UNIVERSIDAD JOSÉ FAUSTINO SÁNCHEZ CARRIÓN

“AÑO DE LA UNIDAD, LA PAZ Y EL DESARROLLO”

FACULTAD: INGENIERÍA PESQUERA

ESCUELA PROFESIONAL: INGENIERÍA PESQUERA

TÍTULO: VIDEO 1 - ESPECTROFOTOMETRIA - USO DEL

ESPECTROFOTOMETRO (RESUMEN)

NOMBRE: LUIS ÁNGEL

APELLIDO: SOTO SILVA

CICLO: IV

NOMBRE Y APELLIDO DEL PROFESOR: GUERRERO ROMERO RUBEN

CURSO: BIOQUÍMICA DE LOS RECURSOS ACUÁTICOS

HUACHO – PERU – 2023

 ESPECTROFOTOMETRIA - USO DEL ESPECTROFOTOMETRO
(RESUMEN)
La espectrofotometría es una técnica analítica fundamental en el campo de la química y
disciplinas relacionadas. Su principal objetivo es determinar la concentración de una sustancia
en una muestra a través de la medición de la absorción de luz. Este proceso se lleva a cabo
mediante un instrumento conocido como espectrofotómetro, el cual consta de varios
componentes esenciales.

El espectrofotómetro incluye una fuente de luz, la cual emite una amplia gama de longitudes
de onda. Dependiendo del tipo de análisis, se emplea una lámpara incandescente para el
espectro visible o fuentes especializadas como las lámparas de deuterio para el rango
ultravioleta (UV). Posteriormente, la luz pasa a través de un monocromador, un dispositivo que
selecciona una longitud de onda específica de la radiación luminosa, permitiendo que solo esa
parte del espectro llegue a la muestra.

La muestra, contenida en una cubeta de celda especialmente diseñada para este propósito, es
expuesta a la radiación seleccionada por el monocromador. La interacción entre la luz y los
componentes de la muestra resulta en la absorción de ciertas longitudes de onda. Esta
absorción es proporcional a la concentración de la sustancia de interés en la muestra.

Un detector, que puede ser un fotodiodo o un fotomultiplicador, registra la intensidad de la luz

que ha pasado a través de la muestra. Este valor se convierte en una señal eléctrica que es
amplificada y procesada por el sistema electrónico del espectrofotómetro. Los datos
resultantes son luego visualizados en una pantalla o impresos.

Para llevar a cabo una medición espectrofotométrica, es crucial seguir una serie de pasos
estándar. Primero, se prepara la muestra siguiendo el protocolo analítico específico. Luego, se
realiza la calibración del espectrofotómetro utilizando soluciones de concentraciones
conocidas, lo que permite establecer la relación entre la absorbancia y la concentración. A
continuación, se selecciona la longitud de onda apropiada para la sustancia de interés.

La muestra se carga en la cubeta de celda y se inserta en el espectrofotómetro. Se registra la

absorbancia, que es la cantidad de luz absorbida por la muestra a la longitud de onda
seleccionada. Utilizando la curva de calibración previamente establecida, se calcula la
concentración de la sustancia en la muestra.

La espectrofotometría tiene una amplia variedad de aplicaciones en diferentes campos

científicos. Se utiliza para el análisis cuantitativo de compuestos químicos, estudios de cinética
química, determinación de la pureza de compuestos, investigaciones de interacciones
biomoleculares, y análisis de muestras biológicas y ambientales, entre otros.

Los colores que percibimos a nuestro alrededor como el verde de las plantas o los llamativos
colores de las flores son el resultado de la capacidad de algunas moléculas que absorber luz,
algunas longitudes de onda del espectro visible cuando la luz blanca incide sobre una molécula
coloreada está absorbe ciertas longitudes de onda del espectro permitiendo que nuestros ojos
capten solo aquellas que no han sido absorbidas por la molécula, lo que determina el color de
la misma, la espectrofotometría utiliza esta propiedad para la identificación y cuantificación de
moléculas en el laboratorio y el espectrofotómetro es el instrumento que nos permite medir la
absorción, un espectrofotómetro típico posee cuatro componentes básicos, una fuente de luz
que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre, un monocromador
que separa la banda de longitud de onda deseada y la dispersa compartimiento de la muestra
un compartimento para la muestra y por último foto detector que mide la radiación que
atraviesan la muestra sin ser absorbida por la misma, la absorción de luz de una muestra
medida diferentes longitudes de onda, la caracterización de una molécula porque cada
molécula que absorbe luz se corresponde con su espectro de absorción es un dato básico en
tiene un espectro de absorción característica. Por lo tanto, realizar el espectro absorción de
muestra nos puede ayudar a analizar cualitativamente las moléculas que la componen

Estás absorben los rayos de las zonas azul violeta y rojo del espectro, pasar solo los de la zona
del verde que es por lo que percibimos las hojas de este color, cuánto mayor sea el número de
moléculas que el az luz encuentre a su paso más luz quedar absorbida por las mismas por ello
la absorbancia de una muestra será mayor, cuánto mayor sea la distancia que atraviese el az
de luz y también será directamente proporcional a la concentración de moléculas en la
muestra, por otra parte la luz e las zonas visibles y ultravioleta del espectro y cada una de las
moléculas de una muestra es capaz de absorber, depende básicamente del número de dobles
enlaces conjugados que posee características que queda expresada en su coeficiente de
extinción molar una constante que indica el valor de la absorbancia de una sustancia que se
encuentra a una concentración 1 molar cuando se mide en una cubeta de 1 centímetro de lado
en esta constante varía según la longitud de onda de trabajo

Resumiendo la absorbancia es directamente proporcional a su coeficiente de extinción molar

a la concentración de dicha sustancia y a la anchura de la cubeta de medida que es siempre de
1 cm esto viene recogido en la Ley de Lambert-Beer por tanto la ley de Lambert-Beer no sirve
para terminar la concentración de una molécula en disolución simplemente midiendo su
absorbancia y siempre que conozcamos de antemano su coeficiente de extinción molar a la
longitud de onda de trabajo la ley de Lambert-Beer tiene aplicación en el estudio de las
reacciones enzimáticas para ello es necesario que un sustrato o un producto de la reacción
puedan absorber luz en las zonas ultravioleta o visible del espectro por sus características el pa
NAD/NADH, es especialmente conveniente para estos ensayos, en su forma oxidada.este
cofactor tiene un máximo de absorción a 260 nanómetros la forma reducida tiene además pico
de absorción a 340 nanómetros, en una reacción de este tipo catalizada por una enzima E, En
la que partimos de NAD como sustrato podremos MONITORIZAR como procede la reacción
midiendo la aparición de NADH por el aumento de la absorbancia a 340 nanómetros, además
como conocemos el coeficiente de extinción molar del NADH a 340 nanómetros podremos
calcular la cantidad de NADH acumula en un lapso de tiempo concreto y así determinar la
actividad de la enzima.

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección

específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolecular, etc) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son
relativamente sencillos. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en
forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos,
entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz
está compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:

Efotón = h⋅ν = h⋅c/λ ,

Donde c es la velocidad de la luz, ν es su frecuencia, λ su longitud de onda y h= 6.6 10 -34 J ⋅s es

la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de
onda λ, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de
onda.

MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE ANÁLISIS

1. NATURALEZA DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

La Radiación Electromagnética es una forma de Energía radiante que se propaga en forma de

ondas. En este fenómeno ondulatorio se define:

a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio. Se expresa, según el S.I. en nanómetros (nm) y sus equivalencias son:

1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.

b) Frecuencia (n): es el número de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su

fórmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

c) Fotones: la luz está formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un
fotón depende de la frecuencia y de la longitud de onda, según la siguiente expresión: E = h x n
= h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energía Electromagnética se mide el
Ergios. La relación entre la longitud de onda y la Energía es inversa, por lo tanto a menor
longitud de onda mayor Energía y viceversa.

d) Espectro Electromagnético: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de

longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias
regiones, las más interesantes para nosotros son:

 Región Ultravioleta: l = 10-380 nm

 Región Visible: l = 380-780 nm

 Región Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Región Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro
de longitudes de onda. Si interacciona con una molécula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENÓMENO DE ABSORCIÓN

Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental

interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partícula en estado excitado.
La molécula absorbe la E de la onda y aumenta su energía, y ese aumento de energía es igual a
la E de la Radiación Electromagnética absorbida (E = h.n). La partícula en estado excitado
tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en
forma de calor.
“Espectro de Absorción”. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene
un determinado espectro de absorción. El espectro de absorción es un gráfico donde se
representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la
cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de la espectrofotometría de
absorción.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la
mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

B. FENÓMENO DE EMISIÓN

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo
la emisión de energía radiante. En este caso, lo que se mide es la energía emitida y, en este
fenómeno se basa la “fotometría de llama” o la “fluorescencia”.

3. LEYES DE ABSORCIÓN

Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad,
debido a la absorción por parte de la sustancia.
Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interacción con la cubeta o el solvente. Para evitar este
error se hace una primera medida con una solución de referencia o BLANCO, que contiene
todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial y se
harán en la misma cubeta que se utilizó en la medida del blanco.

La Transmitancia se usa poco, se emplea más la Absorbancia (A) porque la relación entre A y la
concentración de una solución es directamente proporcional y la de la T es inversamente
proporcional.
La relación entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

 Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

 Si el %T = 0 A = 2-log 0 = ¥

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que
mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

“La absorbancia de una solución es directamente proporcional ala concentración y a la

longitud del paso de la luz”.

A = e . b. c
Siendo:
A: absorbancia. No tiene unidades.

e: el coeficiente de extinción molar, también llamado coeficiente de absorción. Es constante

para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de
temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentración del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia
podemos averiguar su concentración y esto lo podemos hacer de dos formas:

1. Por comparación con una solución conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y
una estándar (S), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas:

2. A través de una curva de calibración: la curva de calibración es la representación gráfica en

un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de
abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A,
construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones
problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema
en la curva de calibración.

Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno
entre las cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración.
Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir
la Ley de Beer, convirtiéndose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los
límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno. En esta
situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la
linealidad.

Empleo de los Factores de Calibración: Para reactivos estables y sistemas fotométricos

estables, este factor se puede mantener constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras
problema multiplicando la A resultante por el factor F.

4. ESPECTROFOTÓMETRO

Se distinguen dos tipos de aparatos:

Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de
una determinada longitud de onda.

Espectrofotómetros: utilizan cromado res. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromático
cuya longitud de onda se varía a voluntad. Los monocroma dores pueden ser de dos tipos:
prismas y redes de difracción.
Monocromador de Prisma
2.2. COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energía radiante en forma de luz visible o no visible.

· Tipos de lámparas:

 Lámparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro

visible y el ultravioleta próximo. Son fuentes de un espectro continuo de energía
radiante entre 360-950 nm.

 Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duración y emiten

energía radiante de mayor intensidad.

 Lámparas de Hidrógeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la región

ultravioleta entre 220-360 nm.

 Lámparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de

líneas que se utilizan para calibración de longitudes de onda, se emplean solo para
espectrofotómetros y cromatografía HPLC.

Precauciones:

 Las subidas y bajadas bruscas de tensión producen sufrimiento de la lámpara y

cambios en las lecturas de la Absorbancia.

 La lámpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el
aparato.

2. Rendija de entrada: tiene como función reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz
dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda.

3. Monocromadores. Pueden ser:

 Prismas: son fragmentos con forma de cuña de un material que permite el paso de la
luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el
ultravioleta lejano.

 Redes de difracción: son un gran número de líneas paralelas situadas a distancias

iguales entre sí y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metálica. Cada una
de estas hendiduras se comporta como un pequeño prisma.

4. Rendija de salida: tiene como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la
muestra, que provocaría desviaciones a la Ley de Beer. (04/10/01)

5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición. Pueden ser de

distintos tipos y tamaños (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores
resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben
marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posición. Suelen estar fabricadas en
vidrio o en plástico.
6. Detector. Puede ser de dos tipos:

 Fotocélulas o células fotovoltaicas:

Es una lámina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de Óxido de
Cobre. A ésto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa
de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y éste
desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de
potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El
conjunto se conecta a un amperímetro que señala el paso de corriente.

Características: son resistentes; económicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los

1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batería externa, ni vacío,...; la corriente
producida es directamente proporcional a la Energía que llega y tienen “efecto fatiga”,
es decir, que presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece
progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos
entre una lectura y otra.

 Fototubos multiplicadores:

Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un cátodo que emite electrones de

forma proporcional a la Energía que incide sobre él. Tiene un ánodo que recoge los
electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre
sucesivos ánodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La señal se
amplifica en cientos o miles de veces.

Características: el tiempo de respuesta es muy rápido, no tienen “efecto fatiga” tan

altos como la anterior y son muy sensibles.

7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energía eléctrica que recoge el detector y que puede
ser lectura directa (se utiliza una célula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de señal como
en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y
cálculos automáticos de concentraciones con relación a las curvas de calibración.

4.2 TIPOS DE APARATOS

Ø ESPECTROFOTÓMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la descripción dada para el

espectrofotómetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinómetro: para
determinar bilirrubina directa en capilar).

Ø ESPECTROFOTÓMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos los componentes están

duplicados, menos la lámpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los
distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad
de luz y de absorbancia.

Ø ESPECTROFOTÓMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: utilizan los mismos componentes

que el espectrofotómetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes
pero no al mismo tiempo. Emplean un “Chopper” consistente en un interruptor rotativo del
haz luminoso colocado a continuación de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la
porción de luz reflejada por el “chopper” a través de una cubeta de referencia y de ahí al
detector común. El detector lee alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la
cubeta de referencia. Esto compensa la variación de energía radiante.

MEDIDAS FOTOMÉTRICAS

1. FLUORIMETRÍA

1.1 CONCEPTOS GENERALES

A. Luminiscencia

B. Fluorescencia

1.2 INSTRUMENTACIÓN FLUOROMÉTRICA

A. Fluorómetro

B. Espectrofluorómetro

1.3 CARACTERÍSTICAS DE LA FLUORIMETRÍA

1.4 APLICACIONES

2. FOTOMETRÍA DE LLAMA

2.1 CONCEPTOS GENERALES

A. Generalidades

B. Fundamento

C. Interpretación

2.2 INSTRUMENTAL

3. ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

3.1 PRINCIPIOS

3.2 INSTRUMENTAL

A. Lámpara de cátodo hueco

B. Quemador
C. Componentes fotométricos
3.3 ABSORCIÓN ATÓMICA

4. NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA

4.1 PRINCIPIOS. LEY DE RAYLEIGH

4.2 DETECCIÓN DE LA LUZ DISPERSADA

A. Turbidimetría Nefelometría

En resumen, la espectrofotometría es una técnica analítica esencial que se basa en la

absorción de luz por parte de una muestra para determinar la concentración de una sustancia
específica. El espectrofotómetro, con sus componentes clave, es el instrumento central en este
proceso, y su uso adecuado implica una serie de pasos que culminan en la obtención de
resultados precisos y confiables.