Tesis Rebeca Díez Antolínez

TESIS DOCTORAL:
PRODUCCIÓN ECO-SOSTENIBLE DE
BIOCARBURANTES A PARTIR DE SUERO
LÁCTEO
“Eco-sustainable production of biofuels from cheese whey”
Programa de Doctorado: “Ingeniería de Producción y Computación”
Directoras: Tesis Presentada por:

Rebeca Díez Antolínez
Xiomar Arleth Gómez Barrios
para optar al grado de Doctor
María Hijosa Valsero
Agradecimientos
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que de un modo u
otro han colaborado en el desarrollo de este trabajo.
En especial a mis directoras de tesis, sin ellas no hubiese sido posible. A María darle las gracias
por su orientación y supervisión continua, por enseñarme a dar carácter científico a mis ideas y
por el apoyo que siempre he recibido por su parte. A Xiomar agradecerle enormemente que
aceptase ser tutora y directora de este trabajo, por su ayuda constante, su aliento y supervisión.
Asimismo, quisiera agradecer a Antonio Morán las facilidades que siempre me ha puesto como
director del programa de doctorado, y lo fácil que es colaborar con él.
Quiero agradecer de un modo muy especial toda la ayuda que he recibido siempre de mis
compañeros del Centro de Biocombustibles y Bioproductos del Instituto Tecnológico Agrario de
Castilla y León, Ana, Raquel, Nuria, Gerardo y Jerson. Sin ellos tampoco hubiese sido posible.
Deseo dar las gracias al Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León por permitirme realizar
mi tesis doctoral.
También quiero dar las gracias a Óscar Esteban de Queserías Entrepinares SAU y a Noelia Puebla
de Quesería Artesanal del Río Carrión S.L., por su amabilidad y disposición a ayudarme, siempre
que ha sido necesario.
Por último, quiero agradecer a mi familia su apoyo incondicional, su paciencia y comprensión

durante todo este tiempo.
Muchas gracias a todos.

Tabla de Contenidos
Índice General
Índice General ................................................................................................................................ I
Índice de Tablas ............................................................................................................................ IX
Índice de Figuras........................................................................................................................... XI
Resumen ..................................................................................................................................... XIV
Abstract ..................................................................................................................................... XVII
Abreviaturas / Abbreviations ..................................................................................................... XXI
1. Introducción y Antecedentes ................................................................................................ 1
1.1. Biocarburantes .................................................................................................................. 3
1.2. Suero lácteo....................................................................................................................... 5
1.3. Valorización del suero lácteo ............................................................................................ 7
1.4. Aplicaciones biotecnológicas del suero lácteo y el permeado de suero........................... 8
1.5. Fermentación de lactosa a etanol ..................................................................................... 9
1.5.1. Bioquímica de la fermentación alcohólica .................................................................. 12
1.5.2. Fermentación de alta o muy alta densidad ................................................................. 15
1.6. Fermentación Acetona-Butanol-Etanol (ABE) ................................................................. 16
1.6.1. Bioquímica de la fermentación ABE ............................................................................ 18
1.6.2. Microorganismos......................................................................................................... 21
1.6.3. Sustratos...................................................................................................................... 21
1.7. Configuración de fermentación....................................................................................... 24
1.7.1. Fermentación discontinua o “por lotes” ..................................................................... 25
I
1.7.2. Fermentación semi-continua o “fed-batch” ............................................................... 26
1.7.3. Fermentación continua ............................................................................................... 27
1.7.3.1. Bioprocesos continuos con inmovilización celular .................................................. 29
1.8. Recuperación de solventes ............................................................................................. 34
1.8.1. Destilación ................................................................................................................... 35
1.8.2. Arrastre de vapor o gas-stripping................................................................................ 36
1.8.3. Extracción Líquido-Líquido (L-L) .................................................................................. 39
1.8.4. Pervaporación ............................................................................................................. 40
1.8.5. Perstracción ................................................................................................................. 42
1.8.6. Adsorción..................................................................................................................... 43
Referencias .................................................................................................................................. 45
2. Objetivos y Estructura ......................................................................................................... 65
2.1. Objetivos ......................................................................................................................... 67
2.1.1. Objetivos específicos ................................................................................................... 67
2.2. Estructura de la tesis ....................................................................................................... 68
3. Materiales y Métodos ......................................................................................................... 71
3.1. Suero lácteo..................................................................................................................... 73
3.2. Microorganismos y condiciones de cultivo ..................................................................... 75
3.3. Pretratamiento del lactosuero ........................................................................................ 78
3.4. Descripción de los sistemas de fermentación ................................................................. 78
3.4.1. Fermentación discontinua o por lotes ........................................................................ 78
3.4.1.1. Etanol....................................................................................................................... 78
II
3.4.1.2. Butanol .................................................................................................................... 80
3.4.2. Fermentación continua. Inmovilización celular .......................................................... 82
3.4.2.1. Inmovilización por atrapamiento en geles de alginato cálcico ............................... 82
3.4.2.2. Inmovilización por adsorción .................................................................................. 83
3.5. Recuperación de solventes ............................................................................................. 85
3.5.1. Optimización del gas-stripping .................................................................................... 85
3.5.2. Gas-stripping en dos etapas ........................................................................................ 87
3.5.3. Fermentación semicontinua con recuperación de solventes in situ mediante gas-

stripping 87
3.6. Métodos de Análisis ........................................................................................................ 88
3.6.1. Determinación de metabolitos principales y secundarios .......................................... 88
3.6.2. Determinación del crecimiento celular ....................................................................... 89
3.6.3. Determinación de aniones y cationes ......................................................................... 89
3.6.4. Determinación de proteína ......................................................................................... 90
3.6.5. Caracterización morfológica........................................................................................ 91
3.7. Parámetros de seguimiento y control de las fermentaciones ........................................ 92
3.8. Análisis estadístico .......................................................................................................... 93
Referencias .................................................................................................................................. 94
4. Very high gravity fermentation of non-supplemented cheese whey permeate (CWP) by

immobilized Kluyveromyces marxianus ...................................................................................... 95
4.1. Introduction..................................................................................................................... 98
4.2. Material and methods ..................................................................................................... 99
4.2.1. Microorganisms and culture conditions...................................................................... 99
III
4.2.2. Cell immobilization .................................................................................................... 100
4.2.3. Cheese whey and fermentation media ..................................................................... 100
4.2.4. Analytical methods .................................................................................................... 100
4.2.5. Statistical analysis...................................................................................................... 101
4.2.6. Experimental design .................................................................................................. 101
4.3. Results and discussion ................................................................................................... 101
4.3.1. Effect of temperature and initial pH ......................................................................... 101
4.3.2. Effect of substrate concentration ............................................................................. 102
4.3.3. Response surface (RSM) analysis for the optimization of immobilization parameters ..
................................................................................................................................... 104
4.3.4. Repeated batch fermentation ................................................................................... 106
4.3.5. Conclusions................................................................................................................ 107
Acknowledgments ..................................................................................................................... 107
References................................................................................................................................. 108
Anexo 4.1................................................................................................................................... 110
5. Yeast screening and cell immobilization on inert supports for ethanol production from
cheese whey permeate with high lactose loads ....................................................................... 111
5.1. Introduction................................................................................................................... 114
5.2. Material and methods ................................................................................................... 117
5.2.1. Raw Material ............................................................................................................. 117
5.2.2. Yeast strains and culture conditions ......................................................................... 117
5.2.3. Kluyveromyces strains and fermentation media comparison .................................. 118
5.2.4. Saccharomyces strains and lactose whey permeate hydrolysis optimization .......... 119
IV
5.2.5. Optimization of fermentation conditions ................................................................. 120
5.2.6. Comparison of immobilization supports ................................................................... 120
5.2.7. Chemical analyses of fermented broths ................................................................... 121
5.2.8. Statistical analyses..................................................................................................... 122
5.3. Results and Discussion .................................................................................................. 123
5.3.1. Kluyveromyces marxianus strains and fermentation media comparison ................. 123
5.3.2. Saccharomyces cerevisiae strains and fermentation media comparison ................. 125
5.3.3. Optimization of fermentation conditions ................................................................. 126
5.3.3.1. Kluyveromyces marxianus strain ........................................................................... 126
5.3.3.2. Saccharomyces cerevisiae strain ........................................................................... 128
5.3.4. Comparison of immobilization supports ................................................................... 130
5.4. Conclusions.................................................................................................................... 134
Acknowledgements ................................................................................................................... 134
Bibliography .............................................................................................................................. 135
Supplementary Material (SM) ................................................................................................... 140
Anexo 5.1................................................................................................................................... 146
6. Effect of Nutrient Supplementation on Biobutanol Production from Cheese Whey by

Acetone–Butanol–Ethanol Fermentation ................................................................................. 149
6.1. Introduction................................................................................................................... 152
6.2. Material and Methods................................................................................................... 153
6.2.1. Microorganisms and culture conditions.................................................................... 153
6.2.2. Cheese whey and fermentation media ..................................................................... 154
V
6.3.1. Optimization of nutrient supplements in cheese whey ............................................ 156
6.3.2. Effect of initial lactose concentration on YB/L yield and lactose consumption .......... 159
6.4. Conclusions.................................................................................................................... 161
Acknowledgements ................................................................................................................... 161
References................................................................................................................................. 161
7. In situ two-stage gas stripping for the recovery of Butanol from Acetone-Butanol-Ethanol
(ABE) fermentation broths ........................................................................................................ 165
7.1. Introduction................................................................................................................... 169
7.2. Material and Methods................................................................................................... 170
7.2.1. Media and culture ..................................................................................................... 170
7.2.2. Gas-stripping optimization ........................................................................................ 170
7.2.3. Two-stage gas-stripping ............................................................................................ 172
7.2.4. Fed-batch fermentation system coupled with gas-stripping .................................... 172
7.3.1. Gas stripping optimization ........................................................................................ 173
7.3.2. Two-stage gas stripping............................................................................................. 174
7.4. Conclusions.................................................................................................................... 177
VI
Acknowledgments ..................................................................................................................... 178
References................................................................................................................................. 178
8. Conclusiones/ Conclusions ................................................................................................ 181
9. Anexos ............................................................................................................................... 189
Anexo I. Estequiometría de las fermentaciones alcohólica y ABE ............................................ 191
Anexo II. Diseño Experimental .................................................................................................. 193
Metodología de Superficie de Respuesta ................................................................................. 193
Diseños de Plackett-Burman ..................................................................................................... 195
Anexo III. Otras publicaciones científicas .................................................................................. 197
VII
Índice de Tablas
Tabla 1.1. Comparación de propiedades de distintos carburantes líquidos. ................................ 5
Tabla 1.2. Recopilación bibliográfica de obtención de etanol en procesos con inmovilización

celular .......................................................................................................................................... 32
Tabla 1.3. Recopilación bibliográfica de obtención de butanol en procesos con inmovilización

celular .......................................................................................................................................... 33
Tabla 3.1. Características químicas de los sueros utilizados como sustrato ............................... 74
Tabla 4.1. Fermentation results for T and pH0 evaluation (L0 = 120 g/L, time = 44 h). ............ 102
Tabla 4.2. Experimental central composite design (CCD) runs and responses. ........................ 104
Tabla 4.3. Analysis of variance- ANOVA- of the predicted models for Ef and (ΔL) responses .. 105
Tabla 5.1. Fermentation performance of S. cerevisiae CECT 1383, Ethanol Red ®, CECT 13152 and
Hércules in hydrolyzed CWP (Li = 140 g/L). Parameters: final ethanol concentration (Ef), sugar
consumption (ΔL), ethanol yield factor (YE/S), ethanol profit factor (πE), productivity (WE) and
ethanol yield conversion efficiency (ηE). ................................................................................... 126
Tabla 5.2. Experimental results of ethanol concentration (Ef), ethanol yield factor (YE/L), ethanol
profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE) according to a central composite
design employing K. marxianus DSM 5422 for the fermentation of CWP (Li = 132.5 g/L). ...... 127
Tabla 5.3.Experimental results of ethanol concentration (Ef), ethanol yield factor (YE/L), ethanol
profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE) according to a central composite
design employing S. cerevisiae Ethanol Red® for the fermentation of hydrolyzed CWP (Li = 132.5
g/L). ........................................................................................................................................... 129
Tabla 5.4. Comparison of mean fermentation parameters: Ethanol final concentration (Ef),
ethanol yield factor (YE/L), ethanol yield conversion efficiency (ηE), lactose consumption (ΔL),
ethanol profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE) for K. marxianus DSM 5422
during the 14 cycles employing CWP with lactose loads of 130 g/L and 170 g/L for glass Raschig
rings (GRR) and alumina beads (AB) supports. ......................................................................... 134
Tabla 6.1. Composition of the nanofiltered sheep cheese whey employed in the experiments.
................................................................................................................................................... 154
IX
Tabla 6.2. Independent variables included in the Plackett-Burman experimental design with their
respective minimum and maximum values, and effects of each independent variable on the
three response variables.. ......................................................................................................... 157
Tabla 6.3. Conditions of the RSM experiment. In the case of the RSM variables, axial values are
indicated. ................................................................................................................................... 158
Tabla 6.4. Fermentation results for different initial lactose concentrations. ........................... 160
Tabla 7.1. Gas stripping performance indicators for a synthetic aqueous medium (5 g/L A; 10 g/L
B; 1.67 g/L E) under optimal RSM conditions. Operation conditions: T feed = 60 °C, Gas flow =
1.34 L/min, T refrigeration = 5 °C. A: Acetone, B: Butanol, E: Ethanol. .................................... 174
Tabla 7.2. Gas stripping performance indicators for the fermentation broth (cheese whey with
C. beijerinckii CECT 508). Stripping conditions T feed = 60 °C, Gas flow = 1.34 L/min, T
refrigeration = 5 °C, t = 4 h. Initial concentrations (1st stripping): 3,02 g/L A; 12,04 g/L B; 0,23 g/L
E. Initial concentrations (2nd stripping): 4,71 g/L A; 9,63 g/L B; 0,29 g/L E. A: Acetone, B: Butanol;
E:Ethanol. .................................................................................................................................. 176
X
Índice de Figuras
Figura 1.1. Esquema de valorización fraccionada e integral de suero lácteo ............................... 7
Figura 1.2. Ruta metabólica de fermentación de lactosa a etanol ............................................. 13
Figura 1.3. Ciclo de vida de Clostridum spp. ............................................................................... 18
Figura 1.4. Rutas metabólicas de la lactosa en Clostridium spp. (en el interior de las cajas se
muestran los compuestos extracelulares) .................................................................................. 20
Figura 1.5. Esquemas de configuraciones de fermentación: A) Discontinuo, B) Semicontinuo, C)

Continuo. ..................................................................................................................................... 25
Figura 1.6.Etapas de desarrollo de una película de biofilm ........................................................ 31
Figura 1.7. Esquema de la recuperación de solventes por gas-stripping .................................... 37
Figura 1.8. Esquema de la recuperación de solventes por extracción Líquido-Líquido ............. 40
Figura 1.9. Esquema de la recuperación de solventes por pervaporación ................................. 41
Figura 1.10. Esquema de la recuperación de solventes por adsorción, incluyendo tanto el ciclo
de carga como el de regeneración. ............................................................................................. 44
Figura 2.1. Esquema de la estructura desarrollada..................................................................... 70
Figura 3.1. Muestras de suero lácteo utilizados durante el proceso experimental: a) Suero 1
(suero ultrafiltrado) y b) Suero 2 (suero nanofiltrado). .............................................................. 73
Figura 3.2.Unidad experimental de filtración.de placas LabStak® M20 (Alfa Laval, Suiza) ........ 74
Figura 3.3. Imágenes de los microorganismos en microscopía de contraste de fases a 400X a)

Kluyveromyces marxianus DSMZ 7239; b) Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red®; c) Clostridium
beijerinckii CECT 508, en sustrato de lactosuero. ....................................................................... 77
Figura 3.4.Proceso de producción de etanol mediante fermentación de suero lácteo utilizando

la levadura Kluyveromyces marxianus. a) Placa de cultivo puro de klumveromyces marxianus; b)
Proceso de inoculación del microorganismo en el medio de fermentación; c) Fermentación de
las muestras en el incubador con agitación orbital; d) Aspecto de la muestra tras finalizar la
fermentación alcohólica. ............................................................................................................. 79
Figura 3.5.Proceso de producción de butanol a partir de suero lácteo por fermentación ABE con
C. beijerinckii CECT 508. a) Carrusel de fermentación con control de pH automático; b) Cabina de
XI
anaerobiosis; c) Reactor de fermentación pre (1) y post (2) fermentación y d) Cabina de
incubación con agitación controlada. ......................................................................................... 81
Figura 3.6. Biorreactor Biostat B® de 2 L (Sartorious, Alemania) con Micro-DCU (Braun,

Alemania). ................................................................................................................................... 81
Figura 3.7. Imágenes de la inmovilización de células de K. marxianus DSM 5422 por atrapamiento
en geles de alginato: a) Instalación utilizada para la fabricación de los geles de alginato; b) Detalle
de las esferas de alginato. ........................................................................................................... 83
Figura 3.8. Soportes inertes utilizados en la inmovilización celular. De izquierda a derecha: a)

Anillos Raschig de plástico; b) Anillos Raschig de Tygon; c) Anillos Raschig de vidrio y d) Esferas
de alúmina. .................................................................................................................................. 84
Figura 3.9. Configuración del sistema de extracción de gas utilizado en los experimentos: a)
Diagrama del sistema; b) fotografía del montaje de gas stripping. ............................................ 86
Figura 3.10. Microscopio Electrónico de Barrido Jeol LV 6100okio, Japón)................................ 92
Figura 4.1. Effect of CWP lactose content on Ef, ΔL, η and WE variables. ................................. 103
Figura 4.2.Kinetic fermentation parmeters (Ef, ∆L, η and WE) at the end of each cycle. .......... 106
Figura 5.1. Fermentation performance of K. marxianus DSM 7239, DSM 5418, DSM 5422 and
DSM 70799 in concentrated synthetic medium (Li = 130 g/L). Parameters: final ethanol
concentration, ethanol yield conversion efficiency (ηE), lactose consumption (ΔL) and
productivity (WE). ...................................................................................................................... 123
Figura 5.2. Evaluation of the effect of different combinations of nutrients on alcoholic

fermentation performance. Response variables: Ethanol final concentration (Ef), ethanol yield
conversion efficiency (ηE), lactose consumption (ΔL) and productivity (WE) of K. marxianus 5422
employing concentrated CWP (Li = 130 g/L). ............................................................................ 125
Figura 5.3. Evolution of ethanol concentration during ethanol fermentation for inorganic
supports [glass Raschig rings (GRR), plastic Raschig rings (PRR), tygon Raschig rings (TRR) and
alumina beads (AB)] during 7 fermentation cycles (Li = 130 g/L) employing K. marxianus DSM
5422........................................................................................................................................... 131
Figura 5.4. Evolution of ethanol concentration employing K. marxianus DSM 5422 on inorganic
supports [glass Raschig rings (GRR) and alumina beads (AB)] during 14 fermentation cycles (Li=
130 g/L). .................................................................................................................................... 132
XII
Figura 5.5. Evolution of ethanol concentration employing K. marxianus DSM 5422 on inorganic
supports [glass Raschig rings (GRR) and alumina beads (AB)] during 14 fermentation cycles (Li=
170 g/L). .................................................................................................................................... 132
Figura 6.1. Contour plots for butanol production in the RSM experimental design................. 158
Figura 7.1. Setup diagram of the gas stripping system used in the experiments ..................... 171
Figura 7.2. a) Dynamic evolution of ABE solvent concentration in the condensate during second-
stage gas stripping; b) Dynamic evolution of ABE solvents recovery during second-stage gas
stripping. ................................................................................................................................... 175
Figura 7.3. Evolution of ABE fermentation by C. beijerinckii in a fed-batch system with cheese
whey during two gas stripping/resting cycles. Stripping conditions T feed = 60 °C, Gas flow = 1.34
L/min, T refr = 5 °C, t = 4 h. ....................................................................................................... 177
XIII
Resumen
El suero lácteo, principal subproducto del procesado de leche y queso, supone un gran
desafío para el sector lácteo, tanto por los elevados volúmenes generados, como por su
elevada carga orgánica. A este desafío en su gestión debe sumarse una legislación
medioambiental cada vez más restrictiva para su disposición final.
El lactosuero es una importante fuente de nutrientes, fundamentalmente lactosa y

proteínas. Una parte de estos nutrientes, como son las proteínas lácteas, son recuperadas
y reincorporadas nuevamente a la cadena alimentaria. Sin embargo, alrededor de la mitad
del suero generado no es valorizado y es gestionado por las industrias lácteas como un
residuo. Asimismo, durante el proceso de recuperación de las proteínas lácteas se
generan como subproducto elevados volúmenes de permeado de suero, corriente
residual que conserva la mayoría de los sólidos, fundamentalmente lactosa, generando
su vertido un problema similar al del lactosuero, tanto por la magnitud del volumen como
por su carga contaminante. El ineficiente aprovechamiento de estos recursos tiene graves
implicaciones medioambientales, económicas y de sostenibilidad.
La obtención de bioalcoholes oxigenados, como el etanol y el butanol, mediante procesos

fermentativos de bioconversión de la lactosa presente en el lactosuero y en el permeado
de suero, puede ser una interesante alternativa para la valorización de este subproducto.
Sin embargo, para garantizar la viabilidad comercial de estos procesos es imprescindible
mejorar el rendimiento y la productividad de las fermentaciones. Es esencial aumentar la
concentración final de solventes en el caldo de fermentación para reducir los elevados
costes de recuperación. Para ello, se debe mejorar la osmotolerancia de los
microorganismos tanto a sustratos como a productos, así como plantear estrategias de
recuperación in situ de los solventes generados. También es necesario trabajar en la
reducción de los tiempos de fermentación para aumentar la productividad y la viabilidad
económica global del proceso.
Esta tesis doctoral se ha centrado en la mejora de las tecnologías de fermentación para la

obtención de bioalcoholes, concretamente etanol y butanol, para su uso como
biocarburantes, a partir de lactosuero y de permeado de suero. A través de la
optimización de las condiciones de fermentación, se trató de aumentar el rendimiento y
XIV
la productividad del proceso. Para ello, se emplearon tecnologías eficientes de
fermentación como son las fermentaciones a alta densidad (conocidas por sus siglas en
inglés, VHG, Very High Gravity) combinadas con inmovilización celular mediante
atrapamiento en esferas de alginato y adsorción sobre soportes inertes. Además, se han
planteado estrategias de recuperación in situ de solventes como el arrastre de vapor o
gas stripping, en una o dos etapas, para mejorar el consumo energético del proceso de
recuperación y purificación, incidiendo positivamente en la viabilidad global.
Inicialmente, se evaluó el efecto de la temperatura y el pH en el desarrollo de la

fermentación alcohólica utilizando levaduras de la especie Kluyveromyces marxianus,
tanto libres como inmovilizadas por atrapamiento en esferas de alginato. Además, se
determinó que la concentración límite de lactosa en el permeado de suero que permite
evitar problemas de inhibición por sustrato está en torno a 170 – 190 g/L, alcanzando
rendimientos de fermentación del 95,5% y productividades de 1,8 g/L·h. Finalmente, se
optimizaron los parámetros más influyentes en la formación de los geles de alginato
(concentración de alginato, carga celular y tamaño de la esfera) mediante diseño
experimental por Metodología de Superficie de Respuesta (MSR), validándose la
estabilidad de las esferas y los rendimientos de producción de etanol durante 6 ciclos, con
producciones medias de etanol de 8,3% (v/v), una productividad de 1,6 g/L·h y una
eficiencia de fermentación del 83%.
Posteriormente, se comparó la capacidad fermentativa de cuatro cepas de levadura de la

especie K. marxianus y cuatro cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae para producir
etanol. Se optimizaron las condiciones de operación (temperatura, pH y tiempo) con un
diseño experimental por MSR para una cepa seleccionada de cada una de las dos especies.
Con la cepa K. marxianus DSM 5422 en condiciones optimizadas, se obtuvo una
concentración de etanol del 6% (v/v) en sólo 44 horas de fermentación, utilizando como
sustrato permeado de suero con una elevada concentración inicial de lactosa (Li = 130 g/L)
en procesos descontinuos. En una siguiente etapa, la cepa fue inmovilizada por adsorción
en cuatro soportes inertes de bajo coste (anillos Raschig de vidrio, plástico y silicona
Tygon®, y esferas de alúmina) para evaluar su comportamiento a lo largo del tiempo. La
inmovilización de la levadura en anillos Raschig de vidrio y perlas de alúmina ofreció el
XV
comportamiento más estable a lo largo del tiempo, con rendimientos medios de etanol
del 6% (v/v) en un régimen continuo durante más de 40 días (1.000 horas).
De un modo similar a como se hizo con la fermentación alcohólica, mediante diseño

experimental de Plackett-Burman y MSR, se determinaron los nutrientes esenciales para
la obtención de butanol con la cepa Clostridium beijerinckii CECT 508, optimizando sus
concentraciones. En este trabajo se alcanzaron rendimientos de fermentación cercanos
al teórico, trabajando con suero lácteo de oveja con una concentración inicial de lactosa
de 40 g/L, llegando a concentraciones de butanol en el caldo de 8,9 g/L.
Finalmente, se evaluó un proceso de fermentación ABE con recuperación in situ de

butanol mediante arrastre de vapor o gas-stripping en una y dos etapas consecutivas. Se
ha realizado una optimización de las condiciones de operación mediante MSR. Utilizando
una recuperación por arrastre a vapor en dos etapas, se consiguió una corriente de
condensado muy enriquecida en butanol (30 – 36% v/v), lo que permite disminuir el
consumo energético de la etapa de deshidratación durante la purificación. Aunque en las
condiciones de recuperación óptimas (T alimentación de 60 °C) las bacterias tuvieron un
fuerte estrés térmico, fueron capaces de recuperarse y producir nuevamente butanol. Sin
embargo, el rendimiento de fermentaciones consecutivas se demostró comprometido.
En futuras actuaciones de investigación sería muy interesante analizar la capacidad de

producir butanol de otras cepas comerciales de Clostridium, así como optimizar la
inmovilización de las bacterias en soportes inertes en procesos discontinuos en una
primera etapa; y en procesos continuos en reactores de biopelícula integrados con
recuperación in situ de solventes mediante gas-stripping en dos fases, en una posterior
etapa de escalado. Asimismo, se deberían evaluar la eficiencia y los costes del proceso
global de fermentación ABE a escala demostrativa para determinar la viabilidad comercial
del proceso propuesto.
XVI
Abstract
Whey, the main by-product of milk and cheese processing, is a great challenge for the
dairy sector, due to the huge volumes generated and its high organic load, along with an
increasingly restrictive environmental legislation for its management and disposal.
Whey is an important source of nutrients, mainly lactose and proteins. A part of these
nutrients, particularly milk proteins, are recovered and newly reintroduced into the food
chain. However, about half of the generated whey is not valorized and it is managed by
the dairy industries as a residual stream, wasting its valuable nutrients. Likewise, during
the recovery process of milk proteins, high volumes of whey permeate are generated as
by-product stream. Whey permeate is an effluent enriched in most of the solid nutrients
present in whey, mainly lactose, whose uncontrolled disposal generates a problem similar
to that of whey, regarding the volume generated and the pollutant load. The inefficient
reuse of these resources has serious environmental, economic and sustainability
implications.
The production of advanced oxygenated biofuels, such as ethanol and butanol, through
fermentation processes for the conversion of lactose present in whey and whey
permeate, is an interesting valorization alternative of the main by-product of dairy
industry. However, to guarantee the commercial viability of these bioprocesses, it is
crucial to improve the yield and the productivity of fermentations. Final solvent titers
must be increased in fermentation broths to reduce the high costs of recovery. Therefore,
microbial osmotolerance, to both substrates and products, must be increased, while, less
energy intensive online solvent recovery and purification technologies have to be
proposed. Moreover, it is necessary to work on reducing fermentation time to improve
the productivity and therefore, the overall economic process viability.
This doctoral thesis is focused on the improvement of fermentation technologies to

produce bioalcohols, specifically ethanol and butanol to be used as biofuels, from whey
and whey permeate. By optimizing fermentation conditions, along with the use of
efficient technologies such as Very High Gravity (VHG) fermentation combined with cell
immobilization, by entrapment in alginate spheres and adsorption on inert supports, it is
expected to improve the yield and productivity of alcoholic and ABE fermentations. The
XVII
purpose is to obtain a higher concentration of alcohol (ethanol/butanol) in the
fermentation broth and to maximize lactose consumption to improve the process from
an environmental and economic point of view. In addition, research was done on the
setting of in-line recovery strategies for solvents, such as gas-stripping in one or two
stages aiming at reducing the energy demand of the recovery and purification step,
thereby improving the viability of the global process.
Firstly, the effect of temperature and pH on the performance of alcoholic fermentation

was tested using yeasts of the species Kluyveromyces marxianus, both free and
immobilized by entrapment in alginate spheres. Additionally, it was established that the
lactose-load threshold in whey to prevent substrate inhibition problems can be fixed
around 170 – 190 g/L, reaching fermentation efficiency yields of 95.5% and productivities
of 1.8 g/L·h. Finally, the most influential parameters in the formation of alginate gels
(alginate concentration, cell load and sphere size) were optimized with an experimental
design using Response Surface Methodology (RSM). The stability of the spheres and the
yields of ethanol production were experimentally validated during 6 cycles, with average
productions of ethanol of 8.3% (v/v), a productivity of 1.6 g/L·h and a fermentation
efficiency of 83%.
After that, the ability of producing ethanol using four yeast strains of the species K.
marxianus and four strains of the species Saccharomyces cerevisiae was evaluated. A
strain of each yeast species was selected and the operating conditions (temperature, pH
and time) were optimized through experimental design by RSM in discontinuous
conditions. The strain K. marxianus DSM 5422 showed the best fermentative behavior,
obtaining 6% (v/v) of ethanol in just 44 hours of fermentation using whey with a lactose
load of 130 g/L as substrate. In the next step, this strain was immobilized by adsorption
on four low-cost inert supports (glass, plastic and Tygon® Raschig rings and alumina
spheres) and performance over time was assessed. The best result was obtained by
immobilizing the yeast on glass Raschig rings and alumina pearls, with average ethanol
titers of 6.% (v/v) in a continuous configuration for more than 40 days (1.000 hours).
Similarly, the previous work regarding alcoholic fermentation, the use of Plackett-Burman
and RSM experimental design for evaluating the effect of essential nutrients for the
XVIII
production of butanol with the strain Clostridium beijerinckii CECT 508 was tested. In this
work, fermentation yields close to the theoretical threshold were obtained, working with
whey having an initial lactose concentration of 40 g/L, reaching butanol concentrations in
the broth of 8.9 g/L.
Finally, a continuous ABE fermentation combined with an in-line butanol recovery gas-
stripping system, in one and two consecutive stages, was proposed. Operating conditions
were optimized using RSM. By employing a two-stage gas-stripping configuration, a highly
enriched-in-butanol condensate was obtained (30 – 36% v/v), reducing the energy
demand of the dehydration stage during purification. Under the optimal recovery
conditions (T feeding of 60 °C), bacteria were able to recover from temperature stress and
produce butanol again, although the process affected the fermentation performance of
the subsequent cycles.
Future research activities would focus on analyzing the ability of producing butanol from
other commercial strains of Clostridium, as well as optimizing the immobilization of
bacteria on inert supports in discontinuous processes in a first stage and in continuous
processes integrating biofilm reactors with solvent recovery in situ by gas-stripping using
a two-phase configuration in a second stage. Moreover, it is necessary to evaluate the
efficiency and cost of the overall ABE fermentation process on a demonstrative scale to
determine its commercial viability.
XIX
Abreviaturas / Abbreviations
AB Alumina bead (Esferas de alúmina)
ABE Acetona-Butanol-Etanol / Acetone-Butanol-Ethanol
ADH Alcohol deshidrogensa
AIE Agencia Internacional de la Energía
AK Acetoquinasa
ALDH Aldehído deshidrogenasa
ANOVA Análisis de la varianza
BADH Butiraldehído deshidrogenasa
BCD Butiril-CoA deshidrogenasa
BDH Butanol deshidrogenasa
BK Butiratoquinasa
BOD Biological oxygen demand
CCD Central Composite Design (Diseño central compuesto)
CE Comisión Europea
CECT Colección Española de Cultivos Tipo
CMNUCC Convención Marco de las Naciones Unidas sobre el Cambio Climático
CoA Coenzima A
CoAT CoA transferasa
COD Chemical Oxygen Demand
COP Conferencia de las Partes del Clima de Naciones Unidas
CPS Concentrado de Proteína de Suero
CWP Cheese Whey Permeate (Permeado de suero de queso)
DBO Demanda Biológica de Oxígeno
DCC Diseño Compuesto Central
XXI
DFA Dairy Farmers of America (Ganaderos Lácteos de América)
DO Densidad Óptica
DQO Demanda Química de Oxígeno
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana

de Microorganismos y Cultivos Celulares)
EEA European Environmetal Agency (Agencia Europea de Medio Ambiente)
EFSA European Food Safety Authority (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria)
ELV Equilibrio Líquido-Vapor
EMP Embden-Meyerhoff-Parnas
ENO Enolasa
ETF Flavoproteína de transferencia de electrones
FBPA Fructosa-bifosfato aldolasa
FDA U.S. Food and Drug Administration (Agencia Estadounidense de Adminsitración

de Alimentos y Medicamentos)
FGM Fosfoglucomutasa
GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
GC Gas Cromatography (Cromatografía de gases)
GEI Gases de Efecto Invernadero
GRAS Generally Recognized as Safe (Generalmente Reconocidos como Seguros)
GRR Glass Raschig Ring (Anillos Raschig de vidrio)
HBD Hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa
HK Hexoquinasa
HG High Gravity (Alta densidad)
HPLC High performance liquid cromatography (Cromatografía líquida de alta

resolución)
LDH Lactato deshidrogenasa
XXII
L-L Líquido-Líquido
MEB Micoscopía Electrónica de Barrido
MSR Metodología de Superficie de Respuesta
NF Nanofiltrado
OCDE Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos
OE Objetivos Específicos
ONU Organización de Naciones Unidas
PDC Piruvato descarboxilasa
PDMS Polidimetilsiloxano
PEBA Poliéter Amida en Bloque
PGI Fosfoglicosa isomerasa
PGK Fosfoglicerato quinasa
PGM Fosfoglicerato mutasa
PHA Polihidroxialcanoato
PFK Fosfofructoquinasa
PRR Plastic Raschig Ring (Anillo Raschig de plástico)
PTA Fosfotransacetilasa
PTB Fosfotransbutirilasa
PTMSP Poli (1-trimetilsilil-1-propino)
PYK Piruvato quinasa
RLF Reactor de Lecho Fijo
RLFl Reactor de Lecho Fluidizado
RSM Response Surface Methodology (Metodología de superficie de respuesta)
SEM Scanning Electron Microscope (Microscopía electrónica de barrido)
SPE Sustancias Poliméricas Extracelulares
XXIII
SGBA Subgrupo de Trabajo de Biocarburantes Avanzados
TPI Triosa-fosfato isomerasa
TRR Tygon® Raschig Ring (Anillos Raschig de silicona Tygon ®)
UDP Uridina difosfato
UF Ultrafiltrado
VHG Very High Gravity (Muy alta densidad)
VHGF Very High Gravity Fermentation (Fermentación de muy alta densidad)
XXIV
1. Introducción y Antecedentes
Introducción y Antecedentes
1.1. Biocarburantes
Existe una creciente concienciación sobre el cambio climático y sus graves impactos. Por
este motivo, en 2015, a través del Acuerdo de París dentro de la Convención Marco de las
Naciones Unidas sobre el Cambio Climático (CMNUCC), se acordó limitar el aumento de
la temperatura media mundial con respecto a la época preindustrial en menos de 2 °C
(ONU, 2015a). Ante este nuevo escenario, la UE se ha comprometido a reducir sus
emisiones de gases de efecto invernadero (GEIs), principalmente CO2, entre un 80% y un
95% con respecto a los niveles de 1990, antes de 2050, como parte del esfuerzo colectivo
de los países desarrollados (CE, 2018a). A través del acuerdo "Chile-Madrid Tiempo de
Actuar" dentro de la 25ª Conferencia de las Partes (COP25) del Clima de Naciones Unidas,
se concluye que es necesrio aumentar la ambición por parte de los países para responder
a la emergencia climática actual. Se reconoce la trasversalidad de la lucha por el cambio
climático en todos los sectores de la sociedad y la dimensión social del problema,
centrando la respuesta a la crisis climática en las personas (ONU, 2019).
El sector del transporte consume un tercio del total de la energía utilizada en la UE-28 y
genera el 25% de los GEIs (Bertoldi et al., 2018). Por lo tanto, para alcanzar los objetivos
acordados es imprescindible reducir al menos dos tercios las actuales emisiones de CO2
en el sector de transporte (EEA, 2018). Por subsectores, el transporte por carretera genera
el 73% del total, representando los vehículos ligeros el 44,5% frente al 18,8% de los
vehículos pesados (EEA, 2018). En la actual economía globalizada, el transporte de bienes
y personas es imprescindible. Por ello, la búsqueda de soluciones sostenibles y menos
contaminantes que contribuyan a la descarbonización del sector es esencial.
El uso de la electricidad es una alternativa prometedora para reducir las emisiones de CO2
(Yabe et al., 2012). Sin embargo, los biocarburantes siguen siendo la alternativa
energética más viable para reducir dichas emisiones (Ahlgren et al., 2017). De acuerdo al
modelo de movilidad desarrollado por la Agencia Internacional de la Energía (AIE) para
cumplir con el acuerdo de París, el 30,7% de la energía en el transporte provendrá de los
biocarburantes, seguido de la electricidad, con una contribución del 27%. Para cubrir esta
futura demanda, la producción de biocarburantes debería multiplicarse por diez (Oh et
al., 2018).
3
Capítulo 1.
La nueva Directiva Europea Renovable “REDII” (CE, 2018b) fija un porcentaje de energía
de fuentes renovables en el mix energético europeo del 32% para el año 2030,
especificando la necesidad de incrementar la cuota de renovables en sectores difusos
como el transporte, la calefacción y la refrigeración. En materia de biocombustibles, se
establece la eliminación gradual del uso de biocombustibles que provoquen un cambio
indirecto en el uso del suelo y el impulso de biocombustibles, denominados “avanzados”.
Actualmente, el 90% del total de los biocarburantes producidos y comercializados

(bioetanol y biodiésel) provienen de biomasa de uso alimentario y son denominados
“biocarburantes de primera generación”. El uso de alimentos como sustratos generó gran
polémica y un fuerte debate asociado a la controversia existente entre “alimentación vs.
combustibles”. Este problema los convierte en una alternativa inviable y carente de
sostenibilidad para abastecer la futura demanda de biocarburantes, por motivos
económicos, medioambientales, éticos y sociales (Ho et al., 2014; Nanda et al., 2015). Por
ello, se trabaja en el desarrollo de un nuevo escenario enfocado en la obtención de
biocarburantes a partir de materias primas alternativas de bajo coste y ampliamente
disponibles como son los cultivos lignocelulósicos, la biomasa residual de origen agrario,
agroalimentario o urbano y la biomasa derivada de algas.
Otra importante barrera para los biocarburantes de primera generación es su complicada

implementación en las actuales estructuras de distribución y almacenamiento para
carburantes fósiles. Tanto las características físico-químicas como el contenido energético
del bioetanol y el biodiésel son muy diferentes a los de los carburantes fósiles
tradicionales, lo que modifica las propiedades de la mezcla final y limita la proporción de
biocarburante en la mezcla, con el fin de prevenir problemas en los motores
convencionales e infraestructuras de almacenamiento (Ranjan y Moholkar, 2012).
Como solución a estos dos problemas, se ha planteado el desarrollo de nuevos

biocarburantes “avanzados”. El Subgrupo de Trabajo de Biocarburantes Avanzados
(SGBA) del foro para el transporte sostenible constituido por la CE define los
biocarburantes avanzados como “aquellos producidos a partir de biomasa no procedente
de cultivos alimentarios que cumplen con el régimen de sostenibilidad de la UE conforme
a la legislación vigente y que presentan unas características superiores a los
biocarburantes actuales” (Maniatis et al., 2017).
4
En el caso de los alcoholes obtenidos por vía fermentativa, se trabaja en su producción a

partir de materias primas no alimentarias (o de segunda generación) tanto en el caso del
etanol, como más recientemente, en el del butanol. El butanol tiene unas propiedades
carburantes muy superiores a las del etanol (Dürre, 2007; Ranjan y Moholkar, 2012;
Sarangi y Nanda, 2018). Este alcohol de 4 átomos de carbono tiene un contenido
energético un 30% mayor que el etanol, es menos corrosivo, volátil e inflamable y, por
tanto, menos peligroso e higroscópico (Ranjan y Moholkar, 2012; Nanda et al., 2014).
Dadas su baja presión de vapor y volatilidad, el butanol puede utilizarse en las actuales
tuberías de suministro de gasolina y mezclarse, tanto con gasolina como con diésel, en
cualquier proporción en los motores de combustión actuales (Lee et al., 2008; Qureshi y
Ezeji, 2008; Sarangi y Nanda, 2018).
Las principales propiedades carburantes de varios combustibles oxigenados se muestran

en la Tabla 1.1., donde se observa que las del butanol son más similares a las de la gasolina
que las del resto de biocarburantes evaluados.
Tabla 1.1. Comparación de propiedades de distintos carburantes líquidos (Ranjan y

Moholkar, 2012).
Carburante Fórmula Densidad Relación Calor de Índice de Índice de Punto de
energética Aire vaporización Octano Octano Ebullición
(MJ/L) /Carburante (MJ/kg) Experimental Motor (°C)
Gasolina H, C4-C12 32 14,6 0,36 91 – 99 81 – 89 32 – 210

Butanol C4H9OH 29,2 11,2 0,43 96 78 118
Etanol CH3CH2OH 19,6 9 0,92 129 102 78
Metanol CH3OH 16 6,5 1,2 136 104 65
1.2. Suero lácteo

El suero lácteo o lactosuero, principal subproducto de la industria láctea, es la fracción
líquida resultante de la coagulación de la caseína de la leche durante la producción de
queso o caseína de leche (De Wit, 2001). El lactosuero es un líquido de carácter ácido y
color amarillo-verdoso, que contiene alrededor del 55% de los nutrientes presentes en la
leche, fundamentalmente lactosa (4,5 – 5,0% p/v), proteínas solubles (0,6 – 0,8% p/v),
5
Capítulo 1.
lípidos (0,4 – 0,5% p/v) y sales minerales (8 – 10% de extracto seco) (De Jesus et al., 2015).
La composición y el tipo de suero dependerán del origen de la leche (cabra, oveja, vaca,
búfala, etc.), el tipo de queso elaborado y la tecnología de producción empleada (De Wit,
2001; Pescuma et al., 2015).
El suero lácteo representa un importante problema medioambiental dados los elevados

volúmenes generados y su alto contenido orgánico (Prazeres et al., 2012; Ahmad et al.,
2019). Se estima que por cada kilogramo de queso producido se generan 9 litros de suero
(Gonzalez-Siso, 1996). A nivel mundial se producen anualmente en torno a 205 millones
de toneladas de suero lácteo, alcanzando los 90 millones de toneladas sólo en la UE-28
(OCDE-FAO; 2018). La elevada carga orgánica está vinculada fundamentalmente a la
lactosa, que representa el 75% de los sólidos del suero y en menor medida a la proteína y
la grasa (De Jesus et al., 2015). El suero lácteo se caracteriza por presentar unos valores
de demanda química de oxígeno (DQO) de alrededor de 30 – 50 g/L y una demanda
biológica de oxígeno (DBO5) de 60 – 80 g/L (Prazeres et al., 2012).
El aprovechamiento del lactosuero supone un gran desafío tanto económico como

medioambiental para la industria láctea. Dadas su elevada concentración de
macronutrientes, el suero es una importante fuente de ingredientes de alto valor añadido
y un interesante sustrato para procesos bioquímicos. Por otra parte, la elevada carga
orgánica puede causar importantes problemas de polución en el aire, el suelo y la calidad
del agua si se producen vertidos inadecuados (Chen et al., 2018). La regulación
medioambiental vigente impide su vertido directo (CE, 1996). Por este motivo, la gestión
del suero ha evolucionado hacia la búsqueda de soluciones integradas y circulares que
consideran este efluente como un recurso valioso, en lugar de una corriente residual
(Singh, 2014; Yadav et al., 2015; Ahmad et al., 2019). La producción de suero aumenta
anualmente un 1 – 2%; sin embargo, menos del 50% del total producido es valorizado
(Panghal et al., 2017), lo que genera una importante pérdida de nutrientes valiosos. Se
estima que anualmente se desaprovechan más de 4 millones de toneladas de lactosa y
0.6 millones de toneladas de proteína de alta calidad (Macwan et al., 2016). Este
ineficiente uso de recursos tiene graves implicaciones sobre la sostenibilidad, además de
suponer un fuerte problema de contaminación ambiental, contribuyendo al cambio
climático y a la propagación de enfermedades (Al-Wasify et al., 2018). Por todo ello,
6
desarrollar e implementar comercialmente un uso sostenible del lactosuero, está

especificado como uno de los objetivos de desarrollo sostenible (ONU, 2015b).
1.3. Valorización del suero lácteo

En la Figura 1.1, se muestra un esquema de las principales alternativas de procesado y
valorización del lactosuero implementadas industrialmente. El principal uso del suero
líquido no procesado es la alimentación animal, aunque su transporte a largas distancias
es difícil de manejar, no resulta económico y es poco sostenible ambientalmente. Por este
motivo, la concentración del lactosuero mediante evaporación u osmosis inversa hasta el
20 – 40%, es una práctica muy extendida que permite reducir los costes de
almacenamiento y transporte (Cheryan y Alvarez, 1995). Otra importante fracción del
suero se seca hasta obtener suero en polvo para alimentación humana y animal. En este
formato se conservan todas las cualidades del suero fresco y se facilitan su
almacenamiento, manipulación y transporte, a pesar del elevado coste energético
(Gonzalez-Siso, 1996).
Figura 1.1. Esquema de valorización fraccionada e integral de suero lácteo (Adaptado de

Yadav et al., 2015).
7
Capítulo 1.
Cuando se plantea una valorización fraccionada de nutrientes, una de las primeras etapas
es la recuperación de la fracción proteica. El suero contiene alrededor del 20% de las
proteínas de la leche, con un elevado valor nutricional y un importante potencial
terapéutico. La tecnología de membrana (ultrafiltración y diafiltración) es el método de
separación más utilizado, recuperando concentrados de proteína de suero con múltiples
aplicaciones en la industria alimentaria (Cheryan y Alvarez, 1995; Gonzalez-Siso, 1996) y
no alimentaria, incluyendo productos cosméticos y farmacéuticos. Del proceso de
separación de las proteínas, se generan como subproducto grandes cantidades de
permeado de suero, una corriente rica en lactosa, que contiene más del 70% del total de
sólidos presentes en el suero. Esta corriente es la principal responsable de los problemas
de vertido, tanto por los volúmenes generados como por su elevada carga contaminante,
generando un problema ambiental similar al del lactosuero (Prazeres et al., 2012;
Pescuma et al., 2015; Parashar et al., 2016; Ahmad et al., 2019).
La lactosa es el azúcar presente en la leche. Este disacárido está formado por una
molécula de glucosa y una molécula de galactosa, y se define químicamente como O-β-D-
galactopiranosil-(1→4)- β-D-glucopiranosa, C6H22O11 (Adam et al., 2005; Gänzle et al.,
2008). Casi la totalidad de la lactosa se recupera por cristalización. Sin embargo, la
demanda de lactosa purificada representa sólo el 5% del total de suero disponible (Adam
et al., 2005). La lactosa purificada se utiliza fundamentalmente como ingrediente
alimentario, para la formulación de alimentos infantiles, agente de relleno o
recubrimiento en la industria farmacéutica. También puede emplearse como sustrato
para la producción de derivados de la lactosa como lactulosa, lactitol o ácido lactobiónico
(Nooshkam et al., 2018) o el desarrollo de hidrolizados de lactosa (Gänzle et al., 2008).
Otra importante aplicación de la lactosa presente en el lactosuero o en el permeado de
suero es su uso como sustrato de procesos fermentativos para la obtención de
bioproductos de alto valor añadido (Yadav et al., 2015; Ahmad et al., 2019).
1.4. Aplicaciones biotecnológicas del suero

lácteo y el permeado de suero
La lactosa ha sido utilizada como sustrato de múltiples procesos fermentativos para
obtener bioproductos tan diversos como biogás, ácidos orgánicos (acético, propiónico,
8
láctico, cítrico, glucónico, etc.), hidrógeno, alcoholes (etanol, butanol, 2-butanodiol,

glicerol, etc.), vitaminas, enzimas (β-galactosidasa y poligalacturonasa), proteínas
unicelulares (SCP) o polihidroxialcanatos (PHAs), utilizando distintos microorganismos
(Pescuma et al., 2015; Yadav et al., 2015; De Jesus et al., 2015; Ahmad et al., 2019).
Los procesos fermentativos se caracterizan por ser altamente intensivos en el uso de

capital y presentar bajos rendimientos de reacción (Westman y Franzen, 2015), motivo
por el que el desarrollo de aplicaciones a escala piloto o industrial está muy limitado
(Singh, 2014). La mayoría de publicaciones que describen la utilización de lactosuero o
permeado de suero lácteo en procesos fermentativos son de carácter científico o a escala
de laboratorio, a excepción de algunas instalaciones industriales de producción de etanol
en Irlanda, Nueva Zelanda o EE.UU. (Parashar et al., 2016; Das et al., 2016).
La conversión de la lactosa en bioalcoholes mediante procesos fermentativos para su uso

como biocarburante, puede ser una alternativa interesante, viable y sostenible para la
reutilización de este subproducto industrial (Mollea et al., 2013; Das et al., 2016). Sin
embargo, estos procesos son complejos e incluyen etapas de pretratamiento como la
deshidratación y desmineralización (Jelen, 2009). Entre los principales inconvenientes del
proceso están las bajas concentraciones de etanol en el caldo de fermentación, la baja
tolerancia osmótica de las levaduras y los prolongados tiempos de fermentación (Ling,
2008; Prazeres et al., 2012; Parashar et al., 2016;).
Simplificar el proceso, utilizando tecnologías alternativas y novedosas que reduzcan las

etapas de pretratamiento, mejorará el atractivo y el desarrollo comercial de la
fermentación de la lactosa. Algunas de las estrategias que deben estudiarse para
aumentar el rendimiento y la productividad global de los bioprocesos comprenden el
cultivo a alta densidad celular y/o el empleo de cepas microbianas modificadas
genéticamente o adaptadas evolutivamente, que permitan mejorar los rendimientos de
transformación de la lactosa y reducir las inhibiciones por sustrato o producto (Westman
y Franzen, 2015; Das et al., 2016; Parashar et al., 2016; Saini et al., 2017).
1.5. Fermentación de lactosa a etanol

La producción mundial de etanol está en torno a 97 millones de m3 anuales (Datos de
2016. Alternative Fuel Data Center. https://www.afdc.energy.gov/data/?q=ethanol). El
9
Capítulo 1.
bioetanol se produce por vía fermentativa a partir de materias primas agrícolas tanto de
origen amiláceo (60%), maíz y trigo, fundamentalmente, como de azúcares simples
procedentes de la caña de azúcar o la remolacha (40%) (Vohra et al., 2014). Entre las
principales aplicaciones del etanol están su uso como carburante (> 80%), la industria
química (10%) y la industria alimentaria (9%). El principal productor mundial de etanol es
EE.UU. (58% de la producción total), obtenido en un 98% a partir de grano de maíz,
seguido de Brasil (28% del total de la producción) a partir de caña de azúcar (OCDE, 2018)
y la UE-28, con una producción del 5,4% del total, obtenido fundamentalmente a partir
de maíz (43%), trigo (26%) y jugos azucarados (21%) (ePure, 2019).
Una de las principales barreras al etanol derivado de materias primas alimentarias es la

limitación en el suministro de las mismas y la inestabilidad de los precios (Vohra et al.,
2014). Se calcula que en torno al 75% de los costes de producción de los biocombustibles
corresponde al abastecimiento de la materia prima. Por lo tanto, su adecuada selección
es crucial para garantizar la competitividad final de los biocarburantes (Hirani et al., 2018).
El uso de materias primas alternativas no-alimentarias de bajo coste y ampliamente

disponibles como son los residuos agrícolas, los cultivos energéticos o los residuos
agroalimentarios es a la vez una necesidad y una oportunidad para la industria del
bioetanol teniendo en cuenta las tres dimensiones de la sostenibilidad: económica,
ambiental y social (Baker et al., 2017).
Aunque la conversión de lactosa en etanol por vía fermentativa a partir de lactosuero o

permeado de suero no es económicamente competitiva frente al uso de los sustratos
tradicionales como son el almidón de maíz o caña de azúcar (Das et al., 2016; Parashar et
al., 2016). Sin embargo, la fermentación de corrientes residuales de permeado de suero
a etanol bajo un criterio de biorremediación, utilizando tecnologías mejoradas, puede ser
una alternativa interesante (Guimarães et al., 2010; Pasotti et al., 2017).
Se estima que en torno al 55% de la lactosa presente en el suero lácteo es lactosa

excedentaria no valorizada (Ling, 2008). Así, la cantidad disponible para emplear como
sustrato en procesos fermentativos es superior a 5,5 millones de toneladas anuales.
Considerando una eficiencia de conversión a etanol del 85%, se podrían obtener
10
anualmente en torno a 2,6 millones de m3 de etanol, lo que supone cerca de 2,7% de la

producción total de 2016.
La viabilidad económica de la fermentación directa de lactosuero o permeado de suero a

etanol está fuertemente comprometida debido a su baja concentración en lactosa,
generando concentraciones de etanol a su vez bajas (2 – 3% v/v), siendo necesarios
procesos de destilación muy costosos energéticamente (Risner et al., 2018; Tomaszewska
y Białończyk, 2016). La búsqueda de nuevas estrategias que mejoren la productividad y el
rendimiento global, unida a una disminución de los costes de operación y de inversión,
son aspectos en los que es necesario continuar trabajando (Gabardo et al., 2014).
Aumentar la concentración final de etanol en el caldo de fermentación es imprescindible.

Para logarlo, se deben utilizar concentraciones de lactosa superiores a las que presenta el
lactosuero. La concentración de lactosa se puede aumentar fácilmente empleando
tecnologías de membrana como la ultrafiltración o la osmosis inversa. Trabajar con
concentraciones de sustrato muy elevadas como plantean las tecnologías de
Fermentación a Alta Densidad (de las siglas en inglés Very High Gravity, VHG) permite
obtener una elevada concentración de producto, reduciendo significativamente los
consumos de agua y energía, aunque pueden producirse problemas importantes de
inhibición microbiana (Zhang et al., 2015). Por otro lado, favorecer el desarrollo de
fermentaciones rápidas aumentará la productividad final, garantizando la viabilidad
económica del proceso.
Los procesos continuos ofrecen importantes ventajas frente a los procesos discontinuos,
como la mejora de los rendimientos de fermentación, la reducción de los tiempos de
procesamiento y las pérdidas de producto (Gabardo et al., 2014; Li et al., 2014). La
inmovilización celular es una estrategia muy interesante para mejorar la productividad,
ya que aumenta la estabilidad microbiana, al proteger a los microorganismos de
inhibiciones y variaciones ambientales, a la vez que permite trabajar con reactores de
menor tamaño y disminuir los tiempos de reacción y de latencia durante el crecimiento
microbiano, lo cual contribuye a reducir los costes de operación (Mussatto et al., 2010; Es
et al., 2015). No obstante, para el diseño de procesos de fermentación empleando
permeado lácteo concentrado es imprescindible establecer un compromiso entre
maximizar la producción y la productividad del proceso con el consumo de lactosa;
11
Capítulo 1.
minimizando la concentración de lactosa residual en el efluente, ya que debe cumplir con

el doble objetivo de valorización de corrientes residuales y de producción de
biocarburantes.
La primera referencia a la producción de etanol a partir de lactosuero data de 1939 y utiiza

una levadura que directamente transformaba lactosa a etanol (Willem y Van Der, 1939.
U.S. Patent 2,183,141). La especie Saccharomyces cerevisiae ha sido utilizada durante
milenios para la producción de bebidas y es el principal microorganismo empleado para
producir bioetanol (Radecka et al., 2015). Sin embargo, al igual que otras muchas
levaduras, tiene la capacidad de asimilar lactosa, pero no de metabolizarla a etanol. Muy
pocas especies fermentan lactosa directamente a etanol, destacando las cepas de la
especie Kluyveromyces marxianus (que actualmente incluye a la antigua especie K.
fragilis) y su forma anamorfa Candida pseudotropicalis (Zafar y Wais, 2006).
1.5.1. Bioquímica de la fermentación alcohólica

La capacidad para metabolizar naturalmente lactosa se debe a la presencia de dos genes,
LAC12 y LAC4, que codifican las enzimas lactosa-permeasa y β-galactosidasa,
respectivamente (Rubio-Texeira, 2006). La lactosa-permeasa se encarga de transportar la
lactosa a través de la membrana citoplasmática hacia el interior de la célula. La β-
galactosidasa es la enzima responsable de la hidrólisis de la molécula de lactosa en dos
monómeros, glucosa y galactosa. Ambos monómeros se metabolizan por la vía glicolítica
Embden-Meyerhof-Parnas (E-M-P), aunque la galactosa sigue previamente la ruta Leloir,
transformándose previamente en el metabolito glicolítico glucosa-6-fosfato (Frey, 1996;
Rubio-Texeira, 2006; Bai et al., 2008), tal y como se muestra en la Figura 1.2.
La especie Kluyveromyces pertenece al grupo de levaduras no convencionales o no-

Saccharomyces con gran potencial para aplicaciones industriales (Spencer et al., 2002).
Kluyveromyces marxianus presenta atributos de gran interés, como su termotolerancia
hasta temperaturas de 45 °C, su elevada tasa de crecimiento, su capacidad para
metabolizar una amplia variedad de carbohidratos como pentosas, hexosas y disacáridos
(Lane y Morrissey, 2010; Radecka et al., 2015) y su estado GRAS (generalmente
reconocido como seguro) para la producción de proteínas (FDA, 2018; EFSA, 2018). Estas
propiedades hacen que sea particularmente adecuada para fines industriales, como la
12
producción de compuestos farmacéuticos, proteínas de grado alimenticio, enzimas (β-

galactosidasa, β-glucosidasa, inulinasa y poligalacturonasas, entre otras), proteínas
monocelulares y bioetanol (Fonseca et al., 2008). Tradicionalmente, K. marxianus ha sido
clasificada como una levadura Crabtree negativa, aunque su capacidad respiro-
fermentativa ha generado cierta controversia (Lane et al., 2011; Radecka et al., 2015).
Además, esta especie presenta el efecto Kluyver positivo para las pentosas y para la
lactosa en ciertas etapas (Lane et al., 2011; Pentjuss et al., 2017).
Figura 1.2. Ruta metabólica de fermentación de lactosa a etanol (Adaptado de: Frey,
1996; Rubio-Teixeira, 2006; Bai et al., 2008).
Las enzimas: HK: hexoquinasa, UDP-galactosa: uridina difosfato lactosa, PGI: fosfoglicosa
isómerasa, PFK: fosfofrutoquinasa, FBPA: fructosa-bifosfato aldolasa, TPI: triosa-fosfato
isomerasa, GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato deshidrogenasa, PGK: fosfoglicerato quinasa,
PGM: fosfoglicerato mutasa, ENO: enolasa, PYK: piruvato quinasa, PDC: piruvato
descarboxilasa, ADH: alcohol deshidrogenasa.
La bioconversión de lactosa a etanol a partir de las levaduras Kluyveromyces spp. y S.

cerevisiae ha sido ampliamente investigada. La mayoría de los trabajos se han centrado
en el empleo de cepas de la especie K. marxianus, identificándose problemas de inhibición
cuando se trabaja con concentraciones de lactosa elevadas (superiores a 100 g/L),
13
Capítulo 1.
asociados a fermentaciones lentas con ineficiente consumo de azúcares (Silveira et al.,

2005; Ozmihci y Kargi, 2007; Dragone et al., 2011; Gabardo et al., 2014). Asimismo, a pesar
de su incapacidad para metabolizar lactosa a etanol, hay un gran interés en emplear S.
cerevisiae para este tipo de fermentación dado que: a) presenta una buena productividad
y tolerancia al etanol (> 20% v/v); b) su estado GRAS; c) su rápido crecimiento en
condiciones anaerobias; d) su generalizado uso industrial; y e) es uno de los
microorganismos mejor conocidos y más estudiados (Guimarães et al., 2008; Walker y
Stewart, 2016). Inicialmente las estrategias se centraron en una hidrólisis preliminar de la
lactosa en sus monómeros. Sin embargo, los avances biomoleculares han derivado los
estudios hacia la construcción de cepas modificadas genéticamente con capacidad de
metabolizar lactosa (Guimarães et al., 2008; Silva et al., 2010; Kumar et al., 2012).
Múltiples estrategias han sido evaluadas para obtener etanol a partir de lactosa
empleando tanto K. marxianus como S. cerevisiae. Como sustratos de fermentación se
han empleado, tanto lactosuero crudo (Zafar y Owais, 2006; Sansonetti et al., 2009;
Gabardo et al., 2014) como diversos subproductos, incluyendo el suero en polvo
reconstituido (Kargi y Ozmihci, 2006; Ozmihci y Kargi, 2007; Dragone et al., 2011) y el
permeado de suero (Silveira et al., 2005; Diniz et al., 2013). La suplementación con
nutrientes esenciales del suero o el permeado de suero no es necesaria cuando se trabaja
con K. marxianus al tratarse de un sustrato rico en macro y micro-nutrientes (Gabardo et
al., 2014). Sin embargo, algunos autores consideran esencial la adición de nutrientes
esenciales como nitrógeno y fósforo, así como algunas vitaminas, que favorecen el
crecimiento celular, el consumo de lactosa y aumentan la producción de etanol (Parrondo
et al., 2009). Con el objeto de mejorar el rendimiento del proceso fermentativo, distintas
configuraciones de reacción han sido evaluadas, en procesos discontinuos (Ghaly y El-
Taweel, 1995; Zafar y Owais, 2006; Sansonetti et al., 2009) y en biorreactores continuos
con inmovilización celular bajo diversos soportes (Ozmihci y Kargi, 2008, 2009; Sansonetti
et al., 2013; Gabardo et al., 2014, 2015).
A pesar de los trabajos científicos publicados, hay pocas instalaciones que produzcan
etanol a partir de suero lácteo o sus subproductos. La primera planta industrial de
producción de etanol a partir de suero de leche fue construida en 1978 por el grupo
Carbery Milk Products Ltd. en Irlanda para producir etanol tanto para uso alimentario
14
como para uso biocarburante, con una producción anual en torno a los 11 millones de
litros (www.carbery.com). El proceso Carbery, consistente en la fermentación de
permeado de suero desproteinizado utilizando K. marxianus para la fermentación de
lactosa, fue trasladado a Nueva Zelanda y Estados Unidos. En Estados Unidos hay dos
plantas de etanol a partir de suero de escala industrial construidas en la década de 1980
y operadas por la cooperativa láctea Dairy Farmers of America (DFA), con una producción
de aproximadamente 30 millones de litros anuales (http://www.dfamilk.com). En 2007,
el grupo cooperativo Fonterra a través de su división Anchor Ethanol Ltd., comenzó a
comercializar 17 millones de litros de etanol anuales para su uso en la industria cosmética,
farmacéutica y química (https://www.fonterra.com/nz/en.html). Asimismo, el grupo
Theo Müller, comenzó a operar en 2007 una planta de producción de bioetanol a partir
de sus residuos lácteos, con una producción de 10 millones de litros anuales en Alemania
(https://www.muellergroup.com/).
1.5.2. Fermentación de alta o muy alta densidad

La incorporación de tecnologías de fermentación de alta densidad o muy alta densidad
[del inglés “high gravity” (HG) o “very high gravity” (VHG)], implica una importante mejora
de la productividad de la fermentación alcohólica y una significativa disminución de los
requerimientos de agua de los procesos (Puligundla et al., 2019). Esta tecnología ofrece
altos rendimientos de etanol, baja generación de residuos, menor coste de operación y
una reducción del equipamiento requerido (Arshad et al., 2017). Sin embargo, la
generación de una mayor concentración de etanol resulta inhibitoria para la actividad de
las levaduras, reduciendo el rendimiento final del proceso y la eficiencia de la
fermentación. El mayor desafío de la fermentación HG/VHG es el control y la eliminación
del estrés osmótico celular derivado de la elevada concentración de azúcar al inicio de la
fermentación y el estrés por concentración elevada de etanol al final del proceso
(Puligundla et al., 2019).
Una alternativa efectiva para aliviar los efectos de una elevada presión osmótica sobre las
levaduras es la de suplementar el medio de cultivo con diversos nutrientes, tales como
amonio, urea, extracto de levadura o harina de soja, los cuales mejoran la viabilidad y la
15
Capítulo 1.
tasa de crecimiento celular, así como la tasa de producción de etanol (Deesuth et al.,
2015; Phukoetphim et al., 2017), aunque se encarezca el proceso.
Para reducir los costes de producción es imprescindible trabajar con sustratos de bajo
coste y utilizar suplementos nutricionales de nitrógeno baratos. Además, la selección de
cepas osmotolerantes altamente productoras de etanol y el establecimiento de
estrategias de control también resultan recomendables (Puligundla et al., 2019). El uso de
técnicas de inmovilización celular está ampliamente documentado como un método
efectivo para evitar inhibiciones, tanto por sustrato como por producto. Por lo tanto, la
combinación de ambas técnicas permitirá mejorar el rendimiento de la fermentación
consiguiendo un proceso más eficiente y sostenible.
1.6. Fermentación Acetona-Butanol-Etanol

(ABE)
La producción de butanol mediante fermentación microbiana fue publicada por primera
vez por Louis Pasteur en 1861 (Gabriel, 1930). Sin embargo, el gran avance en este
proceso se logró entre 1912 y 1914, cuando Weizmann consiguió aislar una cepa
bacteriana de Clostridium acetobutylicum, que posteriormente se convertiría en el caballo
de batalla de la fermentación Acetona-Butanol-Etanol (ABE) a escala industrial, capaz de
utilizar diversos sustratos, incluyendo el almidón, con un rendimiento de butanol superior
a otras cepas (Jones y Woods, 1986). La creciente demanda de solventes para producir
munición durante la I y II Guerra Mundial, unida a la rápida expansión de la industria del
automóvil, provocó que la fermentación ABE se convirtiese en el segundo proceso
fermentativo industrial más importante, después de la fermentación alcohólica, durante
la primera mitad del siglo XX (Green, 2011). Además, la fermentación ABE tuvo un papel
muy destacado en el desarrollo de la industria bioquímica, ya que fue el precursor de la
fermentación industrial a gran escala en condiciones asépticas, dada la naturaleza
anaerobia del proceso (Lee et al., 2008).
En los años 1950, la fermentación ABE fue drásticamente desplazada por la industria
petroquímica, la cual producía grandes cantidades de acetona y butanol a precios muy
bajos. Esto unido a la escalada de precios de los sustratos de fermentación de origen
alimentario (Green, 2011) ocasionó que dicha fermentación a nivel industrial fuese
16
progresivamente abandonada y sólo se mantuviera a pequeña escala en China (Ni y Sun,

2009; Wong et al., 2017).
No obstante, en las últimas dos décadas, el interés de la industria y la comunidad científica

sobre la fermentación ABE ha resurgido a causa de la preocupación por el agotamiento
de las reservas de petróleo y sus elevadas fluctuaciones de precio (Ni y Sun, 2009). Sin
embargo, actualmente su empleo a escala industrial se encuentra limitado por varios
factores que comprometen de forma importante su viabilidad económica frente a los
procesos petroquímicos. Entre los principales factores destacan: el elevado coste de los
sustratos tradicionalmente empleados (maíz y melazas), la baja concentración de butanol
en el caldo de fermentación, el bajo rendimiento y productividad volumétrica y el elevado
coste asociado a la recuperación de solventes, debido a la gran variedad presente en el
caldo de fermentación, así como al elevado punto de ebullición del butanol (Lee et al.,
2008; Garcia et al., 2011; Ezeji et al., 2013; Becerra et al., 2015).
Para tratar de reducir estas limitaciones, la investigación actual se dirige hacia la mejora
global del proceso mediante el empleo de sustratos más baratos, el uso de las cepas
microbianas más adecuadas para cada sustrato, el empleo de técnicas de mejora genética
microbiana y la utilización de estrategias de recuperación de productos más eficientes
(Ranjan y Moholkar, 2012; Kujawska et al., 2015; Becerra et al., 2015).
Ni y Sun (2009) listaron once empresas dedicadas a la producción de butanol por vía
fermentativa en la República Popular China, además de dos proyectos en ejecución y dos
proyectos en planificación. Otro proyecto comercial destacado es el de Saudi Butanol
Company (SABUCO) que produce en Arabia Saudí, desde 2016, anualmente 330.000
toneladas de butanol y 11.000 toneladas de iso-butanol
(https://www.saharapcc.com/en/pages.aspx?pageid=52). En fase de diseño o
construcción hay proyectos como el de SGBio Renewable [Joint Venture entre GranBio
(Brasil) y Rhodia (Bélgica], que ha adquirido la empresa de base tecnológica americana
Cobalt para el desarrollo de instalaciones en Brasil y Estados Unidos o el de Green
Biologist (Reino Unido) que ha adquirido la cooperativa Central MN Ethanol en Minnesota
(Estados Unidos) para transformar la instalación y producir 65.000 toneladas/año de
butanol.
17
Capítulo 1.
1.6.1. Bioquímica de la fermentación ABE

En condiciones discontinuas, la fermentación ABE se desarrolla en dos etapas: una
primera etapa de acidogénesis asociada con un rápido crecimiento celular y con una
secreción de ácidos carboxílicos, acetato y butirato, hidrógeno y CO2 y una segunda etapa
de solventogénesis, que se corresponde con la producción de solventes; la transición
entre etapas ocurre a pH bajo (Jones y Woods, 1986). Durante la transición, el
metabolismo celular se disocia para la reproducción celular de células acidogénicas y la
producción de solventes, modificándose para ello su morfología, convirtiéndose las
células activas en endoesporas incapaces de reproducirse, pero capaces de metabolizar
ácidos y nutrientes para producir solventes (Ross, 1961) (Figura 1.3.).
Figura 1.3. Ciclo de vida de Clostridum spp. (Patakova et al. (2011)).
La ruta metabólica de C. acetobutylicum a partir de lactosa se muestra en la Figura 1.4. La

lactosa presente en el medio circula a través de la membrana del microorganismo por
difusión, la β-galactosidasa facilita su división en sus monómeros (glucosa y galactosa). La
glucosa se oxida directamente a piruvato mediante la ruta Embden-Meyerhoff-Parnas
(EMP) (Jones y Woods, 1986). Asimismo, la galactosa es transformada en glucosa-1-
fosfato a través de la vía de Leloir. El piruvato, formado durante la glucólisis (vía EMP), se
escinde por la acción de la enzima ferredoxina oxidorreductasa piruvato en presencia de
18
la coenzima-A (CoA) produciendo CO2, acetil-CoA y ferredoxina reducida. El pH del medio

disminuye a medida que se producen estas conversiones, con la acumulación de ácidos
butírico y acético. Estos ácidos pueden penetrar la membrana celular y activan la fase
solventogénica (Jones y Woods, 1986; Mitchell, 1997).
Durante la solventogénesis, los productos de la fase acidogénica son reasimilados y

convertidos en acetona y butanol. La enzima que cataliza esta conversión es la CoA
transferasa. Durante las etapas de oxidación, tanto la glucosa como la galactosa se
transforman a piruvato de modo equivalente.
Los productos obtenidos durante la acidogénesis y la solventogénesis provocan la

inhibición de la reacción cuando se alcanza una determinada concentración en el medio
fermentado (Jones y Woods, 1986). La presencia de butanol genera un aumento de la
fluidez de la membrana celular provocando su desestabilización (Haggstrom, 1985). Para
la mayoría de cepas de Clostridium spp., la cantidad máxima de solventes que las células
pueden tolerar se sitúa en torno a 20 g/L. Este valor limita la cantidad máxima de azúcar
utilizable por lote de fermentación situándola en torno a 60 g/L (Jones y Woods, 1986).
Para evitar el problema de la toxicidad generada por el butanol, se utiliza la eliminación
continúa de solventes del caldo de fermentación o el desarrollo de cepas más resistentes
y tolerantes al butanol.
19
Capítulo 1.
Figura 1.4. Rutas metabólicas de la lactosa en Clostridium spp. (en el interior de las cajas se muestran los compuestos extracelulares)
(Adaptado de: Napoli, 2009; Corrales et al., 2015 y Zhang et al., 2018).
Las enzimas: HK: hexoquinasa, UDP-galactosa: uridina difosfato galactosa, FGM: Fosfoglucomutasa, PGI: fosfoglicosa isómerasa, PFK:
fosfofrutoquinasa, GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato deshidrogenasa, PGK: fosfoglicerato quinasa, PGM: fosfoglicerato mutasa, ENO: enolasa, LDH:
Lactato deshidrogenasa, ALDH: aldehído deshidrogenasa, ADH: alcohol deshidrogenasa, PTA: fosfotransacetilasa, AK: Acetatoquinasa, CoAT: CoA
transferasa, HBD: hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, BCD: Butiril-CoA deshidrogenasa, ETF: Flavoproteína de transferencia de electrones, PTB:
Fosfotransbutirilasa; BK: Butiratoquinasa, BADH: Butiraldehido deshidrogenasa y BDH: Butanol deshidrogenasa.
20
1.6.2. Microorganismos
Varias especies del género Clostridium tienen la capacidad de metabolizar compuestos
orgánicos, incluyendo azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos o polialcoholes, en
determinadas condiciones de operación para producir acetona, butanol, isopropanol y
etanol durante la última fase de la fermentación. Sin embargo, relativamente pocas
especies (incluyendo los mutantes de las especies más conocidas) se usan a nivel
industrial (Dürre, 1998). Tras exhaustivos estudios taxonómicos, las cepas de interés
industrial se clasificaron en cuatro especies: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C.
saccharoperbutylacetonicum y C. saccharobutylicum (Mitchell et al., 1997; Karakashev
et al., 2007). La especie C. acetobutylicum es la más adecuada para sustratos a base de
almidón, mientras que las especies C. saccharobutylicum y C. beijerinckii presentan un
mejor comportamiento con otros sustratos, como la biomasa lignocelulósica (Shaheen
et al., 2000).
En los últimos años, se ha intensificado la investigación sobre ingeniería metabólica de

cepas y especies de Clostridium, con el fin de mejorar la producción de butanol por
fermentación. Se han establecido dos grandes estrategias: la ingeniería regulatoria y
metabólica de la bacteria y la incorporación de la ruta de biosíntesis del butanol en
levaduras y bacterias no productoras de butanol (Becerra et al., 2015). Entre los
principales objetivos de la ingeniería metabólica están favorecer la producción de
butanol frente al resto de solventes y aumentar la concentración y pureza del butanol
en el caldo de fermentación. Asimismo, se intenta mejorar la tolerancia al oxígeno y
aumentar la tolerancia a los solventes generados para disminuir las inhibiciones.
También se trabaja en disminuir la represión catabólica por carbono en mezclas de
azúcares, así como simplificar la ruta metabólica del microorganismo o prolongar la
viabilidad celular (Lee et al., 2008; Visioli et al., 2014).
1.6.3. Sustratos
El precio de las materias primas tiene una gran influencia en la competitividad global de
la fermentación ABE frente a los procesos petroquímicos. Se estima que el coste de los
sustratos representa más del 70% del total de los costes de producción (Gu et al., 2011).
21
Capítulo 1.
Inicialmente, los sustratos empleados eran jugos azucarados y almidones, pero su alto
precio hace que el proceso sea inviable económicamente (Visioli et al., 2014).
Una de las estrategias para reducir los costes de producción es utilizar sustratos más
económicos y sostenibles ambientalmente, tales como los residuos agrarios (Qureshi et
al., 2010 a, b; Paniagua-Garcia et al., 2018; Hijosa-Valsero et al., 2020) y
agroalimentarios (Hijosa-Valsero et al., 2017, 2018, 2019; Wechgama et al., 2017) o
suero lácteo (Becerra et al., 2015). Las cepas de Clostridium no pueden usar
directamente el material lignocelulósico como fuente de carbono. Por este motivo, esta
biomasa debe ser hidrolizada para obtener azúcares de cinco y seis átomos de carbono
que pueden ser metabolizados por este grupo bacteriano; este paso de hidrólisis
dificulta la viabilidad económica de los procesos fermentativos (Sarangi et al., 2018).
El suero lácteo es un sustrato que ha despertado mucho interés en la fermentación ABE

debido a su amplia disponibilidad, su elevada carga contaminante y su adecuada
concentración de lactosa (5% p/v) para producir butanol (Napoli, 2009; Silva et al.,
2010). Es posible someter el lactosuero a una etapa preliminar para la recuperación de
las proteínas, fundamentalmente la caseína. Este paso previo es compatible con la
fermentación ABE, ya que las proteínas interfieren en el proceso y conviene eliminarlas
antes de la fermentación (Schoutens et al., 1985). El filtrado de suero libre de proteínas
presenta una concentración de lactosa muy baja para muchos microorganismos, lo que
hace que no sea un sustrato adecuado para algunos procesos fermentativos, como es la
fermentación alcohólica, la cual requiere concentraciones de lactosa superiores al 10%,
para garantizar su viabilidad y rentabilidad (Dragone et al., 2011). Sin embargo, la
concentración de lactosa en el filtrado de suero es idónea para la fermentación ABE, ya
que permite evitar problemas de inhibición por producto (Jones y Woods, 1986).
Múltiples derivados y subproductos del suero lácteo han sido investigados, desde polvo
de suero ácido (Schoutens et al., 1985; Qureshi y Maddox, 1995, 2005; Maddox et al.,
1995); permeado de suero ácido (Ennis y Maddox, 1985; Qureshi y Maddox, 1987) y
medios sintéticos con diversas concentraciones de lactosa (Napoli et al., 2010, 2011).
Sin embargo, apenas hay publicaciones que utilicen suero crudo, con rendimientos de
fermentación muy bajos (Foda et al., 2010).
22
El rendimiento de la conversión de lactosa en butanol presenta un valor teórico en torno

a 0,41 gbutanol/glactosa (Napoli, 2009). En condiciones experimentales, el rendimiento es
inferior debido a la inevitable presencia de sustratos no transformables por los
microorganismos durante el proceso. La selectividad del butanol respecto a otros
solventes está en un rango de 0,6 – 0,8 gbutanol/gABE.
En fermentaciones discontinuas, la productividad global del reactor utilizando suero

lácteo como sustrato es relativamente baja en comparación con otros sustratos como el
almidón o las melazas, con concentraciones de solventes entre 5 – 15 g/L,
productividades de 0,1 g/L·h y rendimientos de fermentación entre 0,23 – 0,41
gsolventes/gsustrato (Qureshi y Maddox, 1995; 2005; Maddox et al., 1995; Becerra et al.,
2015). Esto unido a la incompleta utilización de la lactosa durante el proceso,
representan los principales inconvenientes de las fermentaciones discontinuas.
El hecho de que la concentración total de solventes al final de la fermentación sea menor

que la alcanzada con otros sustratos convencionales evita problemas de inhibición. La
mayoría de las cepas de Clostridium spp. toleran concentraciones de solventes de 20 g/L
(Maddox, 1983) y hasta el momento no se han alcanzado estos valores de producción
empleando suero como sustrato (Becerra et al., 2015). En cualquier caso, la relación
butanol/acetona al final de la fermentación trabajando con C. acetobutylicum es mayor
que la obtenida fermentando glucosa, alcanzando relaciones 20:1 frente a las
tradicionales 3:1 con glucosa (Linden et al., 1986). Los cambios metabólicos que tienen
lugar para incrementar la relación butanol/acetona aún se desconocen. Distintos
estudios indican que tanto la composición del suero como la temperatura de reacción
afectan a la productividad tanto de acetona como de butanol (Voget et al., 1985).
Además de los carbohidratos, las especies C. acetobutylicum (Madihah, 2001) y C.

beijerinckii (Nimcevic et al., 1998) requieren nutrientes adicionales como proteínas y
sales minerales para su crecimiento y metabolismo celular. La mayoría de estudios sobre
fermentación ABE emplean complejos medios de cultivo, que contienen nutrientes
suplementarios del crecimiento como extracto de levadura, triptona, vitaminas y sales
minerales. Por lo general, las especies de Clostridium, requieren valores bajos del
potencial redox para su metabolismo celular y crecimiento (Douglas et al., 1973). Sin
23
Capítulo 1.
embargo, durante la fase de solventogénesis se producen reacciones redox por lo que,

para mantener un bajo potencial, debe suplementarse el medio con minerales férricos.
Otros factores que afectan de modo importante la fermentación ABE son el pH o la

presencia de oxígeno en el medio de cultivo. Así, las cepas de Clostridium spp. tienen
una gran sensibilidad a cambios de pH (Ezeji et al., 2005). Como ya se ha indicado, la
fermentación ABE se desarrolla en dos etapas. En la etapa acidogénica se producen
ácidos, que son secretados al medio y disminuyen su pH. La fase de solventogénesis,
comienza después de superar un punto de pH denominado “pH breakpoint”, a partir del
cual los ácidos son reasimilados dando inicio a la producción de solventes (Jones y
Woods, 1986). Por lo tanto, un valor bajo de pH es un requisito para que se desarrolle la
solventogénesis. El hecho de que elevadas concentraciones de butirato y acetato
aparezcan en el medio, hace que parámetros como el pH, la concentración de ácidos
débiles y una elevada densidad celular favorezcan la producción de solventes (George y
Chen, 1983). Sin embargo, en medios poco tamponados, el pH puede disminuir por
debajo de 4,5 durante la acidogénesis, lo que provoca la finalización inmediata de la
solventogénesis, mediante el sistema denominado “rotura ácida o acid crash”. Este
fenómeno está asociado con una concentración de ácido acético y butírico que supera
un valor límite en el caldo de fermentado (Maddox et al., 2000). Además, las especies
del género Clostridium inhiben su crecimiento incluso con concentraciones de oxígeno
muy bajas (Bahl y Dürre, 2000). Por ello, es imprescindible garantizar condiciones de
anaerobiosis durante toda la fermentación.
1.7. Configuración de fermentación

El diseño y el modo de operación de los biorreactores juegan un importante papel en la
industria bioquímica (Amarasekara, 2013). Evaluar la cinética de reacción, los
fenómenos de transporte, la hidrodinámica y las condiciones de operación óptimas
permiten mejorar los procesos y aumentar la productividad (Qureshi y Blaschek, 2001).
Con mayor productividad, se pueden utilizar fermentadores más pequeños,
reduciéndose los costes de construcción (Amarasekara, 2013). Múltiples
configuraciones de reacción han sido evaluadas para mejorar la baja productividad típica
24
de los procesos fermentativos. La selección de la configuración de fermentación óptima

debe considerar tanto la simplicidad de operación como la productividad específica.
Los tres procesos básicos de fermentación son la fermentación discontinua por lotes o
en “batch”, la fermentación semi-continua o “fed-batch” y la fermentación continua
(Figura 1.5)
Figura 1.5. Esquemas de configuraciones de fermentación: A) Discontinuo, B)

Semicontinuo, C) Continuo.
1.7.1. Fermentación discontinua o “por lotes”

La fermentación discontinua es la configuración tradicionalmente empleada en la
industria. Este modelo de fermentación es un sistema de cultivo cerrado, en el que el
medio de fermentación es inoculado con un microorganismo. Durante el periodo de
crecimiento celular, no se realiza ninguna modificación del medio de fermentación a
excepción de la adición de ácidos o bases para controlar el pH y el proceso finaliza
cuando se agota la fuente de carbono disponible y los productos de fermentación han
sido generados. Durante la fermentación, tanto los sustratos y nutrientes como los
productos y la biomasa celular cambian continuamente (Dunn et al., 1992). Con esta
configuración, los microorganismos inicialmente trabajan en medios con alta
concentración en sustratos, por lo que el microorganismo necesita un tiempo de
adaptación al nuevo medio, denominado etapa de latencia. Pasado esta etapa, hay una
posterior etapa de crecimiento microbiano exponencial, seguida de una fase
25
Capítulo 1.
estacionaria de generación de producto. En la fase final de la fermentación, los

microorganismos están sometidos a un fuerte estrés debido a la elevada concentración
de producto en el medio, que en la mayoría de los casos provoca un decrecimiento de
la actividad metabólica hasta la autolisis (Diaz-Montaño, 2013).
La fermentación por lotes es un proceso de múltiples recipientes que permite una

operación flexible y un fácil control sobre el proceso (Ingledew, 2003; Godoy et al.,
2008). La principal desventaja de esta configuración es la baja productividad del proceso,
vinculada principalmente a los periodos de inactividad derivados de los periodos de
latencia durante el arranque y los periodos de limpieza del fermentador, una vez
finalizado el proceso antes de iniciar el siguiente lote de fermentación. Además, hay un
bajo control sobre el crecimiento microbiano y la producción de los compuestos de
interés frente a la generación de metabolitos secundarios. Esta configuración requiere
fermentadores de mayor tamaño, lo que supone un mayor coste de construcción y
operación, propios de los sistemas discontinuos (Napoli, 2009; Amarasekara, 2013).
1.7.2. Fermentación semi-continua o “fed-batch”

La fermentación semi-continua o “fed-batch” permite mantener un entorno nutricional
relativamente constante durante todo el proceso. El reactor se inicia en modo
discontinuo con baja concentración de sustrato, ocupando el caldo aproximadamente la
mitad del volumen inicial del fermentador. Cuando el sustrato es consumido por el
cultivo, se comienza a adicionar sustrato a una velocidad que permite mantener la
concentración total de solvente en el caldo por debajo de niveles tóxicos (Diaz-Montaño,
2013).
Esta configuración se emplea industrialmente cuando a una elevada concentración de

sustrato se producen inhibiciones o toxicidades en el microorganismo. Esto ocurre tal y
como se ha comentado en los apartados 1.5 y 1.6, tanto en la fermentación alcohólica
como en la fermentación ABE. Además, controlar la represión catabólica mediante el
control del sustrato, permite una adaptación más rápida de las bacterias y las levaduras,
favoreciendo la metabolización del carbono como fuente de energía (Napoli, 2009).
La fermentación semicontinua permite alargar los periodos de operación de los

microorganismos, alcanzando concentraciones celulares superiores, lo que mejora el
26
rendimiento y la productividad de los procesos. Además, se controla la producción de

metabolitos a través de la dosificación controlada del sustrato. Con esta configuración,
se pueden controlar desviaciones durante el crecimiento microbiano y es posible
reemplazar el agua perdida por evaporación (Amarasekara, 2013).
Entre las principales desventajas de esta configuración están la necesidad de tener

mejores habilidades de operación durante el arranque y el desarrollo del proceso, ya
que es muy importante mantener tanto la concentración como el volumen constante.
Además, trabajar con este modo de fermentación implica tener un amplio conocimiento
sobre la fisiología y el metabolismo de los microorganismos. En procesos semicontinuos
cíclicos, es necesario controlar la formación y acumulación de toxinas, lo que repercutirá
en el rendimiento final del proceso (Dunn et al., 1992; Diaz-Montaño, 2013).
1.7.3. Fermentación continua

En procesos continuos, el sustrato o medio de fermentación es alimentado al reactor de
modo constante, donde se mezclará con los microorganismos, bien directamente, bien
mezclándolo en un pre-fermentador, para posteriormente dosificar la mezcla en un
fermentador agitado o en un set de agitadores paralelos de volumen de operación
constante. El tiempo de residencia en cada fermentador debe ser controlado en función
del tiempo de residencia previamente definido (Amarasekara, 2013). De modo continuo,
se extrae del fermentador el mismo volumen de caldo fermentado que el medio fresco
adicionado, a través de un sistema de bombeo hasta la unidad de recuperación de
producto, para mantener un volumen de fermentación constante. Así, esta
fermentación es un proceso que no para y la fase exponencial se alarga hasta que el
sustrato se agota (Stanbury et al., 1999).
Con esta configuración, si el medio se alimenta de modo continuo en una relación

adecuada, se llega a alcanzar un estado estable en el reactor, en el que la formación de
nueva biomasa microbiana está equilibrada con la muerte celular. En un estado estable,
la tasa de crecimiento específica está controlado por la velocidad de dilución, que es un
parámetro determinado experimentalmente. Por lo tanto, las fermentaciones continuas
deben ser operadas con velocidades de dilución inferiores a la máxima tasa de
27
Capítulo 1.
crecimiento microbiana específica, al contrario que las fermentaciones discontinuas que

operan con la máxima tasa de crecimiento específica (Diaz-Montaño, 2013).
Las fermentaciones continuas presentan ciertas ventajas frente a los procesos

discontinuos a nivel industrial. Dado que la inoculación y el crecimiento celular no se
realizan cada ciclo y los microorganismos están bloqueados en la fase de crecimiento
exponencial, se mejoran la productividad y concentración de los solventes, aumenta el
tiempo de fermentación efectivo, lo que permite reducir el volumen de los reactores, a
la vez que se reduce drásticamente el tiempo de limpieza y esterilización de los equipos
(Ezeji et al., 2005), reduciendo tanto los costes materiales como laborales (Ingledew,
2003). Sin embargo, al igual que con la fermentación semicontinua, es imprescindible
una capacidad técnica superior de los operarios de las instalaciones. Las principales
desventajas en líneas generales de esta configuración de fermentación son los
problemas de contaminación y los problemas para mantener la velocidad de
fermentación elevadas, lo que reduce el rendimiento del proceso, así como garantizar
la estabilidad genética de los microorganismos con el tiempo (Ingledew, 2003).
Además, en bioprocesos complejos como la fermentación alcohólica o la fermentación

ABE, la producción de solventes no es estable y se reduce con el tiempo (Ingledew, 2003;
Ezeji et al., 2005; Godoy et al., 2008). Esto genera grandes fluctuaciones de los niveles
de solventes a lo largo del tiempo, con el consiguiente aumento de la formación de
metabolitos secundarios, lo que disminuye la productividad global del proceso. Además,
la concentración final de solventes es bastante inferior a los valores documentados para
los procesos discontinuos, lo que dificulta su empleo a escala industrial (Ezeji et al., 2005;
Godoy et al., 2008). Otro grave problema asociado a esta configuración en el caso de la
fermentación ABE es la posible degeneración de la capacidad de producir solventes en
el caso de la especie C. acetobutylicum, debida a la pérdida del megaplásmido (pSOL1)
que contiene los genes solventogénicos. En el caso de la especie C. beijerinckii, estos
genes se encuentran en su cromosoma, por lo que presenta un problema menor de
degeneración (Milne et al., 2011). Para tratar de mejorar la productividad y rendimiento
final, procesos en dos fases o multifase han sido estudiados para tratar de separar las
fases de crecimiento (acidogénesis) de la fase de producción (solventogénesis).
28
1.7.3.1. Bioprocesos continuos con inmovilización

celular
En base en resultados publicados hasta el momento, las configuraciones con células
libres, tanto discontinuas como continuas, no garantizan un prometedor desarrollo de
los procesos demostrativos a escala comercial. La viabilidad del proceso exige superar
las limitaciones tanto del proceso continuo (baja productividad) como del discontinuo
(largos periodos de inactividad) (Godoy et al., 2008; Napoli, 2009). Por tanto, se debe
continuar trabajando en aumentar el rendimiento por unidad de volumen de reactor y
reducir los costes de operación (Becerra et al., 2015; Sarangi y Nanda, 2018).
Los reactores operados en continuo que utilizan microorganismos inmovilizados o en

reactores de membrana con reciclado en continuo de microorganismos, ofrecen una
productividad superior a los procesos en continuo con microorganismos libres, gracias a
la mayor concentración celular (Es et al., 2015; Pal et al., 2018).
Los procesos de inmovilización celular consisten en confinar las células en una estructura
física que las obligue a permanecer en una determinada región espacial, preservando su
actividad catalítica (Karel et al., 1985). Las tecnologías de inmovilización más comunes
son la adsorción, el atrapamiento y la formación de enlaces covalentes (Nuñez y Lema,
1987). Las técnicas de atrapamiento y formación de enlaces covalentes requieren el
empleo de sustancias químicas que en muchas ocasiones interfieren en la propagación
o crecimiento celular en el reactor y aumentan los costes de operación.
Los sistemas con inmovilización de microorganismos presentan importantes ventajas

frente a los sistemas de células libres como son la facilidad de separación de las células
al estar retenidas en una matriz, la elevada densidad celular por unidad de volumen de
reacción, lo que permite reducir el volumen de fermentación y los costes de
inmovilizado material, así como una mayor flexibilidad en el diseño del reactor,
pudiéndose emplear reactores tanto de lecho fijo como de lecho percolado o fluidizado,
en procesos continuos. Además, con esta configuración se consigue un mayor control
de la cinética de reacción, un mejor aprovechamiento de los nutrientes y una menor
inhibición por producto, a la vez que se logra una mejor transferencia de masa debido a
la menor viscosidad del medio y un menor riesgo de contaminación (Kourkoutas et al.,
29
Capítulo 1.
2004; Eş et al., 2015). Sin embargo, las técnicas de inmovilización celular también
presentan desventajas, como una disminución de la accesibilidad del sustrato,
alteraciones en la conformación y la actividad del biocatalizador y problemas de estrés
en el biocatalizador, además de costosos sistemas de reacción (Eş et al., 2015).
La adsorción es un proceso de adhesión natural de las células a los soportes de fijación

con el posterior crecimiento celular sobre el mismo soporte (Qureshi y Maddox, 1987).
La adsorción es la técnica de inmovilización celular que consigue una retención celular
alta en procesos reversibles del modo más simple, rápido y barato, pudiéndose utilizar
superficies de adsorción tanto orgánicas como inorgánicas. Sin embargo, los enlaces no
son específicos, por lo que se producen problemas de sobrecarga celular, impedimentos
estéricos en los soportes, contaminación por producto o desorción celular por agentes
externos, como el pH o el estrés iónico (Elnashar, 2011). Los problemas intrínsecos de la
adsorción se pueden solventar utilizando enlaces alternativos como la adsorción-
reticulación, la adsorción selectiva con enlace covalente o la adsorción-revestimiento
(Cao, 2015).
Los soportes inorgánicos presentan ciertas ventajas sobre los soportes orgánicos, al ser
fáciles de manejar, estables, reutilizables, esterilizables con vapor y baratos. Además, no
requieren pretratamientos previos como la deslignificación o la derivatización, lo que
simplifica los procesos de inmovilización (Gonçalves et al., 1992; Genisheva et al., 2011).
Sobre los soportes pueden adherirse células microbianas para producir compuestos
químicos, tal y como ocurre con la fermentación ABE o la fermentación alcohólica, en
estructuras de biopelícula o biofilm. Las biopelículas se desarrollan en cinco etapas tal y
como se muestra en la Figura 1.6. Hay una etapa inicial de fijación, seguida de una etapa
de unión irreversible, al generarse sustancias poliméricas extracelulares (SPE), una etapa
de desarrollo, seguida de una etapa de maduración de la arquitectura de las biopelículas
y una etapa final de liberación de células del biofilm (Stoodley et al., 2002). La capa SPE
ejerce como nexo de unión del microorganismo con la superficie, protegiendo a las
células de tensiones mecánicas o toxicidades por compuestos químicos o
microorganismos. Sin embargo, la capa SPE es una barrera a los nutrientes necesarios
para el crecimiento de las células, generando un microambiente en la biopelícula muy
diferente del microambiente del medio de fermentación (Karaguler et al., 2017).
30
Figura 1.6.Etapas de desarrollo de una película de biofilm (Karaguler et al., 2017).
Las superficies rugosas facilitan la formación de biopelículas y los materiales porosos

generan un ambiente protegido para la adhesión celular (Van der Wende et al., 1990).
La formación de las biopelículas se favorece en materiales hidrofóbicos, formándose
mucho más rápidamente en teflón y otros plásticos que en vidrio o metal (Donlan y
Costerton, 2002). Las temperaturas elevadas (Annachhatre y Bhamidimarri, 1992) y las
concentraciones de nutrientes elevadas (Cowan et al., 1991) aumenta la tasa de
crecimiento celular y en la producción de la SPE, favoreciendo la inmovilización.
Diversos soportes de inmovilización han sido utilizados para la producción de etanol y

butanol, incluyendo: polímeros (p.j., alginato, agar, carragenina, colágeno, quitosano,
etc.), materiales inorgánicos (p.j. arcilla, vidrio sinterizado, plástico o alúmina) y
materiales orgánicos (p.j. algodón, carbón vegetal, residuos agrícolas y forestales, etc.)
(Nedovic y Willaert, 2005; Margaritis y Kilonzo, 2005; Saratale y Oh, 2012; Kilonzo y
Bergougnou, 2012; Eş et al., 2015).
En la Tabla 1.2, se recogen ejemplos de producción de etanol en procesos con

inmovilización celular utilizando lactosa como sustrato. Asimismo, en la Tabla 1.3, se
recopilan ejemplos de producción de butanol mediante fermentación ABE en procesos
con inmovilización celular utilizando como sustrato lactosa.
31
Capítulo 1.
Tabla 1.2. Recopilación bibliográfica de obtención de etanol en procesos con inmovilización celular
Sustrato Levadura Soporte/Tipo bioreactor YE/S (g/g) QE (g/L·h) η (%) Referencia
Suero hidrolizado/ K.marxianus CCT4086 Alginato/ RLFl 0,49/0,47 1,68/1,39 96,0/90,2 Gabardo et al., 2015
Permeado suero S. cerevisiae
hidrolizado CAT-1 0,44/0,35 0,78/0,32 86,0/68,4
(L=56 g/L) PE-2 0,43/0,36 0,78/0,31 83,6/70,4
CAT-1/CCT48086 0,44/0,40 1,32/1,30 86,0/79,2
Permeado de suero K. marxianus Alginato/ RLFl Gabardo et al., 2014
(L=90 g/L) CBS 6556 0,45 1,96 83,6
CCT4086 0,47 2,53 89,2
CCT2653 0,33 0,75 61,8
Suero K. marxianus TY-3 Alginato/ RLFl 0,34 0,68 63,1 Guo et al., 2010
(L=100 g/L) S. cerevisiae
TY-3/ AY-5 (mezcla) 0,43 0,88 79,9
TY-3/AY-5 (co-inmovilizado) 0,42 0,85 77,0
Suero K. marxianus Alginato/ RLFl
(L=60 g/L) CCT 6556 0,45 0,96 83,3 Gabardo et al., 2012
CCT 4086 0,43 0,81 79,1
CCT 2653 0,45 0,84 73,3
Suero en polvo K. marxianus DSMZ-7239 Pepita aceituna/ RLF 0,52 -- Ozmihci y Kargi, 2008
(L=100 g/L)
Medio sintético K. fragilis NRRL 665 Alginato 0,36 0,74 51,7 Gunasekaran et al., 1991
(L=150 g/L) Zymomonas mobilis
NRRL B4286 0,44 0,88 61,9
665/B4286 (mezcla) 0,47 0,89 62,9
665/B4286 (co-inmovilización) 0,47 1,0 70,0
Permeado de suero K. marxianus NCYC 179 Alginato/ carragenina 0,43 - 82,2 Marwaha y Kennedy, 1984
(L=100 g/L)
RLFl = Reactor de lecho fluidizado; RLF = Reactor de lecho fijo; YE/S = rendimiento etanol-sustrato; QE = Productividad; ɳ = Rendimiento porcentual de
fermentación; L = concentración de lactosa.
32
Tabla 1.3. Recopilación bibliográfica de obtención de butanol en procesos con inmovilización celular
Sustrato Bacteria Soporte/Tipo biorreactor YB/S (g/g) QB (g/L·h] CABE (g/L) Referencia
Medio sintético C. acetobutylicum DSM 792 Anillos de Tygon ®/ RLF (4 0,18 9,2 15,0 Raganati et al., 2016
(L= 100 g/L) en serie)
Medio sintético C. acetobutylicum DSM 792 Bioreactor de membrana 0,15 0,5 5,62 Procentese et al., 2015
(L= 50 g/L) de microfiltracion
Suero lácteo C. acetobutylicum DSM 792 Anillos de Tygon®/ RLF 0,26 2,7 6,01 Raganati et al., 2013
(L= 28 g/L)
Medio sintético C. acetobutylicum DSM 792 Silicagel, arena, bolas de 0,88 4,4 5,19 Napoli et al., 2010
(L=30 g/L) cristal, Anillos de teflón,
anillos de PVC, anillos de
Tygon ®/ RLF
Permeado de suero C. acetobutylicum P262 Hueso/ RLF + 0,22 2,0 3,59 Friedl et al., 1991
(L=60-160 g/L) pervaporacion
Permeado de suero C. acetobutylicum P262A Bioreactor de membrana -- -- 7,13 Ennis y Maddox, 1989
(L=50 g/L) de microfiltración
Permeado de suero C. acetobutylicum P262 Carbón vegetal/ RLF 0,23 4,1 4,1 Qureshi y Maddox, 1987
(L=45-50 g/L)
Permeado de suero C. beyerinckii LMD 27.6 Alginato/RLFl -- 0,5-1,0 2,1 (B) Schoutens et al., 1985
(L= 37 g/L)
RLFl=Reactores de lecho fluidizado; RLF=Reactor de lecho fijo; YB/S = rendimiento butanol-sustrato; QB = Productividad butanol; CABE = concentración de
solventes ABE (Acetona-Etanol-Butanol); L = concentración de lactosa.
33
Capítulo 1.
1.8. Recuperación de solventes

Para recuperar los alcoholes generados en la fermentación alcohólica y ABE de los caldos
de fermentación, se utilizan tecnologías de separación y purificación, incluyendo la
destilación, la adsorción, el arrastre de vapor o gas stripping, la extracción líquido-
líquido, la pervaporación, la perstracción o las separaciones híbridas (Abdehagh et al.,
2014; Friedl, 2016; Patraşcu et al., 2017).
La destilación clásica es la tecnología de recuperación más consolidada y utilizada

industrialmente a pesar de su elevada demanda energética (Friedl, 2016; Patraşcu et al.,
2017). Es una tecnología robusta con un factor de recuperación del alcohol alto y fácil
de escalar (Vane, 2008). Sin embargo, hay una gran necesidad en mejorar la eficiencia
energética de las tecnologías de separación de alcoholes y buscar alternativas a la
destilación. Además, la purificación de estos compuestos hasta el grado requerido
industrialmente no puede lograrse utilizando una única tecnología de separación, sino
que requiere el uso de combinaciones de tecnologías de separación y purificación
(Venkatesen, 2013).
Por otro lado, tanto en la fermentación alcohólica como en la fermentación ABE, a partir
de ciertas concentraciones de solventes se observan importantes inhibiciones
microbianas. Así, en el caso de la fermentación alcohólica, las levaduras comienzan a
sufrir inhibiciones a partir del 5% (p/p) de etanol que se intensifican a partir del 10%
(p/p) de etanol (Vane, 2008). Con concentraciones de butanol entre 1 – 2% (p/p), se
observan importantes inhibiciones en el crecimiento bacteriano debido a las
interacciones con la membrana plasmática (Kumar y Gayen, 2011), lo cual supone una
limitación importante para la generación de butanol por vía fermentativa. Para solventar
este problema, se trabaja tanto en la obtención de cepas bacterias más tolerantes al
butanol mediante ingeniería genética como en el empleo de tecnologías de
recuperación in situ de los solventes generados en el reactor a medida que se produce.
Mediante técnicas in situ de recuperación de producto, se mejora el aprovechamiento

de los sustratos y se minimizan las inhibiciones microbianas, a la vez que se reducen los
costes de recuperación, mejorando el rendimiento y la productividad global de los
procesos fermentativos (de Vrije et al., 2013; Xue et al., 2014). Diferentes técnicas
34
integradas de recuperación de solventes in situ junto con la fermentación y diversos

tipos de sustratos han sido estudiadas (Vane, 2008; Ramaswamy et al., 2013; Huang et
al., 2014; Xue et al., 2014). Todas estas tecnologías presentan tanto ventajas como
desventajas en función de su capacidad, selectividad, ensuciamiento, atascos, escalado,
simplicidad operacional o requerimientos energéticos (Ezeji et al., 2007, 2010; Vane,
2008; Oudshoorn et al., 2009). A continuación, se desarrollan esquemáticamente las
principales técnicas viables de recuperación in situ de alcoholes en procesos de
recuperación combinados con la fermentación.
1.8.1. Destilación
Tanto el etanol como el butanol presentan un Equilibrio Líquido-Vapor (ELV) favorable
en soluciones acuosas para la concentración de los alcoholes en la fase vapor. A presión
atmosférica, el etanol forma un azeótropo con agua al 95,6% de etanol a 78,2 °C (Weast,
1988). Por encima del azeótropo, la volatilidad relativa del etanol es muy baja. Como el
etanol para uso carburante requiere una pureza del 99,7% (p/p) (EN 15489 y EN 15692),
está aceptado industrialmente el empleo de técnicas de adsorción por tamiz molecular
para la deshidratación del alcohol.
El sistema de destilación estándar de la industria del bioetanol es el uso de hasta tres

columnas de separación (unidad de stripping, unidad de rectificación y unidad de
rectificación en colas) unido a un tamiz molecular empleando zeolitas (Kwiatkowski et
al., 2006). Con esta configuración se consigue mejorar significativamente la integración
energética del proceso frente a la destilación clásica a pesar de su mayor complejidad y
coste de equipamiento asociado (Vane, 2008).
Al contrario de lo que ocurre con la mezcla etanol-agua, la mezcla butanol-agua se puede

separar combinando columnas de destilación y equipos de separación. A presión
atmosférica, el sistema butanol-agua, presenta un azeótropo a 93 °C con sólo un 55,5%
(p/p) de butanol (Weast, 1988). Además, el butanol sólo es soluble en agua a
concentraciones de butanol inferiores a 7,7% (p/p). Dado que el azeótropo se produce
por encima de este límite de solubilidad, se forman dos fases en el azeótropo. La fase
superior contiene un 79,9% en peso de butanol mientras que la fase inferior contiene
un 7,7% de butanol (Weast, 1988). Dada la separación de fases azeotrópicas y la relativa
35
Capítulo 1.
buena volatilidad del butanol, los sistemas de destilación multi-columna o la integración

de un sistema de destilación a la fermentación se convierten en una alternativa viable
para recuperar butanol al 99,9% (p/p) (Seader et al., 1998; Mariano et al., 2011).
En el caso del butanol, la destilación supone una demanda excesiva de energía. Se

requieren 79,5 MJ/kg de butanol recuperado en un proceso de destilación clásico.
Cuando se parte de un caldo de fermentación con una concentración de butanol
alrededor de 0,5% (p/v), se traduce en un requerimiento energético del 220% de la
energía contenida en el butanol (Patraşcu et al., 2017). Esta energía puede disminuir
hasta 36 MJ/kg de butanol, si se parte de una solución con una concentración inicial de
butanol del 1% (p/v), que equivale a la energía que contiene el propio butanol
(Matsumura et al., 1988; Oudshoorn et al., 2009). Para tratar de garantizar la viabilidad
global de la fermentación ABE es imprescindible reducir drásticamente este valor (hasta
un 20% o incluso menos). Esto se puede conseguir combinando tecnologías de
recuperación in situ de producto (Bildea et al., 2016; Xue et al., 2014).
1.8.2. Arrastre de vapor o gas-stripping

El arrastre de vapor o gas-stripping es una buena opción alternativa a la destilación para
la recuperación in situ de alcoholes (Xue et al., 2014; Friedl, 2016). Las principales
ventajas de esta técnica son la simplicidad de operación, su inocuidad para los
microorganismos, el bajo aporte energético necesario y la moderada inversión de capital
para las instalaciones (Xue et al., 2014;). Además, esta técnica es fácilmente integrable
en configuraciones de fermentación discontinuas, semi-continuas y continuas, lo que la
hace muy adecuada para su aplicación a escala industrial (Ezeji et al., 2005; Rom et al.,
2016). En la Figura 1.7, se muestra un esquema de esta técnica de recuperación de
alcohol de caldos de fermentación.
El principio de operación del arrastre de vapor se basa en el contacto directo líquido-gas

a contracorriente, gobernado por el equilibrio líquido-vapor, de un modo similar a la
destilación clásica. Así, solventes volátiles contenidos en el caldo de fermentación se
transfieren en fase vapor a un gas inerte, que actúa como agente portador, hasta
recuperarse en una trampa de frío o un tamiz molecular (Huang et al., 2008).
36
Una variante del gas-stripping es la fermentación a vacío, basada en la recuperación de

los solventes en condiciones de vacío, lo que disminuye las temperaturas de ebullición,
y por lo tanto, la temperatura de condensación. Se pensaba que la fermentación a vacío
no era válida para recuperar solventes más volátiles que el agua, lo cual excluye al
butanol, con un punto de ebullición superior al del agua (118 °C) (Roffer et al., 1984).
Sin embargo, Mariano et al. (2008) demostraron la viabilidad de recuperar butanol
mediante esta técnica, consiguiendo una productividad de 0,43 g/L·h de butanol, sin
dañar a los microorganismos y disminuyendo los tiempos de fermentación a 44 horas,
con un consumo total del sustrato y un mayor crecimiento celular y (Mariano et al.,
2011).
Figura 1.7. Esquema de la recuperación de solventes por gas-stripping (Adaptado de

Vane, 2008).
El arrastre de vapor permite obtener alcoholes de gran pureza, a pesar de ser una
técnica poco selectiva, ya que la separación está regida por el equilibrio líquido-vapor.
No obstante, el contacto contracorriente entre el caldo de fermentado y el gas de
arrastre incrementa el área de contacto y, por tanto, la velocidad de recuperación.
Además, el uso del propio gas generado de la fermentación como gas de arrastre
permite mejorar la economía del proceso.
37
Capítulo 1.
La relación alcohol-gas inerte es una función que depende de un modo importante de la

temperatura de operación, ya que la presión de vapor de los compuestos volátiles en la
fase gaseosa se determina, según la ecuación:
𝑃 =𝑦𝑃 =𝑥𝛾𝑃 (ec. 1.1)
donde Pi es la presión parcial, PTotal es la presión total de la fase gaseosa, yi y xi son la

fracción molar de la fase gaseosa y la fase líquida, respectivamente, γi es el coeficiente
de actividad en la fase líquida y Pisat es la presión de vapor saturado.
La presión de saturación es muy sensible a la temperatura. Así, ligeros aumentos de la

temperatura provocan importantes incrementos en la presión de saturación de los
compuestos. Por lo que, para una misma presión, el volumen de gas necesario para
eliminar el solvente se reduce significativamente. El alcohol transferido a la fase vapor
se puede recoger por diversos medios, destacando el uso de la condensación (Ennis et
al., 1986), aunque se pueden emplear distintos métodos de separación como
tecnologías de membranas o adsorción (Vane, 2008).
La selectividad de la separación del butanol (αB), el factor de recuperación (ηB) y la

concentración de butanol recuperado, dependen de las condiciones de operación,
incluyendo el flujo de gas utilizado, la temperatura de enfriamiento y los parámetros de
fermentación (concentración de butanol, temperatura y densidad celular en el medio)
(Ezeji et al., 2003; Thang et al., 2010; Xue et al., 2014). El gas stripping presenta una
selectividad baja en comparación con otros métodos de separación (Oudshoorn et al.,
2009), con concentraciones finales de butanol inferiores a 70 g/L de butanol y 120 g/L
de solventes ABE (Xue et al., 2013). Dadas las bajas concentraciones de butanol, se
requiere una etapa posterior de recuperación con un elevado consumo energético. El
consumo energético de la recuperación de butanol por gas-stripping, seguido de una
etapa de destilación o evaporación a vapor es de 14 – 31 MJ/kg, dependiendo del
proceso y la concentración de butanol en el caldo de fermentación (Xue et al., 2014).
La optimización de los parámetros claves en el gas-stripping permite mejorar la

recuperación de butanol y el ahorro energético para un proceso integrado de
fermentación ABE con recuperación in situ mediante gas-stripping (Xue et al., 2013).
Además, realizar recuperaciones intermitentes de butanol mediante gas-stripping
38
permite reducir hasta un 66% el consumo energético (Xue et al., 2014). Asimismo, Xue
et al. (2014) han documentado que el uso de un proceso in situ de recuperación
mediante gas-stripping en dos fases, permite obtener un condensado con una
concentración de butanol 26 veces superior a la del caldo de fermentación. En este
proceso, se obtiene un condensado con una elevada concentración de butanol [51,5%
(p/v) y 67,1% (p/v) de solventes ABE], a partir de un caldo de fermentación con una
concentración de butanol del 1% (p/v). Por lo tanto, el proceso de gas-stripping en dos
fases permite reducir al menos en un 50% el consumo energético (7 – 15 MJ/kg butanol)
del producto recuperado (Xue et al., 2014). Por lo tanto, los procesos de fermentación
integrados con recuperación in situ de butanol son una alternativa viable desde un
punto de vista energético y económico para la producción de butanol (Xue et al., 2013).
1.8.3. Extracción Líquido-Líquido (L-L)

La extracción L-L es un proceso de separación de solventes basado en el contacto
continuo de la solución acuosa enriquecida en los solventes de interés con uno o más
líquidos extractantes. Estos líquidos extractantes son fluidos inmiscibles en la solución
acuosa que extraen selectivamente los solventes del caldo de fermentado, sin afectar al
resto de componentes, fundamentalmente nutrientes y células (Vane, 2008; Huang et
al., 2014). Un esquema típico del proceso de se muestra en la Figura 1.8.
El contacto entre el caldo de fermentación y el extractante líquido puede ser “directo”

a través de una columna de contacto o “indirecto” a través de una membrana porosa no
permeable (en este caso, la tecnología se denomina “perstracción”). Para reducir el
consumo de reactivos químicos es posible reutilizar el extractante, utilizando una unidad
de regeneración como el gas stripping, la destilación o la pervaporación utilizando
membranas (Vane, 2008). Esta técnica ha sido utilizada para recuperar etanol y butanol
tanto en procesos discontinuos como en procesos en línea integrados con la
fermentación (Huang et al., 2014).
El factor más importante de la extracción L-L es la adecuada selección del agente de

extracción, ya que debe ser un compuesto no tóxico para los microorganismos, tener
una alta selectividad a los solventes de interés, presentar un coeficiente de distribución
alto, ser insolubles en agua y no formar parte de los nutrientes, sustratos o productos
39
Capítulo 1.
intermedios de fermentación. Por otra parte, el extractante debe presentar una elevada
tensión interfacial con el agua para facilitar la separación, una baja viscosidad, una
mínima solubilidad en agua, una alta estabilidad térmica, ser fácilmente regenerado,
biodegradable y presentar una diferencia de densidad elevada, para facilitar la
operación en contracorriente (Huang et al., 2014). Entre los potenciales extractantes
para la recuperación de etanol y butanol destacan el alcohol oleico, los ácidos grasos,
los aceites vegetales, el biodiésel, los surfactantes o los líquidos iónicos (Vane, 2008).
Figura 1.8. Esquema de la recuperación de solventes por extracción Líquido-Líquido

(Adaptado de Vane, 2008).
La extracción L-L es una tecnología energéticamente eficiente para recuperar alcoholes,

siendo más eficiente la separación en el caso del butanol que en el del etanol (Huang et
al., 2014). El desarrollo de nuevos extractantes mejorados como los líquidos iónicos
favorecerá la eficiencia de esta tecnología. Sin embargo, el alto coste de los extractantes
específicos es un factor limitante adicional a esta técnica (Ezeji et al., 2005).
1.8.4. Pervaporación
La pervaporación es un proceso de separación basado en interacciones moleculares
entre los componentes de la alimentación y una membrana, porosa de tipo orgánico o
inorgánico por un lado y no porosa por el otro lado. Como se muestra en la Figura 1.9,
40
se aplica vacío al caldo de fermentación de un lado de la membrana, los compuestos

volátiles difunden y son transportados a través de la membrana y desorbidos al lado del
permeado en forma de vapor. La separación se produce como resultado de un gradiente
de potencial químico, debido a las diferencias de presión parcial de vapor de los
componentes entre los dos lados de la membrana. La presión parcial de vapor de los
componentes en la alimentación está en saturación y viene fijada por la temperatura y
la composición de la mezcla líquida y por la naturaleza de los componentes. El otro lado
de la membrana se mantiene a baja presión mediante la aplicación de vacío mediante
un gas portador inerte o condensación a bajas temperaturas (Garcia et al., 2011).
Figura 1.9. Esquema de la recuperación de solventes por pervaporación (Adaptado de

Vane, 2008)
Esta técnica es especialmente eficaz cuando la concentración del compuesto a recuperar

de la alimentación es baja (intervalos de concentración de 200 a 50.000 ppm). Esta
característica hace que la pervaporación sea especialmente conveniente para la
recuperación de butanol, dada su baja concentración en el caldo de fermentado.
Además, la pervaporación se puede acoplar fácilmente a la fermentación de modo que
los solventes se retiran continuamente, tan pronto como se forman. Además, el proceso
es energéticamente eficiente e inofensivo para el caldo de fermentación (Garcia et al.,
2011; Selvaraj y Banat, 2019).
41
Capítulo 1.
El material de la membrana influye en la separación alcanzada en el proceso. Si el

material de la membrana es hidrófobo, la membrana permeará preferentemente
compuestos orgánicos en relación con el agua y el permeado se verá enriquecido en los
compuestos orgánicos. Por el contrario, si la membrana presenta propiedades hidrófilas,
se enriquecerá en agua en el permeado y los compuestos orgánicos permanecerán en
el retenido (Ranjan y Moholkar, 2012). Los dos parámetros principales son la
selectividad de la membrana, denominada factor de enriquecimiento y el flujo (Garcia
et al., 2011). Los valores de estos parámetros dependen de las condiciones
experimentales (temperatura, composiciones de alimentación, material y espesor de la
membrana y las presiones a ambos lados de la membrana) (Qureshi y Blaschek, 1999).
Se han realizado una gran cantidad de trabajos para recuperar tanto etanol como
butanol de caldos de fermentación utilizando membranas permeables (Vane, 2008;
Garcia et al., 2011; Castro-Muñoz et al., 2018). La mayoría de los estudios publicados
utilizan membranas de polidimetilsiloxano (PDMS). Se selecciona este polímero debido
a su alta permeabilidad, su elevada selectividad y su buena adaptabilidad a diversas
formas de membrana, tanto con formatos planos como tubulares (Thongsukmak y
Sirkar, 2007). El rendimiento de la membrana de PDMS ha mejorado mucho
incorporando silicalita en caucho de silicona (Huang y Meagher, 2001; Fouad y Feng,
2008). Otros materiales utilizados son bloques de amida de poliéter (PEBA) (Fouad y
Feng, 2008) y poli-1-trimetilsilil-1-propino (PTMSP) (Thongsukmak y Sirkar, 2007). La
principal desventaja que presenta este material es que componentes impermeables
presentes en el caldo, tales como ácidos, bases, sales y azúcares, puedan influir en el
rendimiento de la pervaporación, al penetrar la membrana y causar su ensuciamiento y
deterioro (Garcia et al., 2009).
1.8.5. Perstracción
Una variante de la pervaporación es la perstracción, que en esencia combina los
principios de la pervaporación y la extracción L-L (Ranjan y Koholmar, 2012). Este
proceso supera ciertas deficiencias del proceso de extracción L-L, como son la toxicidad
del disolvente, la agregación de microorganismos en la interfase L-L, la formación de
emulsiones y los problemas de separación entre las fases acuosa-orgánica (Qureshi y
42
Maddox, 2005). Otra ventaja de esta técnica es el control independiente de la velocidad

del flujo del caldo y del extractante. Asimismo, una disposición en serie de los módulos
de las membranas de fibra hueca facilita el funcionamiento en modo de contracorriente,
favoreciendo una eliminación eficaz de butanol. Con la perstracción, se consigue la
difusión de los productos de fermentación de modo controlado, basándose en la
diferencia de presiones de vapor de los componentes de difusión en los dos lados de la
membrana. Una vez que los componentes atraviesan la membrana, los productos se
disuelven inmediatamente en el extractante.
1.8.6. Adsorción
La adsorción, fundamentalmente los tamices moleculares, han sido ampliamente
utilizados para deshidratar el bioetanol para la obtención de etanol anhidro para uso
carburante. La adsorción también tiene un gran potencial para la separación de butanol
de caldos de fermentación ABE (Stagg y Nielsen, 2015).
En los procesos de adsorción, las moléculas, tanto de líquidos como gaseosas, se unen
preferentemente a una superficie sólida. La fase sólida se llama “adsorbente”, el
componente adsorbido se denomina “adsorbato”. La adsorción se debe a las fuerzas de
atracción existentes entre la superficie del adsorbente y las moléculas de adsorbato. Las
fuerzas atractivas son de tipo van der Waals (dispersión y repulsión), fuerzas
electrostáticas y enlaces químicos (Venkatesen, 2013). La relación de equilibrio entre la
cantidad de material adsorbido por un sólido y la presión del gas, a temperatura
constante, se denomina isoterma de adsorción y se obtienen experimentalmente. En la
Figura 1.10, se esquematiza del proceso de adsorción cíclica. Los adsorbentes son
generalmente más biocompatibles que los solventes, totalmente inmiscibles y no
emulsionan, lo que facilita su separación de los microrganismos y favorece su
regeneración y reutilización repetitiva (Huang et al., 2014). El proceso de adsorción se
desarrolla en dos etapas: una primera etapa de adsorción seguida de una etapa de
desorción para obtener una solución concentrada del solvente a recuperar con
regeneración de los adsorbentes.
La selectividad del adsorbente influye significativamente sobre el rendimiento del

proceso de recuperación ya que los caldos de fermentación contienen numerosos
43
Capítulo 1.
metabolitos generados, sustratos y nutrientes no agotados (Dürre, 2007). La capacidad

de adsorción, la selectividad y la facilidad de desorción dependen del material
adsorbente sólido utilizado (Abdehagh et al., 2014). Destacan tres tipos de materiales
adsorbentes para la recuperación de butanol y etanol de caldos de fermentación: el
carbón activado, las zeolitas y las resinas poliméricas.
Figura 1.10. Esquema de la recuperación de solventes por adsorción, incluyendo tanto

el ciclo de carga como el de regeneración (Adaptado de Vane, 2008).
La desorción de especies adsorbidas de un adsorbente se puede realizar mediante (1)

oscilación de presión, (2) purga de arrastre de vapor, (3) desorción por desplazamiento
y (4) oscilación térmica (Oudshoorn et al., 2012). La regeneración del adsorbente
mediante oscilación térmica es la técnica de regeneración más utilizada (Oudshoorn et
al., 2012). Las operaciones de oscilación térmica utilizan el cambio en el
comportamiento de adsorción en función de la temperatura.
44
Referencias
Abdehagh, N., Tezel, F. H., & Thibault, J. (2014). Separation techniques in butanol production:
challenges and developments. Biomass and Bioenergy, 60, 222-246.
Adam, A. C., Rubio-Texeira, M., & Polaina, J. (2005). Lactose: the milk sugar from a
biotechnological perspective. BFSN, 44(7-8), 553-557.
Ahlgren, E. O., Börjesson Hagberg, M., & Grahn, M. (2017). Transport biofuels in global energy–
economy modelling–a review of comprehensive energy systems assessment
approaches. Gcb Bioenergy, 9(7), 1168-1180.
Ahmad, T., Aadil, R. M., Ahmed, H., ur Rahman, U., Soares, B. C., Souza, S. L., ... & Freitas, M. Q.
(2019). Treatment and utilization of dairy industrial waste: A review. Trends in Food
Science & Technology.
Alternative Fuel Data Center. (Disponible online:

https://www.afdc.energy.gov/data/?q=ethanol.).
Al-Wasify, R. S., Ali, M. N., & Hamed, S. R. (2017). Biodegradation of dairy wastewater using
bacterial and fungal local isolates. Water Science and Technology, 76(11), 3094-3100.
Amarasekara, A. S. (2013). Handbook of cellulosic ethanol. John Wiley & Sons.
Annachhatre, A. P., & Bhamidimarri, S. M. R. (1992). Microbial attachment and growth in fixed-
film reactors: process startup considerations. Biotechnology advances, 10(1), 69-91.
Arshad, M., Hussain, T., Iqbal, M., & Abbas, M. (2017). Enhanced ethanol production at
commercial scale from molasses using high gravity technology by mutant S.
cerevisiae. Brazilian Journal of Microbiology, 48(3), 403-409.
Bahl, H., & Dürre, P. (2000). Biotechnology and medical applications. Biotechnology, 2(1).
Bai, F. W., Anderson, W. A., & Moo-Young, M. (2008). Ethanol fermentation technologies from
sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances, 26(1), 89-105.
Baker, J. A., Li, J., Zhou, D., Yang, M., Cook, M. N., Jones, B. C., ... & Lu, L. (2017). Analyses of
differentially expressed genes after exposure to acute stress, acute ethanol, or a
combination of both in mice. Alcohol, 58, 139-151.
Becerra, M., Cerdán, M. E., & González-Siso, M. I. (2015). Biobutanol from cheese
whey. Microbial Cell Factories, 14(1), 27.
45
Capítulo 1.
Bertoldi P., Diluiso F., Castellazzi L., Labanca N. and Ribeiro Serrenho T., Energy Consumption
and Energy Efficiency Trends in the EU-28 2000-2015, EUR 29104 EN, Publications Office
of the European Union, Luxembourg, 2018, ISBN 978-92-79-79372-1, doi:10.2760/6684,
JRC110326.
Bîldea, C. S., Patraşcu, I., Hernandez, J. S., & Kiss, A. A. (2016). Enhanced down-stream
processing of biobutanol in the ABE fermentation process. In Computer Aided Chemical
Engineering (Vol. 38, pp. 979-984). Elsevier.
Cao, Y., Wang, K., Wang, X., Gu, Z., Gibbons, W., & Vu, H. (2015). Adsorption of butanol vapor
on active carbons with nitric acid hydrothermal modification. Bioresource
Technology, 196, 525-532.
Castro-Muñoz, R., Galiano, F., Fíla, V., Drioli, E., & Figoli, A. (2019). Mixed matrix membranes
(MMMs) for ethanol purification through pervaporation: Current state of the
art. Reviews in Chemical Engineering.
CE (2018a). Commission staff working document: “Evaluation of the EU Strategy on adaptation

to climate change” accompanying the document “Report from the Commission to the
European Parliament and the Council on the implementation of the EU Strategy on
adaptation to climate change” of 12 November 2018. (Document number: 32018L2001).
CE (2018b). DIRECTIVA (UE) 2018/2001 del Parlamento Europeo y del Consejo de 11 de

diciembre de 2018 relativa al fomento del uso de energía procedente de fuentes
renovables (versión refundida).
CE (1996). DIRECTIVA 96/61/CE DEL CONSEJO de 24 de septiembre de 1996 relativa a la

prevención y al control integrados de la contaminación
Chen, G. Q., Talebi, S., Gras, S. L., Weeks, M., & Kentish, S. E. (2018). A review of salty waste
stream management in the Australian dairy industry. Journal of Environmental
Management, 224, 406-413.
Cheryan, M. & Alvarez, J. R. (1995). Food and beverage industry applications. In: Membrane
Science and Technology (Vol. 2, pp. 415-465). Elsevier.
Corrales, L., Romero, D., Macías, J. & Vargas, A. (2015). Bacterias anaerobias: procesos que
realizan y contribuyen a la sostenibilidad de la vida en el planeta. Nova. 13. 55.
Costerton, J. W. (1999). Introduction to biofilm. International Journal of Antimicrobial

Agents, 11(3-4), 217-221.
46
Cowan, M. M., Warren, T. M., & Fletcher, M. (1991). Mixed-species colonization of solid
surfaces in laboratory biofilms. Biofouling, 3(1), 23-34.
Das, M., Raychaudhuri, A., & Ghosh, S. K. (2016). Supply chain of bioethanol production from
whey: a review. Procedia Environmental Sciences, 35, 833-846.
Deesuth, O., Laopaiboon, P., Klanrit, P., & Laopaiboon, L. (2015). Improvement of ethanol
production from sweet sorghum juice under high gravity and very high gravity conditions:
Effects of nutrient supplementation and aeration. Industrial Crops and Products, 74, 95-
102.
Díaz-Montaño, D. M. (2013). Continuous agave juice fermentation for producing bioethanol.

In Biomass Now-Sustainable Growth and Use. IntechOpen.
Diniz, R. H., Rodrigues, M. Q., Fietto, L. G., Passos, F. M., & Silveira, W. B. (2014). Optimizing
and validating the production of ethanol from cheese whey permeate by Kluyveromyces
marxianus UFV-3. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 3(2), 111-117.
Donlan, R. M., & Costerton, J. W. (2002). Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant
microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15(2), 167-193.
Douglas, F., Hambleton, R., & Rigby, G. J. (1973). An Investigation of the Oxidation-reduction
Potential and of the Effect of Oxygen on the Germination and Outgrowth of Clostridium
butyricum Spores, using Platinum Electrodes. Journal of Applied Bacteriology, 36(4), 625-
633.
Dragone, G., Mussatto, S. I., e Silva, J. B. A., & Teixeira, J. A. (2011). Optimal fermentation
conditions for maximizing the ethanol production by Kluyveromyces fragilis from cheese
whey powder. Biomass and Bioenergy, 35(5), 1977-1982.
Duarte, J. C., Rodrigues, J. A. R., Moran, P. J., Valença, G. P., & Nunhez, J. R. (2013). Effect of
immobilized cells in calcium alginate beads in alcoholic fermentation. AMB Express, 3(1),
31.
Dunn, I. J., Ingham, J., Heinzle, E., & Prenosil, J. E. (1992). Biological Rection Engineering (p.
438). Weinheim: VCH.
Dürre, P. (2007). Biobutanol: an attractive biofuel. Biotechnology Journal: Healthcare Nutrition

Technology, 2(12), 1525-1534.
47
Capítulo 1.
Dürre, P. (1998). New insights and novel developments in clostridial

acetone/butanol/isopropanol fermentation. Applied Microbiology and
Biotechnology, 49(6), 639-648.
EEA, 2018, Renewable energy in Europe 2018: recent growth and knock-on effects, EEA Report
No 20/2018, European Environment Agency Disponible online en:
https://www.eea.europa.eu/publications/renewable-energy-in-europe-2018.
European Food Safety Authority (EFSA) Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). Update of the list
of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to
EFSA 8: suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2018. EFSA Journal.
2018; 16(7).
Ennis, B. M., & Maddox, I. S. (1989). Production of solvents (ABE fermentation) from whey
permeate by continuous fermentation in a membrane bioreactor. Bioprocess
Engineering, 4(1), 27-34.
Ennis, B. M., Gutierrez, N. A., & Maddox, I. S. (1986). The acetone-butanol-ethanol

fermentation: A current assessment. Process Biochemistry, 21(5), 131-147.
Ennis, B. M., & Maddox, I. S. (1985). Use of Clostridium acetobutylicum P262 for production of
solvents from whey permeate. Biotechnology Letters, 7(8), 601-606.
Elnashar, M. M. M. (2011). U.S. Patent Application No. 12/866,748.
EPure. European renewable ethanol – key figures 2018. European Renewable Ethanol
Association. Disponbile online en:https://epure.org/media/1920/190828-def-data-
statistics-2018-infographic.pdf.
Eş, I., Vieira, J. D. G., & Amaral, A. C. (2015). Principles, techniques, and applications of
biocatalyst immobilization for industrial application. Applied Microbiology and
Ezeji, T. C., Qureshi, N., & Blaschek, H. P. (2013). Microbial production of a biofuel (acetone–
butanol–ethanol) in a continuous bioreactor: impact of bleed and simultaneous product
removal. Bioprocess and Biosystems Engineering, 36(1), 109-116.
Ezeji, T., Qureshi, N., & Blaschek, H. P. (2007). Production of acetone–butanol–ethanol (ABE) in
a continuous flow bioreactor using degermed corn and Clostridium beijerinckii. Process
Biochemistry, 42(1), 34-39.
48
Ezeji, T. C., Qureshi, N., & Blaschek, H. P. M. (2005). Industrially relevant fermentations.
In Handbook on Clostridia (pp. 797-812). CRC Press.
Ezeji, T. C., Qureshi, N., & Blaschek, H. P. (2003). Production of acetone, butanol and ethanol
by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 19(6), 595-603.
U.S. Food & Drug Administration (FDA). 2018 Apr 1 [cited 9 Nov 2018]. Microorganisms &
Microbial-Derived Ingredients Used in Food 2018. Disponible en:
https://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/MicroorganismsMicro
bialDerivedIngredients/default.htm
Foda, M. I., Dong, H., & Li, Y. (2010). Study the suitability of cheese whey for bio-butanol
production by Clostridia. Journal of American Science, 6(8), 39-46.
Fonseca, G. G., Heinzle, E., Wittmann, C., & Gombert, A. K. (2008). The yeast Kluyveromyces
marxianus and its biotechnological potential. Applied Microbiology and
Fouad, E. A., & Feng, X. (2008). Use of pervaporation to separate butanol from dilute aqueous
solutions: Effects of operating conditions and concentration polarization. Journal of
Membrane Science, 323(2), 428-435.
Frey, P. A. (1996). The Leloir pathway: a mechanistic imperative for three enzymes to change
the stereochemical configuration of a single carbon in galactose. The FASEB
Journal, 10(4), 461-470.
Friedl, A., 2016. Downstream process options for the ABE fermentation. FEMS Microbiology
Letters, 363, 1–5. doi:10.1093/femsle/fnw073
Friedl, A., Qureshi, N., & Maddox, I. S. (1991). Continuous acetone-butanol-ethanol (ABE)
fermentation using immobilized cells of Clostridium acetobutylicum in a packed bed
reactor and integration with product removal by pervaporation. Biotechnology and
Bioengineering, 38(5), 518-527.
Gabardo, S., Pereira, G. F., Rech, R., & Ayub, M. A. Z. (2015). The modeling of ethanol production
by Kluyveromyces marxianus using whey as substrate in continuous A-Stat
bioreactors. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 42(9), 1243-1253.
Gabardo, S., Rech, R., Rosa, C. A., & Ayub, M. A. Z. (2014). Dynamics of ethanol production from
whey and whey permeate by immobilized strains of Kluyveromyces marxianus in batch
and continuous bioreactors. Renewable Energy, 69, 89-96.
49
Capítulo 1.
Gabardo, S., Rech, R., & Ayub, M. A. Z. (2012). Performance of different immobilized-cell
systems to efficiently produce ethanol from whey: fluidized batch, packed-bed and
fluidized continuous bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 87(8),
1194-1201.
Gabriel, C. L., & Crawford, F. M. (1930). Development of the butyl-acetonic fermentation

industry. Industrial & Engineering Chemistry, 22(11), 1163-1165.
Gänzle, M. G., Haase, G., & Jelen, P. (2008). Lactose: crystallization, hydrolysis and value-added
derivatives. International Dairy Journal, 18(7), 685-694.
García, V., Päkkilä, J., Ojamo, H., Muurinen, E., & Keiski, R. L. (2011). Challenges in biobutanol
production: how to improve the efficiency?. Renewable and Sustainable Energy
Reviews, 15(2), 964-980.
García, V., Pongrácz, E., Muurinen, E., & Keiski, R. L. (2009). Pervaporation of dichloromethane
from multicomponent aqueous systems containing n-butanol and sodium
chloride. Journal of Membrane Science, 326(1), 92-102.
Genisheva, Z., Mussatto, S. I., Oliveira, J. M., & Teixeira, J. A. (2011). Evaluating the potential of
wine-making residues and corn cobs as support materials for cell immobilization for
ethanol production. Industrial Crops and Products, 34(1), 979-985.
George, H. A., & Chen, J. S. (1983). Acidic conditions are not obligatory for onset of butanol
formation by Clostridium beijerinckii (synonym, C. butylicum). Applied Environmental
Microbiology., 46(2), 321-327.
Ghaly, A. E., & El-Taweel, A. A. (1995). Effect of micro-aeration on the growth of Candida
pseudotropicalis and production of ethanol during batch fermentation of cheese
whey. Bioresource Technology, 52(3), 203-217.
Godoy, A., Amorim, H.V., Lopes, M.L., Oliveira, A.J. (2008) Continuous and batch fermentation
processes: advantages and disadvantages of these processes in the Brazilian ethanol
production. International Sugar Journal, 110, 175–181.
Goncalves, L. M. D., Barreto, M. T. O., Xavier, A. M. B. R., Carrondo, M. J. T., & Klein, J. (1992).
Inert supports for lactic acid fermentation—a technological assessment. Applied
Gonzalez-Siso, M. (1996). The biotechnological utilization of cheese whey: a review. Bioresource

Technology, 57(1), 1-11.
50
Green, E. M. (2011). Fermentative production of butanol—the industrial perspective. Current

Opinion in Biotechnology, 22(3), 337-343.
Gu, Y., Jiang, Y., Wu, H., Liu, X., Li, Z., Li, J., ... & Li, Y. (2011). Economical challenges to microbial
producers of butanol: feedstock, butanol ratio and titer. Biotechnology Journal, 6(11),
1348-1357.
Guimarães, P.M.R., Teixeira, J.A., Domingues, L. (2010). Fermentation of lactose to bio-ethanol

by yeasts as part of integrated solutions for the valorisation of cheese whey.
Biotechnology Advances, 28, 375-384.
Guimarães, P.M., Teixeira, J.A., Domingues, L. (2008). Fermentation of high concentrations of

lactose to ethanol by engineered flocculent Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology
Letters, 30(11), 1953.
Gunasekaran, P., & Kamini, N. R. (1991). High ethanol productivity from lactose by immobilized
cells of Kluyveromyces fragilis and Zymomonas mobilis. World Journal of Microbiology
and Biotechnology, 7(5), 551-556.
Guimarães, P. M., Teixeira, J. A., & Domingues, L. (2010). Fermentation of lactose to bio-ethanol
by yeasts as part of integrated solutions for the valorisation of cheese
whey. Biotechnology Advances, 28(3), 375-384.
Guimaraes, P. M., Teixeira, J. A., & Domingues, L. (2008). Fermentation of high concentrations
of lactose to ethanol by engineered flocculent Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology
Letters, 30(11), 1953.
Guo, X., Zhou, J., & Xiao, D. (2010). Improved ethanol production by mixed immobilized cells of
Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae from cheese whey powder
solution fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 160(2), 532-538.
Häggström, L. (1985). Acetone-butanol fermentation and its variants. Biotechnology

Advances, 3(1), 13-28.
Hijosa-Valsero, M., Garita-Cambronero, J., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2020). A

global approach to obtain biobutanol from corn stover. Renewable Energy, 148, 223-233.
Hijosa-Valsero, M., Garita-Cambronero, J., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2019).

Tomato Waste from Processing Industries as a Feedstock for Biofuel
Production. BioEnergy Research, 1-12.
51
Capítulo 1.
Hijosa-Valsero, M., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2018). Industrial potato peel as
a feedstock for biobutanol production. New Biotechnology, 46, 54-60.
Hijosa-Valsero, M., Garita-Cambronero, J., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2018).

Biobutanol production from coffee silverskin. Microbial Cell Factories, 17(1), 154.
Hijosa-Valsero, M., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2017). Biobutanol production

from apple pomace: the importance of pretreatment methods on the fermentability of
lignocellulosic agro-food wastes. Applied Microbiology and Biotechnology, 101(21),
8041-8052.
Hirani, A. H., Javed, N., Asif, M., Basu, S. K., & Kumar, A. (2018). A review on first-and second-
generation biofuel productions. In Biofuels: Greenhouse Gas Mitigation and Global
Warming (pp. 141-154). Springer, New Delhi.
Ho, D. P., Ngo, H. H., & Guo, W. (2014). A mini review on renewable sources for
biofuel. Bioresource Technology, 169, 742-749.
Huang, H. J., Ramaswamy, S., & Liu, Y. (2014). Separation and purification of biobutanol during
bioconversion of biomass. Separation and Purification Technology, 132, 513-540.
Huang, J., & Meagher, M. M. (2001). Pervaporative recovery of n-butanol from aqueous
solutions and ABE fermentation broth using thin-film silicalite-filled silicone composite
membranes. Journal of Membrane Science, 192(1-2), 231-242.
Idris, A., & Suzana, W. (2006). Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial
pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized
Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry, 41(5), 1117-1123.
Ingledew, W. M. (2003). Continuous fermentation in the fuel alcohol industry: how does the
technology affect yeast. The alcohol textbook: a reference for the beverage, fuel and
industrial alcohol industries. Nottingham University Press, Nottingham, 135-144.
Jelen, P. (2009). Dried whey, whey proteins, lactose and lactose derivative products. Dairy
Powders and Concentrated Products, 255-266.
De Jesus, C. S. A., Ruth, V. G. E., Daniel, S. F. R., & Sharma, A. (2015). Biotechnological
alternatives for the utilization of dairy industry waste products. Advances in Bioscience
and Biotechnology, 6(03), 223.
Jones, D. T., & Woods, D. R. (1986). Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiological

Reviews, 50(4), 484.
52
Karakashev, D., Thomsen, A. B., & Angelidaki, I. (2007). Anaerobic biotechnological approaches
for production of liquid energy carriers from biomass. Biotechnology Letters, 29(7), 1005-
1012.
Karaguler, T., Kahraman, H., & Tuter, M. (2017). Analyzing effects of ELF electromagnetic fields
on removing bacterial biofilm. Biocybernetics and Biomedical Engineering, 37(2), 336-
340.
Karel, S. F., Libicki, S. B., & Robertson, C. R. (1985). The immobilization of whole cells:
engineering principles. Chemical Engineering Science, 40(8), 1321-1354.
Kargi, F., & Ozmıhcı, S. (2006). Utilization of cheese whey powder (CWP) for ethanol
fermentations: Effects of operating parameters. Enzyme and Microbial
Technology, 38(5), 711-718.
Kilonzo, P., & Bergougnou, M. (2012). Surface modifications for controlled and optimized cell
immobilization by adsorption: applications in fibrous bed bioreactors containing
recombinant cells. Journal of Microbiology Biochemical Technology, 8, 18-21.
Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I. M., Marchant, R., & Koutinas, A. A. (2004).
Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages
production: a review. Food Microbiology, 21(4), 377-397.
Kumar, M., & Gayen, K. (2011). Developments in biobutanol production: new insights. Applied
Energy, 88(6), 1999-2012.
Kujawska, A., Kujawski, J., Bryjak, M., & Kujawski, W. (2015). ABE fermentation products
recovery methods—a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 48, 648-661.
Kwiatkowski, J. R., McAloon, A. J., Taylor, F., & Johnston, D. B. (2006). Modeling the process and
costs of fuel ethanol production by the corn dry-grind process. Industrial Crops and
Products, 23(3), 288-296.
Lane, M. M., Burke, N., Karreman, R., Wolfe, K. H., O’Byrne, C. P., & Morrissey, J. P. (2011).
Physiological and metabolic diversity in the yeast Kluyveromyces marxianus. Antonie Van
Leeuwenhoek, 100(4), 507-519.
Lane, M. M., & Morrissey, J. P. (2010). Kluyveromyces marxianus: a yeast emerging from its
sister's shadow. Fungal Biology Reviews, 24(1-2), 17-26.
Lee, S. Y., Park, J. H., Jang, S. H., Nielsen, L. K., Kim, J., & Jung, K. S. (2008). Fermentative butanol
production by Clostridia. Biotechnology and Bioengineering, 101(2), 209-228.
53
Capítulo 1.
Li, T., Chen, X. B., Chen, J. C., Wu, Q., & Chen, G. Q. (2014). Open and continuous fermentation:
products, conditions and bioprocess economy. Biotechnology Journal, 9(12), 1503-1511.
Linden, J. C., Moreira, A. R., & Lenz, T. G. (1986). Acetone and butanol. Comprehensive
biotechnology: The principles of biotechnology: engineering consideration. Pergamon
press, Oxford, 915-931.
Ling KC. Whey to ethanol: a biofuel role for dairy cooperatives? Washington DC: USDA Rural
Development; 2008 (Disponible online: http://www.rurdev.usda.gov/RBS/
pub/RR214.pdf).
Macwan, S. R., Dabhi, B. K., Parmar, S. C., & Aparnathi, K. D. (2016). Whey and its
utilization. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 5(8), 134-
155.
Maddox, I. S., Steiner, E., Hirsch, S., Wessner, S., Gutierrez, N. A., Gapes, J. R., & Schuster, K. C.
(2000). The Cause of" Acid Crash" and" Acidogenic Fermentations" During the Batch
Acetone-Butanol-Ethanol (ABE-) Fermentation Process. Journal of Molecular
Maddox, I. S., Qureshi, N., & Roberts-Thomson, K. (1995). Production of acetone-butanol-

ethanol from concentrated substrate using Clostridium acetobutylicum in an integrated
fermentation-product removal process. Process Biochemistry, 30(3), 209-215.
Maddox, I. S., & Murray, A. E. (1983). Production of n-butanol by fermentation of wood

hydrolysate. Biotechnology Letters, 5(3), 175-178.
Madihah M.S., Ariff A.B., Sahaid K.M., Suraini A.A., Karim M.I.A., 2001, Direct fermentation of
gelatinized sago starch to acetone–butanol–ethanol by Clostridium acetobutylicum,
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17, 567–576.
Maniatis, Kyriakos & Landälv, Ingvar & Waldheim, Lars & van den Heuvel, Eric & Kalligeros,
Stamatis. (2017). Sub Group on Advanced Biofuels (SGAB) - Building Up the Future.
Terminology and Glossary With common abbreviations & conversion factors.
Margaritis, A., & Kilonzo, P. M. (2005). Production of ethanol using immobilised cell bioreactor
systems. In Applications of Cell Immobilisation Biotechnology (pp. 375-405). Springer,
Dordrecht.
Mariano, A. P., Qureshi, N., Filho, R. M., & Ezeji, T. C. (2011). Bioproduction of butanol in
bioreactors: new insights from simultaneous in situ butanol recovery to eliminate
product toxicity. Biotechnology and Bioengineering, 108(8), 1757-1765.
54
Marwaha, S. S., & Kennedy, J. F. (1984). Ethanol production from whey permeate by
immobilized yeast cells. Enzyme and Microbial Technology, 6(1), 18-22.
Matsumura, M., Kataoka, H., Sueki, M., & Araki, K. (1988). Energy saving effect of pervaporation
using oleyl alcohol liquid membrane in butanol purification. Bioprocess Engineering, 3(2),
93-100.
Milne, C. B., Eddy, J. A., Raju, R., Ardekani, S., Kim, P. J., Senger, R. S., ... & Price, N. D. (2011).
Metabolic network reconstruction and genome-scale model of butanol-producing strain
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052. BMC Systems Biology, 5(1), 130.
Mitchell, W. J. (1997). Physiology of carbohydrate to solvent conversion by clostridia.

In Advances in Microbial Physiology (Vol. 39, pp. 31-130). Academic Press.
Mollea C., Marmo L., Bosco F., 2013, Valorisation of Cheese Whey, a By-Product from the Dairy
Industry: Food Industry Eds. I. Muzzalupo, INTECH, 549-588. ISBN 9789535109112
Mussatto, S. I., & Teixeira, J. A. (2010). Lignocellulose as raw material in fermentation

processes. In: Current Research, Technology and Education Topics in Applied
Microbiology and Microbial Biotechnology (pp. 897-907).
Nanda, S., Azargohar, R., Dalai, A. K., & Kozinski, J. A. (2015). An assessment on the sustainability
of lignocellulosic biomass for biorefining. Renewable and Sustainable Energy
Reviews, 50, 925-941.
Nanda, S., Dalai, A. K., & Kozinski, J. A. (2014). Butanol and ethanol production from
lignocellulosic feedstock: biomass pretreatment and bioconversion. Energy Science &
Engineering, 2(3), 138-148.
Napoli, F., Olivieri, G., Russo, M. E., Marzocchella, A., & Salatino, P. (2011). Continuous lactose
fermentation by Clostridium acetobutylicum–assessment of acidogenesis
kinetics. Bioresource Technology, 102(2), 1608-1614.
Napoli, F., Olivieri, G., Russo, M. E., Marzocchella, A., & Salatino, P. (2010). Butanol production
by Clostridium acetobutylicum in a continuous packed bed reactor. Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, 37(6), 603-608.
Napoli F. Development of an integrated process for butanol production. Dottorato in Scienze

Biotecnologiche- XXII ciclo Indirizzo Biotechnologie Industriali. 2009. Universiy of Napoli
Federico II.
55
Capítulo 1.
Nedović, V., Willaert, R., Leskošek-Čukalović, I., Obradović, B., & Bugarski, B. (2005). Beer
production using immobilised cells. In Applications of Cell Immobilisation
Biotechnology (pp. 259-273). Springer, Dordrecht.
Nimcevic, D., Schuster, M., & Gapes, J. R. (1998). Solvent production by Clostridium beijerinckii
NRRL B592 growing on different potato media. Applied Microbiology and
Nooshkam, M., Babazadeh, A., & Jooyandeh, H. (2018). Lactulose: Properties, techno-
functional food applications, and food grade delivery system. Trends in Food Science &
Nuñez, M. J., & Lema, J. M. (1987). Cell immobilization: Application to alcohol

production. Enzyme and Microbial Technology, 9(11), 642-651.
OECD (2018), "Cheese projections: Production and trade", in OECD-FAO Agricultural Outlook
2018-2027, OECD Publishing, Paris.
OECD (2018), “Biofuels”, In OECD-FAO Agricultural Outlook 2017-2026, OECD Publishing, Paris.
Oh, Y. K., Hwang, K. R., Kim, C., Kim, J. R., & Lee, J. S. (2018). Recent developments and key
barriers to advanced biofuels: a short review. Bioresource Technology, 257, 320-333.
Organización de Naciones Unidad (ONU) (2015). Acuerdo de París dentro de la Convención

Marco de las Naciones Unidas sobre el Cambio Climático (CMNUCC) Disponible online
en:.https://unfccc.int/resource/docs/2015/cop21/spa/l09s.pdf.
Organización de Naciones Unidad (ONU) (2019). Acuerdo de Chile – Madrid: Tiempo de actuar
dentro de la Convención Marco de las Naciones Unidas sobre el Cambio Climático
(CMNUCC) Disponible online en:
https://unfccc.int/sites/default/files/resource/cp2019_L10S.pdf
Oudshoorn, A., Van Der Wielen, L. A., & Straathof, A. J. (2009). Assessment of options for
selective 1-butanol recovery from aqueous solution. Industrial & Engineering Chemistry
Research, 48(15), 7325-7336.
Oudshoorn, A., Van der Wielen, L. A. M., & Straathof, A. J. J. (2012). Desorption of butanol from
zeolite material. Biochemical Engineering Journal, 67, 167-172.
Ozmihci, S., & Kargi, F. (2009). Fermentation of cheese whey powder solution to ethanol in a
packed-column bioreactor: effects of feed sugar concentration. Journal of Chemical
56
Technology & Biotechnology: International Research in Process, Environmental & Clean

Technology, 84(1), 106-111.
Ozmihci, S., & Kargi, F. (2008). Ethanol production from cheese whey powder solution in a
packed column bioreactor at different hydraulic residence times. Biochemical
Engineering Journal, 42(2), 180-185.
Ozmihci, S., & Kargi, F. (2007). Effects of feed sugar concentration on continuous ethanol
fermentation of cheese whey powder solution (CWP). Enzyme and Microbial
Technology, 41(6-7), 876-880.
Panghal, A., Kumar, V., Dhull, S. B., Gat, Y., & Chhikara, N. (2017). Utilization of dairy industry
waste-whey in formulation of papaya RTS beverage. Current Research in Nutrition and
Food Science Journal, 5(2), 168-174.
Pal, P., Kumar, R., & Ghosh, A. K. (2018). Analysis of process intensification and performance
assessment for fermentative continuous production of bioethanol in a multi-staged
membrane-integrated bioreactor system. Energy Conversion and Management, 171,
371-383.
Paniagua-García, A. I., Hijosa-Valsero, M., Díez-Antolínez, R., Sánchez, M. E., & Coca, M. (2018).
Enzymatic hydrolysis and detoxification of lignocellulosic biomass are not always
necessary for ABE fermentation: The case of Panicum virgatum. Biomass and
Bioenergy, 116, 131-139.
Parashar, A., Jin, Y., Mason, B., Chae, M., & Bressler, D. C. (2016). Incorporation of whey
permeate, a dairy effluent, in ethanol fermentation to provide a zero waste solution for
the dairy industry. Journal of Dairy Science, 99(3), 1859-1867.
Parrondo, J., García, L. A., & Díaz, M. (2009). Nutrient balance and metabolic analysis in a
Kluyveromyces marxianus fermentation with lactose-added whey. Brazilian Journal of
Chemical Engineering, 26(3), 445-456.
Pasotti, L., Zucca, S., Casanova, M., Micoli, G., De Angelis, M. G. C., & Magni, P. (2017).
Fermentation of lactose to ethanol in cheese whey permeate and concentrated
permeate by engineered Escherichia coli. BMC Biotechnology, 17(1), 48.
Patakova, P., Lipovsky, J., Paulova, L., Linhova, M., Fribert, P., Rychtera, M., & Melzoch, K.
(2011). Continuous production of butanol by bacteria of genus Clostridium. Journal of
Chemistry and Chemical Engineering, 5(2).
57
Capítulo 1.
Patraşcu, I., Bîldea, C. S., & Kiss, A. A. (2017). Eco-efficient butanol separation in the ABE
fermentation process. Separation and Purification Technology, 177, 49-61.
Pentjuss, A., Stalidzans, E., Liepins, J., Kokina, A., Martynova, J., Zikmanis, P., ... & Fell, D. A.
(2017). Model-based biotechnological potential analysis of Kluyveromyces marxianus
central metabolism. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 44(8), 1177-
1190.
Pescuma, M., de Valdez, G. F., & Mozzi, F. (2015). Whey-derived valuable products obtained by
microbial fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology, 99(15), 6183-6196.
Phukoetphim, N., Salakkam, A., Laopaiboon, P., & Laopaiboon, L. (2017). Improvement of
ethanol production from sweet sorghum juice under batch and fed-batch fermentations:
Effects of sugar levels, nitrogen supplementation, and feeding regimes. Electronic Journal
of Biotechnology, 26, 84-92.
Puligundla, P., Smogrovicova, D., Mok, C., & Obulam, V. S. R. (2019). A review of recent
advances in high gravity ethanol fermentation. Renewable Rnergy, 133, 1366-1379.
Prazeres, A. R., Carvalho, F., & Rivas, J. (2012). Cheese whey management: A review. Journal of
Environmental Management, 110, 48-68.
Procentese, A., Raganati, F., Olivieri, G., Russo, M. E., Salatino, P., & Marzocchella, A. (2015).
Continuous lactose fermentation by Clostridium acetobutylicum–Assessment of
solventogenic kinetics. Bioresource Technology, 180, 330-337.
Qureshi, N., Saha, B. C., Dien, B., Hector, R. E., & Cotta, M. A. (2010). Production of butanol (a
biofuel) from agricultural residues: Part I–Use of barley straw hydrolysate. Biomass and
Bioenergy, 34(4), 559-565.
Qureshi, N., Saha, B. C., Hector, R. E., Dien, B., Hughes, S., Liu, S., ... & Cotta, M. A. (2010).
Production of butanol (a biofuel) from agricultural residues: Part II–Use of corn stover
and switchgrass hydrolysates. Biomass and Bioenergy, 34(4), 566-571.
Qureshi, N., & Ezeji, T. C. (2008). Butanol, ‘a superior biofuel’ production from agricultural
residues (renewable biomass): recent progress in technology. Biofuels, Bioproducts and
Biorefining: Innovation for a sustainable economy, 2(4), 319-330.
Qureshi, N., & Maddox, I. S. (2005). Reduction in butanol inhibition by perstraction: utilization
of concentrated lactose/whey permeate by Clostridium acetobutylicum to enhance
butanol fermentation economics. Food and Bioproducts Processing, 83(1), 43-52.
58
Qureshi, N., & Blaschek, H. (2001). Evaluation of recent advances in butanol fermentation,
upstream, and downstream processing. Bioprocess and Biosystems Engineering, 24(4),
219-226.
Qureshi, N., & Blaschek, H. P. (1999). Economics of butanol fermentation using hyper-butanol
producing Clostridium beijerinckii BA101. Food and Bioproducts Processing, 78(3), 139-
144.
Qureshi, N., & Maddox, I. S. (1995). Continuous production of acetone-butanol-ethanol using

immobilized cells of Clostridium acetobutylicum and integration with product removal by
liquid-liquid extraction. Journal of Fermentation and Bioengineering, 80(2), 185-189.
Qureshi, N., & Maddox, I. S. (1987). Continuous solvent production from whey permeate using
cells of Clostridium acetobutylicum immobilized by adsorption onto bonechar. Enzyme
and Microbial Technology, 9(11), 668-671.
Radecka, D., Mukherjee, V., Mateo, R. Q., Stojiljkovic, M., Foulquié-Moreno, M. R., & Thevelein,
J. M. (2015). Looking beyond Saccharomyces: the potential of non-conventional yeast
species for desirable traits in bioethanol fermentation. FEMS Yeast Research, 15(6).
Ranjan, A., & Moholkar, V. S. (2012). Biobutanol: science, engineering, and

economics. International Journal of Energy Research, 36(3), 277-323.
Raganati, F., Procentese, A., Olivieri, G., Russo, M. E., Gotz, P., Salatino, P., & Marzocchella, A.
(2016). Butanol production by Clostridium acetobutylicum in a series of packed bed
biofilm reactors. Chemical Engineering Science, 152, 678-688.
Raganati, F., Olivieri, G., Procentese, A., Russo, M. E., Salatino, P., & Marzocchella, A. (2013).
Butanol production by bioconversion of cheese whey in a continuous packed bed
reactor. Bioresource Technology, 138, 259-265.
Ramaswamy, S., Huang, H. J., & Ramarao, B. V. (2013). Separation and purification technologies
in biorefineries (p. 1). John Wiley & Sons Incorporated.
Risner, D., Shayevitz, A., Haapala, K., Meunier-Goddik, L., & Hughes, P. (2018). Fermentation
and distillation of cheese whey: Carbon dioxide-equivalent emissions and water use in
the production of whey spirits and white whiskey. Journal of Dairy Science, 101(4), 2963-
2973.
Rom, A., Miltner, A., Wukovits, W., & Friedl, A. (2016). Energy saving potential of hybrid
membrane and distillation process in butanol purification: Experiments, modelling and
simulation. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 104, 201-211.
59
Capítulo 1.
Ross D. (1961). The acetone-butanol-ethanol fermentation. Progress in Industrial Microbiology,

3, 3-85.
Rubio-Texeira, M. (2006). Endless versatility in the biotechnological applications of

Kluyveromyces LAC genes. Biotechnology Advances, 24(2), 212-225.
Saini, P., Beniwal, A., Kokkiligadda, A., & Vij, S. (2017). Evolutionary adaptation of
Kluyveromyces marxianus strain for efficient conversion of whey lactose to
bioethanol. Process Biochemistry, 62, 69-79.
Sansonetti, S., Curcio, S., Calabrò, V., & Iorio, G. (2009). Bio-ethanol production by fermentation
of ricotta cheese whey as an effective alternative non-vegetable source. Biomass and
Bioenergy, 33(12), 1687-1692.
Sarangi, P. K., & Nanda, S. (2018). Recent Developments and Challenges of Acetone-Butanol-
Ethanol Fermentation. In: Recent Advancements in Biofuels and Bioenergy
Utilization (pp. 111-123). Springer, Singapore.
Saratale, G. D., & Oh, S. E. (2012). Lignocellulosics to ethanol: The future of the chemical and
energy industry. African Journal of Biotechnology, 11(5), 1002-1013.
Schoutens, G. H., Nieuwenhuizen, M. C. H., s& Kossen, N. W. F. (1985). Continuous butanol

production from whey permeate with immobilized Clostridium beyerinckii LMD
27.6. Applied Microbiology and Biotechnology, 21(5), 282-286.
Seader, J. D., Henley, E. J., & Roper, D. K. (1998). Separation process principles (Vol. 25). New
York: Wiley.
Shaheen, R., Shirley, M., & Jones, D. T. (2000). Comparative fermentation studies of industrial
strains belonging to four species of solvent-producing clostridia. Journal of Molecular
Selvaraj, M. & Banat, F. (2019). Ethanol-water separation using membrane technology.

In: Biorefinery: Integrated Sustainable Processes for Biomass Conversion to Biomaterials,
Biofuels, and Fertilizers. Springer.
Silva, A. C., Guimaraes, P. M., Teixeira, J. A., & Domingues, L. (2010). Fermentation of
deproteinized cheese whey powder solutions to ethanol by engineered Saccharomyces
cerevisiae: effect of supplementation with corn steep liquor and repeated-batch
operation with biomass recycling by flocculation. Journal of Industrial Microbiology &
60
Silveira, W. B., Passos, F. J. V., Mantovani, H. C., & Passos, F. M. L. (2005). Ethanol production
from cheese whey permeate by Kluyveromyces marxianus UFV-3: a flux analysis of oxido-
reductive metabolism as a function of lactose concentration and oxygen levels. Enzyme
and Microbial Technology, 36(7), 930-936.
Singh, Ram. (2014). Biotechnological Approaches for Valorization of Whey. In book: Advances in
Industrial Biotechnology, Chapter: Biotechnological Approaches for Valorization of Whey,
Publisher: I. K. International Publishingh House Pvt. Ltd., New Delhi, Banglore, India,
Editors: Ram Sarup Singh, Ashok Pandey, Christian Larroche, pp.443-478
Spencer, J., de Spencer, A. R., & Laluce, C. (2002). Non-conventional yeasts. Applied
Staggs, K. W., & Nielsen, D. R. (2015). Improving n-butanol production in batch and semi-
continuous processes through integrated product recovery. Process Biochemistry, 50(10),
1487-1498.
Stanbury, P. F., Whitaker, A., & Hall, S. J. (2013). Principles of fermentation technology. Elsevier
Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., & Costerton, J. W. (2002). Biofilms as complex differentiated
communities. Annual Reviews in Microbiology, 56(1), 187-209.
Thang, V. H., Kanda, K., & Kobayashi, G. (2010). Production of acetone–butanol–ethanol (ABE)
in direct fermentation of cassava by Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-
4. Applied Biochemistry and Biotechnology, 161(1-8), 157-170.
Thongsukmak, A., & Sirkar, K. K. (2007). Pervaporation membranes highly selective for solvents
present in fermentation broths. Journal of Membrane Science, 302(1-2), 45-58.
Tomaszewska, M., Białończyk, L. (2016). Ethanol production from whey in a bioreactor coupled
with direct contact membrane distillation. Catalysis Today, 268, 156-163.
UNE-EN 15692:2009. Etanol como componente en la formulación de gasolinas. Determinación

del contenido en agua. Método de valoración potenciométrica de Karl Fischer.
UNE-EN 15489:2008. Etanol como componente en la formulación de gasolinas. Determinación

del contenido en agua. Método de valoración culombimétrica de Karl Fischer.
Van der Wende, E., & Characklis, W. G. (1990). Biofilms in potable water distribution systems.
In Drinking water microbiology (pp. 249-268). Springer, New York, NY.
Vane, L. M. (2008). Separation technologies for the recovery and dehydration of alcohols from
fermentation broths. Biofuels, Bioproducts and Biorefining, 2(6), 553-588.
61
Capítulo 1.
Venkatesen, V. Adsorption. In: Ramaswamy, S., Huang, H. J., & Ramarao, B. V. (2013). Separation
and purification technologies in biorefineries (p. 1). John Wiley & Sons Incorporated.
Visioli, L. J., Enzweiler, H., Kuhn, R. C., Schwaab, M., & Mazutti, M. A. (2014). Recent advances
on biobutanol production. Sustainable chemical processes, 2(1), 15.
Vohra, M., Manwar, J., Manmode, R., Padgilwar, S., & Patil, S. (2014). Bioethanol production:
feedstock and current technologies. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2(1),
573-584.
de Vrije, T., Budde, M., van der Wal, H., Claassen, P. A., & López-Contreras, A. M. (2013). “In situ”
removal of isopropanol, butanol and ethanol from fermentation broth by gas
stripping. Bioresource Technology, 137, 153-159.
Walker, G. M., & Stewart, G. G. (2016). Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented
beverages. Beverages, 2(4), 30.
Weast, R. C., Astle, M. J., & Beyer, W. H. (1988). CRC handbook of chemistry and physics (Vol.
69). Boca Raton, FL: CRC Press.
Wechgama, K., Laopaiboon, L., & Laopaiboon, P. (2017). Enhancement of batch butanol
production from sugarcane molasses using nitrogen supplementation integrated with gas
stripping for product recovery. Industrial Crops and Products, 95, 216-226.
Westman, J. O., & Franzen, C. J. (2015). Current progress in high cell density yeast bioprocesses
for bioethanol production. Biotechnology Journal, 10(8), 1185-1195.
Willem, K., & Van Der, L. P. J. (1939). U.S. Patent No. 2,183,141. Washington, DC: U.S. Patent and
Trademark Office.
De Wit J.N., 2001, Lecturer’s handbook on whey and whey products. European Whey Products
Association. Brussels, Belgium. Available at:
[http://ewpa.euromilk.org/publications.html].
Wong, S. S., Mi, L., & Liao, J. C. (2017). Microbial production of butanols. Industrial
Biotechnology: Products and Processes, 573-595.
Xue, C., Zhao, J. B., Chen, L. J., Bai, F. W., Yang, S. T., & Sun, J. X. (2014). Integrated butanol
recovery for an advanced biofuel: current state and prospects. Applied Microbiology and
62
Xue, C., Zhao, J., Liu, F., Lu, C., Yang, S. T., & Bai, F. W. (2013). Two-stage in situ gas stripping for
enhanced butanol fermentation and energy-saving product recovery. Bioresource
Xue, C., Zhao, J., Lu, C., Yang, S. T., Bai, F., & Tang, I. C. (2012). High-titer n-butanol production
by Clostridium acetobutylicum JB200 in fed-batch fermentation with intermittent gas
stripping. Biotechnology and Bioengineering, 109(11), 2746-2756.
Yabe, K., Shinoda, Y., Seki, T., Tanaka, H., & Akisawa, A. (2012). Market penetration speed and
effects on CO2 reduction of electric vehicles and plug-in hybrid electric vehicles in
Japan. Energy Policy, 45, 529-540.
Yadav, J. S. S., Yan, S., Pilli, S., Kumar, L., Tyagi, R. D., & Surampalli, R. Y. (2015). Cheese whey: A
potential resource to transform into bioprotein, functional/nutritional proteins and
bioactive peptides. Biotechnology Advances, 33(6), 756-774.
Zafar, S., & Owais, M. (2006). Ethanol production from crude whey by Kluyveromyces
marxianus. Biochemical Engineering Journal, 27(3), 295-298.
Zhang, J., Amartey, S., Lin, C., Shen, Z., Fan, L., & Qin, W. (2018). A Brief Review of Some Current
Improvements in ABE Production: New Development of Raw Materials, Strain
Improvement, Fermentation Systems, and End Product Extraction. Journal of Biobased
Materials and Bioenergy, 12(5), 405-414.
Zhang, Q., Wu, D., Lin, Y., Wang, X., Kong, H., & Tanaka, S. (2015). Substrate and product
inhibition on yeast performance in ethanol fermentation. Energy & Fuels, 29(2), 1019-
1027.
63
2. Objetivos y Estructura
Objetivos y Estructura
2.1. Objetivos
Esta tesis doctoral tiene como objetivo global la evaluación de tecnologías de
fermentación eficientes que faciliten la valorización del lactosuero y el permeado de
suero para la producción de alcoholes (etanol y butanol) para uso biocarburante. Para
ello, se evaluará la influencia de los principales parámetros operacionales sobre la
eficiencia de la fermentación en condiciones discontinuas. Además, se evaluarán otras
tecnologías como son las fermentaciones a alta densidad, conocida por sus siglas en
inglés VHG (Very High Gravity), combinadas con procesos continuos basados en
inmovilización celular tanto por atrapamiento en esferas de alginato como por
adsorción sobre soportes inertes, así como la integración de la recuperación in situ de
solventes, para aumentar el rendimiento y la productividad de la fermentación ABE.
2.1.1. Objetivos específicos

Las actividades desarrolladas en este trabajo tratan de alcanzar los siguientes objetivos
específicos (OE):
OE1.- Plantear estrategias ecosostenibles, simples y económicas de valorización

del suero y el permeado de suero lácteo industrial para obtener etanol y butanol
mediante procesos fermentativos.
OE2.- Mejorar la fermentación alcohólica para producir etanol a partir de

permeado de suero industrial crudo en fermentaciones de alta densidad,
evitando la suplementación de costosos nutrientes esenciales, mediante la
selección de levaduras comerciales osmotolerantes en procesos discontinuos y
continuos con inmovilización celular, tanto por atrapamiento en esferas de
alginato como por adsorción sobre soportes inertes de bajo coste.
OE3.- Optimizar las condiciones de operación de la fermentación alcohólica de

permeado de suero industrial crudo sin suplementar con nutrientes esenciales
en procesos continuos con inmovilización celular mediante Metodología de
Superficie de Respuesta (MSR), validados experimentalmente durante
prolongados periodos de tiempo de fermentación.
67
Capítulo 2.
OE4.- Optimizar los parámetros de la fermentación ABE para maximizar la

producción de butanol a partir de lactosuero mediante diseños experimentales
con Plackett-Burmann y MSR para reducir el consumo de nutrientes esenciales y
maximizar el aprovechamiento de la lactosa para tratar de minimizar sus efectos
medioambientales, a la vez que se reducen los costes de operación.
OE5.- Proponer tecnologías in situ de recuperación de butanol del caldo de

fermentación integradas con la fermentación ABE, que permitan producir mayor
concentración de butanol con un mejor aprovechamiento de la lactosa, al
reducirse las inhibiciones microbianas.
2.2. Estructura de la tesis

Para alcanzar los objetivos globales y específicos de la tesis, se ha llevado a cabo el
siguiente plan experimental, recogido en los diferentes capítulos técnicos de la tesis y
que se resumen a continuación.
El bloque inicial de la tesis corresponde a la Introducción y Antecedentes (Capítulo 1), el

presente capítulo (Capítulo 2), donde se definen los objetivos y la estructura segida en
los capítulos experimentales, y el Capítulo 3, en el que se describen los materiales y
métodos utilizados.
En los Capítulos 4 y 5 de este trabajo, se recogen los ensayos de fermentación alcohólica

para obtener etanol a partir de permeado de suero industrial altamente concentrado no
enriquecido con nutrientes esenciales, en procesos continuos con inmovilización
microbiana tanto por atrapamiento como por adsorción.
Concretamente, en el Capítulo 4, se evaluó el efecto de la temperatura y el pH en el

desarrollo de la fermentación utilizando levaduras de la especie Kluyveromyces
marxianus, tanto libres como inmovilizadas por atrapamiento en esferas de alginato.
Además, se determinó la concentración límite de lactosa en el permeado de suero que
permite evitar problemas de inhibición Finalmente, se optimizaron con un diseño
experimental mediante Metodología de Superficie de Respuestas (MSR), los parámetros
más influyentes en la formación de los geles de alginato (concentración de alginato,
carga celular y tamaño de la esfera).
68
Objetivos y Estructura
En el Capítulo 5, se comparó la capacidad para producir etanol a partir de permeado de

suero industrial altamente concentrado en lactosa de cuatro cepas de levadura de la
especie K. marxianus y cuatro cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae. Para ello,
se seleccionó una cepa de cada uno de las especies de levadura y se optimizaron las
condiciones de operación [temperatura (T), pH y tiempo (t)] a través de diseño
experimental por MSR. Posteriormente, la cepa seleccionada fue inmovilizada por
adsorción en cuatro soportes inertes de bajo coste (anillos Raschig de vidrio, plástico y
silicona Tygon®, y esferas de alúmina) para evaluar su comportamiento a lo largo del
tiempo.
En los Capítulos 6 y 7, siguiendo una metodología similar a la empleada para la obtención

de etanol, se recogen los trabajos realizados para mejorar la fermentación ABE, a partir
de suero lácteo con la cepa Clostridium beijerinckii CECT 508 en procesos discontinuos.
En el Capítulo 6, mediante diseño experimental de Plackett-Burman y MSR, se
determinaron los nutrientes esenciales para la fermentación ABE y se optimizaron sus
concentraciones. El objetivo es maximizar la producción de butanol, minimizando el
aporte de nutrientes para mejorar la rentabilidad económica del proceso.
Finalmente, en el Capítulo 7 se evaluó la combinación de la fermentación ABE con

recuperación in situ de butanol mediante arrastre de vapor o gas-stripping, en una y dos
etapas consecutivas, optimizándose las condiciones de operación mediante MSR
El Capítulo 8 recoge las conclusiones de los estudios desarrollados en la tesis doctoral,

de modo que éstas puedan ser tenidas en consideración para futuros diseños de
fermentaciones a mayor escala.
En la Figura 2.1 puede verse un resumen gráfico de la estructura descrita.
69
Capítulo 2.
Figura 2.1. Esquema de la estructura desarrollada
70
3. Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
3.1. Suero lácteo

Como sustrato para el desarrollo de este trabajo se empleó lactosuero con dos orígenes
y composiciones claramente diferenciadas: a) suero lácteo ultrafiltrado procedente de
la producción industrial de quesos de leche de vaca, oveja o mezclas de leches, facilitado
por la empresa Quesería Entrepinares SAU (Valladolid, España) (suero 1) y b) suero
lácteo crudo sin procesar obtenido de la producción artesanal de queso crudo de oveja,
procedente de la Quesería Artesanal del Río Carrión S.L. (La Serna, Palencia, España)
(suero 2) (Figura 3.1). En la Tabla 3.1., se recogen los resultados de la caracterización
físico-química de los dos tipos de suero empleados.
a) Suero 1 b) Suero 2
Figura 3.1. Muestras de suero lácteo utilizados durante el proceso experimental: a)
Suero 1 (suero ultrafiltrado) y b) Suero 2 (suero nanofiltrado).
Las muestras de Suero 1 y Suero 2 fueron pasteurizadas mediante calentamiento a 80°C

durante 30 minutos. El suero lácteo de leche de oveja fue nanofiltrado (suero 2 NF), en
una unidad de filtración de placas LabStak® M20 (Alfa Laval, Lund, Suiza) para
concentrar el producto (Figura 3.2.) y realizar las diferentes diluciones requeridas para
obtener las distintas concentraciones de lactosa utilizadas durante la fase experimental.
73
Capítulo 3.
Tabla 3.1. Características químicas de los sueros utilizados como sustrato

Parámetros (*) Suero 1 (UF) Suero 2 Suero 2 NF
Lactosa (g/L) 120 – 170 55 137
Proteína (g/L) 2,60 1,5 5,5
pH 5,8
K (mg/L) 5730,51 1400 2500
Na (mg/L) 1629 456 751
Ca (mg/L) 927,45 200 200
Mg (mg/L) 309,09 <100 200
Cu (mg/L) <0,1 <8 <1
Fe (mg/L) <0,5 <5 <5
Mn (mg/L) <0,8 <8 <8
Zn (mg/L) <0,1 <1 <1
-
F (mg/L) 187 212,87 138,63
Cl- (mg/L) 5120 880,74 1181,34
Br- (mg/L) 258 31,35 33,03
-
NO2 (mg/L) 1,02 <1 <1
-
NO3 (mg/L) 9,4 <1 <1
SO42- (mg/L) 418 65,59 221,96
PO43- (mg/L) 2620 896,99 1906,95
(*) Valores expresados en base seca. UF = suero ultra filtrado; NF= suero nanofiltrado; el Suero
2, corresponde a suero crudo no tratado.
Figura 3.2.Unidad experimental de filtración.de placas LabStak® M20 (Alfa Laval, Suiza)
Tal y como se ha indicado en el Capítulo 1, la concentración de lactosa requerida para el

eficiente desarrollo de la fementación ABE, evitando problemas de inhibición, entre 50
74
– 60 g/L. Por este motivo, el Suero 2 nanofiltrado se diluyó en agua destilada hasta
obtener sustratos con la concentración inicial de lactosa deseada.
3.2. Microorganismos y condiciones de cultivo

Para el desarrollo de este trabajo se han utilizado levaduras de las especies
Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae para la producción de etanol y la
bacteria anaerobia Clostridium beijerinckii para la producción de butanol. Con el objeto
de garantizar la esterilidad, todos los componentes de los medios de cultivo fueron
autoclavados a 121 °C durante 15 – 20 minutos. Durante este trabajo se han utilizado
estos procedimientos de cultivo de microorganismos:
a) Para la producción de etanol, se ha trabajado con las siguientes cepas de K.

marxianus: DSM 5418, DSM 5422, DSM 7239 y DSM 70799. Estas cepas fueron
suministradas por Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ) (Braunschweig, Alemania) en forma de liófilo. El cultivo se activó
en medio líquido YPG (extracto de levadura 10 g/L, peptona 20 g/L, glucosa 20
g/L) y se incubó a 35 °C, con una agitación de 120 rpm, durante 24 h. Los cultivos
reactivados se criopreservaron en glicerol al 16% a -80 °C. De manera rutinaria,
las cepas fueron inoculadas en placas de medio YPG sólido (20 g/L de agar) hasta
el crecimiento de colonias y se conservaron a 4 °C.
El inóculo se preparó a partir de una colonia en un medio de cultivo estéril (50
g/L de lactosa, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona, 2 g/L de NH4Cl,
1 g/L de KH2PO4 y 0,3 g/L de MgSO4·7H2O, pH 5 ajustado con HCl 2M) y se incubó
en un agitador orbital termocontrolado (Infors HT Minitron; Infors AG,
Bottmingen, Suiza) a 35 °C con una agitación constante de 120 rpm durante 7 h
hasta alcanzar la fase de crecimiento exponencial y una densidad celular en
torno a 108 células/mL.
b) Aunque las cepas de la especie S. cerevisiae no tienen capacidad natural para

metabolizar lactosa, se ha trabajado con cuatro cepas seleccionadas en base a
su aplicación a nivel industrial. Para ello, el suero lácteo fue sometido a un
proceso previo de hidrólisis enzimática. Se seleccionaron las cepas: Ethanol Red®
75
Capítulo 3.
(Leaf de Lesaffre, Marcq-en-Baroeul, Francia), cepa utilizada de modo

estandarizado en destilerías de etanol que ofrece una elevada tolerancia a altas
temperaturas y a concentraciones de etanol superiores al 18% (v/v); la cepa
híbrida osmotolerante CECT 13152 obtenida de la fusión protoplasmática de las
cepas de S. cerevisiae NCY73 y una cepa no identificada de S. cerevisiae
(suministrada por la empresa Tomsa Destil S.L., Madrid, España); la levadura
aislada en destilerías CECT 1383, suministrada por la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT) (Valencia, España) en forma de liófilo y la levadura de
panadería fresca prensada de nombre comercial “Hércules” (Lesaffre Ibérica,
Valladolid, España).
Las cepas Ethanol Red®, CECT 13152 y “Hércules” fueron directamente añadidas
en forma sólida (0,1%, p/v) al fermentador sin realizar una propagación
preliminar. En el caso de la cepa CECT 1383, una vez reactivada la cepa, fue
cultivada en agar nutritivo (5 g/L de peptona, 3 g/L de extracto de carne, 20 g/L
de agar, pH 6,8) y almacenada a 4 °C. Las cepas fueron inoculadas en placas de
medio YPG estéril hasta el crecimiento de colonias y se conservaron a 4°C.
El inóculo de CECT 1383 se preparó transfiriendo una colonia en 50 mL de medio

YPG en condiciones estériles y se incubó a 32°C en un agitador orbital
termocontrolado (Infors HT Minitron; Infors AG, Bottmingen, Suiza) con una
agitación constante a 120 rpm durante 7 h hasta alcanzar la fase de crecimiento
exponencial y una densidad celular de aproximadamente 108 células/mL.
c) Para la producción de butanol, se utilizó la especie Clostridium beijerinckii CECT

508 suministrada por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Valencia,
España) en forma de liófilo. El liófilo fue resuspendido en medio RCM (38 g/L)
(Oxoid CM0149, Oxoid Ltd., Hampshire, Reino Unido). Las condiciones de
anaerobiosis se garantizaron trabajando en una cabina de anaerobiosis Whitley
DG250 Workstation (Don Withley Scientific, Reino Unido) con una atmósfera
compuesta por 80% N2, 10% H2 y 10% CO2 (Contse S.A., Madrid, España).
Posteriormente, se obtuvieron esporas de la cepa. Para ello, se inoculó una
colonia bacteriana en 50 mL de medio RCM y se incubó durante 10 días a 37 °C.
76
Posteriormente, el cultivo se centrifugó a 5 °C durante 21 minutos y se eliminó

el sobrenadante. Seguidamente, el pellet bacteriano se resuspendió en 2 mL de
agua estéril, se centrifugó de la misma manera y se eliminó el sobrenadante.
Posteriormente se resuspendió en 2 mL de tampón fosfato (PBS) (Sigma Aldrich,
St. Louise, USA) y 100 g de lisozima (Sigma Aldrich, St. Louise, USA), se sonicó
durante 5 minutos y se incubó a 37 °C durante 2 h. Posteriormente, se centrifugó
y se eliminó el sobrenadante. Se realizaron 7 lavados del pellet bacteriano
mediante centrifugación con 2 mL de agua estéril. Por último, se cubren las
esporas con agua estéril y se conservan a 4 °C.
El inóculo bacteriano para la fermentación se obtuvo a partir de 250 μL de
esporas inoculadas en 100 mL de medio de cultivo RCM contenidos en botellas
de cristal de 125 mL y se sometió a un choque térmico (80 °C durante 2 minutos
seguido de 5 minutos en un baño de hielo). Las condiciones de anaerobiosis se
generaron mediante burbujeo de N2 (99,9 % de pureza; Contse S.A., España) en
la zona de cabezas de las botellas durante 5 minutos. Finalmente, las botellas se
incubaron durante 20 h a 35 °C hasta alcanzar una densidad bacteriana de
aproximadamente 6·108 células/mL.
En la Figura 3.3., se muestran las imágenes obtenidas mediante microscopia de fases

(Microscopio DM 750, Leica Microsystems, Alemania) de las especies microbianas
empleadas en este estudio.
Figura 3.3. Imágenes de los microorganismos en microscopía de contraste de fases a

400X a) Kluyveromyces marxianus DSMZ 7239; b) Saccharomyces cerevisiae Ethanol
Red®; c) Clostridium beijerinckii CECT 508, en sustrato de lactosuero.
77
Capítulo 3.
3.3. Pretratamiento del lactosuero

Dada la incapacidad natural de la especie S. cerevisiae para metabolizar lactosa, el Suero
1 se sometió a una hidrólisis enzimática, utilizando β-galactosidasa comercial (HA-
Lactase 2100, Chr. Hansen Holding A/S, Hoersholm, Dinamarca), con una actividad
enzimática de 2.100 NLU/g.
Las condiciones de hidrólisis de la lactosa (Capítulo 5) se optimizaron mediante

metodologías de superficie de respuesta (MSR) de tipo central compuesto (CC). Se
trabajó con el Suero 1, con una concentración inicial de lactosa de 120 g/L. Los factores
evaluados fueron: dosis de enzima, pH y tiempo de hidrólisis. Las variables de respuesta
fueron la concentración final de glucosa (Gf) y la concentración final de galactosa (Galf),
ambas expresadas en g/L, y el rendimiento de hidrólisis.
La optimización se realizó utilizando 50 mL de Suero 1 en matraces Erlenmeyer de 100

mL cubiertos con tapones de espuma. Las hidrólisis se realizaron en un agitador orbital
termocontrolado (Infors HT Minitron; Infors AG, Suiza) con una agitación constante de
120 rpm durante 7 h, en las condiciones de operación (T, pH y tiempo de reacción)
establecidas en el diseño experimental. Los ensayos fueron realizados por triplicado.
3.4. Descripción de los sistemas de

fermentación
Los sistemas de fermentación se mantuvieron en condiciones de esterilidad, mediante
su autoclavado durante 15 minutos a 121 °C, incluyendo los fermentadores, los
instrumentos de control y cualquier material en contacto con los microorganismos.
Asimismo, cuando fue necesario, las condiciones de anaerobiosis se obtuvieron
inyectando N2 (pureza de 99,9%) en el interior de los fermentadores.
3.4.1. Fermentación discontinua o por lotes

3.4.1.1. Etanol
Para la producción de etanol (Capítulos 4 y 5), se utilizaron como fermentadores para
los ensayos discontinuos, matraces Erlenmeyer de 100 mL de volumen, que contenían
50 mL de Suero 1 o hidrolizado de Suero 1. La concentración de lactosa requerida se
78
ajustó diluyendo con agua destilada. En todos los casos se añadió un 2,5% (v/v) de
inóculo en el medio de fermentación (pH 6). Posteriormente, se incubó a 35 °C y una
agitación constante a 150 rpm en un incubador orbital termocontrolado (Infors HT
Minitron; Infors AG, Suiza) a diferentes tiempos, dependiendo de los experimentos
realizados (Figura 3.4). Los experimentos fueron realizados por duplicado durante los
ensayos preliminares y por triplicado durante la optimización de las condiciones de
operación. En el caso de diseños experimentales mediante MSR, el punto central se
repitió por quintuplicado, tal y como se detalla en el Anexo II.
Figura 3.4.Proceso de producción de etanol mediante fermentación de suero lácteo

utilizando la levadura Kluyveromyces marxianus. a) Placa de cultivo puro de
klumveromyces marxianus; b) Proceso de inoculación del microorganismo en el medio
de fermentación; c) Fermentación de las muestras en el incubador con agitación orbital;
d) Aspecto de la muestra tras finalizar la fermentación alcohólica.
Además, se evaluó el efecto de diversos factores que pueden afectar el rendimiento de

la fermentación como la temperatura, el pH y la concentración inicial del sustrato
(Capítulo 4). Asimismo, se determinó el efecto de la suplementación de lactosuero con
soluciones nutritivas ricas en nitrógeno; sales de fosfato responsables del crecimiento
celular (Parrando et al., 2009); sales de magnesio que promueven el crecimiento de la
79
Capítulo 3.
masa celular (Dombek and Ingram, 1986) o tioglicolato de sodio, agente reductor que
neutraliza los efectos tóxicos (MacFaddin, 1985). El objeto de esta experiencia fue
minimizar o eliminar el uso de nutrientes, dado su elevado coste, y así, mejorar la
viabilidad económica del proceso (Capítulo 5).
3.4.1.2. Butanol
Para la fermentación ABE, los experimentos preliminares se realizaron con control del
pH automático, dosificando una solución de NaOH (1 M) empleando buretas
automáticas (Crison, España) con el fin de mantener el pH del medio por encima de 5, y
así evitar un posible “crash-ácido”. El control de temperatura y agitación se realizó sobre
una placa calefactora con agitación integrada en el carrusel de reacciones de 6 x 250 mL
(Radleys, Reino Unido). Las condiciones de anaerobiosis se garantizaron inyectando N2
industrial (99,9% de pureza). Se inocularon 200 mL del medio de fermentación con 3 mL
de inóculo (Figura 3.5). Sin embargo, a lo largo de la investigación se observó que era
posible evitar un posible “crash ácido” adicionando CaCO3 como medio tamponador.
En procesos discontinuos, se evaluó el efecto de la adición de nutrientes sobre la

producción de butanol y el rendimiento de la fermentación ABE (Capítulo 6). El proceso
de fermentación se llevó a cabo utilizando como reactores botellas de vidrio para plasma
de rosca de 40 mm con tapones de caucho de 100 mL que contenían 50 mL de suero 2,
previamente nanofiltrado y diluido con agua destilada hasta la concentración de lactosa
necesaria. El pH del medio de fermentación se ajustó a 6.0 utilizando una solución
alcalina y se inóculo con un 3% (v/v) de cultivo bacteriano. Posteriormente, se burbujeó
N2 de calidad industrial en la zona de cabezas durante 5 minutos. Los fermentadores se
incubaron a 35 °C y 100 rpm durante 96 horas en un incubador orbital termocontrolado
(Infors HT Minitron; Infors AG, Suiza) (Figura 3.5). Todos los experimentos fueron
realizados por triplicado. Como medio control del proceso de fermentación se utilizó un
medio estándar adaptado a partir de medio P2 (Qureshi y Blaschek, 1999), consistente
en 5 g/L de extracto de levadura; 1 g/L de KH2PO4; 2,1 g/L de NH4Cl; 5 g/L de CaCO3; 0,2
g/L de MgSO4·7H2O; 0,01 g/L de FeSO4·7H2O y 0,5 g/L de cisteína, además del sustrato,
en este caso lactosa. Tanto el lactosuero empleado como todos los compuestos
constituyentes del medio de cultivo fueron autoclavados durante 15 minutos a 121 °C,
a excepción de las sales MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O y la cisteína que fueron esterilizadas
80
mediante filtración a través de un filtro de nylon con un tamaño de poro de 0,2 μm y 25

mm de diámetro (Auxilab S.L, España).
Figura 3.5.Proceso de producción de butanol a partir de suero lácteo por fermentación

ABE con C. beijerinckii CECT 508. a) Carrusel de fermentación con control de pH
automático; b) Cabina de anaerobiosis; c) Reactor de fermentación pre (1) y post (2)
fermentación y d) Cabina de incubación con agitación controlada.
El escalado de las fermentaciones discontinuas para las fermentaciones ABE se realizó

utilizando un fermentador de cristal de 2 L autoclavable Biostat B® (Sartorious,
Alemania), con agitación superior y control automático de pH y temperatura,
empleando una micro-DCU (Braun, Alemania) (Figura 3.6).
Figura 3.6. Biorreactor Biostat B® de 2 L (Sartorious, Alemania) con Micro-DCU (Braun,

Alemania).
81
Capítulo 3.
3.4.2. Fermentación continua. Inmovilización

celular
Las fermentaciones en continuo se realizaron con microorganismos inmovilizados con el
fin de aumentar la densidad celular. Las tecnologías de inmovilización empleadas para
la obtención de etanol fueron el atrapamiento en geles de alginato (Capítulo 4) y
adsorción sobre soportes inorgánicos (Capítulo 5).
3.4.2.1. Inmovilización por atrapamiento en geles de

alginato cálcico
En el Capítulo 4, se trabajó en mejorar la inmovilización de la cepa K. marxianus DSM
5422 por atrapamiento. Para ello, se realizó un diseño experimental mediante
Metodología de Superficie de Respuesta para optimizar los parámetros de formación de
las esferas de alginato cálcico [concentración de alginato (%, p/v), diámetro de la esfera
(mm) y carga celular (%, v/v)], para maximizar la producción de etanol en
fermentaciones de alta densidad trabajando con concentraciones elevadas de lactosa
(L0 = 170 – 190 g/L). El modelo de inmovilización optimizado se validó
experimentalmente mediante el reciclado del medio de fermentación durante seis ciclos
trabajando con suero lácteo concentrado, con el fin de demostrar la viabilidad de
combinar la fermentación de alta concentración con la inmovilización celular.
Los geles de alginato cálcico se realizaron disolviendo distintas concentraciones de

alginato de sodio (de acuerdo al diseño experimental) en una disolución acuosa de 0.9%
(p/v) de NaCl y esterilizándolo mediante autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Las
diferentes suspensiones celulares (%, p/v) de la cepa K. marxianus DSM 5422
establecidas en el diseño experimental fueron mezcladas en la solución de alginato. La
mezcla se homogeneizó con ayuda de una bomba peristáltica (323 U/RL Watson
Marlow, Watson Marlow Bredel Pumps, Corwall, England). Se dejó gotear a través de
agujas de distinto calibre para obtener esferas de diferentes diámetros, sobre una
solución estéril de cloruro de calcio al 2% (p/v). Las esferas inmovilizadas se mantuvieron
en la solución durante 1 h a 35 °C y una agitación de 150 rpm para el endurecimiento de
la superficie del gel. Finalmente, las esferas de alginato inmovilizadas se lavaron con
agua estéril para eliminar el exceso de iones Ca2+ y de células libres (Figura 3.7).
82
En cada uno de los fermentadores, se adicionaron 10 g de esferas de gel de alginato

cálcico con células de K. marxianus DSM 5422 inmovilizadas en matraces Erlenmeyer de
250 mL, incorporando como sustrato Suero 1 no suplementado con nutrientes
adicionales. Las condiciones de fermentación T, pH inicial del caldo de fermentación y
concentración inicial de lactosa en el suero lácteo fueron establecidas para cada uno de
los microorganismos utilizados.
Figura 3.7. Imágenes de la inmovilización de células de K. marxianus DSM 5422 por

atrapamiento en geles de alginato: a) Instalación utilizada para la fabricación de los geles
de alginato; b) Detalle de las esferas de alginato.
3.4.2.2. Inmovilización por adsorción

Otra tecnología de inmovilización evaluada en este estudio ha sido la adsorción sobre
soportes inorgánicos (Capítulo 5). Para ello, se seleccionaron cuatro soportes
inorgánicos porosos, dada su amplia disponibilidad, su bajo coste económico, su fácil
acondicionamiento y la posibilidad de esterilizar con vapor, lo que facilita su
reutilización. Los materiales seleccionados fueron: plástico, vidrio sinterizado y silicona
Tygon® en forma de anillos Raschig (longitud de 5 – 5,5 mm) y esferas de alúmina (5 mm
de diámetro) (Figura 3.8).
Los cuatro soportes inorgánicos seleccionados fueron lavados con agua desionizada y
esterilizados en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Se pesaron en torno a 10 g de
cada uno de los materiales de soporte y se introdujeron en matraces Erlenmeyer de 250
83
Capítulo 3.
mL. Posteriormente, se adicionaron 50 mL de Suero 1 no suplementado a una

concentración inicial de lactosa de 130 g/L y 3,7% (v/v) de inóculo. La cepa de levadura
y las condiciones de fermentación fueron determinadas a través de un diseño
experimental de optimización. Cada 48 o 72 horas se reemplazó el suero agotado por
suero fresco durante 7 ciclos de fermentación. Los caldos de fermentación agotados
fueron analizados para determinar el desarrollo de la fermentación evaluando el
rendimiento producto-sustrato, la tasa de consumo de la lactosa y la productividad.
Figura 3.8. Soportes inertes utilizados en la inmovilización celular. De izquierda a

derecha: a) Anillos Raschig de plástico; b) Anillos Raschig de Tygon; c) Anillos Raschig de
vidrio y d) Esferas de alúmina.
Posteriormente, los soportes de inmovilización con mejor comportamiento durante la

fermentación fueron sometidos a un test de estabilidad durante un periodo de tiempo
prolongado. Para ello, los dos soportes en los que se obtuvieron mayores rendimientos
de fermentación fueron seleccionadaos y sometidos al reciclado del caldo de
fermentación durante 14 ciclos (1.000 horas). Para comparar el efecto de la
concentración de lactosa sobre el biofilm y la fermentación, se trabajó con Suero 1 a dos
84
diluciones de lactosa (130 g/L y 170 g/L). Toda la experimentación fue realizada por
triplicado.
3.5. Recuperación de solventes

Para mejorar la productividad de la fermentación ABE y garantizar una concentración de
solventes elevada, se han evaluado el arrastre de vapor o gas stripping como tecnología
de recuperación in situ de producto, con el fin de conseguir un mejor aprovechamiento
de los sustratos y minimizar la inhibición microbiana por producto. A la vez se reducen
los costes de recuperación, se mejora el rendimiento y la productividad global del
proceso fermentativo (de Vrije et al., 2013; Xue et al., 2014).
En este trabajo se evaluó la recuperación de solventes ABE por arrastre de gas. En la

experimentación se trabajó con dos tipos de soluciones:
a) Una solución acuosa sintética con 5 g/L de acetona, 10 g/L de butanol y 1,67 g/L
de etanol con una relación A:B:E (3:6:1), de acuerdo a modelos ideales de
producción de solventes en la fermentación ABE.
b) Caldos de fermentación que contenían bacterias agotadas. Estos caldos se
obtuvieron fermentando el suero de queso de oveja (Suero 2), con una
concentración inicial de 40 g/L de lactosa suplementado con nutrientes, e
inoculado con C. beijerinckii CECT 508, de acuerdo a la optimización de la
suplementación de nutrientes obtenida en el Capítulo 6.
3.5.1. Optimización del gas-stripping

El sistema de gas-stripping utilizado en el Capítulo 7 (Figura 3.9), consistió en un
condensador Dimroth de doble serpentín con una longitud de 400 mm y una superficie
de 1.135 cm2. Los condensados generados se recogen en un evaporador refrigerado de
1 L (Pobel, España). El sistema se conecta al fermentador mediante un conjunto de
tuberías y bombas. El fermentador consistía en una botella de vidrio de 1 L que contenía
un agitador magnético. La botella se cerró con una tapa roscada que tenía en la parte
superior una placa metálica de acero inoxidable en la que se realizaron cinco
entradas/salidas: una entrada para la sonda de temperatura; una segunda entrada para
la entrada del gas de arrastre mediante un difusor de piedra metálico; una salida para
85
Capítulo 3.
los vapores de condensación con o sin gases de arrastre; y dos entradas para la adición
de nutrientes y/o antiespumantes durante la fermentación.
Se utilizó una placa de calentamiento y agitación con sonda de temperatura (Yellow

MAG HS 10, IKA, Staufen, Alemania) para controlar la temperatura de la solución de
alimentación. La temperatura de refrigeración del sistema de condensación se mantuvo
mediante un termostato LAUDA Integral T 2200 utilizando una mezcla de
monoetilenglicol/agua (LAUDA, Lauda-Königshofer, Alemania). El gas de arrastre fue
recirculado con una bomba de vacío Modelo DOA-P504-BN (GAST Manufacturing,
Michigan, EE. UU.). El flujo de gas se controló mediante un rotámetro ajustable
manualmente (Key Instruments, Brooks Instruments, Hatfield, PA, EE. UU.).
El sistema de recuperación se iniciaba con el purgado de todo el circuito de gas durante

2 minutos con N2 industrial para reemplazar el aire atmosférico. Posteriormente, se
cerraba el circuito, se fijaba el flujo de gas deseado con el rotámetro y se recirculaba el
gas de arrastre continuamente mediante la bomba. Después de 15 minutos de
estabilización, se iniciaba el experimento.
Figura 3.9. Configuración del sistema de extracción de gas utilizado en los experimentos:
a) Diagrama del sistema; b) Fotografía del montaje de gas stripping.
86
Las condiciones de proceso se optimizaron mediante MSR con un diseño central

compuesto de tres variables (temperatura de alimentación, flujo de gas y temperatura
de refrigeración) para maximizar la recuperación de butanol y la selectividad de butanol,
en el medio acuoso sintético. Cada experimento de la MSR tuvo una duración de 18
horas. Las condiciones de trabajo optimizadas con el medio acuoso sintético, fueron
validadas experimentalmente con el caldo de fermentación. a varios tiempos de
operación (4 – 18 h).
3.5.2. Gas-stripping en dos etapas

Para aumentar la concentración final de butanol, la fase acuosa recogida en el
condensado de la primera etapa de gas-stripping, con una concentración de butanol
~ 8% (p/p) se sometió a una segunda etapa de gas-stripping, de acuerdo con las
condiciones previamente optimizadas en la sección 3.5.1. La fase orgánica, con una
concentración de butanol de ~ 60% (p/p), recogida de la primera etapa de stripping, se
almacenó junto a la corriente orgánica recogida en la segunda etapa de stripping. Todas
las corrientes recogidas fueron caracterizadas.
3.5.3. Fermentación semicontinua con

recuperación de solventes in situ mediante gas-
stripping
Las condiciones óptimas obtenidas con disoluciones acuosas sintéticas, según las
ecuaciones de la MSR, fueron validadas experimentalmente con caldos de fermentación
a varios tiempos de fermentación entre 4 y 18 horas. Para ello, se partió de un caldo de
fermentación de 500 mL obtenido a partir del Suero 1, utilizando C. beijerinckii CECT 508
como microorganismo. La composición del caldo de fermentación fue de 3,02 g/L de
acetona, 12,04 g/L de butanol, 0,23 g/L de etanol, 0,99 g/L de ácido acético y 1,15 g/L
de ácido butírico, con una densidad bacteriana de 7·108 células/mL. Este caldo se acopló
a una etapa de recuperación por gas-stripping, tal y como se indica en la Sección 3.5.1.
Asimismo, se evaluó el efecto del gas-stripping sobre las células de C. beijerinckii. Para
ello, después de un primer ciclo de gas-stripping en las condiciones optimizadas según
el modelo MSR, se añadió agua destilada y lactosa al caldo de fermentación para
conseguir un volumen final de 500 mL con una concentración final de lactosa de ~ 40 g/L.
87
Capítulo 3.
Se adicionaron 0,5 g de extracto de levadura con el objeto de evitar déficits de nitrógeno

que perjudicasen el metabolismo microbiano. Cuando las bacterias alcanzaron
nuevamente su fase estacionaria y produjeron ~ 10 g/L de butanol, se inició un segundo
ciclo de gas-stripping, utilizando las mismas condiciones empleadas en el primer ciclo.
3.6. Métodos de Análisis

El seguimiento de los procesos de fermentación y recuperación de productos se realizó
recogiendo muestras periódicas durante las etapas de pretratamiento y/o fermentación
con el fin de evaluar la evolución temporal de los procesos. Las muestras recogidas de
modo aséptico se centrifugaron a 12.000 x g en una microcentrífuga (MiniSpin,
Eppendrorf, Hamburgo, Alemania) durante 3 minutos.
3.6.1. Determinación de metabolitos principales

y secundarios
La determinación de lactosa, glucosa, galactosa, ácido láctico y etanol se realizó
utilizando un equipo HPLC Agilent 1200 con un detector de índice de refacción G1362A
(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) y la columna Aminex HPX-87H (300
mm x 7,8 mm) (Biorad, Hercules, California, USA) con una fase móvil acuosa de 5 mM
de H2SO4, una velocidad de flujo de 0,6 mL/min y una temperatura de columna de 60 °C.
El volumen de inyección de la muestra fue de 20 µL.
La determinación de acetona, etanol, butanol, ácido acético y ácido butírico se realizó

mediante cromatografía de gases utilizando el equipo Agilent 7890 A GC con detector de
ionización de llama (FID), utilizando una columna HP Innowax 30 m x 0,530 mm, 1,00 µm
(Agilent Tecnologies, Santa Clara, California, USA). La llama del FID se mantuvo con una
mezcla de 30 mL/min de H2 y 400 mL/min de aire, usando N2 como gas auxiliar. Se
inyectó un volumen de la muestra acuosa de 1 μL en modo split (ratio 25:1) y la
temperatura del inyector fue de 250 °C. La temperatura del horno se mantuvo en 40 °C
durante 2 min, luego se elevó a 45 °C con una rampa de calentamiento de 5 °C/min,
aumentando a una velocidad de 20 °C/min hasta 225 °C y se mantuvo durante 8 min a
esa temperatura. La temperatura del detector se ajustó a 250 °C. El gas portador fue
helio a 2 mL/min.
88
En la etapa de recuperación de solventes mediante gas-stripping, se tomaron muestras

acuosas del depósito de alimentación antes y después de la etapa de gas-stripping y del
condensado obtenido del proceso. Todos los volúmenes fueron medidos utilizando una
probeta graduada. Las soluciones acuosas y el condensado fueron directamente
analizados para determinar la concentración de solventes ABE por cromatografía de
gases, tal y como se ha indicado en el párrafo anterior. El caldo de fermentación fue
inicialmente centrifugado a 12.000 rpm durante 3 minutos en una microcentrífuga
(MiniSpin, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y el sobrenadante fue filtrado a través de
un filtro de nylon de 0,20 μm antes de determinar la concentración de solventes ABE
por cromatografía de gases.
3.6.2. Determinación del crecimiento celular

En general, la densidad celular se determinó utilizando una cámara de recuento Bürker
(Paul Marienfeld GmbH Co. KG, Lauda-Königshofen, Alemania). En el caso de las cepas
de la levadura K. marxianus, la concentración de células libres se midió usando métodos
de densidad óptica y peso seco. Para cada cepa se determinó una correlación entre el
peso de la célula seca (N) y la densidad óptica (DO). El peso seco se determinó
centrifugando las muestras a 10.000 rpm en una microcentrífuga (Minispin, Eppendorf,
Hamburgo, Alemania) durante 3 minutos. Las células se lavaron con agua desionizada
dos veces, se secaron durante la noche a 90 – 100 °C y se pesaron. La densidad óptica
se midió a una longitud de onda de 600 nm utilizando un espectrofotómetro VARIAN
Cary 50 Conc UV-visible (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La correlación
obtenida para la cepa K. marxianus DSM 5422 fue:
N (g/L) = (0,2754 x DO + 1,1486) R2 = 0,996
3.6.3. Determinación de aniones y cationes

Los aniones (F-, Cl-, Br-, NO2-, NO32-, SO42- y PO43-) se determinaron mediante
cromatografía iónica, con el equipo Dionex Model ICS 2000 (ThermoFisher, Sunnyvale,
CA, USA) dotado con un detector conductimétrico Dionex DS6. Para el procesado de los
datos se utilizó el software Dionex Chromeleon versión 6.7. La separación fue realizada
utilizando la columna de intercambio aniónico Dionex IonPac AS19 (250 x 4 mm de d.i.i)
combinada con la precolumna Dionex IonPAC AG19 (50 x 4 mm de d.i.) y un supresor de
89
Capítulo 3.
conductividad Dionex ASRS Ultra II 4 mm ubicado entre la columna analítica y la celda

de conductividad. El eluyente utilizado fue una disolución de hidróxido potásico que se
generó en línea, utilizando el cartucho Dionex EG50 KOH y permitió trabajar en
gradiente. Un volumen de muestra de 75 μL fue inyectado con el muestrador
automático Dionex AS40. La columna se mantuvo a 30 °C con una velocidad de flujo de
1,0 mL/min. La concentración del eluyente se mantuvo en 10 mmol/L desde 0 a 20
minutos, se incrementó a 45 mmol/L durante los siguientes 5 minutos, después se bajó
a 10 mmol/L y se mantuvo a esa concentración durante 5 minutos. Después la columna
se equilibró a 10 mmol/L durante 15 min. Las muestras fueron filtradas a través de un
filtro de nylon de 0,45 μm antes de analizar. El rango de calibración para los aniones fue
de 10-500 mg/L.
La concentración de cationes (Na, K, Ca y Zn) fue determinada en un espectrofotómetro

Varian 240FS AA (Agilent Tecnologies, Palo Alto, CA, USA) mediante absorción atómica
de llama (aire-acetileno). Los cationes Na y K fueron determinados midiendo la emisión
atómica de radiación, mientras que los cationes Ca, Mg y Zn se determinaron midiendo
la absorción atómica de radiación. Los cationes Fe, Cu y Mn fueron determinados
mediante absorción atómica en un horno de grafito con corrección de fondo por efecto
Zeeman (en atmósfera inerte de argón) utilizando el espectrofotómetro Varian 240Z AA.
Las muestras fueron filtradas a través de un filtro de nylon de 0,45 μm antes de analizar.
El rango de calibración para todos los metales fue de 1 – 5 mg/L.
3.6.4. Determinación de proteína

El contenido de proteína se calculó como el resultado de multiplicar el contenido en
nitrógeno por un factor de transformación del nitrógeno en proteína. El nitrógeno total
se determinó por el método Kjeldahl (MAPA, 1994). En este método, la muestra se
digiere con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador, transformándose en sulfato
de amonio. El equipo de digestión utilizado fue un Tecator Digestor Auto20 (Foss,
Barcelona, España). Posteriormente, se alcaliniza el medio con una solución de hidróxido
sódico. El amoniaco liberado es arrastrado por destilación y recogido sobre ácido bórico
utilizando la unidad Tecator Scrubber y el destilador KjeltecTM 2200 (Foss, Barcelona,
España). Finalmente, los aniones del borato formado se titulan con HCl 0,1 N en un
90
valorador automático 927 Titrino de Metrohm (Herisau, Suiza) para determinar el

nitrógeno inicial y por tanto el porcentaje de proteínas.
3.6.5. Caracterización morfológica

Para evaluar los cambios morfológicos en los soportes de inmovilización después de
varios ciclos de fermentación se utilizó microscopía electrónica de barrido (MEB o SEM,
las siglas en ingles de Scanning Electron Microscope), empleando el equipo Jeol JSM
6610LV (Tokio, Japón). Para ello, las muestras biológicas requieren un proceso de
desecado y un recubrimiento con una película de un metal conductor. Con este
propósito, al inicio de la experimentación y al finalizar los siete ciclos de fermentación
continuos, se tomó una pieza de cada uno de los materiales inertes de inmovilización y
unas esferas de alginato de calcio inoculadas con K. marxianus (Anexos de los Capítulos
4 y 5; Figuras A.4.1 y A.5.1). Los soportes inorgánicos se lavaron con agua desionizada y
se secaron durante 24 horas a 60 °C de acuerdo a Genisheva et al. (2011). En el caso de
las esferas de alginato, las muestras fueron estabilizadas químicamente mediante
inmersión en una solución salina tamponada con fosfatos al 2,5% de glutaraldehído, pH 7,4
(Sigma Aldrich, St. Louis, USA) a 4 °C durante 4 horas. Posteriormente, se sometieron a una
deshidratación química, sumergiéndolas en soluciones de etanol acuoso a
concentraciones crecientes (30%, 50%, 70%, 90%, 3 x 96% y 3 x 100%) durante 30
minutos en cada solución. Las esferas de alginato se secaron en un desecador de punto
crítico CPD 030 (BAL-TEC, Principado de Liechtenstein). Las muestras se fijaron sobre
soportes cilíndricos metálicos de aluminio y se recubrieron con un revestimiento de oro
para crear una superficie conductora utilizando el pulverizador SCD 004 (Balzers UL,
Principado de Liechtenstein).
En los Anexos A.4.1 y A.5.1, se muestran imágenes de microscopía electrónica de barrido

(MEB) con la distribución y colonización de K. marxianus DSM 5422 inmovilizada por
adsorción sobre diversos soportes inertes y atrapados en esferas de gel de alginato.
91
Capítulo 3.
Figura 3.10. Microscopio Electrónico de Barrido Jeol LV 6100okio, Japón)
3.7. Parámetros de seguimiento y control de las

fermentaciones
Los parámetros de seguimiento evaluados fueron:
a) La tasa de lactosa consumida (ΔL) definida como la lactosa consumida respecto

a la lactosa inicial, de acuerdo a la ecuación:
∆𝐿 = (ec. 3.1)
siendo Li y Lf, las concentraciones inicial y final de lactosa, expresadas en g/L.

b) El rendimiento producto-sustrato (YP/L, g/g), que se define como la relación entre
la concentración final de producto (etanol o butanol) y el sustrato consumido
(diferencia entre el contenido inicial y final de azúcares, en este caso lactosa, de
acuerdo a la ecuación:
𝑌 = (ec. 3.2)
siendo Pf la concentración final del producto, expresada en g/L.

c) El rendimiento de producto por porcentaje de sustrato consumido (πP, g/L),
definido como la concentración de producto (g/L) multiplicada por la tasa de
lactosa consumida (ΔL), de acuerdo a la ecuación:
𝜋 = 𝑃 × 𝛥𝐿 (ec. 3.3)
d) La productividad [WP, g/L·h], se expresó como la relación de los gramos de

producto (etanol o butanol) generados por litro de suero en relación al tiempo
de fermentación (h).
𝑊 = (ec. 3.4)
92
e) Adicionalmente, se determinó el rendimiento porcentual de fermentación, ηP

(%) como la relación entre el rendimiento real y el teórico para cada uno de los
dos procesos de fermentación evaluados.
𝜂 = ,
× 100 (ec. 3.5)
𝜂 = ,
× 100 (ec. 3.6),
donde ηE es el rendimiento porcentual para el etanol y ηB es el rendimiento

porcentual para el butanol.
f) La eficiencia de la hidrólisis enzimática de lactosa a glucosa y galactosa
(η(G+Gal)/L, %), se calcula de acuerdo a la ecuación:
𝜂( )⁄ = × 100 (ec. 3.7),
siendo Li, la concentración inicial de lactosa, Gf la concentración final de glucosa

libre y Galf la concentración final de galactosa libre, expresadas en g/L.
g) Finalmente, para los procesos de recuperación de solventes por gas-stripping,
los parámetros de seguimiento son la selectividad o factor de separación (αi) y el
rendimiento del factor de recuperación de butanol (ηi), calculados a partir de las
siguientes ecuaciones:
𝛼⁄ = (ec. 3.8)
𝜂 = × 100 (ec. 3.9)
donde αi es la selectividad para el metabolito i (en el caso del butanol; αB), xi es

la relación de masa del metabolito i en la solución de alimentación, yi es la
relación de masa del metabolito i en el condensado, ηi es el porcentaje de
eficiencia de recuperación para metabolito i (en el caso del butanol; ηB), miC es
la masa del metabolito i en el condensado (expresado en g) y miF es la masa del
metabolito i en la solución de alimentación.
3.8. Análisis estadístico

La comparación entre muestras se realizó con pruebas ANOVA de una vía, la prueba HSD
de Tukey o la prueba U de Mann-Withney, utilizando el software Statistica 7 (StatSoft
Inc., Tulsa, OK, EE. UU.), considerando diferencias significativas cuando p<0,05. Para los
93
Capítulo 3.
procesos de optimización, el diseño experimental utilizando Metodología de Superficie

de Respuesta (MSR) y los diseños de Plackett-Burman, fueron generados utilizando el
software Minitab 16 (Minitab Inc., State Collage, Pa, USA).
En el Anexo II, se detalla el diseño experimental por Metodología de Superficie de

Respuesta y los diseños de Plackett-Burman.
Referencias
Genisheva, Z., Mussatto, S. I., Oliveira, J. M., & Teixeira, J. A. (2011). Evaluating the potential of
wine-making residues and corn cobs as support materials for cell immobilization for
ethanol production. Industrial Crops and Products, 34(1), 979-985.
MacFaddin, J.F. (1985). Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenace of Medical

Bacteria, Vol.1, Williams and Wilkins, Baltimore.
MAPA, (1994). Métodos Oficiales de Análisis. Dirección General de Política Alimentaria.

Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación., Madrid.
Napoli F. (2009). Development of an integrated process for butanol production. Dottorato in

Scienze Biotecnologiche- XXII ciclo Indirizzo Biotechnologie Industriali. Universiy of Napoli
Federico II.
Parrondo, J., García, L. A., & Díaz, M. (2009). Nutrient balance and metabolic analysis in a
Qureshi, N., & Blaschek, H. P. (1999). Production of acetone butanol ethanol (ABE) by a hyper-
producing mutant strain of Clostridium beijerinckii BA101 and recovery by
pervaporation. Biotechnology Progress, 15(4), 594-602.
de Vrije, T., Budde, M., van der Wal, H., Claassen, P. A., & López-Contreras, A. M. (2013). “In situ”
removal of isopropanol, butanol and ethanol from fermentation broth by gas
stripping. Bioresource Technology, 137, 153-159.
Xue, C., Du, G. Q., Sun, J. X., Chen, L. J., Gao, S. S., Yu, M. L., ... & Bai, F. W. (2014). Characterization
of gas stripping and its integration with acetone–butanol–ethanol fermentation for high-
efficient butanol production and recovery. Biochemical engineering Journal, 83, 55-61.
94
4. Very high gravity fermentation of non-
supplemented cheese whey permeate (CWP)
by immobilized Kluyveromyces marxianus
Very high gravity fermentation of non-supplemented CWP by immobilized K. marxianus
Very high gravity fermentation of non-

supplemented cheese whey permeate (CWP) by
immobilized Kluyveromyces marxianus
Abstract
The aim of this research was to improve the ethanol production process with very high
gravity fermentation combined with entrapment cell immobilization employing non-
supplemented high lactose-load cheese whey permeate (CWP) as substrate. The effect
of temperature and initial pH was tested on free and immobilized cells and the maximal
allowable doses of substrate without inhibition effects were assessed. An experimental
design by Response Surface Methodology (RSM) was applied to figure out the influence
of gel formation parameters (alginate concentration, cell loading and bead size) on the
entrapment immobilization process. Bead stability and continuous yield production was
evaluated by repeated-batch recycling. The experimental data have demonstrated that
non-supplemented high lactose-load CWP is an excellent low cost substrate. Lactose
dosages between 170-190 g/L provided free-cell yield efficiencies reaching 95.5% with
productivities higher than 1.80 g/L·h at 30 °C. The optimal immobilized model was
validated recycling the gel beads for 288 h, with a mean ethanol production of 83.2 g/L,
a productivity of 1.6 g/L·h and a yield efficiency of 83.2%. Therefore, results demonstrate
the feasibility of combining very high fermentation processes with Kluyveromyces
marxianus immobilization at lab scale, which encourages its validation in continuous
pilot plant configurations.
Keywords: Very high gravity fermentation (VHGF), ethanol, Kluyveromyces marxianus,

entrapment immobilization.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Díez-Antolínez R, Hijosa-Valsero M, Paniagua-García AI, Gómez X (2016) Effect of nutrient
supplementation on biobutanol production from cheese whey by ABE (acetone–butanol–
ethanol) fermentation. Chemical Engineering Transactions 49, 217–222, DOI:
10.3303/CET1649037.
The edition of the manuscript was in accordance with the scientific journal requirements.
97
Capítulo 4.
4.1. Introduction
Bioethanol is a renewable and environmentally friendly alternative to petrol. High
ethanol productivity from low cost feedstock, in addition to lower investment and
operation costs and reduced energy demand, are important aspects in these
bioprocesses (Gabardo et al., 2014). To reduce costs and improve the economics of
ethanol production, several techniques have been developed including very high gravity
(VHG) fermentation or continuous fermentation configurations (Zhang et al., 2015;
Gabardo et al., 2014; Puligundla et al., 2011).
VHG fermentation is associated with important water and energy savings, although the
high concentrations of substrates and end products severely inhibit the performance of
yeasts, limiting the production of ethanol. Therefore, the maximum allowable dose of
substrate is a relevant parameter to avoid inhibitions (Zhang et al., 2015). On the other
hand, cell immobilization techniques overcome most of the bioprocess restrictions, offer
long-term stability of cells, increased molecular selectivity, higher resistance against
inhibition, better cell protection against environmental factors, more active biocatalyst
per unit of reactor volume, low loss of activity, reduced lag phase and reaction time (Eş
et al., 2015). However, cell immobilization techniques also present disadvantages, such
as the decrease of substrate accessibility, alterations in biocatalyst conformation and
activity, biocatalyst stress problems and costly specific reactor systems (Eş et al., 2015).
Cell entrapment is a usual and effective immobilization technique and alginate hydrogel
beads are commonly used due to their biocompatibility, low cost, high porosity and
simplicity of preparation. However, there are challenges to overcome, such as
uncontrollable gel degradation by the loss of covalent ions, mass transfer limitations,
low mechanical strength or large pore size (Duarte et al., 2013). Determinant factors
are: alginate concentration, cell loading and bead diameter (Duarte et al., 2013; Idris
and Suzana, 2006).
The utilization of agro-industrial wastes is of great relevance to reduce operating cost.

Interesting substrates for alcoholic fermentation are cheese whey and cheese whey
permeate (CWP) (Sansonetti et al., 2010; Pisano et al., 2015), even without nutrient
supplementation (Gabardo et al., 2014). The use of high lactose-load CWPs is not
98
common due to inhibitory problems, long fermentation times and low substrate
consumption. Lactose contents about 100 g/L were reported as optimal to reduce
substrate imbalance or inhibitions (Gabardo et al., 2014; Dragone et al., 2011; Ozmichci
and Kargi, 2007, 2009). However, dairy industry concentrates whey up to values of 170
- 180 g/L to reduce transport costs. Therefore, developing VHG fermentations employing
high load CWPs would be an important improvement. To achieve this, it is necessary to
optimize non-inhibitory dosages and operating conditions.
Few microorganisms ferment lactose directly to ethanol with the exception of the genus
Kluyveromyces. The species K. marxianus presents interesting attributes for industrial
uses, such as thermotolerance, high growth rate, capacity to metabolize different
substrates and its GRAS status. However, not many researches evaluating ethanol
production using Kluyveroymes sp. from substrates rich in lactose in immobilized
systems have been reported (Gabardo et al., 2014, 2012; Ozmihci and Kargi, 2009; Brady
et al., 1997).
The aim of this work was to improve the ethanol production process employing VHG
fermentation of non-supplemented high loaded CWPs combined with cell
immobilization by entrapment in alginate. In the first stage, the effect of the
fermentation factors temperature (T) and initial pH (pH0) was tested. Secondly, the
maximal allowable doses of substrate without inhibition effects were assessed. Thirdly,
the entrapment immobilization process was improved by optimizing three gel formation
parameters [alginate concentration (Alg, % w/v), cell loading (Cell, % v/v) and bead size
(Dp, mm)] by response surface methodology (RSM). Finally, bead stability and
continuous yield production was evaluated by repeated-batch recycling.
4.2. Material and methods

4.2.1. Microorganisms and culture conditions
A lyophilized K. marxianus DSM 5422 strain provided by Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Germany) was used. The
reactivated culture was maintained on nutrient agar and stored at 4 °C. A loop-full of a
slant culture was transferred to sterilized growth medium [50 g/L lactose, 0.3 g/L
MgSO4·7H2O (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), 5 g/L yeast extract, 2 g/l NH4Cl
99
Capítulo 4.
(Fluka-Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), 10 g/L peptone (Fluka, Buchs, Switzerland)

and 1 g/L KH2PO4 (Panreac, Castellar del Vallès, Spain)]. The medium was incubated in
an orbital shaker Infors HT Minitron (Bottmingen, Switzerland) at 35 °C with a constant
shaking at 120 rpm during 7 h in order to obtain exponential-phase cells.
4.2.2. Cell immobilization

Sodium alginate (Sigma Aldrich) was dissolved at different concentrations in 0.9% w/v
NaCl (Fluka-Sigma Aldrich) and sterilized by autoclaving at 121 °C for 15 min. The
different tested cell suspensions (%, v/v) were mixed to the sterile alginate solution. The
mixture was immediately dripped trough different gauge needles to get beads of
different diameters using a peristaltic pump into a flask containing a 2% (w/v) CaCl2
solution (Sigma Aldrich). Immobilized beads were left to harden for 1 h at 35 °C with an
agitation of 150 rpm. These beads were rinsed twice with sterile distilled water to
remove residual calcium ions and free cells.
4.2.3. Cheese whey and fermentation media

Cheese whey permeates obtained from a mixture of cow and sheep milk after a
concentration process by ultrafiltration provided by Quesería Entrepinares SAU
(Valladolid, Spain) was the substrate. The CWP was pasteurized by heating at 80 °C for
30 min to avoid the effects of endogenous microorganisms. Lactose and protein content
were respectively 170 g/L and 34 g/L. The CWP presented an initial pH of 5.8.
4.2.4. Analytical methods

Lactose and ethanol were measured using Agilent LC1200 HPLC equipment with a
refractive index detector and an Aminex HPX-87-H column (Bio-Rad, Hercules,
California, USA) with a 5 mM H2SO4 mobile phase.
At the end of each run, fermentation kinetic parameters were determined: lactose
consumption rate (ΔL, %) (defined as the percentage of lactose consumed), ethanol
conversion yield (YE/L, g/g) (defined as the ratio between ethanol produced and lactose
consumed), ethanol production efficiency (η, %) (defined as the ratio between the actual
yield and the theoretical yield expressed as a percentage (considering a theoretical value
100
of 0.538 g/g)) and ethanol production rate (WE, g/(L·h)) (defined as the ratio between
ethanol concentration (g/L) and fermentation time (h)).
4.2.5. Statistical analysis

The RSM for experimental design was generated and interpreted with the software
Minitab 16 (Minitab Inc., State College, PA, USA). Comparisons among treatments were
assessed with Mann-Whitney U tests with the software Statistica 7 (StatSoft Inc., Tulsa,
OK, USA); differences were considered significant when p < 0.05.
4.2.6. Experimental design

This study had a twofold aim. On one hand, to evaluate the effect of key factors such as
initial lactose concentration (L0), T, initial pH (pH0) and fermentation time on the
efficiency of bioethanol production from CWP during VHG fermentation, employing free
and immobilized cells. On the other hand, to improve immobilized fermentation yield
optimizing alginate bead formation parameters to maximize ethanol production. The
optimized model was validated by repeated-batch fermentations, prolonged for 288 h
(6 cycles of 48 h). The whole experimentation was carried out in 100 mL Erlenmeyer
flasks containing 50 mL of CWP at different lactose concentrations without any nutrient
supplementation. Flasks were plugged with foam stoppers to guarantee aeration and
maintained with a constant shaking at 150 rpm in an orbital shaker.
4.3. Results and discussion

4.3.1. Effect of temperature and initial pH
The effect of T and pH0 on free and immobilized cell fermentation is shown in Table 4.1.
Significant differences (p < 0.05) were observed for temperature and type of
fermentation (free or immobilized cells) but not for pH0. The highest ethanol production
(η > 85%; WE = 1.23 g/L·h) was obtained employing free cells at 30 °C. With immobilized
cells, the performance was lower (η = 75%; WE = 1.08 g/L·h), working also at 30 °C.
Lactose consumption was total in all cases. The worst performance was obtained by
immobilized cells due to diffusion problems, because entrapped cells have a poorer
effective contact with essential nutrients in the broth (Nikolic et al., 2010). These data
are in accordance with previous works, which fixed 30 °C as optimal fermentation
101
Capítulo 4.
temperature for K. marxianus strains employing CWP as a substrate in ranges between

30 and 45 °C (Gabardo et al., 2012), with a productivity of 0.96 g/(L·h) and an efficiency
of 83.3%, respectively.
Tabla 4.1. Fermentation results for T and pH0 evaluation (L0 = 120 g/L, time = 44 h).
Ef ΔL YE/L Η WE
T (°C) pH Type
(g/L) (%) (g/g) (%) (g/L·h)
30.0 5.5 Free 54.19±0.33 100.00±0.00 0.460±0.003 85.50±0.52 1.35±0.008
37.0 5.5 Free 48.65±2.04 99.10±1.55 0.413±0.002 76.76±3.21 1.22±0.051
30.0 6.3 Free 53.86±0.84 100.00±0.00 0.461±0.000 85.73±0.02 1.34±0.021
37.0 6.3 Free 50.79±0.62 100.00±0.00 0.432±0.005 80.21±0.98 1.27±0.015
30.0 5.5 Immobilized 48.11±0.34 100.00±0.00 0.408±0.003 75.90±0.54 1.09±0.008
37.0 5.5 Immobilized 45.33±0.92 100.00±0.00 0.385±0.008 71.51±1.45 1.03±0.021
30.0 6.3 Immobilized 47.12±0.72 99.27±1.26 0.403±0.001 74.95±0.25 1.07±0.016
37.0 6.3 Immobilized 44.68±0.41 100.00±0.00 0.380±0.003 70.55±0.64 1.01±0.009
4.3.2. Effect of substrate concentration

The hypertonic environment caused by excessive levels of substrate could weaken the
viability and fermentation ability of yeasts (Zhang et al., 2015). Significant differences
were observed on all kinetic fermentation parameters at the tested lactose dosages. As
shown in Figure 4.1, it could be inferred that 170 g/L is the optimal substrate
concentration, because at this dosage, yield efficiency (η) reached 95.5% in 48 h, with
an ethanol production of 86.6 g/L and the highest productivity (WE = 1.80 g/L·h). Ethanol
concentration increased up to 91.3 g/L with an initial lactose concentration of 190 g/L,
but productivity decreased to 1.40 g/L·h with a yield efficiency of 90%. From this point
on, either ethanol production is blocked and lactose consumption is interrupted or
substrate is used for other purposes, independently of the duration (fermentations were
prolonged more than 96 h), resulting in a drastic decrease of productivity. This fact might
be due to the severe decrease in cell membrane fluidity for long-exposure to hypertonic
solutions, mass transfer becoming difficult (Thomas and Ingledew, 1992). Therefore,
additional carbon sources are consumed by the yeast to maintain the activity of the
102
transport system of essential materials instead of being fermented to produce ethanol

(Zhang et al., 2015). Therefore, employing a CWP with 170 g/L lactose, commonly
produced by dairy industry, is very convenient for the economy of ethanol industry,
taking the advantages of VHG fermentation (Puligundla et al., 2011) without wasting
resources.
To the best of our knowledge, this is the first time that K. marxianus is described to work
with such a high lactose concentration. Many authors have reported inhibitory problems
working with substrate concentrations higher than 100 g/L (Gabardo et al., 2014;
Dragone et al., 2011; Ozmichci and Kargi, 2009, 2007). This study concludes that K.
marxianus DSM 5422 did not suffer important substrate inhibition below 230 g/L
lactose. However, at lactose concentrations higher than 190 g/L, worse sugar
exploitation was obtained with a drastic reduction of ethanol productivity, so its use
would not be feasible.
100 2,0
1,8
80
Ef (g/L); L (%); (%)
1,6
1,4
WE (g/Lh)
60
1,2
40
1,0
0,8 Ef
20
L
0,6 
WE
0 0,4
125 150 170 190 210 230 250 310
L0 (g/L)
Figura 4.1. Effect of CWP lactose content on Ef, ΔL, η and WE variables.
103
Capítulo 4.
4.3.3. Response surface (RSM) analysis for the

optimization of immobilization parameters
A central composite design (CCD) of three factors was used (X1: Alg, %; X2: Cell, %; X3:
Dp, mm). The design had 20 experiments and included 8 cube points, 6 axial points and
6 central point replications (α = 1.68). Final ethanol concentration (Ef, g/L) and lactose
consumption rate (ΔL; %) were selected as response variables. Fermentation conditions
were established at L0 = 170 g/L; T = 30 °C; pH0 = 6.3. In all cases, 10 g of cell-immobilized
beads were employed per 50 mL of fermentation medium. Table 4.2 shows randomized
experimental conditions and observed responses (Ef and ΔL). The RSM showed that the
studied parameters affected significantly both responses. The empirical models in terms
of uncoded factors for Ef and ΔL are given in Eq (4.1) and (4.2), respectively (Note:
Significant coefficients are marked with an asterisk).
𝐸 = 82.01 − 1.51𝑥 ∗ + 1.26𝑥 ∗ − 5.15𝑥 ∗ + 0.41𝑥 ∗

+ 0.06𝑥 ∗
+ 0.24𝑥 ∗
(Ec. 4.1)
+ 0.06𝑥 ∗ − 0.05𝑥 − 0.21𝑥
∆ 𝐿 = 107.17 − 1.18𝑥 ∗ + 2.77𝑥 ∗ − 4.37𝑥 ∗ + 0.20𝑥 ∗

− 0.04𝑥 ∗
+ 0.58𝑥 ∗
(Ec. 4.2)
− 0.02𝑥 ∗ − 0.17𝑥 − 0.57𝑥
Tabla 4.2. Experimental central composite design (CCD) runs and responses.
Independent factors Responses Independent factors Responses
Run X1 X2 X3 Ef (g/L) ΔL (%) Run X1 X2 X3 Ef (g/L) ΔL (%)
1 3.50 2.00 3.75 68.10 97.11 11 3.50 2.00 4.84 66.43 95.25
2 5.00 1.00 3.10 68.16 96.48 12 5.00 1.00 4.40 67.28 95.00
3 3.50 2.00 3.75 68.01 96.60 13 5.00 3.00 3.10 70.16 98.82
4 5.00 3.00 4.40 67.18 95.46 14 2.00 3.00 4.40 68.22 97.09
5 3.50 3.68 3.75 68.97 97.93 15 3.50 2.00 3.75 68.32 97.04
6 2.00 3.00 3.10 69.71 99.41 16 6.02 2.00 3.75 67.46 96.25
7 3.50 0.32 3.75 67.16 95.45 17 2.00 1.00 4.40 67.29 96.14
8 0.98 2.00 3.75 70.66 99.40 18 3.50 2.00 3.75 67.93 95.55
9 3.50 2.00 3.75 67.5 96.69 19 2.00 1.00 3.10 69.23 97.37
10 3.50 2.00 2.66 70.73 99.31 20 3.50 2.00 3.75 66.70 95.23
104
From an ANOVA analysis (Table 4.3), it was inferred that predicted models were
adequate for both responses. However, the Ef model predictability could be questioned
(pred-R2= 5.99 %). Therefore, reduced models were proposed to try to improve model
predictability and obtain quadratic model significance. The reduced quadratic models
for Ef and ΔL responses are shown in equations (4.3) and (4.4), respectively.
𝐸 = 82.01 − 1.61𝑥 ∗ + 0.46𝑥 ∗ − 5.87𝑥 ∗ + 0.18𝑥 ∗

+ 0.56𝑥 (Ec. 4.3)
∆ 𝐿 = 113.49 − 1.83𝑥 ∗ + 0.73𝑥 ∗ − 6.03𝑥 ∗ + 0.19𝑥 ∗

+ 0.58𝑥 (Ec. 4.4)
In the reduced models, regression, linear and quadratic significance were obtained
(Table 4.3). For both responses, the F-value increased after eliminating not significant
terms, p-value for lack of fit was also greater, improving accuracy. R2 and R2adj were
slightly affected; however, model predictability was heavily improved.
Tabla 4.3. Analysis of variance- ANOVA- of the predicted models for Ef and (ΔL)
responses
Ef Model ΔL Model Ef reduced Model ΔL reduced Model
Source F p-value F p-value F p-value F p-value
Regression 5.67 0.006 9.41 0.001 12.89 0.000 17.28 0.000
Linear 14.71 0.001 24.48 0.000 18.89 0.000 25.94 0.000
Square 2.06 0.170 2.71 0.101 3.89 0.045 4.28 0.035
Interaction 0.26 0.851 1.05 0.412
Lack of fit 1.92 0.426 0.35 0.864 1.21 0.438 0.43 0.869
R2 (%) 83.6 89.4 82.1 86.0
R2adj (%) 68.9 79.9 75.8 81.1
pred- R2 6.0 67.9 51.3 73.1
Optimum conditions were mathematically determined through the maximization of

both responses. At the optimal point (X1 = 0.98%; X2= 3.68%; X3= 2.66 mm), Ef achieved
71.22 g/L with a yield efficiency of 80% and total lactose consumption. Smaller beads
yielded a better performance, due to an increase in the surface-volume ratio. The
obtained values of alginate about 1% are in accordance with reported studies
105
Capítulo 4.
immobilizing S. cerevisiae (Idris and Suzana, 2006). However, these authors pointed out
that bead alginate concentrations lower than 2% are highly susceptible to compaction
and disintegration during the process in bioreactor systems due to the internal
mechanical loading on the beads. As it was confirmed experimentally, the use of alginate
concentration above 2% generates an ethanol decrease probably due to the lower
diffusion efficiency of the beads. Therefore, a concentration of 2% of sodium alginate
will be considered as optimal. An improvement of 5% in efficiency was obtained with
the optimization versus the results obtained in Section 4.3.1 (Table 4.2. Run 5).
4.3.4. Repeated batch fermentation

The optimal immobilized model (% Alg: 2; % Cell: 3.68; Dp: 2.66 mm) was validated by
recycling the gel beads for 6 cycles of 48 h, employing non-supplemented CWP (L0=170
g/L) as a substrate to assess continuous fed-batch fermentation performance. The
evolution of fermentation kinetic parameters is shown in Figure 4.2.
100 1.8
80
1.6
Ef (g/L); L (%); (%)
WE (g/Lh)
60
1.4
40
1.2 Ef
20 L

WE
0 1.0
1 2 3 4 5 6
Cycle Number
Figura 4.2.Kinetic fermentation parmeters (Ef, ∆L, η and WE) at the end of each cycle.
106
In the first cycle, final ethanol concentration, efficiency and productivity were lower
than in the next cycles. This could be due to the need of cells to adapt to the
immobilization stress (Duarte et al., 2013). During the 288 h of experimentation, there
was a mean ethanol production of 83.2 g/L, with a productivity of 1.6 g/L·h and a yield
efficiency of 83.2%. A stable ethanol production can be observed throughout the cycles
with a very good performance without contamination; therefore, this immobilization
technique could be employed in continuous fermentation configurations with tubular
bioreactors. A minimum degree of compaction was observed, but beads did not
experience disaggregation during operation. When the beads were created (t=0) they
had a spherical shape (r=1.30 mm, V= 9.20 mm3) and contained 1.99·103 cell/mm3. After
six batch cycles the amount of yeast cells inside the beads was only slightly lower
(1.16·103 cell/mm3). In addition, at the end of every cycle cells were also detected in the
CWP outside the bead. For instance, after the sixth cycle, the yeast concentration in CWP
was 9.48·104 cell/mm3. The average final volume of each bead was 6.39 mm3 and they
had an ellipsoidal shape (a=b=1.25 mm, c=0.98 mm).
4.3.5. Conclusions
High lactose-loaded cheese whey permeate is an excellent low-cost medium for
alcoholic fermentation employing Kluyveromyces marxianus. The CWP did not need
nutrient supplementation to maximize ethanol production, which improves significantly
the economic feasibility of the process. The combination of VHG fermentation with cell
entrapment immobilization turned out to be a very promising approach to ethanol
production: very low substrate cost, high ethanol efficiency, high productivity, total
substrate consumption, and great stability throughout time without contamination.
Experiments were performed under a fed-batch configuration at lab scale, which should
be scaled up in continuous bioreactors in pilot plants.
Acknowledgments
Authors thank ITACyL for financial support. M.H-V is supported by a postdoctoral
contract (DOC-INIA, grant Nº DOC 2013-010) funded by the Spanish Agricultural and
Agrifood Research Institute (INIA) and the European Social Fund. Authors thank R. Antón
and N. del Castillo for their technical help during experimentation.
107
Capítulo 4.
References
Brady D., Nigam P., Marchant R., McHale A.P., 1997, Ethanol production at 45 °C by alginate-
immobilized Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactose-containing media,
Bioprocess Engineering, 16, 101–104.
Dragone G., Mussatto S.I., Almeida e Silva J.B., Teixeira J.A., 2011, Optimal fermentation
whey powder. Biomass and Bioenergy, 35, 1977-1982.
Duarte J.C., Rodrigues J.A.R., Moran P.J.S., Valença G.P., Nunhez J.R., 2013, Effect of immobilized
cells in calcium alginate beads in alcoholic fermentation. AMB Express, 3(1), 31.
Eş I., Vieira J. D. G., Amaral A. C., 2015, Principles, techniques, and applications of biocatalyst
immobilization for industrial application. Applied Microbiology and Biotechnology, 99(5),
2065-2082.
Gabardo S., Rech R., Rosa C.A., Ayub M.A.Z., 2014, Dynamics of ethanol production from whey
and whey permeate by immobilized strains of Kluyveromyces marxianus in batch and
continuous bioreactors. Renawable Energy. 69, 89-96.
Gabardo S., Rech R., Ayub M.A.Z., 2012, Performance of different immobilized-cell systems to
efficiently produce ethanol from whey: fluidized batch, packed-bed and fluidized
continuous bioreactors. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 87(8), 1194-
1201.
Idris A., Suzana W., 2006, Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and
temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized
Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry, 41, 1117-1123.
Nikolić S., Mojović L., Pejin D., Rakin M., Vukašinović M., 2010, Production of bioethanol from
corn meal hydrolyzates by free and immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus. Biomass and Bioenergy, 34(10),1449-1456.
Ozmihci S., Kargi F., 2009, Fermentation of cheese whey powder solution to ethanol in packed-
column bioreactor: effects on feed sugar concentration, Journal of Chemical Technology
and Biotechnology, 84, 106-111.
108
Ozmihci S., Kargi F., 2007, Effect of feed sugar concentration on continuous ethanol
fermentation of cheese whey powder solution (CWP). Enzyme and Microbial Technology,
41, 876-880.
Pisano I., Agrimi G., Grosso G., Mena M.C., Ricci M.A., Palmieri L., 2015, Improved
Saccharomyces cerevisiae growth on cheese whey by controlling enzymatic lactose
hydrolysis. Chemical Engineering Transactions, 43, 637-642
Puligundla P., Poludasu R.M., Rai J.K., Obulam V.S.R., 2011, Repeated batch ethanolic
fermentation of very high gravitiy medium by immobilized Saccharomyces cerevisae.
Annals of Microbiology; 61: 863-869.
Sansonetti S., Curcio S., Calabrò V., Iorio G., 2010a, Evaluation of the parameters effects on the
bioethanol production process from Ricotta cheese whey, Chemical Engineering
Transactions 20, 13-18.
Thomas, K.C., Ingledew, W. M., 1992, Production of 21% (v/v) ethanol by fermentation of very
high gravity (VHG) wheat mashes. Journal of Industrial Microbiology, 10(1), 61-68.
Zhang Q., Wu D., Lin Y., Wang X., Kong H., Tanaka S, 2015, Substrate and product inhibition on
yeast performance in ethanol fermentation. Energy Fuels, 29, 1019-1027.
109
Capítulo 4.
Anexo 4.1.
En la Figura A.4.1., se muestran las imágenes de la distribución y colonización de la cepa
K. marxianus DSM 5422 inmovilizada sobre esferas de alginato cálcico por atrapamiento.
Figura A.4.1. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SME) representando la

distribución y colonización de K. marxianus DSM 5422 inmovilizada por atrapamiento a)
gel de inmovilización: alginato cálcico; b) microorganismo inmovilizado por
atrapamiento en esferas de alginato cálcico
110
5. Yeast screening and cell immobilization on
inert supports for ethanol production from
cheese whey permeate with high lactose
loads
Yeast screening and cell immobilization on inert supports for ethanol production from cheese
whey permeate with high lactose loads
Yeast screening and cell immobilization on inert

supports for ethanol production from cheese whey
permeate with high lactose loads
Abstract
The development of efficient processes for the treatment of cheese whey complying with
environmental aspects and economic feasibility are a pressing need in dairy industries.
High lactose content cheese whey permeate (CWP) could be a perfect feedstock for
ethanol production. However, appropriate yeast strains must be found to overcome
technical difficulties, as it is the need of metabolizing lactose, to survive under high
osmotic pressure with high sugar concentrations and to produce high levels of ethanol
concentration. In the present study, eight yeast strains of the genera Saccharomyces and
Kluyveromyces were screened to ferment high lactose-load CWP (>130 g/L lactose)
without nutrient supplementation. The fermentation conditions (temperature, pH and
time) were optimized to maximize the fermentation performance (ethanol titer, ethanol
yield and lactose consumption) for the two preselected strains, K. marxianus DSM 5422
and S. cerevisiae Ethanol Red ®, using a response surface methodology (RSM). Under
optimized conditions, K. marxianus DSM5422 attained ethanol titers of 6% (v/v) in only
44 h. Moreover, the feasibility of immobilizing this strain on four different inorganic
supports (plastic, glass and Tygon® silicone Raschig rings and alumina beads) was
assessed. Glass Raschig rings and alumina beads showed a more stable performance
over time, yielding ethanol titers of 60 g/L during more than 1.000 hours, which
remarkably reduces yeast cultivation costs. Results demonstrate the feasibility of using
CWP for successful ethanol production in a simple and economical process.
Keywords: High-loaded cheese whey permeate (CWP), bioethanol, Kluyveromyces marxianus,

Saccharomyces cerevisiae, inert support immobilization
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Díez-Antolínez R, Hijosa-Valsero M, Paniagua-García AI, Garita-Cambronero J, Gómez X (2018) Yeast
screening and cell immobilization on inert supports for ethanol production from cheese whey permeate
with high lactose loads. PLoS ONE 13(12): e0210002 (18 páginas). DOI: 10.1371/journal.pone.0210002
The edition of this manuscript was in accordance with the scientific journal requirements.
113
Capítulo 5.
5.1. Introduction
Cheese whey, the liquid by-product of milk coagulation during cheese production, is the
most important source of organic contamination in the dairy industry due to the large
volumes produced. About 10 L of cheese whey are generated for each kilogram of
cheese manufactured (Prazeres et al., 2012). It contains about 50% of the total solid
content of the original milk, with lactose (48 – 60 g/L), proteins (6 – 8 g/L) and mineral
salts (4 – 10 g/L) as major components (Gonzalez-Siso, 1996). The European Union (EU-
27) and USA are the largest producers of cheese, generating more than 150 Mton each
year (OECD-FAO, 2013). Cheese whey is characterized by a high organic pollutant load
with high biological and chemical oxygen demand values (BOD and COD) ranging
between 40 – 60 g/L and 50 – 80 g/L, respectively (Ergüder et al., 2001). Lactose is
responsible for 90% of the COD and BOD contents in whey (Gonzalez-Siso, 1996). About
50% of the cheese whey production is treated or valorized as source of proteins and
lactose into feed and food products (Baldasso et al., 2011). However, the surplus of
lactose is not further resourceful; consequently, whey disposal means a serious
environmental and economic problem (Mollea et al., 2013).
The improper disposal of whey may cause major environmental problems like
eutrophication or toxicity in the receiving environments (Prazeres et al., 2012).
Therefore, environmental restrictive rules have been established, forcing the dairy
industry to find solutions to the large whey volumes generated and to seek for
alternatives rather than the direct discharge. Nowadays, whey is evolving into a sought-
after product because of the nutrients it contains and the functional properties it
imparts to food (Koushki et al., 2012). Moreover, its use as substrate for the biological
production of several value-added products such as single cell protein, solvents (e.g.
ethanol, butanol or acetone), organic acids (e.g. acetic, butyric, lactic, malic, propionic,
malic or succinic), hydrogen, biopolymers and biodegradable plastics (Mollea et al.,
2013; Prazeres et al., 2012) has been proposed.
Cheese whey has been employed as low cost and abundant raw material substrate for
ethanol production. However, the alcoholic fermentation of whey is hardly economically
competitive in comparison to traditional feedstocks such as sugar cane or corn
114
(Guimarães et al., 2010). Despite this fact, the biotechnological reuse of this abundant
and widely spread waste as a source for fuel production offering no competition with
the food market and land uses is strongly desirable (Zoppellari and Bardi, 2013).
Not many yeast strains are capable of naturally fermenting lactose to ethanol.
Traditional yeasts used for industrial fermentation processes, such as Saccharomyces
cerevisiae, cannot metabolize lactose, due to the lack of both lactose permease and β-
galactosidase enzyme systems (Kargi and Ozmichi, 2006). Therefore, an enzymatic or
chemical hydrolysis of lactose is required to use whey for ethanol production using S.
cerevisiae. Typical ethanol yields from lactose are reported as 80 – 85 % of theoretical
(Mawson, 1994) when using cheese whey with lactose concentrations of 40 – 50 g/L.
Another alternative strategy is the engineering of S. cerevisiae, but most of the obtained
strains have shown undesirable characteristics such as low growth, genetic instability
and low ethanol production (Guimarães et al., 2008; Gabardo et al., 2015).
Nevertheless, most of the Kluyveromyces species are capable of metabolizing the lactose
to ethanol. In spite of the interesting attributes of Kluyveromyces species, such as
thermotolerance, high growth rate, capacity to metabolize a wide variety of
carbohydrates such as hexoses, pentoses and disaccharides (Lane and Morrissey, 2010
as well as its generally recognized as safe (GRAS) (Hensing et al., 1994, 1995), it is far
away to compete in industrial processes using Saccharomyces.
Different strategies have been tested for developing ethanol production processes using
these species. For K. marxianus, Gabardo et al. (2014) concluded that it is unnecessary
to supplement either whey or whey permeate because this organic stream is already
rich in nutrients and the addition of nitrogen could affect ethanol production by cell
metabolism impairment. Nevertheless, inhibitory problems or process imbalances have
been frequently reported when working with substrate concentrations higher than 100
g/L (Ozmihci and Kargi, 2007, 2009; Dragone et al., 2011; Gabardo et al., 2014).
Therefore, direct fermentation of whey is not economically feasible due to low ethanol
concentrations and high distillation costs (Ozmihci and Kargi, 2009; Dragone et al.,
2011). Nevertheless, Diez-Antolinez et al. (2016) reported the viability of directly
fermenting non-supplemented cheese whey permeate (CWP) with a lactose load of
115
Capítulo 5.
about 170 g/L without substrate inhibitions, reaching ethanol yield efficiencies of 95.5%
in 48 h with ethanol titers of 86.6 g/L.
In the case of S. cerevisiae, the conversion of galactose into glycolytic intermediates

needs energy and additional catabolic steps, because glycolytic enzymes are not
galactose specific. Hence, the Leloir pathway is switched on to convert galactose into
glucose 6-phosphate, metabolized in the glycolysis pathway and reduced to ethanol
(Gabardo et al., 2015; Rubio-Texeira, 2005; Timson, 2007). Therefore, S. cerevisiae
strains require richer nutrient media, especially in nitrogen, to efficiently convert
galactose into ethanol, reporting ethanol concentrations of only 18 g/L and 15 g/L using
as substrates non-supplemented cheese whey and cheese whey permeates,
respectively (Gabardo et al., 2015).
Due to the low productivity of batch ethanol fermentation, continuous processes based
on the immobilization of S. cerevisiae and K. marxianus to increase cell concentration in
organic and inorganic supports by adsorption or entrapment (Diez-Antolinez et al., 2016;
Soupioni et al., 2013; Gabardo et al., 2012; Singh et al., 2009) have been studied. Gel
supports have great problems of stability over time (Gonçalves et al., 1992) and organic
supports require complex derivatization pretreatments (Lee et al., 2012). Thus, it is
interesting to explore the viability of inorganic supports in alcoholic fermentations
In the present study, the ability of eight yeast strains of the genera Saccharomyces and
Kluyveromyces to ferment high lactose-load cheese whey permeate (CWP) was
compared, and the most efficient strain for the production of ethanol was selected.
Optimization of the operating conditions of the alcoholic fermentation (temperature,
initial pH, time and cell immobilization) was optimized. As a whole, this permitted to
improve prior knowledge of this fermentative process by using a K. marxianus strain
immobilized on inert supports, which was able to ferment 90% of the lactose with yields
higher than 90% during more than 1.000 hours by a repeated-batch recycling process.
116
5.2. Material and methods

5.2.1. Raw Material
CWP used as substrate was obtained from a mixture of cow and sheep milk after a
concentration process by ultrafiltration provided by Quesería Entrepinares SAU
(Valladolid, Spain). CWP was pasteurized by heating at 80 °C for 30 min to eliminate
endogenous microorganisms. Lactose content ranged between 120 – 170 g/L with a
protein contain of 34 g/L. The CWP presented an initial pH of 5.8.
5.2.2. Yeast strains and culture conditions

Four strains of K. marxianus and four strains of S. cerevisiae were used in this work. K.
marxianus DSM 5418, DSM 5422, DSM 7239 and DSM 70799 were provided in
lyophilized form by Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(Braunschweig, Germany). The reactivated culture was maintained on nutrient agar and
stored at 4 °C A loop-full of a slant culture was transferred to sterilized growth medium
[50 g/L lactose (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), 0.3 g/L MgSO4·7H2O (Sigma
Aldrich), 5 g/L yeast extract (AES Laboratories, Bruz, France), 2 g/L NH4Cl (Fluka-Sigma
Aldrich, Steinheim, Germany), 10 g/L peptone (Fluka, Buchs, Switzerland) and 1 g/L
KH2PO4 (Panreac, Castellar del Vallès, Spain)]. The medium was incubated in an orbital
shaker Infors HT Minitron (Bottmingen, Switzerland) at 35 °C with a constant shaking at
120 rpm during 7 h in order to obtain exponential-phase cells.
The four S. cerevisiae strains were chosen because of their good ethanol and sugar
tolerance or their worldwide commercial availability. The freeze-dried distillery yeast S.
cerevisiae Ethanol Red® (Lesaffre Company, Marcq-en-Baroeul, France), the
osmotolerant hybrid S. cerevisiae CECT 13152 (Tomsa Destil S.L., Madrid, Spain)
obtained from the protoplast fusion of S. cerevisiae NCYC73 and a non-identified strain
of S. cerevisiae, the compressed baker’s yeast branded S. cerevisiae Hércules (Lessafre
Iberica S.A., Valladolid, Spain) and the distillery yeast S. cerevisiae CECT 1383 provided
by Colección Española de Cultivos Tipo (Valencia, Spain) were used in this study. In the
case of strains Ethanol Red ®, CECT 13152 and Hércules, 0.1% (w/v) yeast was directly
added to the fermenter without a previous propagation step. Strain CECT 1383 was
reactivated, maintained on nutrient agar and stored at 4 °C. A loop-full of a slant culture
117
Capítulo 5.
was transferred to sterilized growth medium [20 g/L glucose (Sigma Aldrich, Steinheim,
Germany), 10 g/L of yeast extract (AES Laboratories, Bruz, France) and 10 g/L peptone
(Fluka, Buchs, Switzerland)]. The medium was incubated in an orbital shaker Infors HT
Minitron (Bottmingen, Switzerland) at 32 °C with a constant shaking at 120 rpm during
7 h in order to obtain exponential-phase cells. A viable cell concentration of about 108
cells/mL was obtained.
5.2.3. Kluyveromyces strains and fermentation

media comparison
In order to find the most suitable yeast strain for directly fermenting high-loaded CWP
to ethanol, the four K. marxianus strains listed in section 5.2.2 were assessed employing
a synthetic medium with an initial lactose concentration of 130 g/L, supplemented with
3 g/L yeast extract, 2 g/L peptone, 2 g/L NH4Cl, 2 g/L KH2PO4, 2 g/L K2HPO4, 1 g/L
MgSO4·7H2O and 0.1 g/L MnSO4·H2O.
After selecting the most efficient strain, the effect of nutrient supplementation was
assessed on that single strain by testing the addition of three nutrient solutions to the
CWP. Nutrient solution “A” contained 3 g/L yeast extract, 2 g/L NH4Cl, 2 g/L KH2PO4 and
2 g/L K2HPO4, which is rich in nitrogen sources (ammonium chloride and yeast extract)
and phosphorous (phosphate salts) to promote cell growth and ethanol production
(Parrando et al., 2009). Nutrient solution “B” was composed of 1 g/L MgSO4·7H2O.
Magnesium has been identified as an active component, which prolongs exponential
growth, resulting in increased yeast cell mass (Dombek and Ingram, 1986). The addition
of magnesium also reduces the decline in fermentative activity. Nutrient solution “C”
contained 200 mg/L of sodium thioglycolate. Sodium thioglycolate acts as a reducing
agent and neutralizes possible toxic effects (MacFaddin, 1985). Nutrients were
autoclaved within the CWP medium, except magnesium and manganese salts, which
were added as a microfiltered concentrate after autoclaving. CWP samples
supplemented with eight different combinations of the three solutions (ABC, AB, AC, BC,
A, B, C or none) were fermented.
All fermentations were carried out in 100-mL Erlenmeyer flasks containing 1.25 mL of
inoculum and 48.75 mL of fermentation medium. Flasks plugged with foam stoppers
118
were incubated at 35 °C and 150 rpm in an Infors HT Minitron orbital shaker during 48
h after adjusting the pH to 6 units. Experiments were performed in duplicate.
5.2.4. Saccharomyces strains and lactose whey

permeate hydrolysis optimization
After testing the incapacity of the four selected S. cerevisiae strains listed in section
5.2.2. to naturally metabolize the lactose present in the CWP (data no included), lactose
hydrolysis was performed using a commercial β-galactosidase (Ha-Lactase 2100,
enzymatic activity of 2.100 NLU/g, Chr. Hansen Holding A/S, Hoersholm, Denmark). In
order to optimize the hydrolysis, a complete central design (CCD) and response surface
methodology (RSM) experiments were developed using CWP with an initial lactose
concentration of Li = 120 g/L lactose. Three variables were assessed: enzyme dosage, pH
and time. The response variables considered were the final concentrations of glucose
(Gf) and galactose (Galf) released expressed in g/L, as well as the hydrolysis efficiency
(η(G+Gal)/L), which was calculated as follows:
𝜂( )/ = × 100 (Ec. 5.1)
Some characteristics of these RSM experiments are provided in the Supplementary

Material (SM) in Table SM.5.1. The estimated regression coefficients for hydrolysis
efficiency (%) and the analysis of variance results are reported in the Supplementary
Material (SM) in Tables SM.5.2 and SM.5.3, respectively. A surface model was fitted and
the resulting polynomial equation was used to estimate the optimal enzyme dosage,
time and pH values to obtain the highest amount of glucose and galactose released in
the broth before the subsequent fermentation. Contour plots can be seen in Figure
SM.5.1 for each pair of variables. A maximum lactose hydrolysis efficiency of 85% was
obtained adding 0.28 mL/L of enzyme to the substrate and keeping the mixture at a pH
of 5.9 and temperature of 30 °C during 7 hours. The hydrolyzed contained 65 g/L
glucose, 65 g/L galactose and 7 g/L residual lactose.
In order to select the most efficient S. cerevisiae strain in the same conditions of K.
marxianus, the four strains were compared for the fermentation of a hydrolyzed CWP
without any nutrient supplementation. Fermentations were carried out in 100-mL
119
Capítulo 5.
Erlenmeyer flasks containing 50 mL of hydrolyzed medium and 0.1% (w/v) of inoculum.

Flasks plugged with foam stoppers were incubated at 35 °C and 150 rpm in an Infors HT
Minitron orbital shaker (Infors AG, Bottmingen, Switzerland) during 65 h after adjusting
the pH to 5.4 units. Experiments were performed in triplicate.
5.2.5. Optimization of fermentation conditions

The optimization of operating conditions was made by employing each of the selected
K. marxianus and S. cerevisiae strains, which had the best alcoholic performance in
Sections 5.2.3 and 5.2.4.
Fermentations were carried out in 250-mL Erlenmeyer flasks containing 95 mL of CWP

with an initial lactose concentration of 132.5 g/L (with previous lactose hydrolysis in the
case of S. cerevisiae). The batch runs started after the aseptic addition of a ratio of 0.1%
(w/v) of inoculum to the fermentation medium. Three variables were optimized:
temperature (T, °C), pH (pH, –) and fermentation time (t, h). A complete central
composite design (CCD) experiment was run and response surface methodology (RSM)
was applied for evaluating the empirical model. Second order polynomial were fitted for
each response and the resulting equations used to estimate the optimal temperature,
pH and time values that maximize the ethanol production (concentration and yield
expressed per unit of lactose consumed). All the estimated optimal points were
validated experimentally.
Twenty experiments were performed and included 8 cube points, 6 central points and 6
axial points (α=1.68179). Fermentation conditions were simultaneously optimized for
maximizing the responses of ethanol final concentration (Ef), ethanol yield factor (YE/L),
ethanol profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE).
5.2.6. Comparison of immobilization supports

Four inorganic porous materials were selected because of their wide availability, easy
preparation and reutilization, their steam sterilizability and their inexpensive or low-
cost. Raschig rings of similar dimensions (length of 5 – 5.5 mm) of three different porous
materials (plastic, glass and Tygon® silicone) and alumina beads with 5 mm of diameter
120
were selected. The inorganic porous supports were washed with deionized water and
sterilized by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.
Approximately, 10 g of every support were introduced in 250-mL Erlenmeyer flasks, 50

mL of non-supplemented CWP with an initial lactose concentration of 130 g/L and 3.7%
(v/v) of the selected yeast cells. The yeast strain and the fermentation conditions were
obtained during the optimization step. For laboratory personal logistic needs, every 48
or 72 hours, fresh CWP replaced the exhausted whey medium for 7 cycles. Samples of
exhausted whey were analyzed for fermentation performance. All experiments were
performed in triplicate.
After 7 cycles, two supports were selected to test their stability for a prolonged period
of time. The experiments were extended refreshing CWP during 14 cycles. In order to
compare the effect of lactose load in immobilization performance, experiments were
carried out employing non-supplemented CWP at two initial lactose concentrations (130
g/L and 170 g/L). All experiments were performed in triplicate.
5.2.7. Chemical analyses of fermented broths

Periodic samples were collected from the fermentation flasks using aseptic techniques
to measure lactose, glucose, galactose and ethanol concentrations. Samples were
centrifuged at 12.000 × g in a micro-centrifuge for 3 min (MiniSpin, Eppendorf, Hamburg,
Germany). The concentrations of lactose, ethanol and lactic acid production were
measured from supernatant samples filtered through a 0.22 µm filter and analyzed by a
high performance liquid chromatography (HPLC) system (Agilent LC1200 HPLC) coupled
to a refractive index detector (Agilent 1200 Series), using a Bio-Rad Aminex HPX-87-H
(300 mm x 7.8 mm) column (Bio-Rad, Hercules, California, USA) with 5 mM H2SO4
mobile phase, a flow rate of 0.6 mL/min and a column temperature of 60 °C (Díez-
Antolínez et al., 2016).
∆𝐿 = (Ec. 5.2)
𝑌 = (Ec. 5.3)
121
Capítulo 5.
𝜂 = .
× 100 (Ec. 5.4)
𝑊 = (Ec. 5.5)
𝜋 = 𝐸 × Δ𝐿 (Ec. 5.6)
The fermentation kinetic parameters were calculated at the end of the runs as follows.
Lactose consumption rate (ΔL, %) was defined as the rate of consumed lactose being Li
and Lf, the initial and final concentration of lactose (g/L), respectively (Equation 5.2). The
ethanol yield factor (YE/L, g/g) was defined as the ratio between ethanol final
concentration (Ef, g/L) and lactose consumed (g/L) (Equation 5.3). The yield conversion
efficiency (ηE, %) was defined as the ethanol yield versus the theoretical ethanol yield,
assuming a theoretical ethanol production, by means of alcoholic fermentation of 0.538
g of ethanol per g of lactose consumed by yeast (Mawson, 1994) (Equation 5.4). The
ethanol productivity (WE, g/L·h) was defined as the ratio between ethanol concentration
(g/L) and fermentation time (h) (Equation 5.5). In addition, we propose the use of a new
parameter called profit factor (πE), defined as the ethanol concentration Ef (g/L)
multiplied by the lactose consumption rate ΔL (Equation 5.6). The ethanol yield (YE/L)
and yield conversion efficiency (ηE) can be misleading when low ethanol concentration
(Ef) and low lactose consumption (ΔL) values are recorded. From the environmental
point of view, it is important to deplete as much lactose as possible during the
fermentation, in order to reduce the COD of the broth before treating it as a liquid
waste. Therefore, the parameter πE combines in a single figure ethanol production and
lactose consumption. In addition, high ΔL values imply a successful fermentation process
with an almost complete use of available sugars by yeasts.
5.2.8. Statistical analyses

Comparisons among treatments were assessed with a one-way ANOVA and the Tukey
HSD test using the software Statistica 7 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA); differences were
considered significant when p < 0.05. For the optimization steps, experimental designs,
such as Response Surface Methodology (RSM) were generated and interpreted with the
software Minitab 16 (Minitab Inc., State Collage, PA, USA).
122
5.3. Results and Discussion

5.3.1. Kluyveromyces marxianus strains and
fermentation media comparison
This set of experiments was performed to determine the capacity of four different
strains of K. marxianus to convert lactose into ethanol without inhibition problems
working at lactose concentrations higher than 100 g/L. The four strains metabolized and
biotransformed naturally lactose to ethanol. The ethanol produced, the lactose
consumed and the ethanol yield varied substantially among the strains when a synthetic
medium with an initial lactose concentration of 130 g/L was used. As can be observed in
Figure 5.1, the highest ethanol production with a total lactose consumption
corresponded to K. marxianus DSM 5422 and K. marxianus DSM 7239, with an ethanol
yield of 0.41 g/g and 0.36 g/g, ethanol titers of 52.9 g/L and 48.8 g/L and productivities
of 1.10 and 1.01 g/L·h, respectively. Due to the better fermentation performance
obtained with K. marxianus DSM 5422, this strain was selected for the subsequent
optimization process to increase its ethanol production capacity.
100 1.4
80 1.2
Ef (g/L); (%); L (%)
60 1.0
W E (g/Lh)
40 0.8
Ef (g/L)
20 0.6
 (%)
L (%)
W E (g/Lh)
0 0.4
DSM 7239 DSM 5418 DSM 5422 DSM 70799
Figura 5.1. Fermentation performance of K. marxianus DSM 7239, DSM 5418, DSM 5422
and DSM 70799 in concentrated synthetic medium (Li = 130 g/L). Parameters: final
ethanol concentration, ethanol yield conversion efficiency (ηE), lactose consumption
(ΔL) and productivity (WE).
123
Capítulo 5.
The effect of nutrient supplementation of CWP was tested with K. marxianus DSM 5422,
due to its better performance employing synthetic media under the same fermentation
conditions. Figure 5.2 shows the results of the fermentation of CWP without any
supplementation and the eight combinations of nutrients tested. As it can be observed,
the exclusive use of CWP without any supplementation provided a similar fermentation
performance to that of CWP supplemented with solutions A, B, A+B and A+B+C. Due to
the significant cost-saving, non-supplemented CWP was selected for the next
experimental steps. The fermentation performance was: an ethanol titer of 62.0 g/L, an
ethanol yield of 0.44 g/g (81.8% of the theoretical maximum yield) and a productivity of
1.3 g/L·h. These results compare well with other works in literature using supplemented
concentrated whey. Dragone et al. (2011) reported conversions of concentrated
deproteinized whey permeate (Li = 150 g/L) into 55.9 g/L of ethanol with yields of 0.37
g/g employing K. fragilis Kf1. Kargi and Ozmihci (2006) reported yields of 0.54 g/g with
final ethanol concentrations of 81 g/L using K. marxianus NRRL-1195 strain in batch
cultivations with a concentrated whey (150 g/L of lactose) and values of 3.7% (v/v) of
ethanol with CWP (100 g/L of lactose) supplemented with 200 mg Na-thioglycolate to
adjust the oxidation-reduction potential using K. marxianus DSM 7239 strains (Kargi and
Ozmihci, 2006).
124
100 1.32
1.30
80
1.28
Ef (g/L);  (%); L (%)
1.26
60
W E (g/Lh)
1.24
1.22
40
1.20
1.18
20
Ef (g/L)
1.16  (%)
L (%)
0 1.14 W E (g/Lh)
No nutrients A B C A+C B+C A+B A+B+C
Nutrient Solutions
Figura 5.2. Evaluation of the effect of different combinations of nutrients on alcoholic

fermentation performance. Response variables: Ethanol final concentration (Ef), ethanol
yield conversion efficiency (ηE), lactose consumption (ΔL) and productivity (WE) of K.
marxianus 5422 employing concentrated CWP (Li = 130 g/L).
5.3.2. Saccharomyces cerevisiae strains and

fermentation media comparison
The capacity of four different strains of S. cerevisiae to produce ethanol from the
hydrolyzate of high loaded lactose CWP (Li = 140 g/L) was assessed. The ethanol
produced, the sugars (glucose, galactose and residual lactose) consumed and the
ethanol yield varied substantially among the strains. As can be observed in Table 5.1,
the highest ethanol production and sugars consumption corresponded to Ethanol Red®,
the only strain that was able to metabolize galactose into ethanol. The ethanol titer was
of 43.63 g/L with an ethanol yield of 0.345 g/g and a productivity of 0.70 g/L·h.
125
Capítulo 5.
Tabla 5.1. Fermentation performance of S. cerevisiae CECT 1383, Ethanol Red ®, CECT
13152 and Hércules in hydrolyzed CWP (Li = 140 g/L). Parameters: final ethanol
concentration (Ef), sugar consumption (ΔL), ethanol yield factor (YE/S), ethanol profit
factor (πE), productivity (WE) and ethanol yield conversion efficiency (ηE).
Ef ΔL Δ(G+Gal) YE/L YE/(G+Gal) πE WE ηE
Strain (g/L) (%) (%) (g/g) (g/g) (g/L) (g/L·h) (%)
CECT 1383 25.11 49.49 51.19 0.127 0.129 12.43 0.39 25.21
Ethanol Red ® 45.63 96.69 99.52 0.345 0.350 44.11 0.70 68.67
CECT 13152 35.94 54.30 56.21 0.192 0.193 19.53 0.55 37.91
Hércules 34.24 52.75 55.29 0.179 0.180 18.06 0.53 35.35
5.3.3. Optimization of fermentation conditions

Optimal fermentation conditions (temperature; initial pH and time) were calculated via
RSM experimental design for each strain employing CWP as feedstock.
5.3.3.1. Kluyveromyces marxianus strain

For the selected strain K. marxianus DSM 5422, the experimental conditions and the
responses obtained are shown in Table 5.2. The full quadratic model was statistically
effective for the final ethanol concentration at 95% confidence level. The estimated
regression coefficients for ethanol titers (g/L) are reported in Supplementary Material
in Table SM5.4. The analysis of variance results is shown in the Supplementary Material
in Table SM5.5. Fermentation conditions were simultaneously optimized for maximizing
the most significant responses (Ef and πE) for the strain DSM 5422. According to the RSM
mathematical estimations, maximum ethanol titer of 58.2 g/L, an ethanol yield factor of
0.44 g/g with an ethanol profit factor (πE) of 58.2 g/L and an ethanol volumetric
productivity (WE) of 1.33 g/L·h would be theoretically obtained at 30.3 °C of
temperature, 6.3 units of initial pH and 44 h of fermentation as optimal points. The
theoretical conditions were tested experimentally to validate the model. An ethanol
titer of 60 g/L was achieved for ethanol concentration with total lactose consumption,
the ethanol yield factor YE/L was of 0.45 g/g, corresponding with an 85.3% of the
theoretical yield. The ethanol profit factor was of 60 g/L with an ethanol volumetric
productivity was of 1.23 g/L·h. These data confirm the predictability of the fitted model
for DSM 5422 strain, with a percentage error between experimental and predicted
values of 3%.
126
Tabla 5.2. Experimental results of ethanol concentration (Ef), ethanol yield factor (YE/L),
ethanol profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE) according to a central
composite design employing K. marxianus DSM 5422 for the fermentation of CWP (Li =
132.5 g/L).
Run Variable Factor Responses

T Time Ef YE/L πE WE
pH
(°C) (h) (g/L) (g/g) (g/L) (g/L·h)
1 6.3 37.5 36 54.19 0.41 54.10 1.51
2 7.5 45.0 24 33.05 0.24 21.69 1.38
3 6.3 37.5 36 53.1 0.40 52.76 1.50
4 6.3 37.5 15.8 45.44 0.40 36.70 2.87
5 5.0 30.0 48 56.43 0.46 56.43 1.18
6 6.3 37.5 56 47.28 0.36 47.19 0.84
7 5.0 30.0 24 44.94 0.48 34.49 1.87
8 6.3 37.5 36 51.70 0.39 49.08 1.51
9 5.0 45.0 48 20.86 0.45 7.97 0.43
10 7.5 30.0 48 50.94 0.43 50.94 1.06
11 5.0 45.0 24 23.98 0.44 10.65 1.00
12 6.3 50.1 36 10.78 0.43 2.05 0.30
13 7.5 45.0 48 26.76 0.40 15.16 0.56
14 7.5 30.0 24 39.64 0.44 29.95 1.65
15 6.3 37.5 36 51.10 0.39 50.34 1.50
16 6.3 37.5 36 54.77 0.41 54.01 1.52
17 8.3 37.5 36 51.08 0.41 41.56 1.42
18 4.1 37.5 36 44.40 0.45 32.93 1.23
19 6.3 37.5 36 50.24 0.39 49.70 1.40
20 6.3 37.5 36 52.92 0.42 50.02 1.47
Even though some authors have reported the effects of substrate and product inhibition
on fermentation performance using Kluyveromyves strains with substrates at
concentrations higher than 100 g/L lactose (Diniz et al., 2014; Sansonetti et al., 2010), in
this study K. marxianus DSM 5422 did not suffer substrate inhibition problems using
CWP with an initial load of 132.5 g/L. Similar ethanol concentrations were reported using
K. marxianus Kf1 at 30 °C from 150 g/L of lactose under 44 h of fermentation (Dragone
et al., 2011). However, ethanol concentration under optimal conditions is threefold
higher than those reported by Ozmihci and Kargi (2007) for K. marxianus DSM 7239,
employing a lactose concentration of 130 g/L for an operation time of 48 h, working at
28 °C and pH 5. This data agrees with reported values of ethanol yields of 0.53 g/g and
0.52 g/g, under hypoxic and anoxic conditions, respectively. However, under aerobic
127
Capítulo 5.
conditions as those in the present study, values fell to 0.39 g/g (Silveira et al., 2005),
which are similar to the values reported by Dragone et al. (2011).
The optimal operation time was 44 h, shorter than typically reported values ranging
between 72 and 96 h when working with lactose loads lower than 100 g/L (Zoppellari
and Bardi, 2013; Christensen et al., 2011; Ozmihci and Kargi, 2007). This work
significantly contributes to improve the economy of this fermentation process. An
increase of ethanol volumetric productivity between 30 and 60% was obtained in this
work versus commonly reported productivity values of 0.5 – 0.9 g/L·h (Gabardo et al.,
2014; Diniz et al. 2013; Ozmihci and Kargi, 2007), using a non-supplemented high lactose
load CWP (Li = 132.5 g/L) as a substrate. The ethanol volumetric productivity of 1.23
g/L·h obtained in this work is similar to values reported by Saini et al. (2017) employing
the evolved adapted osmotolerant strain K. marxianus MTCC 1389.
On the other hand, the drawbacks of using directly Kluyveromyces strains to convert
lactose to ethanol, including low ethanol titers of 2.5 to 4.2% (v/v), low osmotic
tolerance and prolonged fermentation times (Parashar et al., 2016; Guimarães et al.,
2010; USDA Rural Business and Cooperative Programs, 2008), are overcome in this work.
The strain K. marxianus DSM 5422 under the optimized conditions converted directly
lactose to ethanol with ethanol titers of 6% (v/v) in shorter fermentation times (44 h)
employing high load lactose substrates with high osmotic tolerance. Thus, this study
concludes that K. marxianus DSM 5422 is a promising strain for producing high yields of
ethanol from non-supplemented high load lactose CWP. Although temperature, pH and
operating time are factors that significantly affect the fermentation process,
temperature showed the strongest effect on all responses.
5.3.3.2. Saccharomyces cerevisiae strain

In the same way as the fermentation with K. marxianus DSM 5422 was optimized in
Section 5.3.2.1., optimal fermentation conditions (temperature; initial pH and time)
were calculated via RSM experimental design for S. cerevisiae Ethanol Red ®. In this case,
the feedstock employed was the CWP hydrolyzed according to the conditions pointed
out in section 5.2.4. No nutrients were supplemented in order to compare the
fermentation performance of both species employing exactly the same feedstock. The
128
experimental conditions and the responses obtained for each condition are shown in
Table 5.3.
Tabla 5.3.Experimental results of ethanol concentration (Ef), ethanol yield factor (YE/L),
ethanol profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE) according to a central
composite design employing S. cerevisiae Ethanol Red® for the fermentation of
hydrolyzed CWP (Li = 132.5 g/L).

pH T Time Ef YE/L πE WE
(°C) (h) (g/L) (g/g) (g/L) (g/(L·h))
1 5.5 40 72 22.52 0.27 7.563 0.31
2 5.0 35 64 45.03 0.35 44.72 0.70
3 4.5 30 72 44.70 0.35 44.46 0.62
4 5.8 35 64 47.75 0.37 47.46 0.75
5 5.5 30 56 45.65 0.38 40.10 0.82
6 5.0 43.4 64 19.25 0.30 0.70 0.30
7 5.5 40 56 35.61 0.33 23.87 0.64
8 5.0 35 64 45.36 0.35 45.04 0.71
9 5.5 30 72 47.17 0.36 46.93 0.66
10 4.5 40 72 17.67 0.25 1.83 0.25
11 5.0 35 77.5 42.50 0.33 42.24 0.54
12 5.0 35 50.6 39.24 0.36 27.96 0.78
13 4.2 40 64 28.09 0.29 14.44 0.44
14 4.5 40 56 28.31 0.30 13.64 0.51
15 5.0 35 64 44.77 0.35 42.31 0.70
16 5.0 35 64 46.49 0.36 46.13 0.73
17 5.0 35 64 45.20 0.36 43.32 0.71
18 5.0 26.6 64 43.92 0.35 41.35 0.69
19 4.5 30 56 41.79 0.36 33.49 0.75
20 5.0 35 64 45.90 0.36 43.99 0.72
The full quadratic model was statistically effective for the final ethanol concentration at
95% confidence level. The estimated regression coefficients for ethanol titers (g/L) and
the analysis of variance results are reported in the Supplementary Material in Tables
SM.5.6 and SM.5.7, respectively. The optimized fermentation conditions that
simultaneously maximized Ef and πE responses are 30.5 °C of temperature, 5.4 units of
pH and 60 hours of fermentation. The estimated ethanol titer was 48.5 g/L with an
ethanol yield factor of 0.37 g/g and an ethanol profit factor of 48.5 g/L, corresponding
with a conversion efficiency of 70.1% and an ethanol volumetric productivity of 0.81
g/L·h. To validate the fitted RSM model, the fermentation was experimentally tested at
129
Capítulo 5.
the optimized conditions. An ethanol titer of 47 g/L was achieved with a mean glucose
consumption of 99.4% and a mean galactose consumption of 97.3%, the ethanol yield
factor YE/L was 0.37 g/g, corresponding with 68.2% of the theoretical yield. The ethanol
productivity was of 0.73 g/L·h. These data confirm the predictability of the fitted model
for Ethanol Red® strain, with a percentage error between experimental and predicted
values of 3%. These results are in accordance with reported results of Zhang et al. (2015),
who recorded ethanol yield factors of 80% fermenting glucose synthetic media using S.
cerevisiae BY4747 with a sugar load of 120 g/L after 72 hours of fermentation. These
authors observed a strong effect of substrate concentration on ethanol yield,
establishing the critical substrate concentration in 160 g/L of sugar. The high
concentration of substrate decreased membrane fluidity and caused cell atrophy and
organelle dehydration (Zhang et al., 2015).
Moreover, the enzymatic hydrolysis of lactose into glucose and galactose can cause
catabolite repression (Gancedo, 1998), besides of being not economically convenient.
Strains affected by such phenomenon show slower fermentations of sugar mixtures,
such as glucose and galactose, compared to strains without catabolite repression
(Pasotti et al., 2017).
Therefore, the use of K. marxianus DSM 5422 is clearly preferable over S. cerevisiae
Ethanol Red ® for the fermentation of high lactose-loaded CWP.
5.3.4. Comparison of immobilization supports

In order to determine the effect of the immobilization on inorganic supports on the
bioconversion of K. marxianus DSM 5422 for long-term fed-batch processes using high
loaded non-supplemented CWP as a substrate to produce ethanol, four inorganic
supports (glass Raschig rings, plastic Raschig rings, Tygon® silicone Raschig rings and
alumina beads) were tested. The fermentation conditions were defined according to the
results of the RSM model for this strain (section 3.2): 30.3 °C for temperature, 6.3 for pH
and 44 h for fermentation time.
The profiles of ethanol production and the conversion efficiency for the four supports
over time are shown in Figure 5.3. During the first cycles, the four inorganic supports
had a similar behavior with final ethanol concentrations about 60 g/L. However, it was
130
observed that the production of ethanol decreased drastically after the 6th cycle with
the supports of Tygon® and plastic. On the contrary, the samples with glass Raschig rings
and alumina beads, even though they suffered an ethanol production drop during cycle
6th, they resumed production in the next batch. Conversion yields (ηE) were higher than
80 % per all cycles using inorganic supports, with yields higher than 90 % for glass Raschig
rings and alumina beads in the 7th cycle.
70
65
60
Ef (g/L)
55
GRR
50 PRR
TRR
AB
45
0 50 100 150 200 250 300 350 400
time (h)
Figura 5.3. Evolution of ethanol concentration during ethanol fermentation for inorganic
supports [glass Raschig rings (GRR), plastic Raschig rings (PRR), tygon Raschig rings (TRR)
and alumina beads (AB)] during 7 fermentation cycles (Li = 130 g/L) employing K.
marxianus DSM 5422.
Due to their higher stability over time, glass Raschig rings and alumina beads were
selected as immobilization supports to compare their behavior during a prolonged
operation period of more than 1.000 hours, working in 14 cycles refreshing CWP with
two different loads of lactose of 130 g/L and 170 g/L. For both inorganic supports, the
profiles of ethanol production are presented in Figure 5.4 (Li = 130 g/L) and Figure 5.5 (Li
= 170 g/L).
131
Capítulo 5.
CWP (L0= 130 g/L)
70
60
50
Ef (g/L)
40
30
GRR
AB
20
0 200 400 600 800 1000 1200
time (h)
Figura 5.4. Evolution of ethanol concentration employing K. marxianus DSM 5422 on

inorganic supports [glass Raschig rings (GRR) and alumina beads (AB)] during 14
fermentation cycles (Li= 130 g/L).
CWP (L0= 170 g/L)

80
70
60
Ef (g/L)
50
40
30
GRR
AB
20
0 200 400 600 800 1000 1200
time (h)
Figura 5.5. Evolution of ethanol concentration employing K. marxianus DSM 5422 on

inorganic supports [glass Raschig rings (GRR) and alumina beads (AB)] during 14
fermentation cycles (Li= 170 g/L).
132
The experimental results showed that K. marxianus DSM 5422 was able to metabolize
more than 90% of the lactose present in the broth to produce ethanol in 48 – 72 hours
of fermentation during the 14 operational cycles, working with a CWP with 130 g/L
lactose load. However, the strain only metabolized 80% of this disaccharide when the
CWP was loaded at Li = 170 g/L, independent of the support. For this reason, from the
7th cycle, the fermentation time was increased to 72 – 96 hours for this high loaded CWP.
As it can be observed in Figure 5.4, in general the ethanol production remained constant
at a value of 60 g/L during the 14 cycles for both supports, alumina beads and glass
Raschig rings, working with a CWP with a lactose load of 130 g/L. The best performance
was obtained with the alumina beads during all tested cycles with the exception of the
14th cycle, when a significant ethanol concentration drop was observed.
In the case of CWP loaded with 170 g/L lactose (Figure 5.5), the alumina beads had a
worse performance than the glass Raschig rings during all the experimental cycle but
their behavior was improving over time. The mean ethanol production was of 58.2 g/L
after 14 cycles prolonging during more than 1.000 hours of fermentation.
The mean fermentation kinetic parameters for each inorganic support at the two tested
CWP loads (130 g/L and 170 g/L) during the 14 cycles are summarized in Table 5.4. An
important decrease of all the kinetic parameters was observed working with lactose
concentrations of 170 g/L, due to possible inhibitions by substrate. It is noteworthy that
lactose consumption decreased in almost 25%, affecting significantly the profit factor
(πE) and the productivity (WE). In base of the results, it would be more convenient to
work with CWPs with lactose concentration lower than 170 g/L in order to get a total
lactose depletion and avoid environmental problems.
133
Capítulo 5.
Tabla 5.4. Comparison of mean fermentation parameters: Ethanol final concentration

(Ef), ethanol yield factor (YE/L), ethanol yield conversion efficiency (ηE), lactose
consumption (ΔL), ethanol profit factor (πE) and ethanol volumetric productivity (WE) for
K. marxianus DSM 5422 during the 14 cycles employing CWP with lactose loads of 130
g/L and 170 g/L for glass Raschig rings (GRR) and alumina beads (AB) supports.
Ef YE/L ηE ΔL WE πE
(g/L) (g/g) (%) (%) (g/L·h) (g/L)
GRR 59.13 0.452 83.98 97.66 1.09 57.96
CWP (Li= 130 g/L)
AB 58.43 0.450 83.60 96.00 1.09 57.21
GRR 56.71 0.449 81.93 75.66 0.82 43.84
CWP (Li= 170 g/L) AB 50.94 0.445 82.64 68.07 0.72 35.57
5.4. Conclusions
High loaded cheese whey permeates (CWP) could be a feasible feedstock for ethanol
fermentation, contributing simultaneously to an efficient reuse of the main waste
stream of the dairy industry. The selection of an appropriate yeast strain is basic to
overcome current techno-economical process difficulties including low ethanol titers,
low osmotic tolerance and prolonged fermentation times. After the screening of eight
yeast strains of the genera Saccharomyces and Kluyveromyces, the best performance
was obtained employing K. marxianus DSM 5422, capable of fermenting directly high
lactose-load CWP (> 130 g/L) to ethanol without the need of adding nutrients to the
fermentation broth. The statistical optimization of fermentation conditions
(temperature, initial pH and time) allowed the maximization of the fermentation
performance (ethanol titer, ethanol yield and lactose consumption). Ethanol titers of 6%
(v/v) and a total consumption of lactose in only 44 h were attained. Moreover, the
feasibility of immobilizing this yeast strain on inorganic supports was assessed reporting
stable ethanol production, yielding ethanol titers of 60 g/L for more than 1.000 hours
(i.e. fourteen consecutive cycles), which remarkably reduces yeast cultivation costs.
Economic and scale-up studies are needed to verify the feasibility of the proposed
process.
Acknowledgements
Authors are grateful to ITACyL and FEDER European Regional Development founds
(FEDER) for financial support. María Hijosa-Valsero is supported by a postdoctoral
134
contract (DOC-INIA, grant number DOC 2013-010) funded by the Spanish National
Institute for Agricultural and Food Research and Technology (INIA) and the European
Social Fund. Authors thanks R. Antón and N. del Castillo and G. Sarmiento for the
technical help during the experiments. The authors thank Tomsa Destil S.L for kindly
providing samples of S. cerevisiae CECT 13152 strain. The authors are grateful to
Quesería Entrepinares SAU for generously supplying cheese whey permeate.
Bibliography
Baldasso, C., Barros, T.C., Tessaro, I.C. (2011). Concentration and purification of whey proteins
by ultrafiltration. Desalination, 278, 381–386.
Christensen, A.D., Kádár, Z., Oleskowicz-Popiel, P., Thomsen, M.H. (2011). Production of
bioethanol from organic whey using Kluyveromyces marxianus. Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, 38, 283-289.
Díez-Antolínez, R., Hijosa-Valsero, M., Paniagua-García, A.I., Gómez, X. (2016). Very-high-gravity

fermentation of non-supplemented cheese whey permeate by immobilized
Kluyveromyces marxianus. Chemical Engineering Transactions, 49, 529-534.
Dragone, G., Mussatto, S.I., Almeida e Silva, J.B., Teixeira, J.A. (2011). Optimal fermentation
whey powder. Biomass and Bioenergy, 35, 1977-1982.
Diniz, R.H.S., Rodrigues, M.Q.R.B., Fietto, L.G., Passos, F.M.L., Silveira, W.B. (2014). Optimizing
and validating the production of ethanol from cheese whey permeate by Kluyveromyces
marxianus UFV-3. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 3, 111-117.
Dombek, K.M, Ingram, L.O. (1986). Magnesium limitation and its role in apparent toxicity of
ethanol during yeast fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 52, 5975-
5981.
Ergüder, T.H., Tezel, U., Güven, E., Demirer, G.N. (2001). Anaerobic biotransformation and
methane generation potential of cheese whey in batch and UASB reactors. Waste
Management, 21(7): 643-650.
Gabardo, S., Rech, R., Ayub, M.A.Z. (2012). Performance of different immobilized-cell systems
to efficiently produce ethanol from whey: fluidized batch, packed-bed and fluidized
135
Capítulo 5.
continuous bioreactors. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 87(8), 1194-

1201.
Gabardo, S., Rech, R., Rosa, C.A., Ayub, M.A.Z. (2014). Dynamics of ethanol production from
whey and whey permeate by immobilized strains of Kluyveromyces marxianus in batch
and continuous bioreactors. Renewable Energy, 69, 89-96.
Gabardo, S., Pereira, G.F., Rech, R., Ayub, M.A.Z. (2015). The modeling of ethanol production by
Kluyveromyces marxianus using whey as substrate in continuous A-Stat
bioreactors. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 42(9), 1243-1253.
Gancedo, J.M. (1998). Yeast carbon catabolite repression. Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 62(2), 334-361.
Gonzalez-Siso, M.I.G. (1996). The bio-technological utilization of cheese whey: a review.

Bioresource Technology, 57, 1-11.
Gonçalves, L.M.D., Barreto, M.T.O., Xavier, A.M.B.R., Carrondo, M.J.T., Klein, J. (1992). Inert
supports for lactic acid fermentation—a technological assessment. Applied Microbiology
and Biotechnology, 38(3): 305-311.
Guimarães, P.M.R., Teixeira, J.A., Domingues, L. (2010). Fermentation of lactose to bio-ethanol

by yeasts as part of integrated solutions for the valorisation of cheese whey. Biotechnol
Advances, 28, 375-384.
Guimarães, P.M., Teixeira, J.A., Domingues, L. (2008). Fermentation of high concentrations of

lactose to ethanol by engineered flocculent Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology
Letters, 30(11), 1953.
Hensing, M.C., Rouwenhorst, R.J., Heijnen, J.J., van Dijken, J.P., Pronk, J.T. (1995). Physiological
and technological aspects of large-scale heterologous-protein production with yeasts.
Antonie van Leeuwenhoek 67: 261-279.
Hensing, M.C., Vrouwenvelder, H., Hellinga, C., Baartmans, R., van Dijken, J.P. (1994). Production
of extracellular inulinase in high-cell-density fed-batch cultures of Kluyveromyces
marxianus. Applied Microbiology and Biotechnology, 42, 516-521.
Kargi, F., Ozmıhci, S. (2006). Utilization of cheese whey powder (CWP) for ethanol fermentations:
Effects of operating parameters. Enzyme and Microbial Technology, 38, 711-718.
136
Kosikowski, F.V. (1979). Whey utilization and whey products. Journal of Dairy Science, 62, 1149-
1160.
Koushki, M., Jafari, M., Azizi, M. (2012). Comparison of ethanol production from cheese whey
permeate by two yeast strains. Journal of food science and technology, 49(5), 614-619.
Lane, M.M., Morrissey, J.P. (2010). Kluyveromyces marxianus: a yeast emerging from its sister’s
shadow. Fungal Biology Reviews, 24, 17-26.
Lee, S.E., Lee, C.G., Kang, D.H., Lee, H.Y., Jung, K.H. (2012). Preparation of corncob grits as a
carrier for immobilizing yeast cells for ethanol production. Journal of Microbiology and
Biotechnology, 22(12), 1673-1680.
MacFaddin, J.F. (1985). Media for Isolation-Cultivation-Identification-Maintenance of Medical

Bacteria, Vol. 1, Williams and Wilkins, Baltimore.
Mawson, A.J. (1994). Bioconversions for whey utilization and waste abatement. Bioresource
Technology, 47(3), 195-203.
Mollea, C., Bosco, F., Marmo, L. (2013). Valorisation of cheese whey, a by-product from the dairy
industry. In: Food Industry. Ed.: I. Muzzalupo, IntechOpen, DOI: 10.5772/53159.
OECD/Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2013. OECD-FAO Agricultural
Outlook 2013-2022. OECD Publishing.
Ozmihci, S., Kargi, F. (2007). Comparison of yeast strains for batch ethanol fermentation of
cheese-whey powder (CWP) solution, Letters in Applied Microbiology, 44, 602–606.
Ozmihci, S., Kargi, F. (2009). Fermentation of cheese whey powder solution to ethanol in a
packed-column bioreactor: effects of feed sugar concentration. Journal of chemical
technology and biotechnology, 84(1), 106-111.
Parashar, A., Jin, Y., Mason, B., Chae, M., Bressler, D. C. (2016). Incorporation of whey permeate,
a dairy effluent, in ethanol fermentation to provide a zero waste solution for the dairy
industry. Journal of Dairy Science, 99(3), 1859-1867.
Parrondo, J., García, L. A., Díaz, M. (2009). Nutrient balance and metabolic analysis in a
137
Capítulo 5.
Pasotti, L., Zucca, S., Casanova, M., Micoli, G., De Angelis, M. G. C., & Magni, P. (2017).
Fermentation of lactose to ethanol in cheese whey permeate and concentrated permeate
by engineered Escherichia coli. BMC Biotechnology, 17(1), 48.
Prazeres, A.R., Carvalho, F., Rivas, J. (2012). Cheese whey management: a review. Journal of
Environmental Management, 110, 48-68.
Rubio-Texeira, M. (2005). A comparative analysis of the GAL genetic switch between not-so-
distant cousins: Saccharomyces cerevisiae versus Kluyveromyces lactis. FEMS Yeast
Research, 5(12), 1115-1128.
Saini, P., Beniwal, A., Kokkiligadda, A., Vij, S. (2017). Evolutionary adaptation of Kluyveromyces
marxianus strain for efficient conversion of whey lactose to bioethanol. Process
Biochemistry, 62, 69-79.
Sansonetti, S., Curcio, S., Calabrò, V., Iorio, G. (2010). Optimization of ricotta cheese whey (RCW)
fermentation by response surface methodology. Bioresource Technology, 101, 9156-
9162.
Silveira, W.B., Passos, F.J.V., Mantovani, H.C., Passos, F.M.L. (2005). Ethanol production from
cheese whey permeate by Kluyveromyces marxianus UFV-3: A flux analysis of oxido-
reductive metabolism as a function of lactose concentration and oxygen levels. Enzyme
and Microbial Techonoly, 36, 930–936.
Singh, N.L., Srivastava, P., Mishra, P.K. (2009). Studies on ethanol production using immobilized
cells of Kluyveromyces thermotolerans in a packed bed reactor. Journal of Scientific &
Industrial Research, 68, 617-623.
Soupioni, M., Golfinopoulos, A., Kanellaki, M., Koutinas, A.A. (2013). Study of whey fermentation
by kefir immobilized on low cost supports using 14C-labelled lactose. Bioresource
Timson, D.J. (2007). Galactose metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Dynamic Biochemistry.

Process Biotechnology and Molecular Biology, 1(1), 63-73.
USDA Rural Business and Cooperative Programs. 2008. Research Report 214: Whey to ethanol:
A biofuel role for dairy cooperatives? https://www.rd.usda.gov/files/RR214.pdf.
Zhang, Q., Wu D., Lin Y., Wang X., Kong H., & Tanaka S. (2015). Substrate and product inhibition
on yeast performance in ethanol fermentation. Energy & Fuels, 29(2), 1019-1027.
138
Zoppellari, F, Bardi, L. (2013). Production of bioethanol from effluents of the dairy industry by
Kluyveromyces marxianus. New Biotechnology, 30, 607-613.
139
Capítulo 5.
Supplementary Material (SM)

Table SM.5.1. Experimental results of glucose (Gf) and galactose (Galf) release and hydrolysis
efficiency (η(G+Gal)/L) according to a central composite design.

Lactase Time
pH (-) Gf (g/L) Galf (g/L) η(G+Gal)/L (%)
dosage (μL) (h)
1 6 100 4 28.94 22.55 42.44
2 5.63 175 7 45.42 34.11 65.55
3 5.63 175 7 45.44 34.16 65.61
4 6 250 10 45.54 34.21 65.74
5 5.63 175 7 45.42 34.11 65.55
6 5.63 175 2 44.33 31.29 62.33
7 5.63 175 7 44.49 33.56 64.33
8 5.25 250 4 18.88 13.87 26.99
9 5.63 48.87 7 22.18 19.89 34.68
10 5.25 100 10 5.51 8.64 11.66
11 6.26 175 7 45.15 33.97 65.22
12 5.63 175 12 44.37 34.32 64.86
13 5.63 175 7 44.22 33.17 63.79
14 5.63 301.13 7 56.36 44.77 83.36
15 4.99 175 7 2.48 4.46 5.72
16 6 250 4 46.87 34 66.66
17 5.25 250 10 18.26 15.09 27.49
18 6 100 10 31.26 25.72 46.97
19 5.63 175 7 35.53 26.49 51.12
20 5.25 100 4 6.94 7.81 12.16
140
Table SM.5.2. Estimated regression coefficients of lactose hydrolysis efficiency (η(G+Gal)/L). Note:
This model includes all the terms.
Term Coefficient SE coef. T P
Constant 43.7453 2.686 16.285 0
Time (h) -0.0727 1.782 -0.041 0.968
Initial pH 12.7981 1.782 7.181 0
Enzyme dosage (μL) 8.3756 1.782 4.699 0.001
Time (h) * time (h) -1.7973 1.735 -1.036 0.325
Initial pH * Initial pH -9.0575 1.735 -5.221 0
Enzyme dosage (μL) * Enzyme

-3.5933 1.735 -2.071 0.065
dosage (μL)
Time (h) * initial pH 0.38 2.329 0.163 0.874
Time (h) * Enzyme dosage (μL) -0.355 2.329 -0.152 0.882
Initial pH * Enzyme dosage (μL) 0.94 2.329 0.404 0.695
PRESS = 2814.42
R-square(pred.)
S = 6.58633
= 42.94%
R-square = 91.20 % R-square(adj.) = 83.29%
141
Capítulo 5.
Table SM.5.3. Analysis of variance of lactose hydrolysis efficiency (η(G+Gal)/L). Note: This model
includes all the terms.
Source Df SSS SSA MSA F P
Regression 9 4498.41 4498.41 499.82 11.52 0.000
Lineal 3 3194.98 3194.98 1064.99 24.55 0.000
Time (h) 1 0.07 0.07 0.07 0.00 0.968
Initial pH 1 2236.88 2236.88 2236.88 51.57 0.000
Enzyme dosage (μL) 1 958.03 958.03 958.03 22.08 0.001
Quadratic 3 1294.20 1294.20 431.40 9.94 0.002
Time (h) * time (h) 1 6.29 46.55 46.55 1.07 0.325
Initial pH * Initial pH 1 1101.83 1182.28 1182.28 27.25 0.000
Enzyme dosage (μL) *
1 186.08 186.08 186.08 4.29 0.065
Enzyme dosage (μL)
Interaction 3 9.23 9.23 3.08 0.07 0.974
Time (h) * initial pH 1 1.16 1.16 1.16 0.03 0.874
Time (h) * Enzyme dosage
1 1.01 1.01 1.01 0.02 0.882
(μL)
Initial pH * Enzyme dosage
1 7.07 7.07 7.07 0.16 0.695
(μL)
Residual error 10 433.80 433.80 43.38
Lack of fit 5 357.68 357.68 71.54 4.70 0.057
Pure error 5 76.12 76.12 15.22
Total 19 4932.21
Table SM.5.4. Estimated regression coefficients of ethanol (g/L) for strain K. marxianus DSM
5422. Note: This model includes all the terms.
Term Coefficient SE Coef. T P

Constant 52.6545 1.2594 41.8110 0.000
Temperature (°C) -11.5818 0.8356 -13.8610 0.000
Initial pH 1.1287 0.8356 1.3510 0.207
Time (h) 1.2063 0.8356 1.4440 0.179
Temperature (°C) *
-8.2077 0.8134 -10.0910 0.000
Temperature (°C)
Initial pH * Initial pH -2.5897 0.8134 -3.1840 0.010
time (h) * time (h) -3.0777 0.8134 -3.7840 0.004
Temperature (°C) * Initial
3.2200 1.0917 2.9500 0.015
pH
Temperature (°C) * time (h) -4.0250 1.0917 -3.6840 0.004
Initial pH * time (h) -0.4200 1.0917 -0.3850 0.708
S = 3.08780 PRESS = 624.161
R-square(pred.) =
R-square = 97.08 % R-square(adjusted) = 94.44 %
80.85 %
142
Table SM.5.5. Analysis of variance of Ethanol (g/L) for strain K. marxianus DSM 5422. Note: This
model includes all the terms.
Source df SSS SSA MSA F P
Regression 9 3164.68 3164.68 351.63 36.88 0.000
Lineal 3 1869.17 1869.17 623.03 65.35 0.000
Temperature (°C) 1 1831.9 1831.9 1831.9 192.13 0.000
Initial pH 1 17.4 17.4 17.4 1.82 0.207
Time (h) 1 19.87 19.87 19.87 2.08 0.179
Quadratic 3 213.96 213.96 71.32 7.48 0.006
Temperature (°C) *
1 908.85 970.84 970.84 101.82 0.000
Temperature (°C)
time (h) * time (h) 1 136.5 136.5 136.5 14.32 0.004
Interaction 3 213.96 213.96 71.32 7.48 0.006
Temperature (°C) * Initial pH 1 82.95 82.95 82.95 8.7 0.002
Temperature (°C) * time (h) 1 129.61 129.61 129.61 13.59 0.004
Initial pH * time (h) 1 1.41 1.41 1.41 0.15 0.708
Residual error 10 95.35 95.35 9.53
Lack of fit 5 79.27 79.27 15.85 4.93 0.052
Pure error 5 16.07 16.07 3.21
Total 19 3260.05
Table SM.5.6. Estimated regression coefficients of Ethanol (g/L) for strain S. cerevisiae Ethanol
Red®. Note: This model includes all the terms.
Term Coefficient SE coef. T p
Constant 45.0389 1.3947 32.293 0
Temperature (°C) -8.6176 0.9253 -9.313 0
Initial pH 3.8474 0.9253 4.158 0.002
Time (h) -1.085 0.9253 4.158 0.002
Temperature (°C) * Temperature
-4.9045 0.9008 -5.445 0
(°C)
Initial pH * Initial pH -2.6647 0.9008 -2.958 0.14
Time (h) * Time (h) -1.6217 0.9008 -1.8 0.102
Temperature (°C) * Initial pH 0.6025 1.209 0.498 0.629
Temperature (°C) * time (h) -3.395 1.209 -2.808 0.019
Initial pH * time (h) -0.605 1.209 -0.5 0.628
S = 3.41960 PRESS = 765.074 R-square(adj.) = 88.16%

R-square = 93.77 % R-square(pred.) = 59.22%
143
Capítulo 5.
Table SM.5.7. Analysis of variance of Ethanol (g/L) for strain S. cerevisiae Ethanol Red®. Note:
This model includes all the terms.
Source df SSS SSA MSA F P
Regression 9 1759.07 1759.07 195.45 16.71 0.000
Lineal 3 1232.45 1232.45 410.82 35.13 0.000
Temperature (°C) 1 1014.21 1014.21 1014.21 86.73 0.000
Initial pH 1 202.16 202.16 202.16 17.29 0.002
Time (h) 1 16.08 16.08 16.08 1.37 0.268
Quadratic 3 428.58 428.58 142.86 12.22 0.001
Temperature (°C) *
1 299.45 346.64 346.64 29.64 0.000
Temperature (°C)
Time (h) * time (h) 1 37.9 37.9 37.9 3.24 0.102
Interaction 3 98.04 98.04 32.68 2.79 0.095
Temperature (°C) * Initial pH 1 2.90 2.90 2.9 0.25 0.629
Temperature (°C) * time (h) 1 92.21 92.21 92.21 7.89 0.019
Initial pH * time (h) 1 2.93 2.93 2.93 0.25 0.628
Residual error 10 116.94 116.94 11.69
Lack of fit 5 96.93 96.93 19.39 4.85 0.054
Pure error 5 20.00 20.00 4.00
Total 19 1876
144
Fixed Values
Fixed Values
Fixed Values
Figure SM.5.1. Contour plots for the estimation of lactose hydrolysis efficiency (η(G+Gal)/L) as a
function of hydrolysis conditions (enzyme dosage, initial pH and time), according to the
mathematical RSM model.
145
Capítulo 5.
Anexo 5.1.
En la Figura A.5.1., se muestran las imágenes de la distribución y colonización de la cepa
K. marxianus DSM 5422 inmovilizada sobre cuatro soportes inertes por adsorción:
esferas de alúmina, anillos Raschig de plástico, anillos Raschig de Tygon® y anillos
Raschig de vidrio.
146
Figura A.5.1. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SME) mostrando la

distribución y colonización de K. marxianus DSM 5422 inmovilizada sobre soportes
inertes: a) soportes inertes utilizados b) microorganismo inmovilizado sobre 1. Alúmina;
2. Plástico; 3. Tygon® y 4. Vidrio.
147
6. Effect of Nutrient Supplementation on
Biobutanol Production from Cheese Whey by
Acetone–Butanol–Ethanol Fermentatio
Effect of nutrient supplementation on biobutanol production from cheese whey by ABE
fermentation
Effect of Nutrient Supplementation on

Biobutanol Production from Cheese Whey by
Acetone–Butanol–Ethanol (ABE) Fermentation
Abstract
Cheese whey is a liquid effluent obtained from the cheese manufacturing process,
presenting a high volumetric production and high organic loads related to its lactose
content. The aim of this research was to increase the productivity of ABE fermentation
with the bacterial strain Clostridium beijerinckii CECT 508, when using nanofiltered
sheep cheese whey as a substrate. Thermal sterilization of the whey was essential to
avoid the proliferation of lactic acid bacteria. An experimental design including Plackett-
Burman and Response Surface Methodology (RSM) was applied to figure out which
additional nutrients were necessary for the fermentation process and their optimum
concentrations. For this specific whey, it was established that 1 g/L yeast extract, 5 g/L
CaCO3, 0.019 g/L FeSO4·7H2O, 0.2 g/L MgSO4·7H2O and 2.1 g/L NH4Cl needed to be
added. Under optimal nutrient conditions, the highest butanol production (9.11 g/L) was
obtained with an initial lactose concentration of 57 g/L; achieving 49% lactose
consumption and 0.311 g/g YB/L yield. However, the best lactose consumption rate (87%)
was recorded for lactose initial concentrations of 30 g/L, which also allowed satisfactory
fermentation values (8.51 g/L butanol and 0.328 g/g YB/L yield). On the other hand, the
best YB/L yields (0.428 g/g; which is close to the theoretical value) were obtained for initial
lactose concentrations of 40 g/L, attaining a value of 52% lactose consumption and 8.91
g/L butanol. Therefore, the ABE fermentation could be a feasible solution to treat cheese
whey and remove lactose, obtaining acceptable amounts of butanol.
Keywords: ABE fermentation, Clostridium sp., RSM, nutrient supplementation.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
supplementation on biobutanol production from cheese whey by ABE (Acetone-Butanol-
Ethanol) fermentation. Chemical Engineering Transactions 49, 217-222. DOI:
10.3303/CET1649037.
151
Capítulo 6.
6.1. Introduction
Biocatalytic processes are presented as a real alternative to face new social challenges
of a post-oil era. Since the 1980s, there has been an ongoing search for alternative fuels
to be used either directly or mixed with fossil fuels. Interest in butanol production is
increasing (Meesukanun and Satirapipathkul, 2014), because this alcohol presents
higher energy content, lower volatility, lower hygroscopicity and it is less corrosive than
ethanol. Additionally, butanol is an important chemical compound with many
applications, like the production of solvents, resins and plasticisers.
The Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) fermentation with Clostridium strains was used

worldwide at industrial scale for the production of acetone and butanol from the early
twentieth century until the 1960s (Jones and Woods, 1986), but this fermentation was
replaced by petrochemical processes with higher profitability. The major factors that
compromised ABE fermentation economic feasibility included: the high cost of
traditional substrates (corn, molasses, etc.), low concentration of butanol in fermented
broth (associated with strong product inhibition affronted by microorganisms) (Ezeji et
al., 2004), low butanol yield, low volumetric productivity with typical values lower than
0.5 g/L·h (Ezeji et al., 2013) and, finally, the high cost of solvent recovery processes, not
only due to the diversity of solvents produced, but also to the high boiling point of
butanol (118 °C) (Qi et al., 2014). Under batch conditions, ABE fermentation takes place
in two main phases: a first phase called acidogenesis, associated with rapid cell growth
and secretion of carboxylic acids (acetate and butyrate) and a mixture of H2 and CO2 as
gaseous substances, and a second phase involving the conversion of acid intermediates
into solvents, called solventogenesis.
With the aim of reducing fermentation costs, the utilization of an agro-industrial waste
with high polluting potential is of great relevance (Pisano et al., 2015). An interesting
substrate for ABE fermentation is whey. This liquid effluent obtained from the cheese
manufacturing process presents high volumetric production and high organic loads.
Typical chemical and biological oxygen demand (COD and BOD) values are 50 – 102
kg/m3 and 27 – 60 kg/m3, respectively (Ergüder et al., 2001). This high organic load is
mainly due to its lactose content (48 – 60 g/L), which may be too low for most industrial
152
fermentation
fermentation processes, but results optimal in the case of butanol production. Cheese
whey is also characterised by high protein content in the range of 33 – 67 g/L and fat
content in the range of 8 – 10 g/L, which also contributes to its high organic load.
ABE fermentation has been extensively studied as an alternative for whey valorization.
Most of these studies have been conducted in batch conditions resulting in higher
acetone/butanol/ethanol production ratios than those typically obtained when
fermenting carbohydrate substrates, such as starch or molasses (3: 6: 1). Reported
solvent concentrations range between 5 – 15 g/L, with typical butanol productivities and
yields ranging from 0.1 – 0.3 g/L·h and 0.23 – 0.40 gsolvents/gsubstrate (Alam et al., 1988;
Napoli et al., 2010; Welsh and Veliky, 1984), respectively.
The objective of this work was to improve lactose transformation in ABE fermentation
of nanofiltered sheep cheese whey. In the first place, the composition of the
fermentation medium (including the necessity of nutrient addition) was optimised for a
maximal butanol production. Secondly, the effect of initial lactose concentration was
studied in order to increase the fermentation yield and favour lactose depletion, thus
reducing the polluting potential of the resulting effluent.
6.2. Material and Methods

6.2.1. Microorganisms and culture conditions
The strain used was Clostridium beijerinckii CECT 508 (NCIMB 8052), provided by the
Spanish Collection of Type Strains (CECT, Paterna, Spain). The lyophilised cells were
resuspended in synthetic medium consisting of 19 g/L Reinforced Clostridial Medium
(Oxoid, Basingstoke, UK) and 10 g/L lactose (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) and
exposed to a thermal shock (2 min at 80 °C in a water bath and 5 min in ice). They were
subjected to sporulation according to the CECT protocol. Then, 500 µl spores were
added to 100 mL of the above-mentioned synthetic medium, which was placed in glass
bottles capped with a rubber septum, and exposed to a thermal shock. Afterwards,
gaseous N2 was bubbled into the headspace of the closed bottles during 5 min to obtain
anaerobic conditions. The bottles were incubated for 20 h at 35 °C and were employed
as inocula, containing an approximate bacterial density of 6·108 cells/mL.
153
Capítulo 6.
6.2.2. Cheese whey and fermentation media

All fermentations were performed with sheep cheese whey provided by the cheese
factory Quesería Artesanal del Río Carrión S.L. (La Serna, Palencia, Spain). This whey was
nanofiltered, resulting in an increase in the concentrations of its components (Table 1).
Whey ultrafiltration or nanofiltration is sometimes performed at the cheese producer’s
facilities in order to reduce transport costs if the whey is to be treated at a different
locality. In the present work, the use of nanofiltered whey allowed for the possibility of
making dilutions to obtain different lactose concentrations for the experiments.
Tabla 6.1. Composition of the nanofiltered sheep cheese whey employed in the
experiments.
Concentration Concentration Concentration
Lactose (g/L) 137 Mg (mg/L) 207 Cl- (mg/L) 1181
Proteines (g/L) 5.5 Cu (mg/L) <1.0 Br- (mg/L) 33
Fats (%) < 0.05 Fe (mg/L) <5 NO2- (mg/L) <1
K (mg/L) 2524 Mn (mg/L) <8 NO3- (mg/L) <1
Na (mg/L) 751 Zn (mg/L) <1 SO42- (mg/L) 222
Ca (mg/L) 193 F- (mg/L) 139 PO43- (mg/L) 1907
Previous works indicate that ABE fermentation is properly developed up to lactose levels
of 50-60 g/L (Qureshi and Maddox, 2005). Therefore, in the present work the
nanofiltered whey was diluted with distilled water in order to obtain initial lactose
concentrations which were more suitable for the development of C. beijerinckii. An
adequate balance of organic and inorganic nutrients is required for growth and solvent
production by Clostridium sp. Current studies confirm the fact that nutrient
supplementation, particularly the addition of yeast extract, is essential for solvent
production (Ezeji et al., 2013). In the present work, the need for addition of
supplementary nutrients was studied with the following substances: yeast extract
(Fluka, Buchs, Switzerland) as vitamin source, KH2PO4 and KHPO4 (Sigma-Aldrich) as
phosphorus source, NH4Cl (Panreac, Castellar del Vallés, Spain) as nitrogen source,
154
fermentation
MgSO4·7H2O and FeSO4·7H2O (Sigma-Aldrich) as mineral sources, CaCO3 (Sigma-Aldrich)

as pH buffer, and cysteine (Sigma-Aldrich) as reducing agent.
Therefore, fermentation media used in this study consisted on cheese whey

supplemented with one or more of the above-mentioned substances at different
concentrations. For fermentation experiments, 3 mL of inoculum were added to 97 mL
of fermentation medium in rubber-capped bottles. The initial pH was adjusted to 6.0
with NaOH. Gaseous N2 was bubbled into the bottom of the closed bottles during 5 min.
Fermentation bottles were incubated at 80 °C and 100 rpm in an Infors HT Minitron
orbital shaker (Infors AG, Bottmingen, Switzerland) during 92 h. All experiments were
performed in triplicate.
Fermentation media (before inoculation), bottles, control instruments and any material
in contact with microorganisms susceptible to contamination were autoclaved for 15
min at 121 °C. The only exceptions were MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O and cysteine, which
were added to the fermentation media as solutions filtered through syringe nylon filters
with 0.20 µm pore size and 25 mm diameter (Auxilab SL, Beriáin, Spain). It was
experimentally observed that cheese whey must be autoclaved before the inoculation
of C. beijerinckii, regardless whether the whey has been previously pasteurised or
nanofiltered, since lactic acid bacteria can survive these latter processes and inhibit ABE
fermentation.

Periodic samples were collected from the fermentation bottles using aseptic techniques
to determine lactose and metabolite concentration. Samples were centrifuged at 5.000
rpm in a refrigerated microcentrifuge for 5 min. The supernatant was filtered through a
0.20 µm filter and analysed by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas
chromatography (GC). Acetone, butanol, ethanol, acetic acid and butyric acid were
determined by GC using an Agilent 7890 GC equipped with a flame ionization detector
(FID) and using a column HP Innowax 30 m x 0.530 mm, 1.00 µm (Agilent Technologies,
Santa Clara, CA, USA). Lactose and lactic acid were determined by an Agilent LC1200
HPLC equipment with a refractive index detector and an Aminex HPX-87-H column (Bio-
Rad, Hercules, California, USA), where the mobile phase was 5 mM H2SO4.
155
Capítulo 6.
Fermentation yields and productivity were calculated at the end of each run.
Fermentation yield (Yi/L, g/g) was calculated as the ratio between the metabolite (i)
produced and lactose consumed. The metabolite productivity rate (Wi, g/(L·h)) was
calculated as the ratio of metabolite (i) expressed in concentration (g/L) and the time of
fermentation (h).

For the optimization step, experimental designs, such as Plackett-Burman and Response
Surface Methodology (RSM) were generated and interpreted with the software Minitab
16 (Minitab Inc., State College, PA, USA). Comparisons among treatments were assessed
with a one-way ANOVA and the Tukey HSD test using the software Statistica 7 (StatSoft
Inc., Tulsa, OK, USA); differences were considered significant when p < 0.05.

6.3.1. Optimization of nutrient supplements in
cheese whey
In the first place, it was necessary to figure out which additional nutrients were essential
for a correct ABE fermentation with cheese whey. It must be noted that the optimal
nutrient content and fermentation parameters depend on the specific cheese whey
used, since whey chemical composition varies among cheese factories. In order to select
those relevant compounds, a Plackett-Burman experimental design was performed with
the independent variables and value ranges shown in Table 6.2. Twelve experiments
were performed in which the composition of the fermentation media was different in
each run and was a combination of the conditions given in Table 6.2. The variable Initial
lactose in whey refers to the concentration of lactose in whey after diluting with water
(since nanofiltered whey had a too high lactose content). The variable Added lactose
represents the addition of commercial lactose to the fermentation media. The response
variables (i.e. the dependent variables) analysed in every experiment were butanol
concentration (g/L), YB/L (g/g) and consumed lactose (%), after 92 h of fermentation.
156
fermentation
Tabla 6.2. Independent variables included in the Plackett-Burman experimental design

with their respective minimum and maximum values, and effects of each independent
variable on the three response variables. Note: Asterisks indicate a significant effect (p
< 0.05).
Independent variables Response variables (dependent variables). Effects.
Butanol YB/L Consumed lactose
Name Range
(g/L) (g/g) (%)
Yeast extract (g/L) 1-5 -0.302 -0.0057 1.903
FeSO4·7H2O (g/L) 0-0.01 2.908 * 0.0509 * 12.32
MgSO4·7H2O (g/L) 0-0.2 0.712 0.0156 7.717
Cysteine (g/L) 0-0.5 -1.038 -0.0207 -6.893
NH4Cl (g/L) 0-2.1 0.485 0.0102 10.29
K2HPO4 (g/L) 0-1 -0.525 -0.0085 0.300
KH2PO4 (g/L) 0-1 -2.158 -0.0388 -4.123
CaCO3 (g/L) 1-8 1.348 0.0216 11.33
Initial lactose in whey (g/L) 38-54 -0.118 -0.0103 -5.34
Added lactose (g/L) 0-15 0.742 0.0059 -3.68
Temperature (°C) 30-37 0.265 0.0089 -0.617
The results for butanol concentration and YB/L showed parallelism. There were six
independent variables with a positive effect on the response variables (FeSO4·7H2O,
MgSO4·7H2O, NH4Cl, CaCO3, added lactose and temperature). However, the only
nutrient with a significant (p < 0.05) effect on butanol concentration and YB/L was
FeSO4·7H2O (Table 6.2). All those nutrients with a negative effect (yeast extract,
cysteine, K2HPO4, KH2PO4) were considered to be detrimental for the ABE process, and
they were therefore set at the lower values of their ranges for the subsequent
experiments. The effects on the variable Consumed lactose were slightly different, since
this variable is more dependent on the initial lactose concentration.
The following step consisted on an RSM experiment where only three variables were
optimized, whereas the others were kept at fixed values, according to Table 6.3.
157
Capítulo 6.
Tabla 6.3. Conditions of the RSM experiment. In the case of the RSM variables, axial
values are indicated.
RSM variables Fixed parameters
CaCO3 (g/L) 0-10 Yeast extract (g/L) 1 K2HPO4 (g/L) 0
Initial lactose (g/L) 42-70 MgSO4·7H2O (g/L) 0.2 KH2PO4 (g/L) 0
FeSO4·7H2O (g/L) 0.008-0.03 NH4Cl (g/L) 2.1 Cysteine (g/L) 0
The number of variables to be optimized was reduced to three in order to simplify the
process, and they were chosen according to the sign and value of their effects in the
Plackett-Burman test. The RSM design had 20 experiments and included 8 cube points,
6 central points and 6 axial points (α=1.68179). The initial lactose concentration in each
experiment was obtained by diluting the nanofiltered whey with distilled water. The
fermentation was performed at 35 °C during 92 h, and the studied responses were
butanol concentration and YB/L. It was decided to prioritize butanol concentration and,
according to the RSM mathematical estimations, an optimal of 10.09 g/L butanol would
be theoretically obtained when 5.35 g/L CaCO3, 56.7 g/L initial lactose and 0.019 g/L
FeSO4·7H2O are used. Contour plots can be seen in Figure 6.1.
Figura 6.1. Contour plots for butanol production in the RSM experimental design.
Therefore, the final composition of the whey was established as follows: an initial
concentration of lactose at 57 g/L (obtained by dilution with water), and the addition of
158
fermentation
1 g/L yeast extract, 5 g/L CaCO3, 0.019 g/L FeSO4·7H2O, 0.2 g/L MgSO4·7H2O and 2.1 g/L
NH4Cl.
To validate the RSM model, a fermentation was performed in triplicate at 35 °C and

using the optimized composition of the whey (lactose initial concentration and nutrient
addition). After 92 h of fermentation, 9.11 ± 0.66 g/L butanol, 1.44 ± 0.24 g/L acetone,
0.13 ± 0.01 g/L ethanol, 1.47 ± 0.14 g/L acetic acid and 1.12 ± 0.06 g/L butyric acid were
recorded. The consumption of lactose attained 48.5 ± 4.2%, the YB/L yield was
0.3105 ± 0.0081 g/g and the productivity rate WB were 0.0979 ± 0.0071 g/L·h.
Concentrations of butanol and ABE solvents ranging from 5.2 to 8.1 g/L and 8.5 to 11.3
g/L, respectively, have been reported by different authors (Ennis and Maddox, 1985;
Qureshi and Blaschek, 2001; Qureshi and Maddox, 2005) under batch conditions at 50
g/L of lactose and using C. acetobutylicum.
6.3.2. Effect of initial lactose concentration on

YB/L yield and lactose consumption
Although butanol concentrations were satisfactory when using the optimized
supplemented whey described in Section 6.3.1, lactose consumption was not very high.
Depending on the particular circumstances and the industrial objectives, and given the
polluting nature of cheese whey (especially regarding COD), it could be desirable to
maximize lactose consumption by microorganisms instead of prioritizing high butanol
productions. This can be made by reducing initial lactose concentrations; however, too
low lactose concentrations hinder the solventogenesis phase (Welsh and Veliky, 1986).
In order to find a compromise between lactose consumption and the feasibility of ABE
fermentation, four different initial lactose concentrations were tested (30 g/L, 40 g/L,
50 g/L and 60 g/L, obtained by dilution of the nanofiltered whey), maintaining the
addition of supplementary nutrients established in Section 6.3.1. (1 g/L yeast extract, 5
g/L CaCO3, 0.019 g/L FeSO4·7H2O, 0.2 g/L MgSO4·7H2O and 2.1 g/L NH4Cl). The samples
were fermented during 92 h, providing the results shown in Table 6.4.
159
Capítulo 6.
Tabla 6.4. Fermentation results for different initial lactose concentrations. Note: For the
dependent variables marked with an asterisk (*) some letters are given between
brackets, which are related to the results of the ANOVA. If two treatments share one of
the letters, there are no significant differences between treatments (i.e. between initial
lactose concentrations); if they do not have any letter in common, there are significant
differences (p < 0.05) between treatments. In the case of those dependent variables
without an asterisk, no significant differences appeared between treatments.
Initial lactose concentration (g/L)
Dependent variables 30 40 50 60
Acetone (g/L) 1.01 ± 0.22 1.19 ± 0.13 1.27 ± 0.33 1.69 ± 0.33
Butanol (g/L) 8.51 ± 0.17 8.91 ± 0.48 8.47 ± 1.21 9.15 ± 2.32
Ethanol (g/L) 0.12 ± 0.00 0.14 ± 0.01 0.13 ± 0.01 0.14 ± 0.03
Acetic acid (g/L) * 0.69 ± 0.06 (a) 1.15 ± 0.09 (b) 1.24 ± 0.18 (b) 1.64 ± 0.22 (c)
Butyric acid (g/L) 1.44 ± 0.34 1.01 ± 0.15 0.98 ± 0.15 1.28 ± 0.23
Lactose consumption (%) * 86.8 ± 5.4 (a) 52.2 ± 4.1 (b) 52.0 ± 9.0 (b) 50.7 ± 12.8 (b)
Y B/L (g/g) * 0.328 ± 0.018 (a) 0.428 ± 0.019 (b) 0.327 ± 0.011 (a) 0.301 ± 0.006 (a)
WB (g/L·h) 0.093 ± 0.002 0.097 ± 0.005 0.092 ± 0.013 0.099 ± 0.025
Lactose consumption was significantly larger (86.8%) when the initial lactose
concentration was at its lowest level (30 g/L); whereas the best YB/L yields were obtained
for initial lactose concentrations of 40 g/L, attaining a value of 0.428 g/g, which is
considerably high, since the theoretical YB/L value is 0.41 g/g for lactose (Napoli, 2009).
As Madihah et al. (2001) concluded, limited nitrogen concentrations or low
carbon/nitrogen ratios result in better yields and productivities. A higher lactose content
in the medium increases fermentation time and reduces lactose exploitation, therefore
reducing solvent product rates. In addition, an increase in the production of acetic acid
was observed with the increase in the initial value of lactose concentration (Table 4).
The production of metabolites (acetone, butanol, ethanol, acetic acid and butyric acid)
is directly related to lactose utilisation due to the stoichiometry of the reaction. Initial
lactose concentrations also affected A: B: E ratios. Hence, the following ratios were
calculated: 8:71:1 for 30 g/L, 9:66:1 for 40 g/L, 10:64:1 for 50 g/L and 12:64:1 for 60 g/L.
These values are similar to those reported in literature for whey but vary significantly
from those traditionally reported when using glucose as a substrate (ABE ratio of 6:3:1)
160
fermentation
(Qureshi and Blaschek, 2001). In fact, Bahl et al. (1986) also obtained variations in these
ratios by altering nutritional factors affecting growth conditions.
6.4. Conclusions
Nutrient addition and optimization are essential when subjecting cheese whey to ABE
fermentation. This optimization must be performed with each type of whey, since its
composition and fermentation suitability differ depending on the cheese manufacturer.
Experimental design methodologies, like Plackett-Burman and RSM, can simplify the
optimization process and provide reliable results. In addition, lactose consumption and
YB/L yield can be maximized and yet without a loss in butanol concentration.
Acknowledgements
Authors are grateful to ITACyL (Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León) for
financial support. MH-V is supported by a postdoctoral contract (DOC-INIA, grant
number DOC 2013-010) funded by the Spanish Agricultural and Agrifood Research
Institute (INIA) and the European Social Fund. Authors thank Raquel Antón and Nuria
del Castillo for their technical help during the experiments.
References
Alam S., Stevens D., Bajpai R., 1988, Production of butyric acid by batch fermentation of cheese
whey with Clostridium beijerinckii, Journal of Industrial Microbiology, 2, 359–364.
Bahl H., Gottwald M., Kuhn A., Rale V., Andersch W., Gottschalk G., 1986, Nutritional factors
affecting the ratio of solvents produced by Clostridium acetobutylicum, Applied and
Environmental Microbiology, 52, 169–172.
Ennis B.M., Maddox I.S., 1985, Use of Clostridium acetobutylicum P262 for production of
solvents from whey permeate, Biotechnology Letters, 7, 601–606.
Ergüder T.H., Tezel U., Güven E., Demirer G.N., 2001, Anaerobic biotransformation and methane
generation potential of cheese whey in batch and UASB reactors, Waste Management,
21, 643–650.
Ezeji T.C., Qureshi N., Blaschek H.P., 2004, Acetone-butanol-ethanol (ABE) production from
concentrated substrate: reduction in substrate inhibition by fed-batch technique and
product inhibition by gas stripping, Applied Microbiology and Biotechnology, 63, 653–658.
161
Capítulo 6.
Ezeji T.C., Qureshi N., Blaschek H.P., 2013, Microbial production of a biofuel (acetone–butanol–
ethanol) in a continuous bioreactor: impact of bleed and simultaneous product removal,
Bioprocess and Biosystems Engineering, 36, 109–116.
Jones D.T., Woods D.R., 1986, Acetone-butanol fermentation revisited, Microbiological Reviews,
50, 484–524.
Madihah M.S., Ariff A.B., Sahaid K.M., Suraini A.A., Karim M.I.A., 2001, Direct fermentation of
gelatinized sago starch to acetone–butanol–ethanol by Clostridium acetobutylicum,
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17, 567–576.
Meesukanun K., Satirapipathkul C., 2014, Production of acetone-butanol-ethanol from cassava

rhizome hydrolysate by Clostridium saccharobutylicum BAA 117, Chemical Engineering
Transactions, 37, 421-426
Napoli F., 2009, Development of an integrated process for butanol production, PhD Thesis,
Università di Napoli Federico II. <http://www.fedoa.unina.it/4273/1/Fabio_Napoli.pdf>
accessed 08.10.2015.
Napoli F., Olivieri G., Russo M.E., Marzocchella A., Salatino P., 2010, Butanol production by
Clostridium acetobutylicum in a continuous packed bed reactor, Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology, 37, 603–608.
Pisano I., Agrimi G., Grosso G., Mena M.C., Ricci M.A., Palmieri L., 2015, Improved
Saccharomyces cerevisiae growth on cheese whey by controlling enzymatic lactose
hydrolysis, Chemical Engineering Transactions, 43, 637-642
Qi B., Chen X., Yi S., Wan Y., 2014, Inhibition of cellulase, β-glucosidase, and xylanase activities
and enzymatic hydrolysis of dilute acid pretreated wheat straw by acetone-butanol-
ethanol fermentation products, Environmental Progress & Sustainable Energy, 33, 497–
503.
Qureshi N., Blaschek H.P., 2001, Recovery of butanol from fermentation broth by gas stripping,
Renewable Energy, 22, 557–564.
Qureshi N., Maddox I.S., 2005, Reduction in butanol inhibition by perstraction: utilization of
concentrated lactose/whey permeate by Clostridium acetobutylicum to enhance butanol
fermentation economics, Food and Bioproducts Processing, 83, 43–52.
Welsh F.W., Veliky I.A., 1984, Production of acetone-butanol from acid whey, Biotechnology
Letters, 6, 61–64.
162
fermentation
Welsh F.W., Veliky I.A., 1986, The metabolism of lactose by Clostridium acetobutylicum.
Biotechnology LettersLetters, 8, 43-46.
163
7. In situ two-stage gas stripping for the
recovery of Butanol from Acetone-Butanol-
Ethanol (ABE) fermentation broths
In situ two-stage gas stripping for the recovery of butanol from ABE fermentation broths
In situ two-stage gas stripping for the recovery

of Butanol from Acetone-Butanol-Ethanol
(ABE) fermentation broths
Abstract
Separation and purification of butanol from Acetone-Butanol-Ethanol (ABE)
fermentation broths is one of the main challenges related to the implementation of
butanol biorefineries from agrofood wastes. Due to the great energy consumption of
conventional solvent recovery technologies, it is essential to find more environmentally
friendly and economically viable techniques. In this work, two-stage gas stripping was
assessed as an ecoefficient butanol recovery technique. Firstly, in a one-stage stripping
unit, three working variables (feed temperature, gas flow and refrigeration temperature)
were optimized via response surface methodology (RSM) to increase simultaneously
butanol selectivity (αB) and butanol recovery efficiency (ηB). After one-stage simple gas
stripping optimization (T feed = 60 °C, Gas flow = 1.34 L/min, T refrigeration = 5 °C and t
= 4 h), values of αB = 11.08 – 13.95 and ηB = 59 – 67% were reached, with a butanol
concentration in the condensate of 119 g/L (141 g/L ABE). These working conditions were
applied to two-stage gas stripping, and a butanol concentration of 300-360 g/L was
attained in the condensate of the second stripping, reaching a butanol selectivity (αB) of
7 – 8 and a butanol recovery (ηB) of 70 – 80%. This process could significantly reduce
energy consumption in the final butanol purification process. In addition, the resistance
of the ABE fermentation strain Clostridium beijerinckii CECT 508 to this technique was
assessed by subjecting the microorganism to various in situ gas stripping processes under
fed-batch conditions employing cheese whey as a substrate. Bacteria were negatively
affected by the stripping process, due to the high T feed (60 °C) but they were able to
recover and produce butanol again.
Keywords: gas stripping, butanol, ABE fermentation, Clostridium beijerinckii, response surface
methodology.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
167
Capítulo 7.
Díez-Antolínez R, Hijosa-Valsero M, Paniagua-García AI, Gómez X (2018) In situ two-stage gas

stripping for the recovery of butanol from acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation broths.
Chemical Engineering Transactions 64, 37-42. DOI: 10.1016/j.biortech.2012.07.062
168
7.1. Introduction
Biobutanol is not only an important commodity with capacity as a platform chemical.
Moreover, butanol is an advanced biofuel which overcomes most of the limitations of
ethanol as a biofuel. In this line, butanol has higher energy content, lower volatility,
lower hygroscopicity and it is less corrosive than ethanol (Taconi et al., 2009). It could
be even directly used in current internal combustion engines without any modification.
However, until now, ABE fermentation, the most common process to produce
biobutanol, is not economically competitive with petrochemical processes (Kumar and
Gayen, 2011). The high cost of traditional food feedstocks, together with the low titer,
yield and volumetric productivity of butanol in fermented broths, solvent toxicity and
the high cost of solvent recovery processes compromise its economic feasibility (Green,
2011).
To decrease the feedstock cost, the utilization of agrofood wastes with high polluting
potential is of great relevance. Interesting substrates for ABE fermentation are cheese
whey and cheese whey permeate (CWP) (Diez-Antolinez et al., 2016). On the other hand,
integrated fermentation with in situ product recovery is an effective way to reduce ABE
fermentation energy costs (Xue et al., 2012; 2014a). Among butanol recovery methods,
gas stripping has some advantages such as an easy operation, simple scale-up, low
capital investment and low energy cost (Kumar and Gayen, 2011; Xue et al., 2013,
2014a). However, gas stripping typically removes large amounts of water in the butanol
stream and requires a high energy input due to its lower selectivity in comparison with
other recovery techniques (Qureshi et al., 2005). To improve gas stripping efficiency,
coupling gas stripping to broths with butanol concentrations higher than 8 g/L;
concentration at which the condensate vapor has a butanol concentration higher than
its solubility in water (7.7%, w/w) - increases butanol concentration in the organic phase
of the condensate (Chen et al., 2014).
In this study, a central composite design with three independent variables (feed
temperature, gas flow and refrigeration temperature) was used to determine the
optimum combination of these working conditions to maximize the response variables
[butanol selectivity (αB) and butanol recovery efficiency (ηB)]. Moreover, a two-stage gas
169
Capítulo 7.
stripping was performed increasing significantly butanol concentration in the

condensate to reduce dewatering energy consumption and improving the energetic
efficiency of the overall recovery process. Besides, a simplified gas stripping unit was
coupled with fermentation of cheese whey by Clostridium beijerinckii CECT 508 to
enhance the fermentability and assess the effect of gas stripping conditions on bacterial
development by performing two consecutive stripping processes on the same
fermentation broth.
7.2. Material and Methods

7.2.1. Media and culture
Two different feed media solutions were tested: a) a synthetic aqueous solution
containing 5 g/L acetone, 10 g/L butanol and 1.67 g/L ethanol (A:B:E, 3:6:1) and b) a real
fermentation broth containing bacteria. These broths were obtained by fermenting
sheep cheese whey with an initial lactose concentration of 40 g/L, using Clostridium
beijerinckii CECT 508, as described by Díez-Antolínez et al. (2016).
7.2.2. Gas-stripping optimization

The gas stripping system including a double-cooling coil Dimroth condenser (400 mm
length and 1,135 cm2 surface area (Pobel, Madrid, Spain)) for vapour condensation,
pumps and storage vessels was connected to a screw-capped bottle (1 L) (Figure 7.1).
The gas flow was controlled by a manually adjustable rotameter (Key Instruments,
Brooks Instruments, Hatfield, PA, USA). The feed solution consisted of a 500-mL aqueous
solution (5 g/L acetone, 10 g/L butanol, 1.67 g/L ethanol) placed in a 1-L glass bottle
containing a magnetic stirrer. The bottle was closed with a special cap which enabled
the entrance of a temperature probe, a submerged metal stone diffuser for the entrance
of the stripping gas and a stripping gas exit over the surface of the solution. The bottle
was placed on a heating-stirring plate with controllable temperature. The whole gas
circuit was purged during 2 min with industrial N2 to replace atmospheric air. Then, the
gas flow was fixed with a rotameter and the internal N2 was continually recirculated with
a pump. The refrigeration temperature of the condensation system was controlled with
a thermostat LAUDA Integral T 2200 using a monoethylene glycol/water mixture
170
(LAUDA, Lauda-Königshofer, Germany). After 15 min of stabilization, the gas stripping

experiment was started. For each experimental run, the duration of the stripping was
initially fixed in 18 h.
Figura 7.1. Setup diagram of the gas stripping system used in the experiments
A central composite design with three independent variables (feed temperature, gas
flow and refrigeration temperature) was used to determine the optimum combination
of these working conditions to maximize the response variables (butanol selectivity (αB)
and butanol recovery efficiency (ηB)). The RSM design had 20 experiments and included
8 cube points, 6 central points and 6 axial points (α=1.68179). The responses measured
for each trial were introduced in the model to obtain three-variable quadratic
polynomial regression equations to estimate the response variables. These equations
were used to mathematically determine the values of the three independent variables
(T feed, Gas flow and T refrigeration) which maximized the response values (butanol
selectivity and butanol recovery). The response variables were calculated according to
Equations (1) (Lu et al., 2016) and (2), respectively:
𝛼⁄ = (ec. 7.1)
171
Capítulo 7.
𝜂 = × 100 (ec. 7.2)

where αi is the selectivity for metabolite i, xi is the mass ratio of metabolite i in the feed
solution, yi is the mass ratio of metabolite i in the condensate, ηi is the percentage
recovery efficiency for metabolite i, miC is the mass of metabolite i in the condensate
(expressed in g) and miF is the mass of metabolite i in the feed solution.
The final output of the RSM is an equation for each response variable, which is used to
estimate the most adequate values for the independent variables to maximize αB and
ηB. The estimated optimal working conditions were experimentally validated with a
synthetic aqueous solution and with a real fermentation broth. Moreover, the effect of
gas stripping on bacteria was assessed by performing two consecutive stripping
processes separated by a resting fermentation period where bacteria were kept at fed-
batch conditions. The optimal working conditions calculated with the RSM equations
were experimentally validated at various operation times (4 – 18 h). Besides, alternative
feed temperatures (35 °C) suitable for bacteria were also tested.
7.2.3. Two-stage gas-stripping

A second-stage gas stripping was applied to further concentrate butanol from the
aqueous phase formed in the condensate collected from the first-stage gas stripping.
The condensate obtained in the first-stage, with an organic phase consisting of ~ 60%
(w/w) butanol was stored and the aqueous phase with ~ 8% (w/w) butanol was
subjected to gas stripping again under the working conditions optimized according to
section 7.2.2.
7.2.4. Fed-batch fermentation system coupled

with gas-stripping
The best working conditions obtained with the synthetic aqueous medium were tested
with a fermentation broth. The feed solution was a 500-mL fermented cheese whey
sample containing 0.40 g/L residual lactose, 3.02 g/L acetone, 12.04 g/L butanol, 0.23
g/L ethanol, 0.99 g/L acetic acid and 1.15 g/L butyric acid, with a bacterial density of
7·108 cell/mL. The gas stripping started as explained in 7.2.2. A stripping time of 4 h was
the most suitable from preliminary tests. Additionally, the effect of gas stripping
conditions on C. beijerinckii CECT 508 was assessed. After a first stripping cycle, distilled
172
water and lactose were added to the fermentation to guarantee a total volume of 500
mL and a lactose concentration of ~40 g/L; yeast extract (0.5 g) was also supplemented.
When bacteria had reached again their stationary phase and produced ~10 g/L butanol,
a second stripping cycle was performed employing the same working conditions that
were used in the first cycle.

Aqueous samples were taken from the feed bottle before and after the gas stripping
process, and from the condensate after the stripping process. All volumes were
measured with a graduated cylinder. Synthetic aqueous solutions and the condensate
were directly analysed for ABE metabolite concentration. Samples from the real
fermentation broth were centrifuged at 13,000 rpm for 3 min in a microcentrifuge
(Minispin, Eppendorf, Hamburg, Germany) and their supernatant was filtered through a
0.20 µm nylon filter. Analyses by GC were carried out as described by Díez-Antolínez et
al. (2016).

For the optimization step, experimental designs following the Response Surface
Methodology (RSM) were generated and interpreted with the software Minitab 16
(Minitab Inc., State College, PA, USA).

7.3.1. Gas stripping optimization
The results of the RSM model showed that the optimal working conditions to maximize
butanol selectivity (αB) and recovery efficiency (ηB) were T feed = 60 °C, gas flow = 1.34
L/min, T refrigeration = 5 °C. The estimated responses for an 18-h gas stripping were
αB = 6.29; ηB = 94.56 %. The model was experimentally validated for various stripping
times (Table 1). The results were in accordance with literature, where feed temperatures
for gas stripping of 30 – 67 °C, refrigeration temperatures from -60 to 4 °C, and gas flow
rates of 1.25 – 15 L/min have been reported (Yang and Lu, 2013; Abdehagh et al., 2014).
It was observed that shorter stripping times increased selectivity (αB) without drastically
reducing recovery efficiency (ηB) (Table 7.1). It must be pointed out that the shortest
173
Capítulo 7.
stripping time (4 h) produced a condensate with a butanol concentration of 92 g/L,

which is above its solubility value in water, which implies the formation of two phases
(an aqueous and a butylic phase). The upper butylic phase represents about 10% of the
total volume and it usually contains 500 – 680 g/L butanol; and it can be easily separated
from the bottom aqueous phase, which contains 77 – 79 g/L butanol.
Tabla 7.1. Gas stripping performance indicators for a synthetic aqueous medium (5 g/L
A; 10 g/L B; 1.67 g/L E) under optimal RSM conditions. Operation conditions: T feed =
60 °C, Gas flow = 1.34 L/min, T refrigeration = 5 °C. A: Acetone, B: Butanol, E: Ethanol.
Recovery efficiency, η Concentration in
Selectivity, α
(%) condensate, (g/L)
Stripping
A B E A B E A B E
time (h)
18 1.74 3.61 3.64 41.6 84.6 87 9.41 34.71 6.34
10 3.66 5.52 5.32 59.2 86.8 86.6 19.23 51.32 9.46
4 6.28 10.36 7.74 51.3 79.8 64.2 32.55 92.14 13.69
It is worth mentioning that a feed temperature of 60 °C differs from the standard

fermentation temperature of solventogenic Clostridium species (35 – 37 °C). Therefore,
performing the gas stripping at T feed = 35 °C, keeping the other independent variables
fixed (Gas flow = 1.34 L/min, T refrigeration = 5 °C), was tested with synthetic aqueous
medium. However, butanol selectivity (αB) of 4.21 – 5.71 and butanol recovery
efficiencies (ηB) of 15.29 – 35.90%, depending on the stripping time, were obtained. As
a result, it was decided to work at T feed = 60 °C and experimentally assess the resistance
of bacteria to these conditions (see section 7.3.3).
7.3.2. Two-stage gas stripping

To further concentrate butanol from the aqueous phase generated in the condensate
collected from the first-stage gas stripping, a second gas stripping stage was applied to
that phase after separation. The dynamic variations of ABE concentration in the
condensate and the ABE recovery percentage are shown in Figure 7.2. After 4 – 5 h, the
second-stage gas stripping produced a highly concentrated condensate with 350 – 400
g/L butanol, whose butylic phase represented 61 – 66% volume and contained 477 g/L
butanol. A butanol recovery higher than 80% was attained at 5 h, with an acetone
recovery of 47% and an ethanol recovery of 61%. These results are in agreement with
174
other works which observed that solutions containing butanol concentrations near or
exceeding butanol solubility in water (~ 7.7%, w/w) and subjected to gas stripping result
in a significantly high concentrated butanol condensate, thus improving the energy-
saving potential of gas stripping for energy-efficient dewatering technologies (Xue et al.
2013; 2014a,b; Chen et al., 2014).
Figura 7.2. a) Dynamic evolution of ABE solvent concentration in the condensate during
second-stage gas stripping; b) Dynamic evolution of ABE solvents recovery during
second-stage gas stripping.
The optimal working conditions established with synthetic medium were tested with
cheese whey fermentation broth. According to the previous experiments, the selected
time for gas stripping was 4 h (Table 7.1). It must be noted that it was necessary to add
0.3 mL of an antifoaming agent to the solution before connecting the gas stripping. The
results of this experiment are given in Table 7.2 (First stripping cycle). A good selectivity
(αB = 11.08) and a high butanol concentration (119 g/L) were found in the condensate.
Once more, this butanol concentration was above its solubility limit in water and two
phases could be separated. The upper butylic phase represented 7% of the total
condensate volume with concentrations of 661.5 g/L butanol, 13.4 g/L acetone and 7.6
g/L ethanol, whereas the bottom aqueous phase represented 93% of the total
condensate volume and its concentrations were 77.1 g/L butanol, 14.1 g/L acetone and
2.2 g/L ethanol.
175
Capítulo 7.
Tabla 7.2. Gas stripping performance indicators for the fermentation broth (cheese
whey with C. beijerinckii CECT 508). Stripping conditions T feed = 60 °C, Gas flow = 1.34
L/min, T refrigeration = 5 °C, t = 4 h. Initial concentrations (1st stripping): 3.02 g/L A;
12.04 g/L B; 0.23 g/L E. Initial concentrations (2nd stripping): 4.71 g/L A; 9.63 g/L B; 0.29
g/L E. A: Acetone, B: Butanol; E:Ethanol.
Recovery efficiency, η Concentration in condensate,
Selectivity, α
(%) (g/L)
Cycle Nº A B E A B E A B E
1st stripping
4.65 11.08 9.32 27.60 59.29 55.83 13.89 118.9 2.14
cycle
2nd stripping
4.79 13.95 17.11 25.41 66.97 91.99 22.16 119.43 4.94
cycle
The effect of gas stripping conditions (particularly T feed = 60 °C) on bacterial

development was assessed by performing two consecutive stripping processes on the
same fermentation broth. Therefore, after the first 4-h stripping process, the circuit was
closed and the feed was supplemented as explained in section 7.2.4. Despite the
extreme temperature, bacteria could recover and produce butanol again (9.6 g/L were
attained). Afterwards, a second 4-h stripping was run. Table 7.2 and Figure 7.3 show the
results of these stripping/resting cycles. It was corroborated that bacteria were
negatively affected by this high temperature (mortality ~ 85%) and the time to reach
again the stationary phase after nutrient addition was 6 – 7 days. Nevertheless, bacteria
could recover and produce butanol titers of 9.6 g/L. Under the tested conditions,
stripping offered good selectivity and recovery efficiency values (αB: 10 – 14; ηB: 59 – 80
%), for both synthetic media and fermentation broths. Butanol selectivity values of 5.6
– 23 have been reported in model solutions (Ezeji et al., 2005; Yang and Lu, 2013;
Qureshi et al., 2014) and 4 – 31 in fermentation broths (Qureshi and Blaschek, 2001;
Ezeji et al., 2005). This work agrees with publications reporting condensates with 151
g/L butanol, which could be phase-separated to get an organic phase with 445 – 610 g/L
butanol (Xue et al., 2012; Rochón et al., 2017). Others, on the contrary, reported lower
butanol concentrations between 66 – 76 g/L in the condensate (Cai et al., 2016).
176
Figura 7.3. Evolution of ABE fermentation by C. beijerinckii in a fed-batch system with

cheese whey during two gas stripping/resting cycles. Stripping conditions T feed = 60 °C,
Gas flow = 1.34 L/min, T refr = 5 °C, t = 4 h.
On the other hand, the optimal feed temperature (60 °C) was not very appropriate for
bacterial growth, and cells needed 6-7 days to recover after applying stripping. However,
Xue et al. (2012) reported that the asporogenic mutant C. acetobutylicum JB200 was
successfully subjected to eight gas stripping periods with six feeding cycles over 326 h,
keeping butanol concentrations of 6 – 13 g/L in the broth. These data differ significantly
from our results with C. beijerinckii CECT 508, which needs longer recovery times.
7.4. Conclusions
Process parameters of gas stripping, including feed temperature, gas flow rate and
refrigeration temperature, were crucial for butanol recovery. A two-stage gas stripping
process was proven as an efficient technique to obtain a highly concentrated butanol
stream, attaining 350 – 400 g/L butanol in the condensate, with a concentration of 477
g/L of butanol in the organic phase. This contributes to reducing energy consumption
for dewatering in a final butanol purification process. Besides, the resistance of
Clostridium beijerinckii CECT 508 to gas stripping was assessed and, although bacteria
were negatively affected by the stripping process (T feed = 60 °C), they could recover
and produce butanol again.
177
Capítulo 7.
Acknowledgments
The present work was performed as part of the H2020-LCE-2015 Waste2Fuels project
(Sustainable production of next generation biofuels from waste streams - GA-654623),
funded by the European Union’s Horizon 2020 Research and Innovation Programme.
MH-V is supported by a postdoctoral contract (DOC-INIA, grant number DOC 2013-010)
funded by the Spanish Agricultural and Agrifood Research Institute (INIA) and the
European Social Fund. Authors thank R. Antón, N. del Castillo and G. Sarmiento for their
technical help.
References
Abdehagh N., Tezel, F.H., Thibault, J., 2014, Separation techniques in butanol production:
Challenges and developments, Biomass and Bioenergy 60, 222-246.
Cai D., Chen, H., Chen, C., Hu, S., Wang, Y., Chang, Z., Miao, Q., Qin, P., Wang, Z., Wang., J., Tan,
T., 2016, Gas stripping–pervaporation hybrid process for energy-saving product recovery
from acetone–butanol–ethanol (ABE) fermentation broth, Chemical Engineering Journal
287, 1-10.
Chen Y., Ren H., Liu D., Zhao T., Shi X., Cheng H., Zhao N., Li Z., Li B., Niu H., Zhuang W., Xie J.,
Chen X., Wu J., Ying H., 2014, Enhancement of n-butanol production by in situ butanol
removal using permeating–heating–gas stripping in acetone–butanol–ethanol
fermentation, Bioresource Technology 164, 276-284.

supplementation on biobutanol production from cheese whey by ABE (acetone–butanol–
ethanol) fermentation. Chemical Engineering Transactions 49, 217–222, DOI:
10.3303/CET1649037.
Ezeji T.C., Karcher, P.M., Qureshi, N., Blaschek, H.P., 2005, Improving performance of a gas
stripping-based recovery system to remove butanol from Clostridium beijerinckii
fermentation, Bioprocess and Biosystems Engineering 27, 207-214.
Green E.M., 2011, Fermentative production of butanol: the industrial perspective, Current
Opinion in Biotechnology 22, 1-7.
Kumar M., Gayen K., 2011, Developments in biobutanol production: New insights, Applied
Energy 88, 1999-2012.
178
Lu K.M., Chiang Y.S., Wang Y.R., Chein R.Y., Li S.Y., 2016, Performance of fed-batch acetone-
butanol-ethanol (ABE) fermentation coupled with the integrated in situ extraction-gas
stripping process and the fractional condensation, Journal of the Taiwan Institute of
Chemical Engineers 60, 119–123.
Qureshi N., Blaschek, H.P., 2001, Recovery of butanol from fermentation broth by gas stripping,
Renewable Energy 22, 557-564.
Qureshi N., Hughes S., Maddox I. S., Cotta M. A., 2005, Energy-efficient recovery of butanol from
model solutions and fermentation broth by adsorption, Bioprocess and Biosystems
Engineering 27(4), 215-222.
Qureshi N., Singh, V., Liu, S., Ezeji, T.C., Saha, B.C., Cotta, M.A., 2014, Process integration for
simultaneous saccharification, fermentation, and recovery (SSFR): Production of butanol
from corn stover using Clostridium beijerinckii P260, Bioresource Technology 154, 222-
228.
Rochón E., Ferrari, M.D., Lareo, C., 2017, Integrated ABE fermentation-gas stripping process for
enhanced butanol production from sugarcane-sweet sorghum juices, Biomass and
Bioenergy 98, 153-160.
Taconi K.A., Venkataramanan K.P., Johnson D.T., 2009, Growth and solvent production by
Clostridium pasteurianum ATCC® 6013™ utilizing biodiesel‐derived crude glycerol as the
sole carbon source, Environmental Progress & Sustainable Energy 28(1), 100–110.
Xue C., Zhao, J., Lu, C., Yang, S.-T., Bai, F., Tang, I.-C., 2012, High-titer n-butanol production by
Clostridium acetobutylicum JB200 in fed-batch fermentation with intermittent gas
stripping, Biotechnology and Bioengineering 109, 2746-2756.
Xue C., Zhao, J., Liu, F., Lu, C., Yang, S.-T., Bai, F.-B., 2013, Two-stage in situ gas stripping for
enhanced butanol fermentation and energy-saving product recovery, Bioresource
Technology 135, 396-402.
Xue C., Zhao, J.-B., Chen, L.-J., Bai, F.-W., Yang, S.-T., Sun, J.-X., 2014a, Integrated butanol
recovery for an advanced biofuel: current state and prospects, Applied Microbiology and
Biotechnology 98, 3463-3474.
Xue, C., Du, G. Q., Sun, J. X., Chen, L. J., Gao, S. S., Yu, Yang S.T., Bai, F. W., 2014b, Characterization
of gas stripping and its integration with acetone–butanol–ethanol fermentation for high-
efficient butanol production and recovery, Biochemical Engineering Journal 83, 55-61.
179
Capítulo 7.
Yang S.-T., Lu, C., 2013, Extraction-fermentation hybrid (extractive fermentation), In: Separation
and Purification Technologies in Biorefineries, Eds. Ramaswamy S., Huang, H.J., Ramarao,
B.V., John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, UK.
180
8. Conclusiones/ Conclusions
Conclusiones / Conclusions
Las principales conclusiones obtenidas de esta investigación sobre la “Producción eco-

sostenible de biocarburantes y bioproductos a partir de suero lácteo”, se recogen a
continuación:
Relativas a la producción de etanol a partir de permeado de suero lácteo industrial
1. El permeado de suero lácteo industrial concentrado es un sustrato de bajo coste

idóneo para la fermentación alcohólica. Se ha identificado la cepa K. marxianus
DSM 5422 como levadura hiperproductora de etanol utilizando permeado de
suero industrial crudo altamente concentrado, frente a cepas hiperporductoras
de etanol de la especie S. cerevisiae, como Ethanol Red®, sin la adición de
costosos suplementos nutritivos.
2. La combinación de procesos fermentativos de alta y muy alta densidad junto con

técnicas de inmovilización celular ha sido una exitosa aproximación a la
fermentación alcohólica a partir de permeado de suero. El uso de permeado de
suero bruto con concentraciones de lactosa de 170 – 190 g/L como sustrato de
fermentación, en condiciones de operación optimizadas, ha permitido obtener
rendimientos de fermentación del 95,5% sobre el valor teórico, con
productividades superiores a 1,80 g/L·h en procesos discontinuos con
microorganismos libres.
3. Se ha demostrado que la levadura K. marxianus DSM 5422 no sufre problemas

importantes de inhibición por sustrato hasta concentraciones de lactosa en el
permeado de suero superiores a 230 g/L, aunque el límite de concentracion de
trabajo se debe establecer en 190 g/L para evitar reducciones drásticas de la
productividad.
4. La levadura K. marxianus DSM 5422 fue inmovilizada con éxito por atrapamiento
en esferas de alginato a escala de laboratorio durante 12 días (288 horas) para
fermentar suero industrial concentrado. Se obtuvieron concentraciones medias
de etanol de 83,2 g/L, una productividad de etanol de 1,60 g/L·h y un
rendimiento de fermentación del 83,2%.
183
Capítulo 8.
5. La adsorción de la levadura K. marxianus DSM 5422 sobre soportes inertes,

utilizando permeado de suero industrial concentrado no suplementado como
sustrato, fue eficaz y estable, con rendimientos de fermentación superiores al
90%, alcanzando concentraciones finales de etanol en el caldo del 6% (v/v) con
un aprovechamiento total de la lactosa en cortos periodos de fermentación (44
horas), prolongados en procesos discontinuos repetitivos durante más de 40 días
(> 1.000 horas).
6. Entre los desafíos de este proceso destacan las bajas concentraciones finales de
etanol en el caldo, la baja tolerancia osmótica de las levaduras y los prolongados
tiempos de operación. Será necesario evaluar el desarrollo y rendimiento de la
configuración de fermentación planteada en procesos continuos en reactores de
biopelícula a escala experimental y demostrativa.
Relativas a la producción de butanol a partir suero lácteo de oveja
7. En el caso de la fermentación ABE, se ha comprobado que la adición y la

optimización del aporte de nutrientes al lactosuero son esenciales cuando se
utilizan cepas comerciales no modificadas genéticamente, como C. beijerinckii
CECT 508. El uso de herramientas de diseño experimental como Plackett-Burman
y MSR permite la optimización de estos procesos. Se han conseguido mediante
diseño experimental rendimientos producto-sustrato (YB/L) cercanos al teórico
con producciones de butanol de 8,9 g/L, utilizando lactosuero con
concentraciones de lactosa de 40 g/L.
8. La recuperación por gas-stripping en dos etapas es una técnica eficiente de

recuperación de butanol, que permite obtener concentraciones de 350 – 400 g/L
de butanol en el condensado y 477 g/L de butanol en la fase orgánica, lo que
reduce los costes de deshidratación.
9. Aunque la bacteria C. beijerinckii CECT 508 se ve negativamente afectada por el

proceso de gas-stripping cuando se trabaja a temperaturas de alimentación
184
elevadas, tiene la capacidad de recuperarse y producir nuevamente butanol. Con

este trabajo se ha conseguido producir butanol en procesos discontinuos con
buenos rendimientos.
10. En futuras investigaciones será necesario avanzar hacia configuraciones de

fermentación continuas con inmovilización bacteriana en reactores de
biopelículas integrados con recuperación in situ de solventes mediante gas-
stripping en dos fases para mejorar la productividad global de la fermentación
ABE, a escala experimental y demostrativa.
185
Capítulo 8.
The main conclusions obtained from this research related to the “Eco-sustainable
production of biofuels and bioproducts from whey” are summarized below:
Regarding the production of ethanol from industrial whey permeate
1. High lactose-loaded industrial whey permeate is a suitable low-cost substrate for

alcoholic fermentation. K. marxianus DSM 5422 has been identified as a
hyperproductive ethanol yeast strain using high-lactose loaded industrial cheese
whey permeate (CWP) in comparison to hyperproductive strains of the species
S. cerevisiae, as Ethanol Red®, without the addition of high-cost nutritional
supplements.
2. The combination of high and very-high-gravity (HG/VHG) fermentative processes

with cell immobilization techniques has been a successful approach to alcoholic
fermentation from cheese whey permeate. The use of raw CWP with lactose
concentrations between 170 and 190 g/L as fermentation substrate, under
optimized operating conditions, provided fermentation yields of 95.5% over the
theoretical value, with a productivity higher than 1.80 g/L·h in conventional
discontinuous fermentation.
3. It has been shown that the yeast K. marxianus DSM 5422 suffers serious
substrate inhibition problems with lactose concentrations in whey permeate
above 230 g/L, although the limit of the working concentration should be set at
190 g/L to avoid drastic reductions in productivity.
4. Immobilization of K. marxianus by entrapment in alginate spheres, optimized by

Response Surface Methodology (RSM), has been validated in continuous
processes at laboratory scale for 12 days (288 hours) with good performance
results. Average ethanol productions of 83.2 g/L, ethanol productivities of 1.60
g/L·h and fermentation yields of 83.2% have been reported.
5. The adsorption of the yeast K. marxianus DSM 5422 on inert supports, using non-
supplemented high lactose-loaded CWP, was effective and stable. Fermentation
yields greater than 90% were obtained, with titers of ethanol of 6% (v/v) and a
186
total use of lactose in short fermentation periods (44 hours) in repetitive

discontinuous processes, prolonged for more than 40 days (> 1,000 hours).
6. The main challenges of ethanol fermentation are the low final titer of ethanol in
the broth, the low osmotic tolerance of yeasts and the long operating times. It
will be necessary to evaluate the development and performance of the proposed
fermentation configuration in continuous processes in biofilm reactors at
experimental and demonstrative scale.
Regarding the production of butanol from sheep whey
7. In the case of ABE fermentation, it has been proven that the addition and
optimization of the nutrient intake to the whey are essential to improve ABE
fermentation with commercial non-genetically modified strains, such as C.
beijerinckii CECT 508. The use of experimental design tools such as Plackett-
Burman and RSM allows the optimization of these processes. Product-substrate
yields (YB/L) close to the theoretical value were obtained thanks to the
experimental design, with butanol titers of 8.9 g/L, using wheys with lactose
concentrations of 40 g/L.
8. The recovery by gas-stripping in two stages is an efficient technique to recover

butanol in line with the fermentation processes obtaining high concentrated
streams of 350 – 400 g/L of butanol in the condensate and 477 g/L of butanol in
the organic phase.
9. Although C. beijerinckii CECT 508 bacteria were negatively affected by gas-

stripping working at high temperatures in the feeding stream, the microorganism
was capable of recovery and kept butanol production.
10. In future research, it will be necessary to move towards continuous fermentation

configurations with bacterial immobilization in integrated biofilm reactors with
in line solvent recovery by gas-stripping in two phases to improve the overall
productivity of ABE fermentation, at experimental and demonstrative scale.
187
9. Anexos
Anexos
Anexo I. Estequiometría de las fermentaciones

alcohólica y ABE
Al final de cada experimento, se calcularon los parámetros cinéticos de la fermentación.
Aunque estos parámetros cinéticos no describen el proceso global, se utilizan de modo
generalizado para hacer una aproximación a la evaluación del proceso; asumiendo que,
a una mayor tasa de consumo inicial de sustrato, el sistema desarrollaría una mejor
velocidad de reacción, que repercutiría en tiempos más cortos del proceso general.
Fermentación Alcohólica
Para la fermentación alcohólica, el mecanismo de fermentación simplificado a partir de
lactosa es:
·H2O 4 + 4 CO2
Lactosa Etanol
Partiendo del mecanismo de reacción para la producción de etanol, el rendimiento

teórico de etanol en la fermentación se calcula de acuerdo a la ecuación:
1 𝑚𝑜𝑙 𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 4 𝑚𝑜𝑙 𝐶𝐻 𝐶𝐻 𝑂𝐻 46,02 𝑔 𝐶𝐻 𝐶𝐻 𝑂𝐻 𝑔 𝐶𝐻 𝐶𝐻 𝑂𝐻

× × = 0,538
342,3 𝑔 𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 1 𝑚𝑜𝑙 𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 1 𝑚𝑜𝑙 𝐶𝐻 𝐶𝐻 𝑂𝐻 𝑔𝐶 𝐻 𝑂 ·𝐻 𝑂
Fermentación Acetona-Butanol-Etanol (ABE)

La conversión de la lactosa en compuestos ABE mediante el metabolismo microbiano de
algunas especies de Clostridium es un proceso complejo. Sin embargo, las ecuaciones
estequiométricas del proceso de conversión de la lactosa se pueden obtener de la suma
de todas las etapas enzimáticas individuales involucradas en el proceso de producción
de biomasa y metabolitos (Napoli, 2009).
Las principales reacciones que tienen lugar en el proceso son (Napoli, 2009):
191
Capítulo 9.
Fase de Acidogénesis:
𝑀𝑊
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 + 3𝑁𝐻 + 3 𝐴𝑇𝑃 ⎯⎯⎯⎯ 3𝐶 𝐻 𝑂 𝑁+ 6𝐻 𝑂
𝑌
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 + 4 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 8 𝐴𝑇𝑃 + 4 𝐶 𝐻 𝑂 + 4 𝐶𝑂 + 8 𝐻
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 6 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 4 𝐶𝑂 + 4 𝐻
Fase de Solventogénesis:
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 4 𝐴𝑇𝑃 + 4 𝐶 𝐻 𝑂 + 4 𝐶𝑂
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂+2𝐶 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 4 𝐴𝑇𝑃 + 4 𝐶 𝐻 𝑂 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 6 𝐶𝑂 + 4 𝐻
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 2 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 4 𝐴𝑇𝑃 + 4 𝐶 𝐻 𝑂 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 6 𝐶𝑂 + 6 𝐻
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 4 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 4 𝐶𝑂
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂+ 2𝐶 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 4 𝐴𝑇𝑃 + 4 𝐶 𝐻 𝑂 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 6 𝐶𝑂 + 4 𝐻 + 𝐻 𝑂
𝐶 𝐻 𝑂 · 𝐻 𝑂+ 2𝐶 𝐻 𝑂 ⎯⎯⎯⎯ 4 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 2 𝐶 𝐻 𝑂 + 6 𝐶𝑂 + 4 𝐻 + 𝐻 𝑂
El rendimiento del proceso de bioconversión de la lactosa en butanol es bajo, con un

valor teórico en torno a 0,41 gbutanol/gsustrato.
Referencias:
Napoli F. Development of an integrated process for butanol production. Dottorato in Scienze
Biotecnologiche- XXII ciclo Indirizzo Biotechnologie Industriali. 2009. Universiy of Napoli
Federico II.
192
Anexos
Anexo II. Diseño Experimental

Metodología de Superficie de Respuesta
La Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) es una combinación de análisis de
regresión y diseño experimental, introducida por Box y Wilson en 1951. Se define como
un conjunto de técnicas matemáticas y estadísticas utilizadas para modelar y tratar
problemas en los que una respuesta de interés está influenciada por varios factores de
carácter cuantitativo. Es una estrategia para el diseño experimental, mediante una
experimentación secuencial y modelación de los resultados experimentales para
determinar un modelo matemático que conduce a la localización de condiciones
óptimas de operación para las variables independientes que maximizan, minimizan o
cumplen ciertas restricciones en la/s variable/s respuesta/s.
El diseño de superficie de respuesta planteado en este trabajo para todos los casos en
los que se aplica la metodología de superficie de respuesta (Capítulos 4, 5, 6 y 7) es un
diseño central compuesto (DCC) con 2K + 2K + 6 experimentos, donde K es el número de
factores. El DCC está formado por los siguientes tres términos: 1) una porción factorial
no replicada con dos niveles para cada factor (2K); 2) un conjunto de puntos axiales
constituidos por experimentos idénticos al punto central, excepto por un factor, que
asume valores por debajo y por encima de la mediana de los dos niveles factoriales (2K);
3) un punto central replicado 6 veces para mejorar la precisión experimental (6
experimentos). Los puntos axiales y centrales permiten experimentos con tres niveles
para cada variable independiente. Los niveles son −α, 0, α (donde α es la distancia del
origen al punto axial en unidades codificadas), pudiéndose estimar de este modo los
coeficientes cuadráticos. El valor de α equivale a α=nF1/4, donde nF es el número de
puntos en el diseño factorial.
Generalmente, la relación entre las respuestas y las variables independientes no es

conocida y no es lineal, por lo que se requiere de un modelo más complejo que aproxime
la relación funcional entre las respuestas (Y) y los factores independientes (xi). Las
respuestas se ajustan a un modelo cuadrático para estimar la respuesta de cada factor
con respecto al resto de factores independientes, de acuerdo con la ecuación:
193
Capítulo 9.
𝑌 =𝑏 +∑ 𝑏 𝑥 +∑ 𝑏 𝑥 +∑ ∑ 𝑏 𝑥 + 𝜀 (ec. A.II.1)
donde Y es el valor de la respuesta experimental; b0 es el coeficiente de intercepción; bi,

bii y bij son coeficientes constantes para los efectos lineal, cuadrático y de interacción,
respectivamente; xi es cada variable independiente (i) y ε es el error aleatorio.
Una vez que el polinomio de segundo orden ha sido ajustado a la respuesta, se examina
la forma de las curvas de superficie de respuesta y se determinan los máximos, los
mínimos o los puntos de silla que se encuentran en la región experimental seleccionada.
Para ello, se realiza un análisis canónico del modelo polinómico cuadrático predicho en
un enfoque matemático que permite ubicar el punto estacionario de la superficie de
respuesta y determinar si representa un punto máximo, mínimo o de silla de montar.
Para ello, el polinomio de aproximación de segundo orden se escribe de modo matricial:
^´ = 𝑏 + 𝑥 + 𝑥 𝐵 𝑥 (ec.A.II.2)
𝑌
donde el vector b está formado por los coeficientes de la parte lineal (efectos
principales) y la matriz B está formada por los coeficientes correspondientes a las
interacciones y los términos cuadráticos puros.
El máximo se calcula resolviendo el sistema dado por:

^
𝑑𝑌
= 𝑏 + 2𝐵𝑥 (ec. A.II.3)
𝑑𝑥
El punto estacionario está dado por:
𝑥 =− 𝐵 𝑏 (ec. A.II.4)
El análisis de varianza (ANOVA), la falta de ajuste y la importancia de la ecuación del

modelo se evalúan mediante el coeficiente de determinación (R2) y el valor p de la
prueba F. La prueba de significación estadística se basó en los criterios de error total con
un nivel de confianza del 95.0%. Cuanto más pequeño es el valor p, mayor es la
importancia del coeficiente correspondiente. La importancia de los factores y sus
efectos también se explica por la magnitud y el signo de los coeficientes. Los niveles
óptimos de valores independientes se analizaron utilizando la función de deseabilidad.
194
Anexos
Diseños de Plackett-Burman
El diseño de Plackett-Burman (PB) es un diseño de barrido o “screening”, que permite
identificar los principales factores al principio de la fase de experimentación, cuando no
se dispone de un conocimiento completo sobre el sistema. Es una metodología muy
eficiente para identificar un elevado número de factores con el menor número posible
de experimentos (Plackett y Burman, 1946).
En este diseño, cada factor se coloca a dos niveles y el número de experimentos debe
ser múltiplo de 4. Las variables pueden ser cualitativas o cuantitativas. Los niveles se
denominan -1 y +1, escribiéndose de modo simplificado como (-) y (+). Para la
construcción de la matriz para este diseño, la primera línea de signos viene dada y las
restantes se obtienen por permutaciones, a excepción de la última fila, en la que todos
los signos son negativos (-). En este diseño, los efectos principales tienen una compleja
relación de interacciones interefecto. Por ello, estos diseños deben utilizarse
fundamentalmente para estudiar los efectos principales cuando se supone que las
interacciones bidireccionales son insignificantes.
La principal ventaja de este diseño respecto a otros diseños de barrido es la completa

ortogonalidad entre las variables y el reducido número de experimentos trabajando con
un elevado número de factores (Peggs et al., 1999).
En este trabajo, mediante diseños de Plackett-Burman se evaluó el efecto de 11 factores

sobre la fermentación de suero a butanol (Capítulo 6). Entre los factores evaluados
estaban: los nutrientes esenciales adicionados al medio de fermentación (extracto de
levadura; KH2PO4; K2HPO4;; NH4Cl; MgSO4·7H2O; FeSO4·7H2O; cisteína), la concentración
del compuesto tamponador (CaCO3), la concentración inicial de lactosa, la adición de
lactosa suplementaria y la temperatura, para dos rangos de valores (máximo y mínimo),
con el objeto de determinar el rendimiento de fermentación, evaluado sobre las
respuestas, que eran concentración de butanol (g/L), rendimiento producto-sustrato
(YB/L, g/g) y tasa de consumo de lactosa (%). De todos los factores cuyos efectos sobre la
fermentación fueron analizados mediante el diseño PB, se seleccionaron los tres con un
mayor efecto significativo. Posteriormente se realizó un diseño MSR para optimizar los
factores.
195
Capítulo 9.
Referencias:
Box, G. E., & Wilson, K. B. (1951). On the experimental attainment of optimum
conditions. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological), 13(1), 1-38.
Dombek, K. M., & Ingram, L. O. (1986). Magnesium limitation and its role in apparent toxicity of
ethanol during yeast fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 52(5), 975-
981.
Peggs, G. N., Lewis, A. J., & Oldfield, S. (1999). Design for a compact high-accuracy CMM. CIRP
Annals-Manufacturing Technology, 48(1), 417-420.
Plackett, R. L., & Burman, J. P. (1946). The design of optimum multifactorial

experiments. Biometrika, 33(4), 305-325.
196
Anexos
Anexo III. Otras publicaciones científicas

A continuación, se enumeran otras publicaciones científicas de la doctoranda durante el
desarrollo de este trabajo de tesis en otras áreas temáticas distintas.
1. Hijosa-Valsero, M., Garita-Cambronero, J., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R.

(2019). A global approach to obtain biobutanol from corn stover. Renewable Energy.
https://doi.org/10.1016/j.renene.2019.12.026.
2. Paniagua-García, A. I., Hijosa-Valsero, M., Garita-Cambronero, J., Coca, M., & Díez-
Antolínez, R. (2019). Development and validation of a HPLC-DAD method for simultaneous
determination of main potential ABE fermentation inhibitors identified in agro-food waste
hydrolysates. Microchemical Journal, 150, 104147.
https://doi.org/10.1016/j.microc.2019.104147.

(2019). Tomato Waste from Processing Industries as a Feedstock for Biofuel
Production. BioEnergy Research, 12(4), 1000-1011. https://doi.org/10.1007/s12155-019-
10016-7.

(2018). Biobutanol production from coffee silverskin. Microbial Cell Factories, 17(1), 154.
https://doi.org/10.1186/s12934-018-1002-z.
5. Hijosa-Valsero, M., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2018). Industrial potato peel
as a feedstock for biobutanol production. New Biotechnology, 46, 54-60.
https://doi.org/10.1016/j.nbt.2018.07.002.
6. Paniagua-García, A. I., Hijosa-Valsero, M., Díez-Antolínez, R., Sánchez, M. E., & Coca, M.
(2018). Enzymatic hydrolysis and detoxification of lignocellulosic biomass are not always
necessary for ABE fermentation: The case of Panicum virgatum. Biomass and
Bioenergy, 116, 131-139. https://doi.org/10.1016/j.biombioe.2018.06.006.
7. Moreno, R., Martínez, E., Escapa, A., Martínez, O., Díez-Antolínez, R., & Gómez, X. (2018).
Mitigation of volatile fatty acid build-up by the use of soft carbon felt electrodes: evaluation
of anaerobic digestion in acidic conditions. Fermentation, 4(1), 2.
https://doi.org/10.3390/fermentation4010002.
8. Gómez, X., Meredith, W., Fernández, C., Sánchez-García, M., Díez-Antolínez, R., Garzón-
Santos, J., & Snape, C. E. (2018). Evaluating the effect of biochar addition on the anaerobic
197
Capítulo 9.
digestion of swine manure: application of Py-GC/MS. Environmental Science and Pollution

Research, 25(25), 25600-25611. https://doi.org/10.1007/s11356-018-2644-4.
9. Hijosa-Valsero, M., Paniagua-García, A. I., & Díez-Antolínez, R. (2017). Biobutanol

production from apple pomace: the importance of pretreatment methods on the
fermentability of lignocellulosic agro-food wastes. Applied Microbiology and
Biotechnology, 101(21), 8041-8052. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8522-z.
10. Malmierca, S., Díez-Antolínez, R., Paniagua, A. I., & Martín, M. (2017). Technoeconomic
study of biobutanol AB production. 1. Biomass pretreatment and hydrolysis. Industrial &
Engineering Chemistry Research, 56(6), 1518-1524.
https://doi.org/10.1021/acs.iecr.6b02943.
11. Malmierca, S., Díez-Antolínez, R., Paniagua, A. I., & Martín, M. (2017). Technoeconomic
study of biobutanol AB production. 2. Process design. Industrial & Engineering Chemistry
Research, 56(6), 1525-1533. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.6b02944.
12. Paniagua, A. I., Diez-Antolinez, R., Hijosa-Valsero, M., Sanchez, M. E., & Coca, M. (2016).
Response surface optimization of dilute sulfuric acid pretreatment of switchgrass (Panicum
virgatum L.) for fermentable sugars production. Chemical Engineering Transactions, 49,
223-228. https://doi.org/10.3303/CET1649038.
198

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TESIS DOCTORAL:

“Eco-sustainable production of biofuels from cheese whey”

Programa de Doctorado: “Ingeniería de Producción y Computación”

Directoras: Tesis Presentada por:

Por último, quiero agradecer a mi familia su apoyo incondicional, su paciencia y comprensión

Muchas gracias a todos.

Índice de Tablas ............................................................................................................................ IX

Resumen ..................................................................................................................................... XIV

Abstract ..................................................................................................................................... XVII

Abreviaturas / Abbreviations ..................................................................................................... XXI

1. Introducción y Antecedentes ................................................................................................ 1

1.1. Biocarburantes .................................................................................................................. 3

1.2. Suero lácteo....................................................................................................................... 5

1.3. Valorización del suero lácteo ............................................................................................ 7

1.4. Aplicaciones biotecnológicas del suero lácteo y el permeado de suero........................... 8

1.5. Fermentación de lactosa a etanol ..................................................................................... 9

1.5.1. Bioquímica de la fermentación alcohólica .................................................................. 12

1.5.2. Fermentación de alta o muy alta densidad ................................................................. 15

1.6. Fermentación Acetona-Butanol-Etanol (ABE) ................................................................. 16

1.6.1. Bioquímica de la fermentación ABE ............................................................................ 18

1.7. Configuración de fermentación....................................................................................... 24

1.7.1. Fermentación discontinua o “por lotes” ..................................................................... 25

1.7.3. Fermentación continua ............................................................................................... 27

1.7.3.1. Bioprocesos continuos con inmovilización celular .................................................. 29

1.8. Recuperación de solventes ............................................................................................. 34

1.8.1. Destilación ................................................................................................................... 35

1.8.2. Arrastre de vapor o gas-stripping................................................................................ 36

1.8.3. Extracción Líquido-Líquido (L-L) .................................................................................. 39

1.8.4. Pervaporación ............................................................................................................. 40

1.8.5. Perstracción ................................................................................................................. 42

2. Objetivos y Estructura ......................................................................................................... 65

2.1. Objetivos ......................................................................................................................... 67

2.1.1. Objetivos específicos ................................................................................................... 67

2.2. Estructura de la tesis ....................................................................................................... 68

3. Materiales y Métodos ......................................................................................................... 71

3.1. Suero lácteo..................................................................................................................... 73

3.2. Microorganismos y condiciones de cultivo ..................................................................... 75

3.3. Pretratamiento del lactosuero ........................................................................................ 78

3.4. Descripción de los sistemas de fermentación ................................................................. 78

3.4.1. Fermentación discontinua o por lotes ........................................................................ 78

3.4.2. Fermentación continua. Inmovilización celular .......................................................... 82

3.4.2.1. Inmovilización por atrapamiento en geles de alginato cálcico ............................... 82

3.4.2.2. Inmovilización por adsorción .................................................................................. 83

3.5. Recuperación de solventes ............................................................................................. 85

3.5.1. Optimización del gas-stripping .................................................................................... 85

3.5.2. Gas-stripping en dos etapas ........................................................................................ 87

3.5.3. Fermentación semicontinua con recuperación de solventes in situ mediante gas-

3.6. Métodos de Análisis ........................................................................................................ 88

3.6.1. Determinación de metabolitos principales y secundarios .......................................... 88

3.6.2. Determinación del crecimiento celular ....................................................................... 89

3.6.3. Determinación de aniones y cationes ......................................................................... 89

3.6.4. Determinación de proteína ......................................................................................... 90

3.6.5. Caracterización morfológica........................................................................................ 91

3.7. Parámetros de seguimiento y control de las fermentaciones ........................................ 92

3.8. Análisis estadístico .......................................................................................................... 93

4. Very high gravity fermentation of non-supplemented cheese whey permeate (CWP) by

4.2. Material and methods ..................................................................................................... 99

4.2.1. Microorganisms and culture conditions...................................................................... 99

4.2.3. Cheese whey and fermentation media ..................................................................... 100

4.2.4. Analytical methods .................................................................................................... 100