TRABAJO PRÁCTICO Nº 3: MICROBIOTA NORMAL, AMBIENTAL

Y PATÓGENA
La microbiota humana es el conjunto de microorganismos que conviven con el hospedero en estado
normal sin causarle enfermedad, y que está en constante interacción con el sistema inmune. Su
composición es caracterís ca para la especie humana, tanto en el po de microorganismos que la
componen como en su número y distribución en el organismo. El cuerpo humano presenta una gran
superficie cutánea y mucosa que está en contacto con el medio ambiente y en donde existen
diversos sectores con diferentes caracterís cas de humedad, temperatura, pH y disponibilidad de
nutrientes, los cuales están colonizados por microorganismos de la microbiota.

La microbiota basal es la caracterís ca de cada sector del organismo y está cons tuida por bacterias
que siempre están presentes en dicho si o. Por ejemplo, Staphylococcus epidermidis en la piel. En
cambio, la microbiota transitoria es variable de un ser humano a otro y está compuesta por bacterias
que colonizan en forma intermitente un determinado sector. La microbiota transitoria de la piel
puede ser eliminada con el lavado de manos.

La microbiota normal representa un importante mecanismo de defensa del hospedero. Contribuye

al desarrollo de la respuesta inmunológica, como ha sido demostrado en modelos de animales
axénicos (nacen y son criados en condiciones estériles, y presentan un débil desarrollo de los
componentes de su sistema inmunitario). La microbiota normal, además, ayuda a evitar la
colonización de la piel o las mucosas por bacterias que pueden ser patógenas. Generalmente los
microorganismos para iniciar la infección deben primero colonizar los epitelios. Allí compiten con la
microbiota normal por factores tales como receptores celulares y nutrientes.

La colonización microbiana del individuo comienza con el nacimiento. Los primeros microorganismos
en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del área perineal, hacia la piel,
la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las microbiotas caracterís cas de éstas y otras áreas, se
desarrollan después y, probablemente, se derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.

1. Microbiota normal de la piel:

La piel del ser humano es un órgano extenso y heterogéneo con diferencias en su estructura y
condiciones ambientales, lo que determina diferencias en la densidad y composición de su
microbiota normal, según el área considerada. Además, la piel cons tuye mecanismo de defensa,
dado por el recambio celular con nuo de las capas superficiales del epitelio, el pH bajo debido a
metabolitos de las glándulas sebáceas y los macrófagos presentes. Dentro los microorganismos que
cons tuyen la microbiota normal de la piel, predominan las bacterias Gram posi vas. Esta
microbiota cutánea par cipa en el desarrollo de infecciones cuando se producen problemas que
implican la ruptura de la barrera cutánea, por ejemplo, cuando se colocan catéteres percutáneos.
Muchas infecciones como foliculi s o forunculosis enen origen en los folículos pilosos o glándulas.

Ejemplos bacterias:

 Staphylococcus epidermidis
  Propionibacterium acnes
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus (incluye grupo A)
 Peptococcus sp.

Levaduras:

 Candida albicans

2. Microbiota normal de la cavidad oral y faringe:

La microbiota oral es de po mixto, con asociación de bacterias aerobias y anaerobias. Las bacterias
que se adhieren a la superficie dental en forma permanente lo hacen por diferentes polímeros de
origen bacteriano como dextranos y levanos, sinte zados a par r de hidratos de carbono de la dieta.
La can dad de bacterias anaerobias es máxima en el surco gingival. Los dientes presentan superficies
de adherencia que enen la par cularidad de no renovarse periódicamente, como lo hacen los
epitelios. La microbiota de la cavidad oral además está involucrada en la patogenia de enfermedades
como las caries y la periodon s.

Con respecto al aparato respiratorio, este se divide en dos sectores anatómicos: alto y bajo. En el
individuo normal únicamente las vías respiratorias altas (fosas nasales y faringe) están colonizadas
por microbiota normal. Los senos paranasales, el oído medio, la tráquea, los bronquios pulmonares
y la pleura son estériles. La microbiota orofaríngea está implicada en infecciones pulmonares,
causadas por la aspiración de estos microorganismos en pacientes que enen alterados los reflejos
de defensa debido a alteraciones de la conciencia, etc.

Ejemplos:

 Bacteroides sp.
 Lactobacillus sp.
 Ac nomyces
 Bifidobacterium sp.
 Veillonella
 Peptococcus
 Staphylococcus epidermidis
 Haemophilus influenzae (40-80%)
 Streptococcus pneumoniae (20-40%)
 Candida albicans (levadura)
 Enterococcus sp.
 Micrococcus sp.
 Staphylococcus aureus
 Neisseria catarrhalis
3. Microbiota normal de la vagina:

Su composición depende del contenido estrogénico. El es mulo hormonal determina la proliferación

de las células epiteliales que aumentan su contenido de glucógeno. Este es u lizado por los
lactobacilos, siendo el ácido lác co el producto final del metabolismo, el cual provoca un descenso
importante del pH. La acidez resultante inhibe el crecimiento de muchas bacterias. La microbiota
vaginal protege frente a la infección vaginal, especialmente durante el embarazo y suministra la
microbiota normal al recién nacido.

Ejemplos:

 Lactobacillus sp
 Atopobium vaginae
 Peptostreptococcus spp.
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus spp.
 Bacteroides spp.
 Fusobacterium spp
 Prevotella sp.

4. Microbiota normal del tracto diges vo:

El tubo diges vo alberga un gran número de bacterias de la microbiota normal. También en este
nivel se pueden reconocer dis ntos nichos ecológicos. La microbiota normal intes nal contribuye a
la síntesis de vitaminas K y de vitaminas del complejo B, además de ayudar en los procesos
diges vos. También compiten con los microorganismos patógenos por los nutrientes y los
receptores; y elaboran bacteriocinas. Es en el colón donde se concentra el mayor y más complejo
ecosistema microbiano del organismo y se es ma que en él conviven más de 500 especies diferentes,
con predominio de las bacterias anaerobias. Allí la microbiota normal alcanza concentraciones de
107 a 109 bacterias/ml, llegando al máximo en el recto con 1011 bacterias/ml. Entre un 90-95% de
los microorganismos del intes no grueso son anaerobios obligados.

Ejemplos:

 Lactobacillus sp.
 Enterococcus sp.
 Bacteroides sp.
 Escherichia coli
 Klebsiella sp.
 Ac nomycetes sp.
 Proteus mirabilis
 Pseudomonas aeruginosa
 Alcaligenes faecalis
En otras zonas del cuerpo existen can dades menores de microorganismos, a menudo en tránsito
(resto del aparato diges vo y respiratorio, la vejiga y el útero). El hallazgo de microorganismos
patógenos en estos si os es altamente suges vo de enfermedad, pero no cons tuye una prueba.
En el otro extremo se encuentran ciertos tejidos y órganos que son normalmente estériles, en donde
la presencia de microorganismos se considera de importancia diagnós ca, por ejemplo: sangre,
líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido de cavidades estériles (sinovial, pleural, etc.) y los tejidos
profundos en general.

Zonas generalmente estériles:

 Hígado
 Vesícula
 Peritoneo
 Senos nasales, laringe y tráquea
 Oído
 Ojos
 Sangre
 Cerebro, meninges y líquido cefalorraquídeo
 Bronquios y pulmones

Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la microbiota y el hospedero; sin

embargo, este equilibrio puede romperse por:

- Aumento de la masa crí ca de los microorganismos.

- Traslado desde el si o original de los microorganismos.
- Ruptura de barreras mecánicas por trauma smos.

Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a una infección
endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas
enfermedades, como son:

- Deficiencia en el estado inmunitario del hospedero.

- Tratamiento inmunosupresor o con cor coides.
- Cirugías.
- Uso de an bió cos.
 PRUEBAS BIOQUÍMICAS

El Laboratorio de Microbiología ene un rol fundamental en la iden ficación de bacterias en una

muestra determinada. La observación directa de la muestra teñida con Gram entrega información
sobre su contenido bacteriano. Los cul vos permiten observar la morfología de las colonias
bacterianas en un medio determinado. Ambos estudios orienta vos se complementarán con los
análisis de iden ficación mediante baterías bioquímicas y de sensibilidad a agentes an microbianos.

Fisiotaxonomía bacteriana:
La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de las alteraciones
que producen en el medio de cul vo. Estas manifestaciones han permi do establecer diferencias
entre ellas, las que han sido u lizadas en su clasificación en diferentes géneros y especies.

Las técnicas de iden ficación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especies bacterianos
en base a la detección de:

Figura 11: Esquema de Técnicas de iden ficación Bioquímica.

En general, para cocáceas Gram (+) se u lizan fundamentalmente los dos úl mos métodos, en
cambio para bacilos Gram (-) se emplean los tres primeros. Estas pruebas se pueden realizar
mediante baterías en tubos convencionales o mediante sistemas comerciales más fáciles de
manipular (API).
PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COCÁCEAS GRAM POSITIVAS

TEST DE LA CATALASA

Buscar presencia de la enzima catalasa, que descompone H2O2 en H2O y O2. La enzima se encuentra
en la mayoría de las bacterias que con enen citocromo. La excepción es Streptococcus que no puede
descomponer el H2O2. Permite diferenciar: Staphylococcus de Streptococcus.

Test (+): aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos)

Precauciones: No tocar el agar sangre al tomar la colonia, ni usar asas microbiológicas, ya que dan
falsos posi vos.

TEST DE LA COAGULASA

Buscar presencia de enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus. La enzima es un

ac vador de fibrinógeno a fibrina. Además, la pared de la bacteria posee receptor de fibrinógeno
que permite la formación de puentes entre bacteria y bacteria. Diferencia: Staphylococcus aureus
de otros Staphylococcus coagulasa nega vo.

Se realiza en tubo con plasma de conejo o en lámina como test de aglu nación.

Test de aglu nación con par culas de látex: Se debe colocar una gota del reac vo látex sobre un
círculo de la tarjeta, a con nuación, la colonia sospechosa se emulsiona sobre la gota y se agita
durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera posi va. Siempre se debe
realizar un control nega vo que está incluido en el kit.

Precauciones: Tomar la muestra con puntas de plás co o con mondadientes. El fundamento de la

técnica se muestra en la figura 12.

Figura 12: Fundamento test de coagulasa.

Observación de Hemólisis

Buscar diferenciar por el po de ac vidad hemolí ca de diferentes Streptococcus. La hemólisis es la

destrucción de glóbulos rojos en la sangre contenida en Agar Sangre. Existen tres pos de hemólisis:

Hemólisis alfa: Destrucción parcial de glóbulos rojos, se observa un halo verdoso alrededor de las
colonias, producida por Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans y Streptococcus mutans.

Hemólisis beta: Destrucción total de glóbulos rojos, se observa un halo transparente o amarillento
alrededor de las colonias, es producida por Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalac ae.

Hemólisis gamma: Ausencia de hemólisis.

Figura 13: Tipos de hemólisis en agar sangre.

BACTERIAS PATÓGENAS

Bacterias que Infectan el Tracto Urinario:

Las infecciones del tracto urinario son las que se presentan en los riñones, la vejiga y la uretra, estas
pueden causar desde presencia de bacterias en la orina hasta una pielonefri s aguda. Las principales
bacterias que afectan este si o son Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y Escherichia coli, la
cual es la causante del 80% de estas infecciones.

Bacterias que Infectan la Piel:

Las infecciones de la piel se presentan principalmente en niños y en personas con algún po de

inmunosupresión, estas infecciones pueden deberse a un gran número de bacterias entre las que
destacan Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Mycobacterium leprae, Yersinia pes s,
entre otras.

Bacterias que Infectan el Tracto Respiratorio:

Las infecciones respiratorias son la principal causa de consulta y hospitalización de niños en el

mundo. Estas infecciones pueden desencadenar diversas manifestaciones secundarias como
rinofaringi s, faringoamigdali s, o s y neumonía. Estas infecciones pueden ser causadas por
diversas especies bacterianas como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Klebsiella
pneumoniae, entre otras.

Bacterias que Infectan el Tracto Gastrointes nal:

Las infecciones que afectan al tracto gastrointes nal son aquellas infecciones que pueden afectar
cualquier parte del tubo gastrointes nal, desde la boca al ano, siendo las manifestaciones más
comunes la diarrea, la gastroenteri s, disentería, úlceras, entre otras. Existen muchas bacterias
capaces de causar infecciones en este tracto tales como Salmonella enterica, Shigella sp.,
Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori y Escherichia coli, entre muchas otras.

Bacterias que Infectan el Sistema Nervioso:

Este sistema es el encargado de captar para luego procesar las señales a las que nos vemos expuestos
y responder a estas, los principales componentes del sistema nervioso central son el encéfalo y la
médula espinal, ambos recubiertos por una protección dura como lo son los huesos, y una blanda,
que serían las meninges. La principal manifestación de una infección en este sistema es la meningi s,
infección causada principalmente por Neisseria meningi dis.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

BATERÍA BIOQUÍMICA CONVENCIONAL

Una batería bioquímica es un conjunto de medios de cul vos diferenciales y selec vos, lo cuales nos
permi rán evidenciar diferentes reacciones bioquímicas y metabólicas. Estos medios, al ser
inoculados con la muestra problema, presentan diferentes resultados que, en conjunto, nos
permi rán llegar a la iden ficación de un género o especie bacteriana.

Los medios u lizados en una batería bioquímica son los siguientes:

Caldo Glucosado en Campana

Es un medio rico en nutrientes, y no con ene inhibidores del crecimiento bacteriano. El extracto de
carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno, mientras que la glucosa es el hidrato de
carbono. Por la fermentación de la glucosa, se produce ácido y gas, y éste úl mo se demuestra al
usar las campanas Durham.

Resultado

AG Presencia de gas atrapado en la campana, indica acidez del medio de cul vo por fermentación de glucosa,
hasta la formación de gas. Se lee Ácido-Gas.
A No hay presencia de gas en la campana. *En este caso se deben agregar 3 gotas del indicador Azul de
Bromo mol, si se produce un color amarillo se lee como Ácido.
- No hay presencia de gas en la campana. *En este caso se deben agregar 3 gotas del indicador Azul de
Bromo mol, si se produce un color verde o azulado se lee como Nega vo.

Agar Manitol con Rojo Fenol

Agar compuesto por manitol el cual es el carbohidrato de prueba y su fermentación se manifiesta

por un cambio de color del indicador rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo.

Resultado
+ El medio se toma color amarillo, hay fermentación del medio nutri vo y producción de acidez.
- Color rojo indica alcalinidad del medio.

Caldo Sorbitol con Rojo Fenol

La peptona de caseína proporciona al medio los nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. El sorbitol es el carbohidrato de prueba y su fermentación se manifiesta por un
cambio de color del indicador rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo.

Resultados
+ El medio se toma color amarillo, hay fermentación del medio nutri vo y producción de acidez.
- Color fucsia oscuro/rosado indica alcalinidad del medio.
Citrato de Simmons

Esta prueba, nos permi rá determinar si el microorganismo es capaz de u lizar el Citrato como única
fuente de carbono. Con ene el indicador Azul de Bromo mol.

Resultados
+ Color azul por u lización del Citrato como única fuente de Carbono, lo que produce una alcalinización del
medio, por liberación de Amonio.
- Color verde ya que no hay crecimiento ni acidificación, por no ser capaz de u lizar el Citrato como única
fuente de Carbono.

Caldo Urea

En el medio de cul vo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El cloruro de sodio man ene el balance osmó co, y el rojo de fenol es el indicador
de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y
dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo
al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa ac va la enzima ureasa, acelerando la velocidad
del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea.

Resultados

+ Color fucsia, ya que la bacteria posee Ureasa, metaboliza el sustrato y esto provoca alcalinidad del medio
al producir amoníaco.
- No hay cambio en el medio.

Caldo Corriente Luria Bertani

Este caldo u lizado para el crecimiento de bacterias en general con ene tripteína que aporta
grandes can dades de triptofano, el sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la
prueba del indol.

*Se agregan 10 gotas del reac vo de Kovacs.

Resultados
+ Anillo color fucsia en la parte superior del líquido. Indica producción de Indol, a par r de la metabolización
del triptofano.
- Anillo color café o amarillo, indica ausencia de Indol.

Agar Corriente Luria Bertani

En este agar podemos evidenciar las capacidades propias de la bacteria para producir pigmentos en
sus colonias.
 Resultados
+ Colonias bacterianas presentan alguna pigmentación.
- Colonias bacterianas no presentan pigmentación.

Caldo de Voges-Proskauer

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa

con producción de ácido por la vía ácido-mixta o con producción de un producto final neutro:
Ace lme lcarbinol (acetoína) por la vía butanodiólica.

*Se divide en 2 volúmenes iguales en dos tubos dis ntos:

Tubo 1) Producción de Ace lme lcarbinol (Reacción de Voges-Proskauer).

La aparición de un color rosado cons tuye una reacción posi va indicadora de la presencia de
acetoína, producto de la fermentación de la glucosa.

*Agregar 10 gotas de Alfa Na ol, luego 4 gotas de KOH al 40%. Agite y deje reposar por 15 minutos.

Resultados
+ Color rosado oscuro después de los 15 minutos, significa que hay presencia de ace lme lcarbinol.
- Color café o anaranjado indica que no hay producción de ace lme lcarnibol.

Tubo 2) Producción de acidez bajo pH 4,5 (Reacción Rojo de Me lo).

Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la fermentación de la

glucosa, cons tuye un resultado posi vo, una coloración amarilla cons tuye una reacción nega va.
*Agregar una gota del indicador Rojo de Me lo.

Resultados
+ Color rojo indica que la bacteria ha acidificado el medio hasta pH 4,5 o más bajo.
- Color café o naranja indica que la bacteria no fue capaz de acidificar el medio.

Agar TSI (Triple Sugar Iron)

Con ene 3 azúcares: Lactosa, Sacarosa y Glucosa y como indicador de pH Rojo Fenol. Después de 24
horas de incubación a 37°C, si la superficie (tendido) permanece rojo y la profundidad vira a amarillo
(K/A), se ha producido la fermentación de la glucosa (etapa anaeróbica de la glucólisis). Si tanto la
superficie como la profundidad viran al amarillo (A/A), se han fermentado los 3 azúcares. Si la
superficie y la profundidad viran al rojo (K/K) no se produjo fermentación de ningún azúcar.
 Resultado
K/A Color rojo en superficie y color amarillo en profundidad. Solo hay fermentación de Glucosa.
A/A Color amarillo en superficie y profundidad. Hay fermentación de los tres azúcares presentes.
K/K Color rojo en superficie y en profundidad. No se ha fermentado ningún azúcar.

Agar LIA (Lysine Iron Agar)

Si la bacteria no actúa sobre la Lisina, se produce la fermentación de la glucosa que con ene el
medio, virando el indicador Púrpura de Bromocresol al color amarillo en el fondo del tubo y el
tendido se man ene del mismo color (K/A). Si la bacteria descarboxila la Lisina, (reacción se produce
en medio ácido, posterior a la fermentación de la glucosa), se libera Cadaverina, que al ser un
compuesto alcalino neutraliza la acidez y hace que el indicador vire a un color púrpura intenso (K/K).

Resultados

K/K Color púrpura intenso en la superficie y en la profundidad.

K/A Color púrpura en la superficie, y amarillo en la profundidad.

Agar MIO (Mo lidad Indol Orni na)

Medio de cul vo semisólido, altamente nutri vo debido a la presencia de extracto de levadura,

peptona y tripteína. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la orni na es el sustrato para
la detección de la enzima orni na decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH,
que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.

Mo lidad

La mo lidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá
de la línea de inoculación.

Resultados
+ Alrededor del lugar de la picadura hay crecimiento bacteriano, se observa por turbidez de todo el medio.
- Crecimiento bacteriano se limita a la zona de la picadura, hay zonas cristalinas.

Orni na

La reacción posi va a la orni na está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación
de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH
púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez otorga condiciones óp mas para la
ac vidad de la enzima orni na decarboxilasa, la cual decarboxila la orni na presente. Por
decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.
 Resultados
+ Color púrpura del medio, indica alcalinización del medio.
- Color amarillo/anaranjado predominante indica acidez del medio.

Producción de H2S

La aparición de color negro en la siembra en profundidad en el medio TSI o LIA demuestra la

presencia de enzimas proteolí cas. El color negro se debe a la presencia de H2S que se produce en
la degradación del Tiosulfato de Sodio que con ene el medio. Al combinarse el Sulfuro de hidrógeno
con el indicador Citrato férrico amoniacal (LIA) o Sulfato Ferroso (TSI) que con ene el medio, se
forma en ausencia de oxígeno Sulfuro de Hierro, de color negro.

Resultados
+ Color negro en el fondo del tubo.
- Sin presencia de color negro en el tubo.
 Tabla 6: Resultados comunes a diferentes especies de bacterias Gram negativas.
Bacteria Glu Ma Sor Cit Ure Ind VP RM Pig TSI LIA Mot Orn H2S
Escherichia
AG + + - - + - + - A/A K/K (+) + -
coli
Shigella
A V - - - + - + - K/A K/A - - -
flexneri
Shigella
- - - - - + - + - K/A K/A - - -
dispar
Salmonella
A + + V - - - + - K/A K/K + - +
Typhi
Salmonella
AG - + + - - - - - K/A K/K + + +
Typhimurium
Citrobacter
AG + + + - - - + - A/A K/A + - (+)
freundii
Klebsiella
AG - + + + + + V - A/A K/K - - -
oxytoca
Klebsiella
AG + + + - - + - - A/A K/K - - -
pneumoniae
Enterobacter
AG + + + - - + - - A/A K/K + + -
aerogenes
Enterobacter
AG + - V - - (+) (-) - K/A K/K + + -
hafniae
Serratia
V + + + V - + (-) + K/A K/K + + -
marcescens
Serratia
A + - + V - + (-) + A/A K/K (+) + -
rubidae
Proteus
A - - V + + - + - A/A K/A + - +
vulgaris
Proteus
AG - - + + - (+) + - K/A K/A + + +
mirabilis
Pseudomonas
- - - + - - - - + K/K K/K + V -
aeruginosa
Alcaligenes
- - - - - - - - - K/K K/K + V -
faecalis

V = Variable
(+) = Generalmente positivo
(-) = Generalmente negativo
 API 10S:

El API 10S es un sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram
negativos, que utiliza 11 pruebas bioquímicas con sustratos deshidratados más una prueba con la
muestra utilizada crecida en agar corriente.

Tabla 7: Reacciones del API 10S e interpretación de resultados.

TEST REACCIONES POSITIVO NEGATIVO
ONP Presencia de la β-galactosidasa Amarillo Incoloro
G
GLU Fermentación / Oxidación glucosa Amarillo / Amarillo grisáceo Azul / Azul verdoso
ARA Fermentación / Oxidación arabinosa Amarillo Azul / Azul verdoso
LDC Presencia de lisina descarboxilasa Naranja Amarillo
ODC Presencia de ornitina descarboxilasa Rojo / Naranja Amarillo
CIT Utilización del citrato Azul verdoso / Azul Verde pálido / Amarillo
H2S Producción de H2S Depósito / Línea negra Incoloro / Gris
URE Presencia de la enzima ureasa Rojo / Naranja Amarillo
TDA* Presencia de triptófano desaminasa Marrón oscuro Cualquier otro color
IND* Producción de indol Rosado / Rojo Cualquier otro color
NO2* Producción de nitritos Rojo Amarillo / Azul
OX* Presencia de citocromo oxidasa Púrpura/Café Amarillo

*Algunos de estos test necesitan reactivos para su lectura:

TDA: agregue una gota del reactivo TDA en el bolsillo TDA.
IND: Agregue una gota del reactivo de James en el bolsillo IND.
NO2: Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el bolsillo GLU.
OX: Colocar directamente la muestra sospechosa en el extremo de una varilla que contiene un
reactivo oxidable. La reacción es positiva cuando aparece un color púrpura después de 1 min.

AGARES DIFERENCIALES PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS:

Agar Salmonella-Shigella (SS)

El agar Salmonella-Shigella es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada

por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas. Es
diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del
tiosulfato de sodio.

Los microorganismos fermentadores de lactosa acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador
de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Los microorganismos no
fermentadores de lactosa crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La
producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación
de sulfuro de hierro.
Tabla 8: Resultados del crecimiento bacteriano en agar Salmonella-Shigella.

Microorganismo Colonias

Salmonella Typhimurium Transparentes con centro negro

Shigella flexneri Transparentes

Shigella sonnei Transparentes

Escherichia coli Rosadas a rojas

Pseudomonas aeruginosa Transparentes tornando a naranjas, mucosas

Proteus vulgaris Transparentes, grandes y tendencia a los colores café

Proteus mirabilis Transparentes, grandes y con centro negro

Klebsiella oxytoca Rosadas cremosas

Klebsiella pneumoniae Rosadas, cremosas y mucosas

Agar Hektoen Entérico (HE)

El agar Hektoen Entérico contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de la microbiota comensal,
azul de bromotimol y fucsina ácida como indicadores de la fermentación de carbohidratos, y el
citrato de hierro como un indicador de la formación de H 2S a partir del tiosulfato.

Tabla 9: Resultados del crecimiento bacteriano en agar Hektoen entérico.

Microorganismo Colonias

Salmonella Typhimurium Verde-azuladas, con centro muy negro

Shigella flexneri Verdes, elevadas, húmedas

Shigella sonnei Verdes y elevadas

Escherichia coli Naranja brillante rodeadas por un precipitado biliar

Pseudomonas aeruginosa Verde azuladas claras, elevadas

Proteus vulgaris Verde-azuladas, con o sin centro negro

Proteus mirabilis Verde-azuladas, con o sin centro negro

 Klebsiella oxytoca Naranja claro rodeadas en algunas ocasiones por un precipitado biliar

Klebsiella pneumoniae Naranja claro rodeadas en algunas ocasiones por un precipitado biliar

Agar XLD

El agar XLD es utilizado principalmente para el aislamiento y la identificación de patógenos

entéricos, en especial de Shigella. Este medio fue formulado para favorecer el crecimiento de
Shigella, que a menudo no crecía en otras fórmulas debido a inhibidores tóxicos.

Tabla 10: Resultados del crecimiento bacteriano en agar XLD.

Microorganismo Colonias

Salmonella Typhimurium Roja y transparente con centro negro

Shigella flexneri Roja y transparente

Shigella sonnei Roja y transparente

Escherichia coli Amarilla y opaca, precipitación amarilla alrededor de la colonia

Pseudomonas aeruginosa Colonias transparentes y mucosas.

Proteus vulgaris Amarilla, transparente con bordes claros y centro negro

Proteus mirabilis Amarilla, transparente con bordes claros y centro negro

Klebsiella oxytoca Grande, amarillo claro, mucoide u opaca

Klebsiella pneumoniae Grande, amarillo claro, mucoide u opaca

 ACTIVIDADES PRÁCTICAS

OBJETIVOS:

1. Practicar algunas pruebas bioquímicas rápidas para la identificación de cocáceas Gram

positivas. En este caso solo utilizaremos la prueba de catalasa y coagulasa.
2. Identificar macroscópica y microscópicamente bacterias de nuestra flora normal en las
placas sembradas la sesión anterior
3. Descripción macroscópica y microscópica de microorganismos aislados del ambiente
4. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos
intermediarios, debido a la acción bacteriana.
5. Identificar una cepa bacteriana Gram (-) a través de su comportamiento en diferentes
medios de cultivo e analizar macroscópicamente.
6. Realizar test comercial API 10S, para la identificación de bacterias Gram negativo.

MATERIALES:
 Asas microbiológicas
 Pipetas Pasteur plás cas
 1 caja de portaobjetos
 1 caja de cubreobjetos
 1 frasco de aceite de inmersión
 Microscopio óp co de Luz
 Papel para limpiar el microscopio
 Alcohol 70% (una botella por mesón)
 Torulas estériles
 Suero Fisiológico al 0,9% (p/v)
 Agua oxigenada
 Kit de la Coagulasa
 Puntas amarillas estériles
 Placas de agar sangre y agar corriente con microbiota comensal
 Placas de agar sangre, corriente y MacConkey con microbiota ambiental
 Batería bioquímica previamente sembrada con muestra problema
 Galería API10S previamente sembrada
 Placas de agares diferenciales (Salmonella-Shigella, Hektoen Entérico y XLD) previamente
sembradas
 Reactivos de revelado para Baterías bioquímica:
Reactivo de Kovacs
Alfa Naftol
KOH
Rojo Metilo
Azul de bromotimol
 Un Kit de oxidasa
 Reactivos de revelado para Batería API10S:
TDA
 Reactivo de James (IND)
NIT1
NIT 2

PROCEDIMIENTOS:

I. MICROBIOTA COMENSAL Y AMBIENTAL

A. Observe las placas sembradas con muestra de dis ntas partes del cuerpo. Describa las
colonias bacterianas. Observe si se trata de cul vos puros.
B. Para la muestra tomada de la región nasofaríngea, realice las pruebas bioquímicas
correspondientes (Catalasa, Coagulas y Hemólisis).
a. Test de Catalasa: Se debe colocar una gota de peróxido de hidrógeno (agua
oxigenada) sobre un portaobjetos y luego emulsionar la colonia sobre esa gota.
Test (+): aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos)
Precauciones: No tocar el agar sangre al tomar la colonia, ni usar asas
microbiológicas, ya que dan falsos posi vos.
b. Test de Coagulasa: Se debe colocar una gota del reac vo látex sobre un círculo de
la tarjeta, a con nuación, la colonia sospechosa se emulsiona sobre la gota y se agita
durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera posi va.
Siempre se debe realizar un control nega vo que está incluido en el kit.
Precauciones: Tomar la muestra con puntas de plás co o con mondadientes
C. Realice una nción de Gram a una muestra de su flora normal. Observe al microscopio.
D. Observe las placas sembradas en la sesión anterior de las muestras de ambiental. Describa
las colonias bacterianas. Observe si se trata de cul vos puros.
E. Realice una nción de Gram a una de sus muestras ambientales. Observe al microscopio.

Figura 14: Esquema identificación Bioquímica de cocáceas gram positivas.

 II. BACTERIAS PATÓGENAS GRAM NEGATIVAS

A. Lectura e interpretación de una batería bioquímica previamente sembrada y comparar

resultados con tabla 6
B. Lectura de API10S (Tabla 7), y llenar el perfil numérico. Luego realizar el análisis de
resultados en computador con programa API10.

Figura 15: Perfil numérico para realizar análisis de API10S

C. Discuta y compare con su ayudante los resultados obtenidos al analizar la batería

bioquímica convencional y el API10S.
D. Observación de alteraciones producidas en medios de cultivos diferenciales para bacterias
Gram negativas (Tablas 8, 9 y 10).
E. (Opcional) Realice una tinción de Gram de su muestra problema a partir del cultivo en agar
corriente.