Conteo Mesenquimal Nuevo

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
LABORATORIO NACIONAL DE CITOMETRÍA DE FLUJO

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Clave documento:
Informe - LabNalCit LNC-PO02/F01
NÚMERO DOCUMENTO: LNC-PO02/R01/034
DATOS DEL USUARIO:

Nombre: Miriam Susana Santiago Hernández
Institución: Placente regener hominis
E-mail: mimilandazuri@prodigy.net.mx
Dirección:
OBJETIVO
Evaluar la expresión de marcadores de identificación de células madres mesenquimales y su
recuento celular en muestras de tejido placentario
DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA
Número de solicitud: AT R0025_SD

Fecha de recepción de la muestra: 30 MAYO 2019
Código LabNalCit Muestras Observaciones
LNC-190530MSH001 Placenta externa 1 Muestra de tejido placentario
LNC-190530MSH002 Placenta media 1 Muestra de tejido placentario
LNC-190530MSH003 Cordón 1 Muestra de tejido placentario
Página: 1 de 24
* Este documento contiene información confidencial. No reproducir, modificar o revelar sin previa autorización del LabNalCit.
Clave documento:
Procedimiento de muestreo y condiciones de almacenamiento:

Se procedió a procesar los tejidos, para el aislamiento de las células para su posterior cultivo
y/o tinción con anticuerpos.
Observaciones de ingreso de la(s) muestra (s):

Los tejidos ingresaron envueltos en papel aluminio dentro de una hielera.
MÉTODO DE ANÁLISIS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS

Metodología empleada: Las muestras celulares fueron teñidas con los anticuerpos para
CD73, CD90, CD105, CD44, CD34, CD45, y el marcador de viabilidad Viva Fix.
Se analizó muestra control al día 0 de cultivo y muestra enriquecida (8 semanas de cultivo
celular)
Equipos: Citómetro de flujo Attunne Next.
Materiales de referencia y controles:

Se utilizaron los controles de compensación “Sin tinción” y “Tinciones únicas” para el ajuste de
voltajes de de cada uno de los canales dentro de la región negativa y la corrección de la
superposición espectral.
Se utilizaron los controles FMO (Fluorescence Minus One) para delimitar las regiones negativas
de las positivas para la fluorescencia de interés.
Se evaluó la calibración del citómetro utilizando las perlas “Attune performance tracking
beads” teniendo como resultado la aceptación de la prueba de calibración.
Estrategia de análisis:
Página: 2 de 24
Clave documento:
ENTREGABLES:
- Imágenes de citometría y su evaluación.

- Gráficos de fluorescencia.
- Comentarios sobre los datos obtenidos en los gráficos, la estrategia de análisis y su
relación con las muestras control.
Página: 3 de 24
Clave documento:
RESULTADOS
Tabla 1. Fenotipo antes del cultivo (Dia 0):
% % % % % %
Código Muestras CD73 CD90 CD105 CD44 CD34 CD45
LabNalCit
LNC-190530MSH001 Externa 1 1,12 2,51 0,96 11,5 4,52 5,94
LNC-190530MSH002 Media 1 0,65 1,19 2 10,9 2,45 4,45
LNC-190530MSH003 Cordón 1 0,88 1,66 1,61 18,2 4,75 8,72
LNC-190530MSH004 Externa 2 0,63 1,44 0,26 4,47 1,6 4,34
LNC-190530MSH005 Media 2 1,32 2,69 2,28 9,13 4,07 21,4
LNC-190530MSH006 Cordón 2 1,28 0,65 0,81 9,55 6,54 10,4
LNC-190530MSH007 Externa 3 1,79 2,57 0,58 4,83 4,32 6,91
LNC-190530MSH008 Media 3 1,21 2,28 0,47 2,75 1,91 4,3
LNC-190530MSH009 Cordón 3 2,37 1,11 1,37 21 3,44 15,4
Página: 4 de 24
Clave documento:
Tabla 2: Fenotipo después del cultivo (8 semanas)
% % % % % %
Código LabNalCit Muestras CD73 CD90 CD105 CD44 CD34 CD45
LNC-190530MSH001 Externa 1 99,3 95,2 73,6 99,5 0,42 5,69
LNC-190530MSH002 Media 1 99,3 85 75,8 99,7 0,32 5,77
LNC-190530MSH003 Cordón 1 98,5 89,9 93,4 99,8 0,24 0,65
LNC-190530MSH004 Externa 2 99,6 97,9 63 99,8 0,36 0,79
LNC-190530MSH005 Media 2 99,7 99,3 86,8 99,7 0,34 2,34
LNC-190530MSH006 Cordón 2 71,4 63,3 45,6 57,8 30,6 12,9
LNC-190530MSH007 Externa 3 92,6 85,4 87,4 99,5 1,66 0,37
LNC-190530MSH008 Media 3 65,3 69,2 90,8 91,5 0,094 0,29
LNC-190530MSH009 Cordón 3 95,2 86,7 90,7 99,2 0,61 2,23
Página: 5 de 24
Clave documento:
Tabla 3: Recuento celular después del cultivo
Día de Expansión (x106)

Código LabNalCit Muestras
28 38 45 49 53
LNC-190530MSH001 Externa 1 1,210 22,264 690,184
LNC-190530MSH002 Media 1 0,540 7,844 145,065
LNC-190530MSH003 Cordón 1 1,030 23,896 511,374 9.920,663
LNC-190530MSH004 Externa 2 1,190 25,704 966,470
LNC-190530MSH005 Media 2 0,880 8,272 224,998
LNC-190530MSH006 Cordón 2 0,320 0,224
LNC-190530MSH007 Externa 3 1,390 13,344 136,109 2.286,629
LNC-190530MSH008 Media 3 1,380 15,456 612,058
LNC-190530MSH009 Cordón 3 0,360 1,116
Página: 6 de 24
Clave documento:
Figura 1. Recuento de células de placenta a lo largo del cultivo
Página: 7 de 24
Clave documento:
COMENTARIOS
● Los anticuerpos fueron escogidos siguiendo los criterios de la Sociedad Internacional de

Terapia Celular para la identificación de células madre mesenquimales (CMM) humanas
:
Página: 8 de 24
Clave documento:
➔ ≥ 95% de las CMM deben expresar CD90, CD73, CD105 y CD44 cuando son
analizadas por Citometría de flujo. Además de ser negativas (≤ 2%) para CD34
y CD45.
● Las células fueron marcadas con VivaFix, un marcador de viabilidad que nos permitió
discernir por citometría de Flujo a las células vivas de las muertas, para un análisis más
representativo.
● Las muestras de tejidos placentarios fueron procesadas de tal manera que se pudieron
aislar las células para su posterior tinción con los anticuerpos señalados (Tiempo 0).
Como se observa en la tabla 1, no se puede distinguir señal significante para los tres
marcadores: CD73, CD90 y CD105, que son de los tres mínimos propuestos para la
definición de las células madres mesenquimales, no permitiéndonos definir la presencia
de las células madres mesenquimales (Anexo 1).
● Parte de las células fueron puestas en cultivo con un medio adecuado para su
expansión. Después de varias semanas de cultivo, las células adquirieron una
morfología en forma de huso, fibroblastoide, además de su notable adherencia al
soporte de cultivo (Anexo 2).
● Como se observa en la tabla 2, todos los tejidos de placenta expresan los marcadores
CD73, CD90, CD105 y CD44 característicos para la identificación para las CMM
humanas, además la no expresión de los marcadores CD34 y CD45. Si bien las
muestras placentarias en su mayoría presentan una expresión mayor o cercano al 90%,

estas no llegan a cumplir los criterios establecidos por la Sociedad Internacional de
Terapia Celular (≥ 95% deben expresar CD90, CD73, CD105 y CD44 ).
● Las células de placenta mostraron diferentes capacidades de expansión (Tabla 3, Figura
1), algunos llegando a casi 10,000 x 106 de células después de 53 días de cultivo
(Cordón 1, partiendo de 1x106 células), muchas en promedio a 500x106 después de 49
días de cultivo, y otras que no lograron una expansión eficiente (Cordón 2 y 3).
● Es importante señalar que el tejido que presentó una menor eficiencia de expansión
(Cordón 2) también fue afectada en la expresión de marcadores para mesenquimales,
siendo la menos representativa al porcentaje establecido por la Sociedad Internacional
de Terapia Celular.
Página: 9 de 24
Clave documento:
Analizó y Elaboró: Revisó y Aprobó:
______________________
Dra. Maria Gloria Soldevila Melgarejo
Director/Responsable Técnico
LabNalCit
OBSERVACIONES
-Este informe ampara solo las mediciones realizadas a la muestra recibida y en las condiciones
en las que se recibió.
- El LabNalCit no se hace responsable por los resultados obtenidos, toda vez que los mismos
dependen de la manipulación y tratamiento de la muestra por parte del usuario antes de ser
ingresada al LabNalCit.
- El análisis fue realizado en las instalaciones del Laboratorio Nacional de citometría de flujo.
Página: 10 de 24
Clave documento:
ANEXOS
1. FOTOGRAFÍA CÉLULAS CULTIVO
MEDIA 2 - 13 DÍAS DE CULTIVO
Página: 11 de 24
Clave documento:
MEDIA 2 - 28 DÍAS DE CULTIVO
Página: 12 de 24
Clave documento:
2. CÉLULAS PLACENTA TIEMPO 0
PLACENTA 1
Página: 13 de 24
Clave documento:
PLACENTA 2
Página: 14 de 24
Clave documento:
PLACENTA 3
Página: 15 de 24
Clave documento:
3. CÉLULAS PLACENTA DESPUÉS DEL CULTIVO
PLACENTA 1
Externa 1
Página: 16 de 24
Clave documento:
Media 1
Página: 17 de 24
Clave documento:
Cordón 1
Página: 18 de 24
Clave documento:
PLACENTA 2
Externa 2
Página: 19 de 24
Clave documento:
Media 2
Página: 20 de 24
Clave documento:
Cordón 2
Página: 21 de 24
Clave documento:
PLACENTA 3
Externa 3
Página: 22 de 24
Clave documento:
Media 3
Página: 23 de 24
Clave documento:
Cordón 3
Página: 24 de 24

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

LABORATORIO NACIONAL DE CITOMETRÍA DE FLUJO

NÚMERO DOCUMENTO: LNC-PO02/R01/034

DATOS DEL USUARIO:

Número de solicitud: AT R0025_SD

Código LabNalCit Muestras Observaciones

LNC-190530MSH001 Placenta externa 1 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH002 Placenta media 1 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH003 Cordón 1 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH004 Placenta externa 2 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH005 Placenta media 2 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH006 Cordón 2 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH007 Placenta externa 3 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH008 Placenta media 3 Muestra de tejido placentario

LNC-190530MSH009 Cordón 3 Muestra de tejido placentario

Procedimiento de muestreo y condiciones de almacenamiento:

Observaciones de ingreso de la(s) muestra (s):

MÉTODO DE ANÁLISIS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS

Equipos: Citómetro de flujo Attunne Next.

Materiales de referencia y controles:

- Imágenes de citometría y su evaluación.

Tabla 1. Fenotipo antes del cultivo (Dia 0):

LNC-190530MSH001 Externa 1 1,12 2,51 0,96 11,5 4,52 5,94

LNC-190530MSH002 Media 1 0,65 1,19 2 10,9 2,45 4,45

LNC-190530MSH003 Cordón 1 0,88 1,66 1,61 18,2 4,75 8,72

LNC-190530MSH004 Externa 2 0,63 1,44 0,26 4,47 1,6 4,34

LNC-190530MSH005 Media 2 1,32 2,69 2,28 9,13 4,07 21,4

LNC-190530MSH006 Cordón 2 1,28 0,65 0,81 9,55 6,54 10,4

LNC-190530MSH007 Externa 3 1,79 2,57 0,58 4,83 4,32 6,91

LNC-190530MSH008 Media 3 1,21 2,28 0,47 2,75 1,91 4,3

LNC-190530MSH009 Cordón 3 2,37 1,11 1,37 21 3,44 15,4

Tabla 2: Fenotipo después del cultivo (8 semanas)

LNC-190530MSH001 Externa 1 99,3 95,2 73,6 99,5 0,42 5,69

LNC-190530MSH002 Media 1 99,3 85 75,8 99,7 0,32 5,77

LNC-190530MSH003 Cordón 1 98,5 89,9 93,4 99,8 0,24 0,65

LNC-190530MSH004 Externa 2 99,6 97,9 63 99,8 0,36 0,79

LNC-190530MSH005 Media 2 99,7 99,3 86,8 99,7 0,34 2,34

LNC-190530MSH006 Cordón 2 71,4 63,3 45,6 57,8 30,6 12,9

LNC-190530MSH007 Externa 3 92,6 85,4 87,4 99,5 1,66 0,37

LNC-190530MSH008 Media 3 65,3 69,2 90,8 91,5 0,094 0,29

LNC-190530MSH009 Cordón 3 95,2 86,7 90,7 99,2 0,61 2,23

Tabla 3: Recuento celular después del cultivo

Día de Expansión (x106)

LNC-190530MSH001 Externa 1 1,210 22,264 690,184

LNC-190530MSH002 Media 1 0,540 7,844 145,065

LNC-190530MSH003 Cordón 1 1,030 23,896 511,374 9.920,663

LNC-190530MSH004 Externa 2 1,190 25,704 966,470

LNC-190530MSH005 Media 2 0,880 8,272 224,998

LNC-190530MSH006 Cordón 2 0,320 0,224

LNC-190530MSH007 Externa 3 1,390 13,344 136,109 2.286,629

LNC-190530MSH008 Media 3 1,380 15,456 612,058

LNC-190530MSH009 Cordón 3 0,360 1,116

Figura 1. Recuento de células de placenta a lo largo del cultivo

● Los anticuerpos fueron escogidos siguiendo los criterios de la Sociedad Internacional de

muestras placentarias en su mayoría presentan una expresión mayor o cercano al 90%,

Analizó y Elaboró: Revisó y Aprobó:

1. FOTOGRAFÍA CÉLULAS CULTIVO

MEDIA 2 - 13 DÍAS DE CULTIVO

MEDIA 2 - 28 DÍAS DE CULTIVO

2. CÉLULAS PLACENTA TIEMPO 0