Técnicas de Biología Molecular: Extracción del ADN

1 1 1
Díaz Lima Alonso , Lopez Yepez Francisco , Núñez Meza Ana Sofía , Pacheco Paretto Carlos
1 1
, Román Rubatto Marcela .
1
𝑈𝑛𝑖𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝐶𝑎𝑡ó𝑙𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑆𝑎𝑛𝑡𝑎 𝑀𝑎𝑟í𝑎
I. Resumen
La extracción de ADN de las células humanas necesita primero un tubo con heparina o tubos
anticoagulante (EDTA) para evitar la coagulación de la sangre o muestra que necesitaremos.
Seguidamente se introduce para luego extraer y purificar el ADN con los diferentes buffers
en cada etapa (homeostasis, lisis, precipitación, limpiado y elusión) de procesos y
operaciones. Finalmente se cuantifica el ADN mediante el método del espectrómetro que
consiste en medir la absorción de luz máxima en una onda de 260nm permite medir la
concentración de ácidos nucleicos.

Abstract
DNA extraction from human cells first needs a tube with heparin or anticoagulant (EDTA)
tubes to prevent blood clotting or samples we will need. Next, it is introduced to later extract
and purify the DNA with the different buffers in each stage (homeostasis, lysis, precipitation,
cleaning and elution) of processes and operations. Finally, the DNA is quantified using the
spectrometer method, which consists of measuring the maximum light absorption in a 260 nm
wave, allowing the concentration of nucleic acids to be measured.

II. Introducción primera purificación cruda de ADN.

La extracción del ADN es un proceso Lamentablemente, debido a las malas
crucial para cualquier estudio de biología condiciones de trabajo, Miescher renunció a
molecular, siendo este el punto de partida sus estudios de la nucleína - nombre que le
para el mismo. (Dairawan & Shetty; 2020) dio a su descubrimiento - y continuó con su
Actualmente se sabe la importancia del carrera. (Maderspacher, 2004)
ADN para las diferentes investigaciones, No obstante, alrededor de 80 años más
además de conocer numerosos usos y tarde, en 1953, Watson y Crick descubrieron
aplicaciones que se le puede dar en varios la doble hélice del ADN, desde entonces,
ámbitos de la biotecnología; no obstante los descubrimientos relacionados a la
hace más de 100 años esto aún era algo genética molecular han ido floreciendo.
impensable. (Portin, P; 2013) menciona al
En el año 1869, un jóven médico descubrimiento del mecanismo de
llamado Friedrich Miescher quiso realizar replicación del ADN, al nacimiento de la
una investigación para conocer cuáles eran teoría del código genético, de la tecnología
los componentes básicos de la vida; para lo genética y el análisis bioquímico de genes,
cual utilizó leucocitos y comenzó a como lo más destacado de la investigación
investigar sus proteínas. (Dahm, R; 2005) del ADN.
Sin embargo, se pudo dar cuenta que las Desde ese momento, siempre se
propiedades de estos no coincidían con las recuerda este descubrimiento como el punto
de las proteínas, habiendo obtenido así la de partida para la genética. En la actualidad,
existen una gran variedad de técnicas para la el tubo colector y se puso la columna GD en
extracción del ADN, (Gnat, 2017 et al.) un nuevo tubo colector de 2 ml. Para el paso
mencionan el uso de fenol-cloroformo, de lavado se añadieron 400 uL de buffer W1
CTAB, entre otros kits diferentes como a la columna GD y se centrifugó la muestra
técnicas utilizadas en el análisis molecular a 14-16,000 x g por 30-60 segundos;
de dermatofitos; además su uso se encuentra después de esto se procedió a desechar el
asociado a numerosos ámbitos como el fluido y se colocó nuevamente en la
forense, médico, biotecnológico, columna GD en el uso colector de 2 ml,
farmacéutico, entre otros. luego se le añadió 600 uL de buffer de
Por ello, el objetivo del presente lavado a la columna GD, se centrifugó la
trabajo es conocer las propiedades que muestra por 30-60 segundos a 14-16,000 x
presentan los ácidos nucleicos, así como g; y luego se desechó nuevamente el fluido,
conocer las diferentes técnicas de extracción volvimos a colocar la columna GD de nuevo
del ADN y ponerla en práctica dentro del al tubo colector de 2ml y se centrifugó de
trabajo en el laboratorio. nuevo por 3 minutos a 14-16,000 x g para
secar la matriz de la columna. En el último
III. Metodología paso que es la elución del ADN,
transferimos la columna GD seca a un tubo
La muestra extraída fue colectada en microcentrifugo de 1.5 ml limpio, se le
un tubo anticoagulante, procedimos a la añadió 100 uL de buffer de elusión pre -
preparación de la muestra como primero calentado al centro de la matriz de la
paso: es aquí transferimos 200 uL de sangre columna, lo dejamos por 3 minutos para
a un tubo para microcentrífuga de 1.5 ml, se asegurar que el buffer se absorba y por
colocó 900 uL de buffer de lisis RBC y se último se centrifugó a 14-16,000 x g por 30
mezcló por inversión, después de incubar la segundos.
muestra por 10 minutos se centrifugó el tubo
a 3000 x g y se removió el sobrenadante y IV. Resultados
por último se le añadieron 100 uL de buffer Tabla N° 1
de lisis RBC para re suspender el pellejo y
proceder con la lisis celular. En este segundo N° Concentrac A260/A280
ión (ng/ul)
paso se procede a realizar la lisis celular
añadiendo 200 uL de buffer GB al tubo de 1 16.7 0.756
1.5 mL y se sacudió vigorosamente, se
incubó la muestra por 10 minutos a 60°C 2 34.4 2.091
aquí invertimos el tubo cada 3 minutos, 3 38.4 0.92
posteriormente se le añadieron 5 uL de
RNase A a razón de 10mg/ml y se dejó por 5 4 32.3 1.04
minutos a temperatura ambiente.
5 23.5 1.5
Seguidamente se añadieron 200 uL de etanol
puro y se mezcló inmediatamente por 10 6 16.4 1.22
segundos, se colocó una columna GD en un
7 27.5 1.7
tubo colector de 2 ml, transferimos esto a la
columna de GD y se centrifugó a 14-16,000 8 33.8 0.89
x g por 5 minutos y finalmente descartamos
 caso de la extracción de material genético
En la Tabla N° 1 podemos observar los utilizando fuentes como el cabello y sangre
resultados que varían en la extracción del (Souvik Ghatak et al., 2013), posiblemente
ADN de las muestras correspondientes de debido a esto los kit optan por el uso del
cada grupo de prácticas, las concentraciones sangres ya que al ser un fluido resulta más
varían a partir del procedimiento que se fácil de manejar en cuanto a condiciones
realizó o al tener un error al momento de volumétricas.
realizarse.
VI. Conclusiones
V. Discusión VII. Referencias:
https://academic.oup.com/jambio/artic
En el artículo presentado por Koshy et le-abstract/122/5/1368/6714593?login
al. (2017) menciona como el metodo mas =false
comun para la extraccion del ADN es el
método utilizado en el presente trabajo Guha, P., Das, A., Dutta, S., & Tapas
haciendo uso de kits comerciales de silica, Kumar Chaudhuri. (2018). A rapid
mas este no es el más preciso y limpio
and efficient DNA extraction
puesto que en muchos casos presenta una
contaminación por proteínas que superan a protocol from fresh and frozen
proceso de extracción más específicos human blood samples. Journal of
utilizando solventes, encontrándose en
Clinical Laboratory Analysis, 32(1),
promedio fuera del rango aceptable, de la
misma forma que se pudo apreciar en esta e22181–e22181.
ocasión. https://doi.org/10.1002/jcla.22181
El estudio realizado por Guha et
Souvik Ghatak, Rajendra Bose
al.(2018) demostró como un sistema similar
utilizando un Kit de columna de sílice Muthukumaran, & Nachimuthu
pueden extraer a partir de una muestra de Senthil Kumar. (2013). A Simple
500 uL de sangre una concentración de Method of Genomic DNA Extraction
ADN de 22 ug/L, siendo este muy cercano
al promedio obtenido en la presente from Human Samples for PCR-RFLP
experiencia. Analysis. Journal of Biomolecular
En otros estudios se menciona cómo Techniques, jbt.13-001.
se pueden mejorar los proceso de extracción
https://doi.org/10.7171/jbt.13-2404-0
de ADN por medio del uso de solvente
siendo metodología más baratas y más 01
rápidas que el uso de kits comerciales. Hue, N. T., Chan, N. D. H., Phong, P. T.,
posiblemente debido a la reducción de
Linh, N. T. T., & Giang, N. D.
pasos(Hue, N et al., 2012), utilizando un
lizante para una posterior extracción de (2012). Extraction of human
líquido- líquido. genomic DNA from dried blood
La extracción del ADN haciendo uso
spots and hair roots. International
de saliva y otros fluidos corporales a
demostrado no ser tan efectiva como para el
 Journal of Bioscience, Biochemistry Mariyam Dairawan Preetha J Shetty, The
and Bioinformatics, 2(1), 21. Evolution of DNA Extraction
Methods. 2020 - 8(1).
‌Koshy, L. V., Anju, A. L., Sivadasanpillai
AJBSR.MS.ID.001234.
Harikrishnan, V. Ramankutty, Jissa, http://vienloci.org.vn/uploads/vienloci/202
V. T., Irin Kurikesu, Parvathy 1/07/The-Evolution-of-DNA-Extractio
n-Methods.pdf
Jayachandran, A. Sreekumaran Nair,
A. Gangaprasad, Nair, G. M., & VIII. Anexos
Sudhakaran, P. R. (2017). Evaluating
A. Elaborar un cuadro donde estén
genomic DNA extraction methods
indicados los métodos que se
from human whole blood using utilizan para la extracción de
endpoint and real-time PCR assays. ADN, ARN (ácidos nucleicos) y
Molecular Biology Reports, 44(1), proteínas. A continuación,
explique el fundamento de cada
97–108.
uno de los métodos y la
https://doi.org/10.1007/s11033-016-4 metodología empleada.
085-9

Dahm, R. (2005). Friedrich Miescher and

the discovery of DNA.
Developmental Biology, 278(2),
274–288.
https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2004.
11.028
Florian Maderspacher. (2004). Rags before
the riches: Friedrich Miescher and
the discovery of DNA. Current
Biology, 14(15), R608–R608.
https://doi.org/10.1016/j.cub.2004.07
.039

‌PORTIN, P. The birth and development of

the DNA theory of inheritance: sixty
years since the discovery of the
structure of DNA. J Genet 93,
293–302 (2014).
https://ezproxy.ucsm.edu.pe:2089/10.
1007/s12041-014-0337-4
 ARN (para muestras vegetales,
animales y humanos)

B. Determinar la concentración y
calidad del ADN.

Para determinar la concentración del ADN

no basamos en un análisis químicos
espectrofotométrico, en el cual se toma
como base la ley de Beer-Lambert la cual
nos menciona que que la concentración de
una sustancia en solución es equivalente as
su nivel de absorbancia de luz multiplicado
por una constante y por la distancia
recorrida por la celda, el valor de la
constante para el caso del ADN es
50ug/abs.cm. y la longitud de onda en la que
se lo debe medir es de 260 nm debido a que
en este punto la absorbancia es máxima.

Para determinar la pureza del ADN se

realiza una segunda medición, pero en este
caso a un valor mayor de 280 nm, siendo
esta la absorbancia máxima de las proteínas
y otros grupos fenólicos teniendo ambas
absorbancias, se realiza una división en la
cual entre la absorbancia de 260 y la de 280,
si el valor de resulta ser menor a 1.7
significa contaminación por grupos
proteicos , por otro lado valores superiores
a 2.0 demuestran contaminación por grupos
funcionales OH (Banco Adn, 2020)

C. Elaborar un protocolo de
extracción de ADN y otro para
 sílice la cual por su carga nativa tiene la
capacidad de retener el ADN en su
superficie, y separarlo del demás
sobrenadante por centrifugación (Nodarse et
al., 2023).

Método Fenol Cloroformo: El fenol

cloroformo es un disolvente orgánico que
tiene afinidad por las proteínas a diferencia
del ADN por lo sirve con un ciclo del lavado
antes de la adición de algún agente
precipitante o fijador de ADN (Nodarse et
al., 2023).

E. Mencione las diferencias entre

detergentes iónicos y no iónicos.
Cite 3 ejemplos:

De acuerdo a Ríos (2010), estas son

las diferencias:

- Detergentes iónicos: estos están

D. Investigar y explicar cuáles son las compuestos por grupos funcionales
técnicas que se emplean para la que se ionizan en disolución acuosa
purificación de ADN. y originan iones orgánicos con carga
Método clásico: Se utiliza algún agente negativa y a su vez son responsables
lisante para la ruptura del pared celular y de la actividad superficial;
liberación del material genético, comúnmente contienen grupos
posteriormente se añade una agente solubles, sulfatos y sulfonatos de
precipitante de proteínas por sodio. Estos se utilizan porque
desnaturalización, para permitir la presentan un gran poder espumoso;
permanencia del ADN en fase acuosa, se usan en detergentes para la ropa y
finalmente se añade algún disolvente que productos de limpieza. Algunos
extrae el material genético de forma ejemplos son los siguientes:
selectiva para su uso (Nodarse et al., 2023). - Dodecilsulfato sódico o
laurel sódico:
Método por columna de fijación: - Dodecilsulfato de amonio:
Primeramente se realiza la lisis celular para - Dodecilbencenosulfonato de
posteriormente se centrifuga la solución para sodio
recuperar el material genético, este paso por - Detergentes no iónicos: algunos de
una fase de lavado con un detergente que estos son productos de condensación
disuelve las proteínas y las desnaturaliza, del óxido de etileno con materiales
esta mezcla se coloca en una columna de fenólicos o grasos, en disolución
 acuosa no originan iones y poseen Los marcadores de peso molecular de
grupos funcionales con elevada proteínas suelen presentar un peso molecular
afinidad en el agua, corresponden a conocido; pueden estar teñidas o coloreadas
la clase más importante por su buena e ir desde 10 hasta 300 kDa.
tolerancia cutánea, estos hacen
menos espuma que los demás por lo Figura N°1.
que se los utiliza en la industria textil
y como etología por su poder
emulsionante. Algunos ejemplos son
los siguientes:
- Alquil Glucósidos
- Alcanolaminas
- Alcoholes etoxilados

F. Describa el papel que desempeña

el EDTA en los procesos de
extracción de DNA.
El EDTA es el Ácido
Etilendiaminotetraacético: este
compuesto una vez el ADN se libera
del núcleo y queda expuesto a las
enzimas DNAsas de la célula que
degradan el ADN, actúa para evitar
la degradación actuando como
agente quebrante que atrapa los iones
Estos marcadores están disponibles
Mg2+ usados por las DNAsas como
en el mercado y cuentan con una
cofactores. (Cadavid & Gómez)
gran variedad, por lo que el
procedimiento para su uso varía
G. Describa el procedimiento de
dependiendo del manual de usuario.
cuantificación del DNA utilizando
Tomando como ejemplo al “Thermo
marcadores de Peso molecular
Scientific™ Estándar de proteínas
Los marcadores de peso molecular son
preteñidas PageRuler™ Plus, de 10
moléculas de ADN, las cuales van a permitir
a 250 kDa”; al observar el manual,
determinar el tamaño de los fragmentos de
menciona que primero se debe
ácidos nucleicos, por comparación, en
descongelar la escalera a temperatura
aquellas muestras que se hayan sometido a
ambiente o en un intervalo de 37-40
electroforesis.
°C durante unos minutos, de manera
En la Figura NX, se pueden observar las
que se puedan disolver los sólidos
bandas que se obtienen a partir de los
precipitados; sin llegar a hervirla.
fragmentos, utilizando un marcador de uso
Luego se debe mezclar de manera
común, para este caso se trata del fago Phi
que la solución sea homogénea y
X174/Hae III y una escalera denominada 1
finalmente se debe añadir los geles,
Kbase plus ladder.
 considerando su volumen adecuado y al laboratorio;; integración de
espesor. procedimientos para el estudio
de moscas. Pp 93-97.
IX. Referencias:
Alonso, C. D., Santana, H. G., Vigil, González, N., Rodríguez, N., Torres,
A. M. A., González, Y. S., W., & O'Callaghan, J. (2011).
Martínez, L. F., & Moleón, V. Protocolo sencillo para la
R. (2015). Nuevos métodos de extracción de adn genómico de
extracción de ácidos tejido de oreja del ratón y la
ribonucleicos (ARN): rata, usando la enzima
herramientas básicas en la bromelina. Revista Científica,
biología molecular. Revista 21(3), 233-238.
Cubana de Hematología, Ríos Ruiz, F. (2010). Comportamiento
Inmunología y Hemoterapia, ambiental de tensioactivos
31(4), 466-469. comerciales aniónicos y no
Access Medicina. (2013). Extracción iónicos.
de ácidos nucleicos | Biología Nodarse, F., Rodríguez, J., Fuentes,
molecular. Fundamentos y O., Castex, M., &
aplicaciones en las ciencias de Fernández-Calienes, A. (2023).
la salud | AccessMedicina | Comparación entre 5 métodos
McGraw Hill Medical. para la extracción de ADN de
Bancoadn. (2020). PROGRAMA Triatomíneos: su utilización en
CONTROL DE CALIDAD DE la técnica de ADN polimórfico
MUESTRAS DE ADN Y ARN amplificado al azar (RAPD).
PROGRAMA DE CONTROL Revista Cubana de Medicina
DE CALIDAD DE Tropical, 56(3), 203–207.
MUESTRAS DE ADN Y ARN. http://scielo.sld.cu/scielo.php?sc
https://www.bancoadn.org/docs/ ript=sci_arttext&pid=S0375-07
formulario-control-calidad-mue 602004000300010
stras.pdf Mazo Molina, L. C. (2011).
Cadavid & Gomez (S.f) Preparación Evaluación y comparación de 3
de solución de lisis para protocolos de extracción y
extracción de SDN descrito por amplificación del adn contenido
Collins et al (1987). Del campo en exsicados de orquídeas
 conservadas en colecciones de
herbario.
Mhmedical.com. ‌
https://accessmedicina.mhmedic
al.com/content.aspx?bookid=14
73&sectionid=102743658#1118
679548 ‌

Michel-López, C. Y.,
González-Mendoza, D.,
Zapata-Pérez, O., Rubio-Piña,
‌
J., Cervantes-Díaz, L., &
Bermúdez-Guzmán, M. D. J.
(2018). Evaluación de tres
protocolos para la extracción
‌
rápida de ARN total de tejidos
de Prosopis juliflora (SW).
Revista mexicana de ciencias
agrícolas, 9(6), 1259-1267.
Shliesinger, R. (2021, August 23).
¿Cómo encontrar un método de
extracción de ARN que funcione
para tu laboratorio?
AllScience; AllScience.
https://www.e-allscience.com/bl
ogs/articulos/como-encontrar-u
n-metodo-de-extraccion-de-arn-
que-funcione-para-tu-laboratori
o
Merck. (2016). Lisis y extracción de
proteínas. Sigmaaldrich.com.
https://doi.org/dogri