INFORME 2.

AMPLIFICACIÓN DE MATERIAL GENÓMICO DE Leishmania

infantum POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y
LECTURA POR ELECTROFORESIS
1. RESUMEN:

2. OBJETIVOS
o Entender los conceptos básicos de la PCR y aplicar las principales fases de
la técnica en procedimientos de laboratorio para la detección de ADN.
o Comprender los principios básicos de la electroforesis horizontal y vertica
en geles de agarosa y poliacrilamida aplicados en la separación ADN a partir
de productos de PCR.
o Analizar los resultados de amplificación por Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR) del material genómico de Leishmania infantum y la
lectura de esta por Electroforesis.

3. INTRODUCCIÓN
En 1983, Kary Mullis describió una técnica que genera miles de copias de una molécula
de ADN específica en varios ciclos, utilizando una enzima ADN polimerasa y
oligonucleótidos. Esta técnica se basa en la replicación del ADN in vivo plasmada a una
metodología in vitro. La PCR, por la que Mullis ganó un premio Nobel una década
después, revolucionó la biología molecular y cambió la manera en que se estudiaban los
ácidos nucleicos en ese momento (Rodriguez, M.; Rodriguez, W., s.f.). El desarrollo de
esta técnica permitió un estudio y manipulación más precisos del ADN.
La PCR es fundamental en biología molecular, ya que permite amplificar millones de
veces una secuencia específica de ADN a partir de cantidades mínimas de material
genético. Mediante la catálisis de la enzima ADN polimerasa, el ADN molde se copia
fielmente, lo que facilita su análisis para diversos fines científicos y médicos.
La PCR convencional, también conocida como PCR de punto final, requiere un paso
adicional para la lectura de la amplificación del ADN molde mediante la electroforesis en
un gel de agarosa. La electroforesis es un método de laboratorio que aprovecha las
cargas eléctricas de las moléculas en un campo eléctrico para separar fragmentos de
ADN y ARN según su tamaño Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán
hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo positivo. Este proceso
permite visualizar los fragmentos mediante una sencilla tinción, determinando así el
contenido de ácidos nucleicos de una muestra y estimando su concentración y grado de
integridad.
Hoy en día, la PCR se aplica en diferentes áreas de las ciencias biológicas y de la salud,
formando parte del quehacer científico de muchos laboratorios de investigación que la
utilizan principalmente para expresión génica, genotificación, detección de patógenos y
análisis de mutaciones.
En el presente informe se aborda el fundamento y los procedimientos de las técnicas de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis. Además, se analiza el
resultado de la amplificación del material genómico de Leishmania infantum, realizado en
el laboratorio de biología molecular de la Universidad de Pamplona. Este análisis incluye
una descripción detallada de los pasos experimentales, las condiciones específicas de la
PCR, los métodos de visualización mediante electroforesis en gel de agarosa, y la
interpretación de los resultados obtenidos.

4. MARCO TEÓRICO
 4.1 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida por sus siglas en inglés PCR
(Polymerase Chain Reaction), es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la
secuencia blanca es copiada fielmente (Tamay de Dios L, Ibarra C, & Velasquillo C.,
2013). La técnica se basa en el uso de dos oligonucleótidos, también llamados cebadores
o primers, que, tras reconocer la secuencia complementaria en la molécula de ADN, son
alargados cíclicamente mediados por la ADN Polimerasa. Para la PCR es necesario que
uno de los oligonucleótidos tenga la misma secuencia que se encuentra en una de las
cadenas del ADN, y el otro deberá llevar la secuencia complementaria que estará al final
del fragmento que se quiere amplificar (por lo cual se les llama forward y reverse) para
que uno sea complementario a la cadena que forma el otro. Cada ciclo de la técnica,
generalmente 20 o 30 en total, implica la desnaturalización del ADN, el apareamiento de
los cebadores y la síntesis del nuevo fragmento de ADN a partir del cebador, lo que
resulta en un crecimiento exponencial de millones de copias del fragmento seleccionado
(Pedrosa Amado, A., 1999).
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) requiere componentes que
replican las funciones de una reacción in vivo de replicación del ADN. El componente
principal es un fragmento de ADN que contiene la región específica de interés a
amplificar, conocido como ADN molde. Se utilizan dos oligonucleótidos, también
conocidos como iniciadores, primers o cebadores, que son secuencias cortas de ADN de
cadena sencilla que se unen a cada hélice del ADN molde, delimitando la región
específica a amplificar y marcando el lugar donde la enzima ADN polimerasa debe unirse
para iniciar la amplificación. También se añaden nucleótidos libres en forma de
desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs), que son incorporados por la ADN polimerasa
durante la síntesis de las cadenas complementarias del ADN molde. Por último, se
requiere una enzima ADN polimerasa que cataliza la reacción de amplificación,
agregando los dNTPs complementarios al ADN molde para generar cadenas
complementarias en cada ciclo de amplificación. La enzima ADN polimerasa debe ser
termoestable debido a las altas temperaturas a las que se desarrolla la técnica; por ende,
la enzima más utilizada es la Taq polimerasa, que proviene de la bacteria termófila
Thermus aquaticus, la cual vive en aguas termales a temperaturas cercanas a la
ebullición (Ibarra, A., 2021, Agosto 26). La reacción se lleva a cabo en un tampón
apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de
la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de
magnesio (MgCl2). (Perez de Castro, A. M., 2011)
La secuencia de ADN de doble cadena a ser amplificada es sometída a diferentes ciclos
térmicos junto con los componentes de la PCR para llevar a cabo le reacción, esto sucede
en un equipo llamado termociclador, el cual está diseñado para establecer un sistema
homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se
modifiquen en cada uno de los ciclos. Cada ciclo de PCR se lleva a cabo en tres etapas
principales: desnaturalización, hibridación y extensión:
a. Desnaturalización: En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y
separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende
de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario
más tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases
está formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. Además, depende de la
velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al
modelo del equipo. Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que
servirán como templado para el siguiente paso.
 b. Hibridación: En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se
forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación
o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si
el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad
y especificidad del complejo será eficiente.
c. Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-
primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s
complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las
cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura
óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional.
Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el
número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.

El ciclo se repite creándose primero dos, cuatro, ocho,... 2n copias del ADN molde (n=
número de ciclos) obteniendose al final de los 30 ciclos 1.073.741.824 copias de la
secuencia molde. De los millones de copias, 70 serán fragmentos de tamaño mayor
llamadas cadenas largas, obtenidas al sintetizarlos directamente con el ADN genómico,
pero no afecta al producto final porque son casi indetectables.
Al final de la reacción, para corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés, los
productos de la PCR o también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa
para confirmar si la reacción fue exitosa. (Tamay de Dios L, Ibarra C, & Velasquillo C.,
2013)
4.2. ELECTROFORESIS DE ADN
La electroforesis es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN u otras
macromoléculas, como ARN y proteínas, por su tamaño y carga al aplicar una corriente a
través de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga,
las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas
velocidades, con lo que se separan unas de otras determinando el tamaño de las
moléculas al examinarlas junto con una escala estándar de fragmentos de tamaño
conocido. (Khan Academy., s.f).
La electroforesis de ADN puede realizarse en geles de agarosa o de poliacrilamida.
Ambos tienen características diferentes en cuanto a sus propiedades y modo de
preparación, por lo que se utilizará uno u otro en función de la aplicación y objetivos que
persigamos. La electroforesis en geles de agarosa es el método estándar para separar y
purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolución. (Fierro,
F.F., s.f). Existen diferentes tipos de electroforesis en gel de agarosa, pero la
electroforesis horizontal es el más utilizado para separar moléculas de ADN en agarosa.
Otros tipos, como la electroforesis vertical, se utilizan para separar proteínas y utiliza
geles de poliacrilamida.
El gel se realiza disolviendo la agarosa en un tampón llevado a punto de ebullición. La
solución es luego enfriada aproximadamente a 55ºC y se añade al molde para realizar el
gel. Un peine con pocillos es colocado en el gel para que forme los pocillos donde se
sembrarán las muestras. Después que el gel ha solidificado, el gel se coloca en la unidad
de electroforesis y se sumerge con un tampón adecuado para llevar a cabo la
electroforesis. La unidad dispone de un electrodo positivo en un extremo y un electrodo
negativo en el otro extremo. Las muestras se preparan con un tampón de carga que
contiene glicerol para darles densidad y de esta forma se mantienen en el pocillo sin
salirse. La muestra se siembra en los pocillos con una micropipeta. (Bioted, s.f)
Una fuente de corriente es conectada al aparato de electroforesis y se genera una
corriente eléctrica. Las moléculas cargadas de la muestra entrarán en el gel a través de la
pared del pocillo de siembra. Las moléculas con una carga negativa migrarán hacia el
electrodo positivo (ánodo) mientras que las moléculas con una carga positiva migrarán al
electrodo negativo (cátodo). El tampón sirve} como conductor de la electricidad y controla
el pH, lo cual es importante para la estabilidad de las moléculas biológicas. Como el ADN
tiene una carga negativa a pH neutro migrará a través del gel hacia el electrodo positivo
durante la electroforesis. (Bioted, s.f)
El gel de agarosa contiene poros microscópicos que actúa como un tamiz molecular
separando las moléculas según su carga, forma y tamaño. Estas características junto con
las condiciones del tampón, concentración del gel y voltaje, afectarán a la movilidad de las
moléculas en el gel.
La separación ocurre porque las moléculas más pequeñas pasan a través de los poros del
gel más fácilmente que las de mayor tamaño. Si el tamaño de 2 fragmentos son similares
o idénticos, migrarán juntos en el gel. Si el ADN genómico es digerido varias veces, habrá
un rango amplio de fragmentos que producirá un “smear” en el gel. Los fragmentos
lineares de ADN migrarán más rápido a través del gel. (Bioted, s.f)
Cuando los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de
las bandas que hay en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se
coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN
presente en distintos lugares a lo largo del gel. (Khan Academy., s.f)

5. MÉTODOS (Procedimiento)

6. RESULTADOS
En el laboratorio de Biología Molecular se realizó la práctica de Reacción en
Cadena de la Polimerasa para amplificar el material genómico de
Leishmania infantum. Este procedimiento se llevó a cabo utilizando el
equipo Veriti 96 well thermal cycler (THERMO FISHER SICIENTIFIC) junto
con el GoTaq® qPCR Maxter mix ; es una mezcla maestra 2X lista para
usar para PCR cuantitativa en tiempo real (GoTaq® qPCR And RT-qPCR
Systems, s. f.) , esta contiene
ADN polimerasa GoTaq®, Una enzima termoestable que cataliza la síntesis
de ADN durante la reacción de PCR.
dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfato) son los bloques constructores de
las nuevas cadenas de ADN.
Tampón de reacción, Mantiene el pH y la salinidad óptimos para la actividad
de la polimerasa. Iones de magnesio (Mg2+). Agente de unión a la plantilla,
Ayuda a estabilizar la interacción entre los primers y la plantilla de ADN.
Agente de detección fluorescente (como SYBR® Green o una sonda
TaqMan®: Permite la cuantificación en tiempo real de la amplificación del
ADN. y el primer forward (primer T1) que tiene una secuencia.... y el
reverse (primer T2) el cual tiene una secuencia .... al igual se monto el
control positivo y el de la muestra.
En el termociclador Applied Biosystems™ SimpliAmp™ se llevó a cabo la
técnica de PCR a una desnaturalización a temperatura de 94°C, hibridación
a temperatura de 61°C y extensión a temperatura de 72°C.
Para poder evidenciar la amplificación se llevó a cabo la electroforesis en
un gel de agarosa al 2%, en donde se utilizó un voltaje de 90 y 62
miliamperios. Pero previo a esto se le agrego SYBR GREEN, el cual es un
 tinte mas sensibles para detectar ADN bicatenario (ADNbc) en geles de
agarosa y poliacrilamida. este tiene una mayor sensibilidad al ADNds, es
especialmente útil para ensayos en los que la presencia de ARN o ADNss
contaminantes podría oscurecer los resultados (SYBRTM Green I Nucleic
Acid Gel Stain - 10,000X Concentrate In DMSO, s. f.) Cuando el tinte SYBR
Green I se une al dsDNA , el nivel de emisión de fluorescencia de SYBR
Green I aumenta considerablemente, es decir, la fluoresencia es
proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra, y Al utilizar este
fenómeno, la cantidad de producto de la PCR se puede cuantificar
directamente en cada ciclo (Barletta, 2006).
En el momento de evaluar la electroforesis, se observó que en el pozo 5
donde se encontraba el material genómico de Leishmani infantum
previamente amplificado por la técnica de PCR no migro por el gel de
agarosa, interpretándose como una nula amplificación del material
genómico. por otro lado, El control positivo se valida, pues al contener ADN
de leishmania este debe amplificar y evidenciarse una banda de corrida en
la electroforesis, como pudo evidenciarse en el pozo 6.

7. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Al realizar el montaje de la prueba, pueden surgir diversos errores sistémicos que
impidan la amplificación esperada del material genómico de Leishmania infantum
en nuestra muestra. Los problemas técnicos y de manipulación son comunes en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y pueden afectar considerablemente
la eficiencia y precisión de la amplificación del ADN.
Estos errores pueden ser una técnica inadecuada de pipeteo La precisión en el
pipeteo es crucial para la PCR. Errores en esta etapa pueden llevar a la adición
incorrecta de reactivos y de la muestra, lo cual afecta la concentración final de los
componentes de la reacción y, por ende, la eficiencia de la PCR y la amplificación
en la electroforesis.
Degradación del ADN molde, este debe estar intacto para una amplificación
eficiente. El almacenamiento inadecuado del ADN puede llevar a su degradación,
lo cual afecta la calidad y cantidad de los productos de PCR. Factores como el pH,
la temperatura y la exposición a nucleasas pueden contribuir a su degradación.
Para prevenir esto se bebe Evitar ciclos repetidos de congelación y
descongelación ya que esto induce a su degradación, y almacenarlo a -20°C o -
80°C.
Una baja concentración inicial de ADN molde puede resultar en una cantidad no
detectable después de la amplificación. Si la cantidad de ADN amplificado es muy
baja, es posible que no haya suficientes copias del gen de interés presentes en la
muestra para que los resultados de la electroforesis sean visibles. Estos
problemas pueden surgir si la PCR no amplifica adecuadamente el ADN objetivo
debido a cantidades insuficientes de ADN como plantilla o a la pérdida de muestra
durante el procedimiento de preparación.
La pérdida de muestra durante el procedimiento de preparación puede ocurrir de
diversas formas. Durante el pipeteo, una parte de la muestra puede quedar
adherida a las paredes de la punta si no se manipula correctamente. Además, la
contaminación cruzada puede ocurrir si no se utilizan puntas de pipeta estériles o
si no se limpian adecuadamente los instrumentos entre cada manipulación, lo que
también puede resultar en la pérdida de la muestra original.
Se recomienda revisar y analizar detalladamente las condiciones de los reactivos
con el control de calidad, mejorar la técnica de pipeteo de los participantes del
montaje y que a la hora de realizar el procedimiento una sola persona se encargue
de hacerlo, debido que la participación de varias personas en el procedimiento
también puede afectar en el resultado de la amplificación.
8. CONCLUSION

9. BIBLIOGRAFIA
Rodriguez, M; Rodriguez, W., (s.f). PCR en tiempo real. IBT-UNAM.
Tamay de Dios L, Ibarra C, & Velasquillo C, (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y de la PCR en tiempo real. Medigraphic, https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf.
Pedrosa Amado, Andrés. (1999). Reacción en cadena de la polimerasa. Scielo.
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-02551999000200011
Perez de Castro, A. M, (2011). Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR).
Recuperado de
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20poli
merasa.pdf
Ibarra, A, (2021, Agosto 26). La técnica de PCR explicada paso a paso [Video]. YouTube.
https://youtu.be/92DI6NoNkNE?si=FuABXCm9xYyZQlBI
Khan Academy, (s.f). Electroforesis en gel. Recuperado de
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-
regulation/biotechnology/a/gel-electrophoresis
Fierro, F.F, (s.f). Electroforesis de ADN. Recuperado de https://walebuble.com/wp-
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Bioted, (s.f). Electroforesis básica. Recuperado de
https://www.bioted.es/protocolos/ELECTROFORESIS-BASICA.pdf
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https://worldwide.promega.com/products/pcr/qpcr-and-rt-qpcr/qpcr-kits/?catNum=A6001
SYBRTM Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO. (s. f.).
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S7563
Barletta, J. (2006). Applications of real-time immuno-polymerase chain reaction (rt-IPCR)
for the rapid diagnoses of viral antigens and pathologic proteins. Molecular Aspects Of
Medicine, 27(2-3), 224-253. https://doi.org/10.1016/j.mam.2005.12.008