________________________________________________________Revista Científica, FCV-LUZ / Vol.

XIV, Nº 4, 297 - 302, 2004

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE,

UTILIZANDO Lactobacillus helveticus EN CULTIVO CONTINUO
Production of Lactic Acid from Milk Whey Using Lactobacillus helveticus
in Continuous Culture

1 2 2 2 2 2
Lauris Urribarrí , Alex Vielma , Gisela Paéz , José Ferrer , Zulay Mármol y Eduardo Ramones
1
Departamento de Química, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia. Apartado 526. Maracaibo 4001-A,
2
Edo. Zulia, Venezuela. E-mail: lkurribarri@hotmail.com. Departamento de Ingeniería Bioquímica, Escuela de Ingeniería Química,
Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia, Apartado 526. Maracaibo 4001-A, Edo. Zulia, Venezuela.

RESUMEN ABSTRACT

Se estudió el cultivo continuo de la bacteria Lactobacillus helve- The continuous culture of the bacterium Lactobacillus
ticus ATCC 8018 en suero de leche desproteinizado y suple- helveticus ATCC 8018 was studied on deproteinized whey
mentado con 20 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de pepto- supplemented with 20 g/L yeast extract and 10 g/L tryptose
na trípsica de caseína, como una función de la tasa de dilución, peptone as a function of the dilution rate, (D) at pH 5.9 and
(D) a pH 5,9 y temperatura de 40°C, condiciones adecuadas de temperature of 40°C, suitable conditions previously determined
crecimiento del microorganismo previamente determinadas en from batch culture. A biorreactor BioFlo 4000 was used with a
cultivo por carga. Se utilizó un biorreactor BioFlo 4000 con un work volume of 4 L and automatic controls of the feeding and
volumen de trabajo de 4 L y controles automáticos de los flujos extraction flows, temperature, pH and speed of agitation. The
de alimentación, extracción, temperatura, pH y velocidad de agi- dilution rate was varied between 0.05 and 0.4 h-1. The whey
tación. La tasa de dilución se varió entre 0,05 y 0,4 h-1. Se ca- was characterized, and its contents of lactose, nitrogen,
racterizó el suero de leche, determinando su contenido de lacto- proteins, phosphorus and pH, evaluated. The maximum
sa, nitrógeno, proteínas, fósforo y pH. A partir del cultivo conti- specific growth rate (µmax= 0.469 ± 0.012 h-1), the saturation
nuo se determinó el valor de la tasa específica de crecimiento constant (Ks= 0.064 ± 0.004 Kg/m3) and the true yield
máximo, (µmax= 0,469 ± 0,012 h-1), la constante específica de (Yc= 0.759 ± 0.061 Kg of biomass produced/Kg of lactose
consumo de sustrato, (Ks= 0,064 ± 0,004 Kg/m3), y el rendi- consumed for growth) were determined from the continuous
miento real (Yc= 0,759 ± 0,061 kg de biomasa producido/ kg de culture experiments. The maximum concentrations of biomass
lactosa consumido para crecimiento). La máxima concentración and lactic acid were 55 and 10.97 kg/m3 at D= 0.1 h-1,
de biomasa y ácido láctico fue de 55 y 10,97 kg/m3 respectiva- respectively. The maximum productivities of biomass and lactic
mente y se alcanzaron a D= 0,1 h-1. La máxima productividad acid were 6.2 and 1.83 kg/m3.h, respectively at D= 0.2 h-1.
de biomasa y ácido láctico fue 6,2 y 1,83 kg/m3.h respectiva- These results reveal and suggest the potential use of whey as
mente a D= 0,2 h-1. Estos resultados revelan y sugieren el po- a substrate for homolactic bacteria.
tencial uso del lactosuero como sustrato para bacterias homo-
lácticas. Key words: Whey, Lactobacillus helveticus, continuous
culture, lactic acid.
Palabras clave: Suero de leche, Lactobacillus helveticus, cul-
tivo continuo, ácido láctico.
INTRODUCCIÓN

La preocupación pública por el control de la polución

ambiental ha incitado la búsqueda de la más conveniente, eco-
nómica y eficiente forma de aprovechamiento de los subpro-
ductos de la industria láctea, antes de ser desechados [5, 13].
Recibido: 17 / 06 / 2003. Aceptado: 20 / 04 / 2004.

297
Producción de ácido láctico a partir de suero de leche / Urribarrí, L. y col.___________________________________________________

El suero de leche es el subproducto más abundante de Desproteinización y suplementación del suero de leche
la industria láctea, es el residual obtenido de la manufactura Para desproteinizar el suero de leche se le aplicó un tra-
del queso. Este subproducto es de difícil aceptación en el mer- tamiento térmico, en un autoclave (Felisa, México D.F) a
cado, ya que sus características no lo hacen apto para su co- 115°C durante 20 minutos. Luego se enfrió durante 24 horas a
mercialización directa como suero líquido [12]. Debido a esto, 4°C, se decantó para remover las proteínas precipitadas y se
el lactosuero se trata mediante técnicas que permiten la ex- filtró con tierra diatomeas en papel filtro Whatman N° 40 [9].
tracción de sus componentes, tales como: la lactosa (3,3 - Posteriormente se suplementó con 20 g/L de extracto de leva-
6,0%) y proteínas (0,32 - 0,7%), que constituyen fuentes po- dura y 10 g/L de peptona trípsica de caseína [1, 9]. Todos los
tenciales para la alimentación humana; sin embargo, sólo una químicos utilizados como suplemento fueron de grado analíti-
parte del suero se utiliza para estos fines, ya que la mayor par- co. El pH se ajustó al valor deseado (5,9 o 6,8 según la fer-
te del lactosuero se convierte en un efluente altamente conta- mentación a realizar) con HCl 10N y se esterilizó en un auto-
minante cuando se vierte a los cuerpos de agua, debido a su clave a 115°C durante 20 minutos.
gran demanda biológica y química de oxigeno [10, 12] .
Los procesos de bioconversión surgen como una alterna- Métodos de análisis
tiva para el aprovechamiento de este desecho como sustrato
para el crecimiento de microorganismos capaces de producir Nitrógeno: El contenido de nitrógeno se determinó por el
sustancias, como el ácido láctico, ampliamente usado en la in- método de Kjeldahl [2].
dustria alimenticia, textil, farmacéutica y cosmética [10, 11, 15]. Proteínas: El contenido de proteínas se determinó como el
Entre los microorganismos empleados para la produc- porcentaje de nitrógeno multiplicado por el factor
ción de ácido láctico [1, 8, 16], el Lactobacillus helveticus 6,38 [2].
ATCC 8018, consume los nutrientes presentes en el suero, Lactosa: El contenido de lactosa se determinó utilizando
principalmente la lactosa, produciendo además del ácido lácti- el método espectrocolorimétrico de Dubois y co-
co pequeñas trazas de productos volátiles como ácido acético laboradores [6].
y dióxido de carbono, siendo capaz de convertir el 85 % de la
fuente de carbono suministrada en ácido láctico [3]. Fósforo: El contenido de fósforo se determinó mediante el
método espectrocolorimétrico del molibdo-vana-
La producción de ácido láctico y la determinación de los dato de amonio [2].
parámetros de crecimiento de Lactobacillus helveticus en culti-
vo continuo utilizando la lactosa del suero de leche como sus- Biomasa: La concentración de biomasa en el medio se de-
trato son los principales objetivos de esta investigación. terminó turbidimétricamente, midiendo la absor-
bancia de la muestra en un Spectronic 20 a una
longitud de onda de 490 nm [14].
MATERIALES Y MÉTODOS Ácido láctico: La concentración de ácido láctico fue determina-
da por cromatografía en fase gaseosa, emplean-
Microorganismo do un cromatógrafo Perkin Elmer, equipado con
El microorganismo utilizado en la presente investigación una columna capilar Carbowax, para ácidos gra-
fue la bacteria Lactobacillus helveticus ATCC 8018. Esta se sos, de 30 m de longitud y 0,25 mm de diámetro.
obtuvo de la American Type Culture Colection (ATCC), activa- La temperatura en el puerto de inyección fue de
da y mantenida en tubos de cultivo de 25x150 mm (200 g/L de 230°C, la del horno fue 137°C y la del detector
leche descremada, 5 g/L de extracto de levadura, 200 mL/L de fue 250°C [9]. Se empleó helio como gas porta-
jugo de tomate a pH 7 y completado con agua destilada [4]). dor a una presión de 5 psi. El volumen inyectado
Una vez sembrados, los tubos se incubaron aeróbicamente por análisis fue de 1 µL.
durante un lapso de 2 a 3 días a 37°C y posteriormente se al-
macenaron a 4°C hasta su utilización. Preparación del inóculo
Se preparó añadiendo a cada 100 mL de medio, 10 mL
Suero de leche de medio con el microorganismo activo. Posteriormente, se in-
cubó en una incubadora modelo INNOVA 4300 durante 12 ho-
El suero de leche utilizado fue suministrado por la empresa
ras, para garantizar el máximo crecimiento exponencial [9, 15].
VENELÁCTEOS ubicada en Santa Rosa de Agua en Maracaibo,
Edo. Zulia, Venezuela. Se utilizó suero de leche ácido, prove-
Cultivo por carga
niente de la última etapa de producción de queso ricota. Se
caracterizó midiendo nitrógeno, proteínas, fósforo, lactosa y Se realizaron cuatro cultivos por carga, por duplicado, a
pH [2, 6]. temperaturas de 40°C y 42°C y pH de 5,9 y 6,8 a 100 r.p.m,
utilizándo Tween 80 como antiespumante en una concentra-

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ción de 1 g/L [9] en un fermentador New Brunswick Scientific, dos están dentro de los rangos aceptables para suero de leche
modelo BioFlo 4000. Para iniciar las fermentaciones se inoculó [10] y además resultaron similares a los reportados por Ja-
el medio de cultivo con un volumen igual al 10% del volumen kymec y col. [9] y Quintero y col. [15] en los que se utilizó tra-
de trabajo de 4 L. Se midió la concentración de biomasa, la tamiento termo-ácido.
concentración de lactosa y de ácido láctico, cada hora hasta
alcanzar el máximo crecimiento logarítmico de biomasa, y así Cultivo por carga
determinar las condiciones adecuadas de crecimiento del mi-
En los cultivos por carga se observó fase de adaptación
croorganismo para emplearlas en el cultivo continuo.
rápida, como consecuencia de la adecuación previa del inócu-
lo al medio. A pH 5,9 y temperaturas de 40 y 42°C, el cultivo
Cultivo continuo
creció exponencialmente de 6 a 7 horas, mientras que a pH
Establecidas las condiciones de operación a partir del cul- 6,8 y temperaturas de 40 y 42°C la duración de esta fase fue
tivo por carga, se realizaron cinco (5) cultivos continuos por du- de 5 horas (FIGS. 1 a 4).
plicado a tasas de dilución entre 0,05 y 0,40 h-1, en un fermen-
En la TABLA II, se reportan los valores de la velocidad
tador New Brunswick Scientific, modelo BioFlo 4000. El pH 5,9
específica de crecimiento (µ), determinados a partir de la pen-
se controló automáticamente a través de la cónsola de control
diente de la curva logarítmica de la biomasa contra el tiempo
del fermentador, con soluciones de HCl y NaOH 10 N, suminis-
en la región de crecimiento exponencial, a cada una de las
tradas por dos bombas peristálticas del equipo. La temperatura
condiciones estudiadas. El mayor valor de velocidad específi-
se mantuvo constante a 40°C y la agitación en 100 r.p.m. Se
ca de crecimiento fue 0,376 h-1 a las condiciones de pH 5,9 y
utilizó un volumen de trabajo de 4 L con un inóculo del 10%.
temperatura 40°C; los valores de velocidad específica de cre-
Inicialmente se operó como un cultivo por carga; alcan- cimiento obtenidos indican que el pH es el factor determinante
zada la fase de crecimiento exponencial (8 horas después de para el crecimiento del microorganismo.
la inoculación) se comenzó a bombear medio fresco al fermen-
En el cultivo por carga a pH 5,9 y temperatura 40°C se de-
tador y a extraer el producto obtenido.
tectó ácido láctico, siendo la mayor concentración obtenida de
Una vez alcanzado el estado estacionario, donde la con- 13,02 kg/m3. La máxima velocidad específica de crecimiento y la
centración de biomasa es constante (aproximadamente al concentración de ácido láctico obtenidas definen a estas condi-
transcurrir 3 veces el tiempo de retención), se midió la concen- ciones como las adecuadas para utilizarlas en el cultivo continuo.
tración de biomasa, lactosa y ácido láctico finales.
En la TABLA III, se reportan las concentraciones y pro-
ductividades de ácido láctico en cultivo por carga para las con-
RESULTADOS Y DISCUSIÓN diciones que se consideraron adecuadas para el crecimiento
del microorganismo en este y otros estudios.

Composición del suero de leche Puede observarse que la concentración de ácido láctico
producida en este estudio, 13,02 kg/m3, usando Lactobacillus
La caracterización del suero de leche fresco y desprotei- helveticus, fue superior a la obtenida por Jakymec y col. [9],
nizado se presenta en la TABLA I. 1,65 kg/m3, utilizando Lactobacillus bulgaricus, considerado
como el mayor productor de ácido láctico [3, 7], tal diferencia
Se observa un ligero incremento en la concentración de
es explicable por la falta de control del pH en este último tra-
lactosa y fósforo una vez efectuada la desproteinización, mien-
bajo, ya que es sabido que los productos de las fermentacio-
tras que el porcentaje de nitrógeno y proteínas disminuyeron
nes promueven condiciones adversas que inhiben las funcio-
en un 42,86% y 43,28%, respectivamente. Los valores obteni-

TABLA I
CARACTERIZACIÓN DEL SUERO DE LECHE

Parámetros Suero de leche fresco Suero de leche desproteinizado*

x±s x±s
3
Lactosa (kg/m ) 44,20 0,1290 44,93 0,1290
Nitrógeno (%) 0,21 0,0050 0,12 0,0104
Proteínas (%) 1,34 0,0032 0,76 0,0048
Fósforo (%) 0,34 0,0221 0,35 0,0010
pH 5,45 0,0023 5,97 0,0098
X: valor promedio. *Suplementado y ajustado su pH a 5,9.

299
 Producción de ácido láctico a partir de suero de leche / Urribarrí, L. y col.___________________________________________________

50 50 25 50
45
45 45
40 20

Biomasa (kg/m3)
Biomasa (kg/m 3 )

35

Lactosa (kg/m3 )
Lactosa (kg/m3)
40 40
30 15
25 35 35
20 10
15 30 30
10 5
25 25
5
0 20 0 20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo (h) Tiempo (h)
Biomasa Lactosa Biomasa Lactosa

FIGURA 1. CRECIMIENTO EN CULTIVO POR CARGA DE FIGURA 2. CRECIMIENTO EN CULTIVO POR CARGA DE
Lactobacillus helveticus EN SUERO DE LECHE A pH 5,9 Y Lactobacillus helveticus EN SUERO DE LECHE A pH 5,9 Y
T 40°C. T 42°C.
12 45
14 45

12 10
40 40

Biomasa (kg/m3)
Biomasa (kg/m3)

10

Lactosa (kg/m3)
8
Lactosa (kg/m3)

35 35
8
6
6 30 30
4
4
25 25
2 2

0 20 0 20
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo (h) Tiempo (h)
Biomasa Lactosa Biomasa Lactosa

FIGURA 3. CRECIMIENTO EN CULTIVO POR CARGA DE FIGURA 4. CRECIMIENTO EN CULTIVO POR CARGA DE
Lactobacillus helveticus EN SUERO DE LECHE A pH 6,8 Y Lactobacillus helveticus EN SUERO DE LECHE A pH 6,8 Y
T 40°C. T 42°C.

nes de los microorganismos. Por otro lado, la productividad de El rendimiento celular (Yc) se obtuvo a partir de la ecua-
ácido láctico en este estudio resultó comparable con la repor- ción que describe el balance de sustrato en el estado estacio-
tada por Roy y col. [16], quienes trabajaron a igual pH y tem- nario [14]. El rendimiento Yc (FIG. 7), representa la cantidad
peratura de 42°C. de sustrato que el microorganismo empleó para crecimiento y
no para funciones de mantenimiento, siendo éste 0,759 ± 0,01
kg biomasa/kg sustrato.
Cultivo continuo
Los parámetros de crecimiento del Lactobacillus helveti-
Se realizaron los cultivos contínuos, variando la tasa
cus se muestran en la TABLA IV y se calcularon aplicando el
de dilución (D) y manteniendo constante la concentración
modelo del quimiostato con requerimiento de energía de mante-
inicial de lactosa. En las FIGS. 5 y 6 se observan la concen-
nimiento, y la linearización de Lineweaver - Burke [14] (FIG. 8).
tración y productividad de biomasa, y la concentración y la
El valor obtenido de Ks supera en un orden de magnitud al re-
productividad del ácido láctico, respectivamente, para cada
portado por Jakymec y col. [9] (0,00127m3/ kg-h), lo que indica
una de las tasas de dilución empleadas (entre 0,05 y 0,4
que el Lactobacillus helveticus tiene mayor afinidad por el sus-
h-1). La concentración de la biomasa en el estado estaciona-
trato utilizado (lactosa) que el Lactobacillus bulgaricus.
rio aumenta progresivamente a medida que aumenta la tasa
de dilución hasta D= 0,1 h-1, alcanzándose la máxima con-
centración de biomasa de 55 kg/m3 y ácido láctico 10.97 CONCLUSIONES
kg/m3 para luego caer rápidamente hasta alcanzar la tasa
El suero de leche es un sustrato adecuado para la produc-
de lavado (0,47 h-1). La máxima productividad de biomasa y
ción de ácido láctico utilizando Lactobacillus helveticus, obtenién-
ácido láctico fue 6,2 y 1,83 kg/m3.h, respectivamente a las
dose altos valores de rendimiento real (Yc= 0,759± 0,061 kg bio-
0,2 h-1, por lo cual se consideró la tasa de dilución óptima.
masa producidos/kg de lactosa consumidos para crecimiento).

300
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TABLA II
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO (m) EN CULTIVO POR CARGA DE Lactobacillus helveticus EN SUERO DE
LECHE A DIFERENTES CONDICIONES DE pH Y TEMPERATURA

pH T (°C) µ(h-1) r
x±s
5,9 40 0,376 0,002 0,959
42 0,371 0,001 0,921
6,8 40 0,319 0,015 0,949
42 0,336 0,003 0,973

TABLA III
CONCENTRACIÓN Y PRODUCTIVIDAD DE ÁCIDO LÁCTICO EN CULTIVO POR CARGA

Concentración (kg/m3) Productividad (kg/m .h)

3
Microorganismo Fuente
(a) (b)
13,02 2,17 Lactobacillus helveticus Este estudio
©
– 2,70 Lactobacillus helveticus Roy y col. [16]
(d)
1,65 _ Lactobacillus bulgaricus Jakymec y col. [9]

60 7 12 2
1,8
6
P roductivida d (kg/m3.h)

P roductivida d (kg/m3.h)
50 10
1,6
5
Biomasa (kg/m3)

Ácido Láctico (kg/m3)

40 1,4
8
4 1,2
30 6 1
3
0,8
20 4
2 0,6
0,4
10 1 2
0,2
0 0 0 0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
D (1/h) D (1/h)
Biomasa Productividad Ácido Láctico Productividad

FIGURA 5. EFECTO DE LA TASA DE DILUCIÓN EN LA FIGURA 6. EFECTO DE LA TASA DE DILUCIÓN EN LA

CONCENTRACIÓN Y PRODUCTIVIDAD DE BIOMASA EN CONCENTRACIÓN Y PRODUCTIVIDAD DE ÁCIDO
EL ESTADO ESTACIONARIO DURANTE EL CULTIVO LÁCTICO EN EL ESTADO ESTACIONARIO DURANTE EL
CONTINUO UTILIZANDO Lactobacillus helveticus EN CULTIVO CONTINUO UTILIZANDO Lactobacillus
SUERO DE LECHE A pH 5,9 Y T 40°C. helveticus EN SUERO DE LECHE A pH 5,9 Y T 40°C.

Las condiciones óptimas para el crecimiento del Lacto- una tasa de dilución de 0,1 h-1. La máxima velocidad específica
bacillus helveticus son a 40°C y a pH 5,9. A estas condiciones de crecimiento en cultivo continuo fue µmáx= 0,469 h-1.
se obtuvo una concentración y una productividad de ácido lác-
La bacteria Lactobacillus helveticus presenta una gran
tico de 13,02 kg/m3 y 2,17 kg/m3.h, respectivamente.
afinidad por el suero de leche dado el valor de Ks= 0,064
El comportamiento del cultivo continuo con respecto a la ± 0,004 kg/m3 obtenido del cultivo continuo.
tasa de dilución evidencia el efecto de la energía de manteni-
miento a bajas tasas de dilución. El máximo valor de productivi- AGRADECIMIENTOS
dad de biomasa y de ácido láctico fue 6,2 kg /m3.h y 1,83
Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científi-
kg/m3.h respectivamente, se obtuvieron a una tasa de dilución
co y Humanístico (CONDES) por el financiamiento de dicha in-
óptima de 0,2 h-1. La máxima concentración de biomasa y ácido
vestigación.
láctico en el estado estacionario fue 55 kg /m3 y 10,97 kg/m3 a

301
Producción de ácido láctico a partir de suero de leche / Urribarrí, L. y col.___________________________________________________

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