Ud 7 Tecnicas Opticas de Analisis PDF

Curso
U.D.7: TÉCNICAS ÓPTICAS DE ANÁLISIS 2023-2024
1. INTRODUCCIÓN
Los organismos vivos se componen de una serie de sustancias orgánicas e inorgánicas que
deben permanecer dentro de unos límites y realizar una serie de reacciones conocidas para
que la vida se desarrolle con normalidad.
Para determinar los diferentes elementos se utilizarán diversas técnicas, entre las que
destacan las técnicas ópticas de análisis.
2. PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Y

CONCEPTOS FUNDAMENTALES
La radiación electromagnética está formada por la combinación de campos eléctricos que

se producen por la acumulación de cargas eléctricas, y por campos magnéticos generados
por el movimiento de las cargas eléctricas, que se propagan a través del espacio en forma
de ondas portadoras de energía.
Las ondas electromagnéticas tienen las vibraciones perpendiculares a la dirección de

propagación de la onda. Por tal motivo, se las clasifica entre las ondas transversales.
El campo eléctrico es perpendicular al campo magnético
A diferencia de otros fenómenos ondulatorios, como el sonido, la radiación

electromagnética no necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se propaga
fácilmente a través del vacío.
En cualquier medio material, la propagación de la radiación disminuye a causa de la

interacción entre el campo electromagnético de la radiación y los electrones de la materia,
es decir, la longitud de onda disminuye cuando la radiación pasa del vacío a algún otro
medio.
Sin embargo, para describir cuantitativamente determinadas interacciones con la materia,

se hace necesario considerarla como un flujo de partículas o corpúsculos, llamados fotones
(dualidad onda-corpúsculo).
1
Curso
La energía del fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación (la frecuencia se define

como el número de máximos que pasan por un punto en un tiempo determinado), de modo
que un haz de radiación puede ser más o menos intenso en función de la cantidad de fotones
por unidad de área (pero la energía del fotón es siempre la misma).
El espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de

frecuencias (y así como de energías). De hecho, el intervalo es tan grande que se necesita
una escala logarítmica.
Las zonas de separación entre regiones no están establecidas de modo rígido.
Se denominan métodos ópticos a los métodos espectroquímicos que utilizan no sólo la

radiación visible, sino también las radiaciones ultravioleta e infrarroja, a pesar de que el ojo
humano no es sensible a ellos, debido a las similitudes que se observan en las interacciones
de estos tres tipos de radiación con la materia. a pesar de que el ojo humano no es sensible
a ellos.
2
Curso
3. DIFERENTES COMPORTAMIENTOS DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA
➢ Superposición de ondas: cuando dos o más ondas atraviesan la misma región del
espacio, se produce un desplazamiento igual a la suma de los desplazamientos
causados por las ondas individuales.
➢ Difracción de la radiación: proceso por el que un haz paralelo de radiación se

curva cuando pasa por un obstáculo puntiagudo o a través de una abertura estrecha.
➢ Transmisión de la radiación: La velocidad a la que se propaga la radiación a través

de una sustancia es menor que su velocidad en el vacío y depende de los tipos y
concentraciones de átomos, iones o moléculas del medio. Es decir, la frecuencia de
la radiación emitida no varía, pero la velocidad de su propagación disminuye a causa
del tiempo necesario para que se produzca la retención y la emisión.
➢ Refracción de la radiación: se trata de un cambio brusco de dirección de la

radiación cuando incide con un ángulo en la interfase entre dos medios que tienen
densidades diferentes.
3
Curso
➢ Reflexión de la radiación: cuando la radiación atraviesa una interfase entre

medios con diferente índice de refracción, se produce siempre una reflexión. La
fracción de radiación reflejada es tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre
los índices de refracción.
➢ Dispersión de la radiación: Fracción de la radiación momentáneamente retenida

por átomos, iones o moléculas que es reemitida en todas las direcciones cuando las
partículas vuelven a su estado inicial. La intensidad de esta radiación dispersada
aumenta con el tamaño de partícula.
4. INTERACCIÓN MATERIA-RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
Cuando incide radiación electromagnética sobre una muestra material puede ser
absorbida por ella (generalmente de forma parcial), transformándose, en muchas ocasiones,
en energía térmica. Sin embargo, otras veces, parte de la radiación puede ser dispersada o
reemitida, con o sin cambio en la longitud de onda. Incluso es posible que, como
consecuencia de la interacción, se origine simplemente un cambio en las propiedades de la
radiación, sin necesidad de producirse absorción y emisión. Por otra parte, la muestra
puede emitir radiación electromagnética si se la excita bajo determinadas situaciones.
Cuando la materia interacciona con energía térmica o electromagnética, los átomos y

moléculas pueden pasar a un estado activado en el que permanecen durante un periodo de
tiempo muy corto, regresando su estado fundamental. En este proceso, ceden la energía
previamente absorbida a su entorno en forma de calor, o en forma de fotones, de la misma
longitud de onda o menor.
4
Curso
Gracias a estas propiedades podemos clasificar los diferentes métodos ópticos en:
• MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS: aquellos en los que existe intercambio de energía

entre la radiación electromagnética y la materia. En estos métodos se miden
espectros, siendo éstos debidos a transiciones entre distintos niveles energéticos
Existen técnicas basadas en la absorción de radiación y técnicas basadas en la
emisión de radiación.
• MÉTODOS NO ESPECTROSCÓPICOS: aquellos en los que no hay intercambio de

energía, sino cambios en la dirección o en las propiedades físicas de la radiación
electromagnética. Se basan en mecanismos de interacción de la radiación
electromagnética y la sustancia, como son la dispersión, difracción, refracción y
polarización.
5. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
5.1 TÉCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN
La espectrofotometría de UV-visible y la espectrofotometría de absorción atómica, se basan

para su funcionamiento en fenómenos de absorción de radiación electromagnética.
La medida de la cantidad de radiación absorbida con la ayuda de estos métodos nos servirá
en algunos casos aplicando la ley de Lambert-Beer para establecer una relación lineal entre
la radiación absorbida y la concentración de la sustancia en el medio.
- Absorción de radiación y concentración: Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer nos permite establecer una conexión entre la absorción de radiación
y la concentración de la sustancia que absorbe en un medio conocido.
La absorción de radiación provoca una alteración en la posición de ciertos electrones de las

moléculas absorbentes llevándolos a niveles de energía superior.
5
Curso
Las diferentes moléculas y sobre todo los electrones que forman parte de éstas pueden
absorber radiación electromagnética a diferentes λ (longitud de onda) y podemos llegar a
medir ésta y de ese modo conociendo ciertas características de la propia sustancia expresar
su concentración.
La relación de la ley entre concentración y absorción de luz está basada en el uso de
espectroscopía para identificar sustancias.
Irradiando la muestra con luz monocromática (una sola longitud de onda), que situamos
dentro de la cubeta, podemos observar la intensidad antes y después de atravesar la cubeta
(de unos cm determinados de espesor), la cual contiene una muestra con una concentración
determinada.
Debido a las interacciones de los fotones de la luz irradiada con las partículas del medio, se
produce una disminución de potencia entre el haz incidente y el que atraviesa la muestra.
De esta manera se puede definir la Transmitancia como la fracción de la intensidad de la
luz incidente que es transmitida por la disolución.
T = (I/I0)
o
T = (I/I0) 100
Conocida la T (transmitancia) podemos conocer la A (absorbancia).
A partir de la ley de Lambert-Beer podemos definir que:
A= εdc
• A → representa la absorbancia.
• Ε →representa el coeficiente de absorción de la sustancia analizada (l/mol cm) o
absortividad. Su valor varía dependiendo de los materiales absorbentes y la λ
aplicada en cada caso y se determina experimentalmente.
6
Curso
• c →representa la concentración de la muestra (mol/l).

• d → representa el espesor de la cubeta (cm).
La ley tiende a no ser válida para concentraciones muy elevadas, especialmente si el

material dispersa mucho la luz, ni para muestras en las cuales ocurran reacciones químicas.
Existen muchos campos en los que es una herramienta muy usada. En el campo de la
bioquímica nos permite conocer concentración de sustancias, actividades enzimáticas, al
igual que en el de la química analítica con el estudio de otros analitos, etc. y también en la
tecnología de los alimentos
A. Espectrofotometría UV-visible
La espectrofotometría UV-Visible es una técnica de medición basada en la absorción de

radiación UV o visible por parte de las moléculas muy usada en campos como la química
analítica, bioquímica o biología molecular.
Los electrones en una molécula se establecen formando orbitales atómicos y a su vez estos
forman orbitales moleculares. La absorción de esta radiación por parte de las moléculas
provoca un fenómeno denominado transición electrónica en la cual el electrón se mueve
desde un orbital de menor nivel energético a uno de mayor energía.
La absorción por parte de la molécula estudiada de un tipo u otra de radiación UV o visible

(la variación en la λ es causa a su vez de una variación en la energía de la onda) provoca una
transición electrónica diferente entre estos orbitales.
El estado de excitación de la molécula es emitirá la energía recibida en forma de calor o de

otro tipo de radiación como puede ser la fluorescencia o fosforescencia (se estudiará más
adelante); así podemos conocer más acerca de una molécula, de sus grupos funcionales, de
su estructura conociendo su espectro de absorción o de emisión dependiendo de la técnica
que utilicemos.
Podemos conocer la cantidad de bacterias que presenta un medio dada su absorbancia

dentro de λ visibles, también ver la actuación de un enzima sobre un compuesto inicial
viendo su transformación en otro al mismo tiempo que su desaparición, uso de colorantes
como Biuret para determinar la concentración proteica de una suspensión, etc.
7
Curso
La elección del tipo de material de nuestra cubeta también es importante, ya que no

queremos provocar absorción por parte de esta o que bloquee el paso de la luz, las
mediciones para cuantificar ADN se realizan en cubetas de cuarzo, ya que se utilizan λ de
260nm y 280 nm( más energéticas por lo que podrían dañar la cubeta de plástico).
El espectrofotómetro de UV-visible funciona de un modo muy simple:
• Se situará la muestra en una cubeta donde va a ser excitada por un haz de luz
monocromática a una determinada λ seleccionada previamente, e incidimos sobre
ésta.
• El espectrofotómetro permite la medición tanto de la luz incidente como de la
transmitida y de ese modo la absorbida.
• Conocida la absorbancia se podrá conocer la concentración de una sustancia.
El espectrofotómetro se compone de las siguientes partes:
• Fuente de luz: La fuente de luz ilumina la muestra química o biológica, pero para
que realice su función debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad,
direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida.
• Monocromador: El monocromador de un espectrofotómetro aísla las radiaciones
de longitud de onda deseada, logrando obtener luz monocromática.
Un monocromador está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores
y el elemento de dispersión. El colimador es un lente que lleva el haz de luz entrante
con una determinada longitud de onda hacia un prisma, el cual separa todas las
longitudes de onda de ese haz logrando que se redireccione hacia la rendija de
salida.
• Compartimiento de muestra: En el compartimento de muestra es donde se lleva a
cabo la interacción de la radiación electromagnética con la materia.
• Detector: encarga de evidenciar una radiación para que posteriormente sea
estudiada y saber a qué tipo de respuesta se enfrentarán (fotones o calor).
• Registrador: Convierte el fenómeno físico en números proporcionales al analito en
cuestión.
• Fotodetectores: Los fotodetectores de un espectrofotómetro perciben la señal en
forma simultánea en 16 longitudes de onda y cubren al espectro visible, de esta
manera se reduce el tiempo de medida y minimiza las partes móviles del equipo.
8
Curso
B. Absorción atómica
La espectroscopia de absorción atómica se basa en la absorción de luz por parte de átomos

en forma gaseosa, de ese modo podemos medir su concentración.
Mediante esta técnica al igual que antes podemos conocer la concentración de analito por
la ley de Lambert-Beer conociendo la absorbancia de la muestra, pero no permite conocer
estructuras ya que las rompe. Sin embargo, la preparación de la muestra o la no-
uniformidad de ésta pueden darnos valores cambiantes lo cual nos obliga a interpolar
nuestro valor de absorbancia en una curva de calibración.
Los instrumentos de medida son mucho más complejos que en la espectroscopía de UV-
visible. Se necesita una fuente de luz en este caso láser que poseen la intensidad necesaria
para generar la excitación atómica y en consecuencia el cambio hacia un orbital molecular
de mayor energía.
La mayoría de las muestras se encuentran en estado líquido o sólido y en esta técnica la

muestra debe encontrarse en un estado gaseoso. Para su conversión se utiliza un
atomizador, entre otros componentes:
• Atomizador de llama: este tipo de atomizador solamente acepta soluciones

analíticas por ello la muestra debe ser tratada para formar pequeñas gotas. El
atomizador de llama consta de una serie de componentes, son los siguientes:
• Fuente de radiación: este formada por un cátodo hueco fabricado con el mismo
metal a analizar junto con un ánodo que en este caso es un hilo de wolframio todo
sellado en un tubo de vidrio con un gas inerte como el argón. Al aplicar una
diferencia de potencial entre el ánodo y el cátodo se genera una ionización de los
átomos del gas inerte, estos chocan con el cátodo provocando el movimiento de
diferentes átomos para producir una nube atómica que emiten radiación.
• Quemador y un nebulizador: el nebulizador transforma la muestra en un aerosol
fino para alimentar el quemador.
• Monocromador: que selecciona la λ necesaria para cada muestra
El esquema general que presentan estos espectroscopios es:
9
Curso
6. TÉCNICAS BASADAS EN LA EMISIÓN DE RADIACIÓN
6.1. FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR
Cuando una especie química absorbe radiación pasa a un estado electrónico excitado.
Muchas sustancias disipan el exceso de energía en forma de calor. Sin embargo, un cierto
número de especies pierde sólo una parte de ese exceso de energía en forma de calor, y
emite la energía remanente en forma de radiación electromagnética de distinta frecuencia
que la absorbida, a una longitud de onda mayor, y que puede utilizarse con fines analíticos.
La luminiscencia es el término aplicado a la re-emisión de radiación que ha sido

previamente absorbida, mientras que la fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el
que la excitación tenga lugar por absorción de fotones.
La fotoluminiscencia puede clasificarse en: fluorescencia y fosforescencia. Se diferencian en

que las transiciones electrónicas responsables de fluorescencia no conllevan un cambio en
el espín del electrón. Por el contrario, las emisiones de fosforescencia van acompañadas por
un cambio en el spín o sentido de giro del electrón.
Podemos encontrar dos diseños: fluorómetro y espectrofluorímetro. Los distintos

componentes de los instrumentos son similares a los que se encuentran en
espectrofotómetros ultravioleta/visible.
• Componentes de un fluorómetro o un espectroflurímetro:
Los fluorómetros, que utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente, miden
la capacidad de una muestra para absorber luz a una longitud de onda y emiten luz a una
longitud de onda más larga y los espectrofluorímetros, los cuales utilizan monocromadores
para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
10
Curso
Ambos siguen el mismo esquema: la luz de una fuente de radiación pasa a través del filtro o
monocromador incidiendo sobre la muestra. Una parte es absorbida por la muestra,
produciendo algunas moléculas fluorescencia.
Esta luz fluorescente es emitida en todas las direcciones, parte de ella pasa por un segundo
filtro o monocromador llegando al detector. Este detector se encuentra a 90° con respecto
al haz de luz incidente. Esto se hace para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada
o transmitida llegue al detector. De ahí pasa al registrador para obtener el dato medido.
Una de las diferencias entre fluorímetro y espectrofluorímetro es por donde pasa el haz de
radiación, pasando por un filtro en el fluorímetro y por un monocromador en el
espectrofluorímetro.
Esquema de un espectrofluorimetro
Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse por fluorescencia se

encuentran los aminoácidos, las proteínas, las coenzimas, las vitaminas, los ácidos nucleicos,
los alcaloides, las porfirinas, los esteroides, los flavonoides y muchos metabolitos.
6.2. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN MOLECULAR
Los métodos atómicos de emisión se basan en la medida de la radiación emitida de una

muestra, previamente excitados.
La determinación espectroscópica de especies atómicas sólo se puede llevar a cabo dentro
de un medio gaseoso, en el cual los átomos individuales están separados unos de otros, por
lo que el primer paso en todos los procedimientos espectroscópicos es la atomización, un
proceso en el cual los átomos de la muestra son excitados a estados electrónicos superiores.
11
Curso
En la espectroscopia de emisión atómica una parte de la muestra se vaporiza y se excita

térmicamente hasta alcanzar la emisión atómica.
Durante su regreso a un estado electrónico basal o más bajo, los átomos y moléculas emiten
la radicación característica de los componentes de esa muestra. La luz emitida pasa por un
monocromador que aísla la longitud de onda específica para el análisis deseado. Un
fotodetector mide la potencia radiante de la radiación seleccionada, que entonces es
amplificada y enviada a un dispositivo de lectura. La rápida relajación de las especies
excitadas va acompañada de la producción de espectros de líneas ultravioleta y visibles que
son útiles para el análisis de los elementos.
Cada elemento emite un conjunto característico de longitudes de onda discretas en función

de su estructura electrónica. Mediante la observación de estas longitudes de onda puede
determinarse la composición elemental de la muestra.
Los espectros de emisión obtenidos utilizando fuentes de plasma, arco o chispa son muy
complejos, están constituidos por cientos, e incluso, miles de líneas.
La espectroscopia atómica se emplea en la determinación cualitativa y cuantitativa de

muchos elementos. Cada elemento de la tabla periódica tiene un espectro de emisión único
que se conoce como firma espectral, por lo que analizando el espectro de emisión de una
sustancia podemos identificar los elementos que la componen, mientras que la intensidad
de la radiación emitida cuantifica su concentración.
7. METODOS NO ESPECTROSCOPICOS
7.1 TÉCNICAS BASADAS EN LA DISPERSIÓN DE RADIACIÓN
Existen diferentes tipos de dispersión, algunas son:
- Dispersión elástica: se genera cuando la radiación incidente tiene la misma longitud de

onda que la dispersada. Dentro de este tipo de dispersión encontramos la dispersión de
partículas pequeñas o Rayleigh que se produce cuando el tamaño máximo de las partículas
que producen la dispersión es menor al 5% de la longitud de onda de la radiación. (Esta
dispersión es la responsable, por ejemplo, del color del cielo).
12
Curso
- Dispersión inelástica: se produce cuando el fotón emitido tiene una longitud de onda
diferente.
Dispersión elástica Dispersión inelástica
A. TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas
sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia.
La turbidez es la propiedad óptica de una muestra que hace que la radiación sea dispersada
y absorbida más que transmitida en línea recta a través de la muestra. La turbidez es
ocasionada por la presencia de materia suspendida en un líquido.
Hay dos métodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetría y la nefelometría.
Son dos técnicas complementarias. La dispersión afectará a la dirección de la propagación,
porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo.
En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega
a la disolución. En cambio, en la nefelometría la medida de la intensidad de luz se hace con
un ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. El instrumento usado en la
nefelometría, el nefelómetro se asemeja al fluorómetro. En cambio, en turbidimetría se
utiliza el turbidímetro que es un fotómetro de filtro.
La elección entre turbidimetría y nefelometría viene dada por dos factores:
- Intensidad de la radiación transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación

procedente de la fuente. Cuando la concentración de partículas dispersantes en la disolución
es pequeña. Por lo que la mejor elección cuando la muestra contiene pocas partículas
dispersantes es la nefelometría. La turbidimetría es una buena técnica para cuando las
muestras contienen grandes concentraciones de partículas dispersantes.
- Tamaño de las partículas dispersantes. En la nefelometría la intensidad de la radiación

dispersada a 90o es mayor si las partículas son bastante pequeñas para que se produzca una
dispersión Rayleigh. Si las partículas son mayores la intensidad de la dispersión disminuirá
a 90o. En turbidimetría la señal consiste en la disminución relativa de la radiación
transmitida, por lo que el tamaño de las partículas dispersantes es menos importante.
13
Curso
8. CITOMETRIA DE FLUJO
La citometría de flujo se basa en medir características de cada elemento particulado en

suspensión (principalmente celular), cuando se le incide un rayo de luz.
➢ La técnica necesita de un equipo complejo compuesto por:
• Sistema lumínico formado por un rayo de luz de tipo láser y combinación de

espejos, filtros y cristales que llevan la señal luminosa hasta receptores
fotomultiplicadores.
• Sistema fluídico donde las células en suspensión e individualizadas se llevan por
un circuito líquido a una cámara de flujo por el que una célula se sitúa de manera
precisa y estable frente al rayo lumínico.
• Sistema electrónico/informático que recoge, maneja y permite representar y
cuantificar todos los parámetros recogidos, para la evaluación de los distintos
parámetros lumínicos.
➢ En la citometría de flujo se cuantificarán básicamente los siguientes parámetros:
• El canal de dispersión hacia adelante (FSC, Forward Scatter Channel): nos

informa del tamaño celular.
• El canal de dispersión lateral (SCC, Side Scatter Channel): nos informa de lo que
se conoce como complejidad (rugosidad celular, granulosidad celular, etc.).
Con la valoración de FSC y SCC es posible definir los grandes grupos celulares
morfológicamente diferenciables.
14
Curso
Para la medición de estos parámetros la fluorescencia será importante por eso se deben
utilizar fluorocromos.
La principal metodología para llevarlo a término es la inmunofluorescencia (es el marcaje

con fluorocromos de anticuerpos que se unirán a sus antígenos).
Inmunofluorescencia: El anticuerpo es marcado con un fluorocromo. Este anticuerpo se unirá

específicamente al antígeno o epitopo (en este caso una molécula de la célula).
Los fluorocromos son productos químicos que al ser estimulados con fotones con longitud
de onda comprendidos entre diferentes rangos emiten a su vez otro fotón de longitud de
onda mayor. La que más se utiliza es la fluoresceína que al ser estimulada con ultravioleta
emite luz visible de color verde, aunque existen muchos como la ficoeritrina, rodamina, rojo
de Texas…
Es posible a la vez combinar varios fluorocromos siempre que emitan diferentes longitudes
de onda y el fluorómetro sea capaz de excitarlos a la vez y discriminar entre los fotones
emitidos.
Los colorantes más utilizados son la fluoresceína con excitación máxima a 495 nm y emisión
máxima de 520 nm, la ficoeritrina con excitación máxima a 495 nm y emisión a 576 nm, lo
que permite utilizarlos a la vez.
15
Curso
Una vez excitados los fluorocromos, en el sistema informático podremos observar las
diferentes maneras de representarse los datos. Pueden representarse los datos por
histogramas monoparamétricos (FSC o SCC), o usando el “dot-plot”, que son histogramas
paramétricos, siendo este el más utilizado y cada célula podrá representarse usando los dos
parámetros (FSC y SCC).
En estas gráficas se pueden analizar los parámetros delimitando agrupaciones de

características concretas mediante “ventanas citométricas” (gates) o “cuadrantes”. La
citometría también puede proporcionar contaje absoluto de células mediante la adición en
la muestra de partículas diferenciables en una concentración concreta permitiendo calcular
los valores absolutos de las células a estudiar.
Ejemplos de citometria de flujo para detectar fenotipos de células inmunes (Linfocitos Th;
Linfocitos T de memoria, Lintocitos Tc). Se han marcado los CD (que son agrupaciones de
moléculas características de cada célula).
BIBLIOGRAFÍA
1. Análisis instrumental: Espectrometría de Absorción Atómica (EAA)

2. Métodos Espectroscópicos de Análisis
3. Videos complementarios:
16
Curso
https://www.youtube.com/watch?v=ini1RDN7VzQ
https://youtu.be/fXjP10sdmQU
https://youtu.be/0dLppJd_xd0
Citometría de flujo. Fundamentos básicos.
https://youtu.be/gEdZvuDrWo4
Citometría de flujo. Aplicaciones clínicas.
https://youtu.be/2bWsSEGtmGQ
17

Ud 7 Tecnicas Opticas de Analisis PDF

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Ud 7 Tecnicas Opticas de Analisis PDF

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Ud 7 Tecnicas Opticas de Analisis PDF

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Curso

U.D.7: TÉCNICAS ÓPTICAS DE ANÁLISIS 2023-2024

2. PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Y

La radiación electromagnética está formada por la combinación de campos eléctricos que

Las ondas electromagnéticas tienen las vibraciones perpendiculares a la dirección de

El campo eléctrico es perpendicular al campo magnético

A diferencia de otros fenómenos ondulatorios, como el sonido, la radiación

En cualquier medio material, la propagación de la radiación disminuye a causa de la

Sin embargo, para describir cuantitativamente determinadas interacciones con la materia,

La energía del fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación (la frecuencia se define

El espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de

Se denominan métodos ópticos a los métodos espectroquímicos que utilizan no sólo la

3. DIFERENTES COMPORTAMIENTOS DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA

➢ Difracción de la radiación: proceso por el que un haz paralelo de radiación se

➢ Transmisión de la radiación: La velocidad a la que se propaga la radiación a través

➢ Refracción de la radiación: se trata de un cambio brusco de dirección de la

➢ Reflexión de la radiación: cuando la radiación atraviesa una interfase entre

➢ Dispersión de la radiación: Fracción de la radiación momentáneamente retenida

4. INTERACCIÓN MATERIA-RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

Cuando la materia interacciona con energía térmica o electromagnética, los átomos y

• MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS: aquellos en los que existe intercambio de energía

• MÉTODOS NO ESPECTROSCÓPICOS: aquellos en los que no hay intercambio de

5.1 TÉCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN

La espectrofotometría de UV-visible y la espectrofotometría de absorción atómica, se basan

- Absorción de radiación y concentración: Ley de Lambert-Beer

La absorción de radiación provoca una alteración en la posición de ciertos electrones de las

Conocida la T (transmitancia) podemos conocer la A (absorbancia).

A partir de la ley de Lambert-Beer podemos definir que:

• c →representa la concentración de la muestra (mol/l).

La ley tiende a no ser válida para concentraciones muy elevadas, especialmente si el

La espectrofotometría UV-Visible es una técnica de medición basada en la absorción de

La absorción por parte de la molécula estudiada de un tipo u otra de radiación UV o visible

El estado de excitación de la molécula es emitirá la energía recibida en forma de calor o de

Podemos conocer la cantidad de bacterias que presenta un medio dada su absorbancia

La elección del tipo de material de nuestra cubeta también es importante, ya que no

El espectrofotómetro de UV-visible funciona de un modo muy simple:

El espectrofotómetro se compone de las siguientes partes:

La espectroscopia de absorción atómica se basa en la absorción de luz por parte de átomos

La mayoría de las muestras se encuentran en estado líquido o sólido y en esta técnica la

• Atomizador de llama: este tipo de atomizador solamente acepta soluciones

El esquema general que presentan estos espectroscopios es:

6. TÉCNICAS BASADAS EN LA EMISIÓN DE RADIACIÓN

6.1. FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR

La luminiscencia es el término aplicado a la re-emisión de radiación que ha sido

La fotoluminiscencia puede clasificarse en: fluorescencia y fosforescencia. Se diferencian en

Podemos encontrar dos diseños: fluorómetro y espectrofluorímetro. Los distintos

• Componentes de un fluorómetro o un espectroflurímetro:

Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse por fluorescencia se

6.2. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN MOLECULAR

Los métodos atómicos de emisión se basan en la medida de la radiación emitida de una

En la espectroscopia de emisión atómica una parte de la muestra se vaporiza y se excita

Cada elemento emite un conjunto característico de longitudes de onda discretas en función

La espectroscopia atómica se emplea en la determinación cualitativa y cuantitativa de

7.1 TÉCNICAS BASADAS EN LA DISPERSIÓN DE RADIACIÓN

Existen diferentes tipos de dispersión, algunas son:

- Dispersión elástica: se genera cuando la radiación incidente tiene la misma longitud de

Dispersión elástica Dispersión inelástica

La elección entre turbidimetría y nefelometría viene dada por dos factores:

- Intensidad de la radiación transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación

- Tamaño de las partículas dispersantes. En la nefelometría la intensidad de la radiación