En Zimas
En Zimas
En Zimas
Análisis bioquímico
Laboratorio clínico y biomédico
- (ej exoquinasa
produzca reacción aumentando la velocidad :
en el rbosoma
re
Las enzimas se sintetizan en las células y están presentes en todos los tejidos,
aunque no todos los tejidos tienen las mismas enzimas ni en igual cantidad. Es precisamente
el conocimiento de su función y ubicación en los tejidos lo que permite utilizarlas como
verdaderos marcadores de ciertas patologías. La determinación en plasma o en otro líquido
En la orna NO & biológico de una enzima o de un grupo de enzimas nos informa sobre el tejido o células de
porque no se
filtra las que provienen. Se la célula está dañada aumenta la permeabilidad de la membrana y libera
>
- se de
en los
glomercios de la
sangre
Las enzimas son proteínas de alto peso molecular: en condiciones normales no se
filtran en los glomérulos renales. Poseen todas las propiedades de las proteínas, incluida la
posibilidad de desnaturalizarse, en cuyo caso pierden su actividad. También pueden
&
ionizarse según el pH del medio, por lo que se puede aprovechar esta cualidad para hacer
una electroforesis.
ph ácido a + 40 pierde la estructura tercara
o
en un
parte orgánica
↑ lleva el
cofactor
es
catalización enzimática velocidad que
#
menor se
La apoenzima lleva cabo la a
que
-Apo
a
:
E velocidad
-nzimas a
mayor
naturaleza inorgánica
conjugadas / metálicos de
Activadores enzimáticos
: cones
inorgánica
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
En el laboratorio clínico las enzimas interesan desde 3 aspectos:
1º) Como componentes presentes en las muestras, ya que su detección puede ayudar al
diagnóstico de ciertas enfermedades (enzimología diagnóstica),
2º) como reactivos útiles para analizar otras sustancias (técnicas enzimáticas), exoquinasa o GGP
3º) como responsables de diferentes trastornos metabólicos congénitos (enzimopatías).
Y
II – FUNCIÓN genecetonuria
in[
- Las enzimas catalizan reacciones en las que se transforman una o más moléculas de
SUSTRATO (S) en una o más moléculas de PRODUCTO (P). S E P
- El sustrato debe ser previamente activado para que la reacción se lleve a cabo. La cantidad
de energía necesaria para activar al sustrato se llama energía de activación. En muchas
técnicas de laboratorio esta energía se aporta en forma de calor.
- Las enzimas funcionan como catalizadores biológicos y disminuyen la energía de
activación. Permiten así que la reacción se haga a la temperatura normal del cuerpo, sin un
aporte extra de calor.
-Energaden
se
La enzima se enzima
une al sustrato y
forma un complejo enzima-
sustrato (ES). Una vez que se
efectúa la ↓ catálisis, el
sustrato se transforma en
Con la
producto y la enzima
enzima permanece
sin cambio y queda en libertad
para catalizar otras reacciones.
La reacción general es:
E + S O
E-S P+E
b
Esne
e E + P
enzima saturada Compleo
La
enzima
enzima
-
se une
sustrato
al sustrato
y
Las propiedades de las enzimas son:
Imp se satura porque
tiene el
-
III – ISOENZIMAS
Existen formas moleculares de una determinada enzima que pueden catalizar una
misma reacción química. Estas formas diversas de una misma enzima se llaman isoenzimas.
Con técnicas apropiadas se pueden separar las isoenzimas de una enzima. Por
ejemplo:
- como muchas isoenzimas presentan variaciones de carga, pueden separarse por
técnicas electroforéticas.
- también pueden separarse por sus diferencias a la inactivación por calor
(podemos provocar que se inactiven aplicando calor, pero cada isoenzima se
inactiva a una temperatura distinta).
- adsorción selectiva a diferentes soportes
- incubación con diferentes sustratos o con inhibidores selectivos
Sin embargo, se tiende a utilizar cada vez más un código para cada enzima. Consta
de las siglas EC y de 4 números separados por puntos. Esos 4 números significan, en este
orden, lo siguiente:
o Primer número: la clase de enzima (hay 6 posibles clases)
o Segundo número: subclase
o Tercer número: subsubclase
o Cuarto número: número de serie específico de la enzima.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Ejemplo: LDH (LACTATO DESHIDROGENASA)
Código: EC 1.1.1.27
Primer nº: 1. Indica que la clase es oxidorreductasa
Segundo nº: 1. Indica subclase oxidasa
Tercer nº: 1. Indica que la subsubclase es citocromo oxidasa
Cuarto nº: 27. El número de esta enzima dentro de la subsubclase.
V - ENZIMAS PLASMÁTICAS
Todas las enzimas se sintetizan en el interior de las células (en los ribosomas) y la
mayor parte de ellas realizan sus funciones intracelularmente. Sin embargo, en sangre se
puede detectar la actividad de diversas enzimas que, para su estudio, se clasifican en 3
grupos:
Los factores de los que dependen los cambios en la actividad enzimática sérica son:
1º) Los que afectan a la liberación de las enzimas desde las células:
Las enzimas permanecen en las células donde se han sintetizado porque la
membrana plasmática no permite su salida en masa. Esta membrana es parte
metabólicamente activa de la célula y su integridad depende de la producción de energía de
la misma. Por eso, si hay un trastorno en el metabolismo celular se deteriora la membrana y,
si la lesión es irreversible, la célula muere.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
citoplasmático) salen antes que las enzimas intramitocondriales. Estas últimas necesitan una
lesión mayor para salir a la circulación.
VI - CINÉTICA ENZIMÁTICA
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Si mantenemos
constantes las condiciones de la
reacción (pH, temperatura,
cofactores y concentración de
enzima) la velocidad de la
reacción aumenta a medida que
aumentamos la concentración de
sustrato, hasta que llegamos a una
velocidad máxima a partir de la
cual la velocidad es constante
aunque siga aumentando la
concentración de sustrato.
Esto se explica porque al
aumentar mucho la cantidad de
sustrato, la enzima se satura (no
quedan moléculas de enzima
disponibles para unirse al sustrato
ya que todas están ocupadas) y se
alcanza la mayor velocidad de reacción que es posible.
Después, a medida que se consume el sustrato, se acumulan productos que pueden
ser inhibidores y también empieza a hacerse notar la reacción en sentido inverso. Por tanto,
la velocidad de reacción disminuye haciéndose además dependiente de la concentración de
sustrato.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
1) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA:
Este debe ser el único factor limitador para que una determinación enzimática en el
laboratorio sea válida. La velocidad de reacción aumenta cuando la concentración de
enzima es mayor y se reduce cuando es menor. Sin embargo, el valor de Km es
independiente de la concentración de enzima.
2) TEMPERATURA:
La velocidad de las reacciones aumenta a medida que la temperatura aumenta, hasta
que se alcanza un valor óptimo. Si se sobrepasa, la enzima se desnaturaliza, pierde
actividad y la velocidad disminuye.
Por otro lado, en muestras congeladas y recongeladas varias veces, las enzimas pueden
perder su actividad.
Es muy importante que todas las soluciones requeridas para un test enzimático sean
mantenidas a la temperatura prescrita para el test. La solución tampón y otras soluciones
que no dependen de la temperatura, se mantienen en un baño María a la temperatura del test.
Otras soluciones, tales como soluciones de coenzimas y enzimas, se conservan en un baño
de hielo y se llevan a la temperatura del test cada vez en porciones pequeñas.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
3) pH:
Cada enzima tiene un pH al que
su actividad es máxima. La mayoría
tienen un pH óptimo entre 6 y 8. Hay
que añadir soluciones tampones a las
muestras en las que se quiere hacer una
determinación enzimática, para evitar
que el pH varíe.
4) ACTIVADORES ENZIMÁTICOS:
Hay sustancias que incrementan la velocidad de la reacción. En general, son iones
metálicos (como Mg++, Fe++, etc.). Es necesario que estén presentes para que funcionen
aquellas enzimas que los requieran. Si no están presentes, la actividad enzimática no será
óptima. Las coenzimas como NAD y NADP funcionan igual que los activadores.
5) INHIBIDORES:
Son sustancias que inhiben la actividad de determinadas enzimas y que pueden
variar la velocidad de la reacción o el valor de Km.
Existen inhibidores naturales en los tejidos y en el suero, pero que no suelen afectar
significativamente los tests enzimáticos en el laboratorio. Sólo en la orina se han detectado
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
inhibidores que interfieren en la determinación cuantitativa de ciertas enzimas, por lo que se
recomienda dializar la orina antes de proceder a la determinación enzimática.
Varia km
trato
máxima
No la velocidad
doe
sintube
#ma
-
wF
hI
sin inhibidor Con inhibidor
↓ Velocidad máxima
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Inhibición alostérica: Cuando el inhibidor se une en un punto también diferente al centro
activo pero con su actuación lo modifica de tal manera que impide la unión de la enzima y el
sustrato.
VII.1.- MÉTODOS
Según la forma de medir la velocidad de las reacciones enzimáticas hay 3 tipos de métodos:
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
3) MÉTODOS DE MONITORIZACIÓN
CONTINUA: El espectrofotómetro va conectado
a un registrador que detecta de manera continuada
el cambio de la concentración de alguno de los
compuestos que participan en la reacción a lo
largo de un intervalo de tiempo determinado.
VII.2.- MUESTRAS
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Si la reacción enzimática no contiene un componente con absorbancia a una
determinada longitud de onda, se puede acoplar otra reacción usando el producto de la
primera reacción como sustrato de la segunda. Se pueden encadenar así 2 o más reacciones.
Por tanto, si en una reacción enzimática se forma NAD o NADP, se observará una
disminución de la absorbancia a medida que se va efectuando la reacción. Si se forma
NADH o NADPH, se observará que aumenta la absorbancia a medida que va progresando
la reacción.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
3) Métodos con reacción auxiliar y reacción indicadora: se utilizan cuando no se
puede acoplar directamente la reacción principal con la indicadora. Por ejemplo:
En algunos casos, antes de empezar a medir la absorbancia, hay que dejar unos
minutos de incubación previa de la mezcla de reacción para activar la enzima a medir (por
ejemplo, la CK) o para eliminar una reacción paralela que pueda interferir (por ejemplo, el
piruvato sérico podría falsear la actividad de la ALT y para evitarlo se deja tiempo para que
se transforme previamente en láctico).
A 1 Vt
10 6
Actividad (en U/l) = ·d t Vm
A = incremento de la absorbancia
= coeficiente de extinción molar del NADH. Se mide en l / mol x cm.
d = anchura de la cubeta de medida (longitud de la trayectoria luminosa en centímetros).
Vt = volumen total de mezcla
Vm = volumen de la muestra que se quiere analizar
Para unas determinadas condiciones del test, los factores , d, volumen de reactivo y
volumen de muestra son constantes, y por tanto se resumen en un FACTOR válido para
cada técnica (siempre que se mantengan las mismas condiciones). La fórmula queda
entonces así: Actividad enzimática (en U/l) = A x factor
Hoy en día, los aparatos destinados a la medida de actividad enzimática son capaces
de conservar en memoria los factores correspondientes a cada técnica que realizan. Miden el
incremento de absorbancia y lo multiplican por el factor.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Ax 1 Vt
Cp
Actividad enzimática = Ap t Vm
1) A punto final:
Se basan en dejar que se desarrolle toda la reacción, de manera que todo el sustrato
se transforme en producto. La denominación de métodos de equilibrio es más correcta, ya
que la reacción cesa cuando se alcanza el equilibrio. Por ello, es preferible utilizar
reacciones en las que el punto de equilibrio se alcanza cuando prácticamente todo el sustrato
se ha convertido en producto. Cuando esto no sucede, el equilibrio se puede desplazar
donde se desee añadiendo otras reacciones que se encarguen de eliminar uno de los
productos de la primera reacción. Por ejemplo, cuando se mide la concentración de lactato
por medio de la reacción de la LDH, el piruvato formado puede eliminarse haciéndolo
reaccionar con hidrazina.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
El tiempo necesario para que se transforme una determinada cantidad de sustrato en
producto es inversamente proporcional a la cantidad de enzima presente. Por eso, los
métodos de equilibrio pueden necesitar grandes cantidades de enzima como reactivo, a fin
de evitar largos tiempos de incubación.
2) Cinéticos:
En este tipo de métodos se mide la velocidad con que se ha producido la reacción
determinando la cantidad de cambio producido en un tiempo definido. Con ello, se suele
necesitar menos cantidad de enzima como reactivo y el tiempo suele acortarse.
B- ENZIMAS INMOVILIZADOS:
Se hace reaccionar la molécula proteica de la enzima con un adsorbente (como
agarosa o celulosa microcristalina) que se dispone formando partículas esféricas o
membranas.
C- ENZIMOINMUNOANÁLISIS:
En las técnicas de enzimoinmunoensayo (como ELISA o EMIT) también se usan
enzimas como reactivos. Las enzimas van unidas a anticuerpos (anticuerpos marcados)
permitiendo la localización de complejos Ag-Ac. Son técnicas muy sensibles y específicas.
IX- ENZIMOPATÍAS
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Otro tipo de técnicas son las genéticas, que permiten analizar secuencias concretas
de ácidos nucleicos para identificar el gen alterado.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
a) Enfermedades de hígado:
- Colestasis intrahepáticas, ya que la enzima se encuentra en la membrana de los canalículos
biliares y regurgita a sangre cuando la excreción de bilis está dificultada.
- Otras afecciones, como obstrucción biliar extrahepática, cáncer o cirrosis.
Fuentes tisulares:
- próstata (es la principal)
- hígado, riñón, eritrocitos, plaquetas, osteoclastos, etc.
Métodos de determinación:
Se emplea un sustrato como el 1-naftil-fosfato + agua, que por acción de la enzima
se convierten en 1-naftol + fosfato. El 1-naftol se une a otro compuesto para colorearse.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Actividad de la fosfatasa ácida total (sin añadir tartrato) menos Actividad tras añadir
tartrato = Actividad de la isoenzima prostática.
-
AST 11 >
- hepatitis
ALT
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
- citoplasma de las células del miocardio
- riñón
Significado clínico: generalmente, los aumentos séricos de GPT son paralelos a los
de GOT (se elevan las dos juntas). Sin embargo, hay que resaltar que en las hepatitis víricas
se eleva más la GPT que la GOT, mientras que en las cirrosis, en las que el daño celular es
más grave, se eleva más la GOT.
Métodos de determinación:
En una 1ª reacción se emplean los sustratos alanina + alfa-cetoglutárico que dan
como productos glutámico + pirúvico.
En una 2ª reacción (reacción apareada) se emplea el pirúvico + NADH, que por
acción de la enzima LDH se convierte en Láctico + NAD. Este NAD es el que nos interesa
porque da lugar a una disminución de la absorbancia.
Esta reacción es muy importante para las células, sobre todo las musculares, porque
los productos que se forman son la fuente de energía para ellas.
Isoenzimas: Cada enzima CK está formada por 2 subunidades, que pueden ser del
tipo M (inicial de músculo) o B (inicial de "brain",que significa cerebro). Estas subunidades
se pueden combinar de 3 formas distintas, por lo que hay 3 isoenzimas, que son:
CK-BB (o CK-1): está sobre todo en cerebro.
CK-MB (o CK-2): está sobre todo en el miocardio.
CK-MM (o CK-3): está en músculo esquelético y también en miocardio.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
T
de mocardio -1- aumenta en
sangre tropomna
Inforto máximo a las 24h)
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2 LDH , CKMB/3-Sh y pico
3 - AST
Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Métodos de determinación:
- Para determinar CK total: se provocan las siguientes reacciones apareadas:
FOSFATO DE CREATINA + ADP CREATINA + ATP
ATP + GLUCOSA GLUCOSA 6-FOSFATO + ADP
GLUCO 6-P+ NADP 6-FOSFOGLUCONATO + NADPH
Fuentes tisulares: está en los citoplasmas de casi todas las células, sobre todo en
miocardio, eritrocitos, músculo esquelético, hígado y riñón.
La LDH está compuesta por 4 subunidades, que pueden ser del tipo H ("heart",
corazón) o del tipo M (que viene de músculo). Las combinaciones de estas subunidades dan
lugar a 5 posibles isoenzimas:
LDH-1 (HHHH): está presente sobre todo en corazón y eritrocitos.
LDH-2 (HHHM): " " " " " " " "
LDH-3 (HHMM): muy distribuida por todo el organismo.
LDH-4 (HMMM): abunda en músculo esquelético e hígado.
LDH-5 (MMMM): " " " " " "
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
La indicación más frecuente para medir la actividad de la LDH en el laboratorio es
el infarto de miocardio. En este caso, se elevan sobre todo las isoenzimas LDH-1 y LDH-2.
Se elevan unas 8 ó 12 horas después del infarto (después de la CK y de la GOT), y se
mantienen altas durante 6 ó más días (cuando el resto de enzimas ya se han normalizado).
En el suero normal hay más LDH-2 que LDH-1. En el infarto, esto se invierte y hay
más LDH-1.
Métodos de determinación:
- Para la LDH total: Sustratos necesarios: Pirúvico y NADH. Se convierten en
láctico + NAD. Nosotros medimos la disminución de absorbancia producida. La reacción
puede hacerse también a la inversa (con láctico y NAD como sustratos), pero resulta más
lenta.
- Para separar isoenzimas:
- Electroforesis: es el método más frecuente.
- Cromatografía de intercambio iónico
- Inmunoprecipitación: con anticuerpos anti-M se hacen precipitar todas las
isoenzimas menos la LDH-1 que no tiene subunidad M.
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Análisis bioquímico
Enzimología diagnóstica
Fuentes tisulares: se encuentra en los microsomas y membranas de muchas células,
sobre todo del riñón, hígado y páncreas. La mayor parte de la actividad en suero se debe a
la fracción producida en el hígado.
7) ALFA-AMILASA : EC 3.2.1.1.
Pertenece a la clase de las hidrolasas. Necesita calcio como cofactor.
Cataliza la reacción consistente en romper los enlaces alfa (1-4) de los polisacáridos,
transformándolos en moléculas más pequeñas (sobre todo en maltosa, que es un disacárido).
Isoenzimas: Hay 2 isoenzimas: La P, que viene del páncreas, y la S, que viene de las
glándulas salivares y otros tejidos.
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- LIPASA: aumenta en suero en las pancreatitis agudas.
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