero más exigentes en cuanto al mantenimiento de las condiciones de la reacción.
Esto puede conseguirse actualmente con facilidad con los autoanalizadores.

B- ENZIMAS INMOVILIZADOS:
Se hace reaccionar la molécula proteica de la enzima con un adsorbente (como
agarosa o celulosa microcristalina) que se dispone formando partículas esféricas o
membranas.

Las enzimas inmovilizadas pueden volverse a utilizar en varios análisis y


generalmente son más estables que cuando se encuentran en solución acuosa.

Pueden adherirse a membranas que forman parte de electrodos ion-selectivos. Por


ejemplo, se puede determinar glucosa con un electrodo selectivo de oxígeno recubierto de
una membrana que contiene glucosa-oxidasa, midiéndose el oxígeno consumido en la
reacción.

C- ENZIMOINMUNOANÁLISIS:
En las técnicas de enzimoinmunoensayo (como ELISA o EMIT) también se usan
enzimas como reactivos. Las enzimas van unidas a anticuerpos (anticuerpos marcados)
permitiendo la localización de complejos Ag-Ac. Son técnicas muy sensibles y específicas.

IX- ENZIMOPATÍAS

Hay una serie de alteraciones genéticas que producen la síntesis defectuosa de


enzimas. Esto ocasiona alteraciones metabólicas que se pueden manifestar clínicamente de
forma muy variada.

Es muy importante el diagnóstico precoz de estos errores innatos del metabolismo,


ya que cuando aparece su sintomatología las lesiones producidas pueden ser irreversibles.

Desde el punto de vista del laboratorio, el diagnóstico precoz se basa en establecer


un cribaje muy amplio (por ejemplo, todos los recién nacidos) y usar las técnicas adecuadas
para detectar alguno de estos 3 procesos:
- acumulación de metabolitos precursores de la reacción interrumpida
- déficit de metabolitos que no se están sintetizando
- aparición de metabolitos anormales de efecto tóxico

Las técnicas más usadas son las cromatográficas.

15
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

Una forma muy precisa de diagnóstico consiste en realizar el correspondiente


estudio de la actividad enzimática para poner de manifiesto su déficit. Para ello, se obtiene
una biopsia del tejido afectado y se incuba en un medio con el sustrato específico de la
enzima en estudio. Los resultados obtenidos se comparan con los de controles sanos. Este
tipo de análisis se emplea, por ejemplo, para el estudio de las disacaridasas de la mucosa
intestinal.

Otro tipo de técnicas son las genéticas, que permiten analizar secuencias concretas
de ácidos nucleicos para identificar el gen alterado.

X - ENZIMAS CON SIGNIFICADO CLÍNICO

1) FOSFATASAS ALCALINAS (ALP) EC 3.1.3.1.


Pertenecen a la clase de las hidrolasas. Su pH óptimo es de 9 a 10.

Para su DETERMINACION sérica se usa como sustrato el p-nitrofenilfosfato


(pNPP), que se transforma en un compuesto amarillo por acción de la enzima.

Fuentes tisulares: Tiene 5 ISOENZIMAS diferentes, que en conjunto forman el total de la


fosfatasa alcalina sérica. Provienen de estos tejidos:
- hígado
- osteoblastos (en el tejido óseo)
- placenta, intestino, riñón, etc.

Los 2 primeros tejidos son los principales.

Estas isoenzimas se pueden separar mediante:


- ELECTROFORESIS: es el método más frecuente. La fracción hepática migra con
mayor rapidez hacia el ánodo que el resto de las fracciones.
- inactivación por calor.
- inhibición con fenilalaninas o con urea.
- métodos inmunoquímicos, usando antisueros específicos.

16
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

Significado clínico: Un aumento sérico puede deberse a:

a) Enfermedades de hígado:
- Colestasis intrahepáticas, ya que la enzima se encuentra en la membrana de los canalículos
biliares y regurgita a sangre cuando la excreción de bilis está dificultada.
- Otras afecciones, como obstrucción biliar extrahepática, cáncer o cirrosis.

b) Enfermedades óseas con actividad aumentada de los osteoblastos:


- Enfermedad de Paget, osteomalacia por falta de vitamina D, hiperparatiroidismo, etc.
- Desarrollo óseo durante el crecimiento o tras una fractura (en niños y adolescentes es
normal un nivel de fosfatasas alcalinas doble o triple al de los adultos).

2) FOSFATASAS ÁCIDAS (ACP) EC 3.1.3.2.


Pertenecen a la clase de las hidrolasas. Su pH óptimo es de 4´5 a 6.

Fuentes tisulares:
- próstata (es la principal)
- hígado, riñón, eritrocitos, plaquetas, osteoclastos, etc.

Significado clínico: Se eleva en sangre en enfermedades prostáticas, sobre todo en el


carcinoma prostático. Se eleva aún más si el carcinoma prostático ha dado metástasis en
huesos, ya que entonces aumenta la actividad de los osteoclastos.

Isoenzimas: Se puede detectar sólo la isoenzima prostática en vez de la fosfatasa


ácida total.

Métodos de determinación:
Se emplea un sustrato como el 1-naftil-fosfato + agua, que por acción de la enzima
se convierten en 1-naftol + fosfato. El 1-naftol se une a otro compuesto para colorearse.

Otro sustrato que también puede emplearse es el monofosfato de timolftaleína, que


es más específico para la fracción prostática que para las otras isoenzimas. Al reaccionar, da
un compuesto coloreado. La reacción se hace una vez sin añadir tartrato y otra vez
añadiendo tartrato, porque este anión inhibe la actividad de la fracción prostática (se observa
la diferencia de actividad antes y después de añadir tartrato).

17
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

Actividad de la fosfatasa ácida total (sin añadir tartrato) menos Actividad tras añadir
tartrato = Actividad de la isoenzima prostática.

3) TRANSAMINASAS O AMINOTRANSFERASAS >


- Enzimas hepéticas
Pertenecen a la clase de las transferasas. Hay 2 tipos:
Catalizan la transferencia de un
grupo amuno entre un aa y un otocudo
a) Aminotransferasa aspártica (AST) o transaminasa glutámicooxalacética
(GOT). EC 2.6.1.1. aligent
>
-
Cataliza la siguiente reacción: aspártico + alfa-cetoglutárico oxalacético +
glutámico. Necesita una coenzima llamada pridoxal-5-fosfato.

Fuentes tisulares: -citoplasma de las células miocárdicas


-mitocondrias de los hepatocitos se libera la sangre hay
se a un deterior

-citoplasma de las cél. musculares esqueléticas profundo


-riñón, etc.

Significado clínico: Aumenta en suero en:


- infarto de miocardio
- hepatitis vírica (se eleva proporcionalmente menos que la ALT)
- necrosis hepática
se necrosa parte
del
higado , sustituye - cirrosis hepática (se eleva más que la ALT)
se

por tegido febrose


ser
funcion - mononucleosis infecciosa (por la afectación del hígado)
- distrofias musculares

Disminuye en suero en la deficiencia de vitamina B6 (o piridoxamina).

En general, una elevación sérica de una enzima mitocondrial supone mayor


daño celular que el de una enzima citoplasmática. El hepatocito está más dañado cuando
libera AST que cuando libera ALT. AST > 1 grave se ha liberado de la
-

mitocondra atoplasma ALT y aross


-
metocondic
En el infarto de miocardio se eleva en sangre a las pocas horas (pero después que la
enzima creatinquinasa), alcanza su pico máximo a las 36 horas y se normaliza al 5º día. La
enzima no se eleva tanto en otras afecciones cardíacas con síntomas similares, por lo que
sirve para el diagnóstico diferencial.

Métodos de determinación: Se emplean como sustratos aspartato y alfa-


cetoglutárico, que dan como productos glutámico y oxalacético. Se hace después una 2ª
reacción (reacción apareada) que es:
Oxalacético + NADH MDH
málico + NAD. (MDH = málico deshidrogenasa).
Se mide ahora la disminución de absorbancia.

b) Alanina aminotransferasa (ALT) o transaminasa glutámicopirúvica (GPT) (EC


2.6.1.2.)
Cataliza esta reacción: alanina + alfa-cetoglutárico pirúvico + glutámico

La coenzima necesaria es también el piridoxal-5-fosfato.

Fuentes tisulares: - citoplasma de las células hepáticas Chepatitis)


AST
atoplasmatica
leve
Enzima mas
que 340 nm 18
Se mude
,
a

-
AST 11 >
- hepatitis
ALT
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
- citoplasma de las células del miocardio
- riñón

Significado clínico: generalmente, los aumentos séricos de GPT son paralelos a los
de GOT (se elevan las dos juntas). Sin embargo, hay que resaltar que en las hepatitis víricas
se eleva más la GPT que la GOT, mientras que en las cirrosis, en las que el daño celular es
más grave, se eleva más la GOT.

Métodos de determinación:
En una 1ª reacción se emplean los sustratos alanina + alfa-cetoglutárico que dan
como productos glutámico + pirúvico.
En una 2ª reacción (reacción apareada) se emplea el pirúvico + NADH, que por
acción de la enzima LDH se convierte en Láctico + NAD. Este NAD es el que nos interesa
porque da lugar a una disminución de la absorbancia.

4) CREATINA QUINASA (CK) EC 2.7.3.2.


Pertenece a la clase de las transferasas. Necesita al Mg como cofactor.

Cataliza la reacción: Creatina + ATP Fosfato de creatina + ADP

Esta reacción es muy importante para las células, sobre todo las musculares, porque
los productos que se forman son la fuente de energía para ellas.

Fuentes tisulares: Está en las mitocondrias y citoplasmas de muchas células, pero es


más abundante en músculo esquelético, miocardio y cerebro.

Isoenzimas: Cada enzima CK está formada por 2 subunidades, que pueden ser del
tipo M (inicial de músculo) o B (inicial de "brain",que significa cerebro). Estas subunidades
se pueden combinar de 3 formas distintas, por lo que hay 3 isoenzimas, que son:
CK-BB (o CK-1): está sobre todo en cerebro.
CK-MB (o CK-2): está sobre todo en el miocardio.
CK-MM (o CK-3): está en músculo esquelético y también en miocardio.

19
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica

Significado clínico: La separación y análisis de las isoenzimas tiene mayor


significado clínico que la determinación de niveles totales de CK.

La CK total se eleva en el infarto de miocardio, enfermedades musculares y después


de un shock circulatorio.
cerebrales
- enfermedades
La isoenzima CK-BB sólo se encuentra en suero si está alterada la barrera
hematoencefálica. Si se encuentra, indica mal pronóstico de ciertos tumores.

La isoenzima CK-MM es la más abundante en suero (alrededor del 94% de la CK


total en individuos sanos). Se eleva por problemas musculares, como traumatismos, y
también en el infarto de miocardio.
distrafia muscular

La isoenzima CK-MB es el 6% de la CK total sérica. Es muy útil para detectar


precozmente un infarto de miocardio, porque se eleva a las 4 ó 6 horas tras el infarto,
alcanza su punto máximo a las 24 horas y se normaliza en sangre a las 72 horas. Se analiza
de rutina en enfermos con sospecha de infarto de miocardio, ya que es el marcador
enzimático más precoz.

Actualmente se conocen otros marcadores de isquemia cardíaca más precoces, pero


no son enzimas: son las troponinas y la mioglobina.
La mioglobina es el marcador más sensible en las primeras 6 horas y se considera de
elección en la detección precoz de la necrosis.

Las troponinas son de 2 tipos: I y T. La I es más precoz y la T es de elección para los


infartos de larga evolución, en los que han transcurrido más de 48 horas desde su inicio.
Aunque es de más tardía aparición, esta troponina tiene la ventaja de que tiene una gran
ventana diagnóstica (permanece elevada mucho tiempo en suero).

T
de mocardio -1- aumenta en
sangre tropomna
Inforto máximo a las 24h)
20
2 LDH , CKMB/3-Sh y pico
3 - AST
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Métodos de determinación:
- Para determinar CK total: se provocan las siguientes reacciones apareadas:
FOSFATO DE CREATINA + ADP CREATINA + ATP
ATP + GLUCOSA GLUCOSA 6-FOSFATO + ADP
GLUCO 6-P+ NADP 6-FOSFOGLUCONATO + NADPH

En el reactivo deben ir todas las enzimas necesarias (menos la CK). Se mide el


incremento de absorbancia a punto final o por métodos cinéticos producido por el NADPH.

Para determinar isoenzimas se pueden emplear estos métodos:


- Electroforesis en gel de agarosa, a pH 8´6. La CK-BB es la que migra con mayor
rapidez hacia el ánodo, después la CK-MB y la última en migrar es la CK-MM.
- Cromatografía de intercambio iónico
- Inmunoinhibición: se utilizan anticuerpos anti-M que inutilizan a las subunidades M
de las isoenzimas.
- Radioinmunoanálisis: más caro.

5) LACTICO DESHIDROGENASA (LDH) EC1.1.1.27.


Pertenece a la clase de las oxidorreductasas. Cataliza de forma reversible esta
reacción: PIRUVICO + NADH LACTICO + NAD

Fuentes tisulares: está en los citoplasmas de casi todas las células, sobre todo en
miocardio, eritrocitos, músculo esquelético, hígado y riñón.

Isoenzimas: La LDH es la enzima en la que mayor importancia tiene la separación


de sus isoenzimas, dada la variedad de fuentes tisulares de la enzima total.

La LDH está compuesta por 4 subunidades, que pueden ser del tipo H ("heart",
corazón) o del tipo M (que viene de músculo). Las combinaciones de estas subunidades dan
lugar a 5 posibles isoenzimas:
LDH-1 (HHHH): está presente sobre todo en corazón y eritrocitos.
LDH-2 (HHHM): " " " " " " " "
LDH-3 (HHMM): muy distribuida por todo el organismo.
LDH-4 (HMMM): abunda en músculo esquelético e hígado.
LDH-5 (MMMM): " " " " " "

La numeración va en el mismo orden que su velocidad de migración en la


electroforesis (La LDH-1 es la más negativa y por tanto la que migra antes, etc).

Significado clínico: La LDH total se eleva en el infarto de miocardio, en las anemias


megaloblásticas y en enfermedades del hígado, pero no permite hacer un diagnóstico
definitivo de ninguna enfermedad.

21
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
La indicación más frecuente para medir la actividad de la LDH en el laboratorio es
el infarto de miocardio. En este caso, se elevan sobre todo las isoenzimas LDH-1 y LDH-2.
Se elevan unas 8 ó 12 horas después del infarto (después de la CK y de la GOT), y se
mantienen altas durante 6 ó más días (cuando el resto de enzimas ya se han normalizado).

En el suero normal hay más LDH-2 que LDH-1. En el infarto, esto se invierte y hay
más LDH-1.

En enfermedades hepáticas se eleva la LDH-5 dando valores muy altos si son


enfermedades graves como cáncer.

Métodos de determinación:
- Para la LDH total: Sustratos necesarios: Pirúvico y NADH. Se convierten en
láctico + NAD. Nosotros medimos la disminución de absorbancia producida. La reacción
puede hacerse también a la inversa (con láctico y NAD como sustratos), pero resulta más
lenta.
- Para separar isoenzimas:
- Electroforesis: es el método más frecuente.
- Cromatografía de intercambio iónico
- Inmunoprecipitación: con anticuerpos anti-M se hacen precipitar todas las
isoenzimas menos la LDH-1 que no tiene subunidad M.

6) GAMMA GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT) EC 2.3.2.2.


Pertenece a la clase de las transferasas.

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Fuentes tisulares: se encuentra en los microsomas y membranas de muchas células,
sobre todo del riñón, hígado y páncreas. La mayor parte de la actividad en suero se debe a
la fracción producida en el hígado.

Significado clínico: Su elevación en suero indica enfermedades hepatobiliares. Se


eleva sobre todo en casos de obstrucción biliar (colestasis). Se incluye en el perfil básico
hepático, pues es bastante específica de este órgano.

El ALCOHOL y algunos fármacos favorecen su síntesis, por lo que su elevación


en suero puede servir de indicador del alcoholismo. Se puede utilizar para vigilar la
abstinencia de alcohol en alcohólicos que se están rehabilitando, porque los niveles de la
enzima en suero se normalizan unas 5 semanas después de haber dejado el alcohol, pero
aumentan mucho en cuanto se vuelve a tomar.

La gamma-GT se ha asociado recientemente con un mayor riesgo de padecer


diabetes tipo II, enfermedades vasculares y enfermedad renal crónica.

Métodos de determinación: Se provoca la siguiente reacción:


Gammaglutamil-p-nitroanilina + glicilglicina g-glutamil de glicilglicina + p-
nitroanilina.

La p-nitroanilina está coloreada y puede leerse en el espectrofotómetro.

7) ALFA-AMILASA : EC 3.2.1.1.
Pertenece a la clase de las hidrolasas. Necesita calcio como cofactor.

Cataliza la reacción consistente en romper los enlaces alfa (1-4) de los polisacáridos,
transformándolos en moléculas más pequeñas (sobre todo en maltosa, que es un disacárido).

Fuentes tisulares: Acinos de las glándulas salivares y del páncreas.


Una pequeña parte de la amilasa puede filtrarse en el riñón y aparecer en orina.

Isoenzimas: Hay 2 isoenzimas: La P, que viene del páncreas, y la S, que viene de las
glándulas salivares y otros tejidos.

Significado clínico: Ayuda al diagnóstico de la pancreatitis aguda. Se eleva en suero


y orina. Otras enfermedades abdominales también pueden producir hiperamilasemia, por lo
que a veces este dato no es suficiente para asegurar un diagnóstico.

Métodos de determinación: Se aporta un sustrato (por ejemplo, maltotetraosa) para


que actúe la enzima. Después se aparea una 2ª reacción obteniéndose como producto NADH
o p-nitrofenol, que pueden leerse en el espectrofotómetro. No merece la pena separar
isoenzimas.

8) OTRAS ENZIMAS DE INTERÉS DIAGNÓSTICO EN LABORATORIO:

- COLINESTERASA: baja en suero cuando hay insuficiencia hepática grave o


intoxicaciones con pesticidas e insecticidas. Cuando el suero está hemolizado el
resultado sale falsamente disminuido, igual que ocurre con la fosfatasa alcalina.

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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
- LIPASA: aumenta en suero en las pancreatitis agudas.

- ALDOLASA: entra en el perfil básico de patología muscular.

- LEUCINAMINOPEPTIDASA: enfermedades hepáticas. Se puede medir en orina de 24


horas. En suero se puede pedir conjuntamente con la fosfatasa alcalina y 5´NT.

- GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA: anomalías eritrocitarias, etc.

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