Conjunto de Estudios de Caso

Fundación REDBIO Internacional
Juan Izquierdo y Alicia Diamante
Conjunto de estudios de caso

sobre biotecnologías simples, sostenibles
y de bajo costo para la agricultura familiar
Editora
Sandra Sharry
Diseño y diagramación
Eva C. Godoy Contreras
Impresión
XXXX
ISBN: XXXX
Índice
La Fundación REDBIO Internacional 5
Presentación 7
Prólogo 9
Autores 13
Capítulo I La pequeña agricultura: un escenario para la intensificación sostenible 17

de la producción incluyendo la aplicación de las biotecnologías simples.
Juan Izquierdo Fernández , Sandra Sharry y Marcos Rodríguez Fazzone
Capítulo II Cultivo de Tejidos Vegetales 29

María de los Angeles Basiglio
Capítulo III Infraestructura para aplicar biotécnicas simples. Ideas para el diseño 39
de un laboratorio económico de cultivo in vitro de tejidos vegetales
Alejandro Escandón
Capítulo IV Cultivo de Tejidos vegetales. Medios de cultivo para plantas 51

Alicia Rangel Cano
Capítulo V Micropropagación 57
Rosa María Oviedo de Cristaldo
Capítulo VI Cultivo de meristemas 75

Teresa Avila Alba
Capítulo VII Biorreactores de bajo costo para micropropagacion. Elaboracion de biorreactores 87

de bajo costo para micropropagacion de especies de interes
Iselen Trujillo
Capítulo VIII Marcadores moleculares 99

María de Lourdes Torres y Lorena Mejía
Capítulo IX Biofertilizantes. Microorganismos benéficos en agricultura 109
Elizabeth Hodson de Jaramillo, Ph.D. y Lucia Ana Díaz-Ariza, M.Sc.
Capítulo X Conservación in vitro de los recursos genéticos vegetales 125

Ana Abdelnour Esquivel
Capítulo XI Agroinfeccion: una tecnica sencilla para el mejoramiento de plantas 145

Rosa María Rangel Cano
Glosario 157
Bibliografía 159
La Fundación REDBIO Internacional
Conocimiento Biotecnológico Integrado
Fundación Redbio Internacional es una organización No Gubernamental sin fines de

lucro que promueve el desarrollo y la utilización responsable de la biotecnología como
elemento clave para el crecimiento competitivo y sustentable de la producción agropecuaria
y forestal de la Región.
Lanzada como idea en 1998 y creada en el año 2002 como una Organización no
Gubernamental sin fines de lucro, la Fundación REDBIO Internacional (FRI) actúa como
brazo ejecutor de la REDBIO, con el objetivo principal de facilitar y promover la cooperación,
la investigación en conjunto, y la transferencia de biotecnología agropecuaria como parte de
las actividades designadas como prioritarias de la red REDBIO/FAO.
La Fundación es el brazo ejecutivo de la REDBIO (Red de laboratorios de biotecnología

agropecuaria de América Latina y el Caribe). Esta RED promovida por la Organización de
las Naciones Unidas para la Agricultura y la alimentación (FAO), congrega a investigadores
y universidades, así como pequeñas y grandes empresas de América Latina y el Caribe,
para facilitar el intercambio del conocimiento que se generan dentro y fuera de la Región y
potenciar esfuerzos reduciendo costos I+D.
El fin último y más preciado de Fundación Redbio Internacional es dar a conocer los
beneficios que conllevan el desarrollo y la aplicación de las biotecnologías y concientizar a la
sociedad del aporte que la misma supone a la modernización e integración de la región en
el contexto global, a la mejora de la calidad de vida en general y al alcance de la soberanía
tecnológica y alimentaria en particular.
Son objetivos de Fundación Redbio Internacional el promover la concreción de los fines

de la Redbio/FAO:
1- Impulsando el intercambio de conocimientos, tecnología y materiales biológicos entre las
instituciones y organizaciones públicas y privadas de los países de América Latina y el Caribe.
2- Fomentando, el estudio, uso racional y conservación de la biodiversidad de la región.
3- Favorecimiento la gestión de proyectos de investigación y desarrollo entre institutos, laboratorios y
empresas de la región, con similares a nivel mundial.
4- Auspiciando la capacitación técnica y generación de recursos humanos calificados a todo nivel en temas
de biotecnología.
5- Asesorando a los gobiernos, organizaciones regionales e internacionales para la consolidación de estrategias
de desarrollo en biotecnología.
6- Promoviendo políticas nacionales y regionales de desarrollo de biotecnología para los sectores productivos
y agroindustriales.
7- Obteniendo contribuciones nacionales e internacionales para cumplir con sus fines.
Desde el año 2002 La Fundación Redbio Internacional coordina en la región acciones para desarrollar
capacidades, formar recursos humanos y brindar asistencia técnica a los gobiernos e instituciones en temas
relacionados con las biotecnologías.
A tal efecto la FRI cuenta con puntos focales en diferentes países que recopilan información correspondiente a
su ámbito específico a fin de lograr la mejor calidad, mayor seriedad y profesionalismo en los productos y servicios
brindados.Todos los esfuerzos se congregan en el sistema de información en biotecnología agrícola para América
Latina y el Caribe: infoREDBIO, el cual permite acceder a la base de datos que congrega más de 643 laboratorios
de 32 países y alrededor de 4000 investigadores.(www.redbio.org)
La FRI basa su acción en 4 ámbitos, dentro de los cuales ha coordinado y gestionado varios proyectos.
1. Ámbito innovación e investigación 3. Ambito educacion y comunicación
2. Ambito marco regulatorio y bioseguridad 4. Ámbito bioética y aspectos legales.
Conéctese a nuestra página web www.fundacionredbio.org e infórmese sobre todo lo que hay que saber
sobre las biotecnologías en la región o al portal de Redbio/FAO www.redbio.org
Alicia Diamante Vice Presidente

Fundación REDBIO Internacional
Presentación
El presente manual ha sido preparado a sugerencia de la Fundación REDBIO Internacional y como parte
de un acuerdo de colaboración con la Oficina Regional de la FAO. El manual compila contribuciones de
autores investigadores latinoamericanos del sector académico y científico quienes han volcado su experiencia
en biotecnologías de bajo costo y han aportado los resultados de sus investigaciones.
El objetivo de este trabajo es difundir el uso de las biotecnologías con el propósito de orientar a los
sistemas de pequeños agricultores en el uso de técnicas novedosas pero simples, sostenibles y de bajo costo.
Se ha basado en la transferencia de conocimientos desde el sector académico al productivo mediante

casos ajustados y validados que han permitido su uso por agricultores familiares.
Este aporte busca apoyar el camino de una agricultura sostenible y ecológicamente segura, obtener
productos inocuos y de mayor calidad, contribuir a la seguridad alimentaria a través de la generación de
ingresos por acceso a mercados y mejorar las condiciones laborales de los productores y de sus familias.
El manual está dirigido a facilitadores de procesos de desarrollo rural, técnicos y extensionistas agrícolas,
organizaciones de productores, maestros de escuelas rurales, pobladores urbanos y peri-urbanos y a los
grupos de Agricultura Familiar y pequeños agricultores en general.
Su edición ha respondido a las siguientes preguntas:
¿Cómo facilitar el acceso de los pequeños productores a nuevos conocimientos para que puedan
ayudarles a resolver sus problemas?
¿Cómo promover el uso de experiencias exitosas en laboratorio entre los pequeños agricultores?
Esperamos que sea útil y que cumpla con el propósito pautado.
Sandra Sharry, Dr. Alicia Diamante, MSc. Juan Izquierdo

Secretaria Ejecutiva VicePresidente Presidente
Prólogo
En los últimos cincuenta años la agricultura latinoamericana ha vivido un profundo proceso de transformación:
se ha integrado fuertemente al mercado; se ha industrializado; ha complejizado su proceso productivo
modernizándolo a través de la aplicación de adelantos tecnológicos en la producción y utilizando insumos
modernos comprados a la industria, ha modificado sustantivamente sus sistemas de gestión y administración,
Sin embargo, esta modernización ha tenido un carácter desigual e incompleto en todo el continente lo que fue
creando y desarrollando una agricultura fuertemente heterogénea. Es por ello que hasta hoy se visualiza en el
continente, un espectro amplio de unidades productivas de diferente dimensión, pero también con diferentes
racionalidades.
Vale la pena citar la definición de agricultura familiar correspondiente a la Plataforma Tecnológica Regional
sobre Agricultura Familiar del PROCISUR2, en tanto se trata de una definición consensuada entre equipos
técnicos oficiales de los países del MERCOSUR y asociados :
“La Agricultura Familiar es un tipo de producción donde la Unidad Doméstica y la Unidad Productiva están
físicamente integradas, la agricultura es la principal ocupación yfuente de ingreso del núcleo familiar, la familia aporta
la fracción predominante de la fuerza de trabajo utilizada en la explotación, y la producción se dirige al autoconsumo
y al mercado conjuntamente”.
Según lo manifestado por los participantes del Foro nacional de Agricultura Familiar (2006), reunido en
Mendoza, Argentina, la agricultura familiar es una “forma de vida” y “una cuestión cultural”, que tiene como
principal objetivo la “reproducción social de la familia en condiciones dignas”, donde la gestión de la unidad
productiva y las inversiones en ella realizadas es hecha por individuos que mantienen entre sí lazos de familia, la
mayor parte del trabajo es aportada por los miembros de la familia, la propiedad de los medios de producción
(aunque no siempre de la tierra) pertenece a la familia, y es en su interior que se realiza la transmisión de valores,
prácticas y experiencias.
Se incluye en esta definición genérica y heterogénea distintos conceptos que se han usado o se usan en
diferentes momentos, como son: Pequeño Productor, Minifundista, Campesino, Chacarero, Colono, Productor
familiar, y en nuestro caso también los campesinos sin tierra, los trabajadores rurales y las comunidades de
pueblos originarios, lo cual es compartido por el enfoque de este manual.
Tanto a nivel nacional como regional es fundamental considerar el carácter multifuncional de la Agricultura
Familiar, sobre todo en lo que se refiere a la producción de alimentos de alta calidad y seguridad, al mantenimiento
del equilibrio de los ecosistemas, al desarrollo de actividades económicas no agropecuarias que fortalecen el
desarrollo territorial y local, a la generación y mantenimiento de puestos de trabajo, a la ocupación territorial, y la
posibilidad de evitar la expulsión masiva de agricultores y población rural a las zonas urbanas.
Según el investigador brasileño Elibio Rech, “la introducción de la tecnología en la agricultura familiar puede
ser un derecho fundamental y crucial para la participación efectiva y más continua en este importante sector de los
agronegocios en el desarrollo económico y social de los países de latinoamerica. Sin embargo, la tecnología debe ser
configurado como parte de una estrategia de desarrollo que requiere un análisis ex ante en relación con la naturaleza y
la fuerza, combinado con un conjunto de intervenciones complementarias que permitan maximizar los efectos positivos
y mitigar los costos sociales. … El uso de la biotecnología podría ayudar a resolver diferentes problemas y ampliar los
resultados obtenidos por la agricultura familiar, con profundas consecuencias en la calidad de vida de las familias de
agricultores y la agroindustria moderna”.
Las biotecnologías comprenden el uso de organismos (también partes de organismos

o sus procesos) para obtener bienes, productos y servicios.
Las biotécnicas abarcan desde las simples herramientas del cultivo de tejidos hasta la complejidad de la
tecnología del ADN recombinante y la genómica.
Por ejemplo, dentro de las biotécnicas mas difundidas, la micropropagación permite obtener plantas sanas
y libres de enfermedades (capítulos 5 y 6), las nuevas técnicas de reproducción animal permiten aumentar la
productividad, los kits de diagnóstico se utilizan para la identificación de las enfermedades (capitulo 8), el uso
de de cultivos tolerantes a la salinidad, la sequía, el frío y aumentando el valor nutritivo de diferentes alimentos
permite la expansión de la producción en áreas que no podían ser utilizadas en el pasado (capitulo 11), el uso
de tecnologías de ADN recombinante permite aumentar el tiempo de maduración de la fruta, lo que facilita
su comercialización y reducir de las pérdidas postcosecha, la biorremediación minimiza el impacto ambiental, el
cultivo de tejidos in vitro permite aumentar la variabilidad genética (capitulo 2), la biofertilización facilita practicas
mas amigables con el ambiente (capitulo 9) y varias biotécnicas facilitan la conservación de los recursos genéticos,
como semillas y brotes (capitulo 10), entre otros.
Con esta disponibilidad de opciones de uso y aplicación de nuevas técnicas, este Manual “Conjunto de
estudios de caso sobre biotecnologías simples, sostenibles y de bajo costo para la agricultura familiar” ha sido
diseñado como una herramienta de apoyo al quehacer diario del pequeño productor agrícola.
La
distribución de los capítulos del manual por BIOTECNICAS, permite que cada tema sea tratado en forma
independiente. Por lo tanto, su lectura no necesariamente debe seguir el orden clásico de cualquier libro, sino que
se acomodará a la necesidad del lector.
De esta manera, se recomienda acercarse al manual desde la perspectiva de la duda o la necesidad de

información. En cada capítulo se encontrará una visión general inicial a modo de introducción, un cuerpo del
capítulo, conceptos centrales, ﬁguras e imágenes explicativas, en algunos casos una ficha o protocolos para seguir.
Es importante destacar que el usuario del manual puede contar con apoyo par ampliar la información, a través de
la Fundación REDBIO Internacional y su sitio web. www.fundacionredbio.org.
Pasar de una actividad de autoconsumo a una de proyección comercial, necesita un soporte tecnológico
que es necesario adecuar a las condiciones de producción para asegurar su sostenibilidad y la eficiencia en
el uso de los recursos en agricultura familiar. Por ello, la idea general del manual es transferir biotecnologías
simples ajustadas en el sector académico a agricultores familiares que puedan utilizarlas. Estos protocolos, y
experiencias han sido validadas por los autores y colaboradores.
Una tecnología validada es aquella tecnología que ha sido puesta en práctica con éxito con agricultores,
especialmente en un entorno rural y que puede ser fácilmente replicable.
La información aquí compilada queda disponible como un bien público y ha sido desarrollada mediante un
enfoque participativo, contribuyendo a la seguridad alimentaria y al aumento de rendimiento de la tierra y de la
productividad.
Las biotecnicas aquí explicadas, pueden ser adaptadas en varios lugares y son fáciles de adoptar por diversos
grupos de usuarios. En general, requieren un aporte bajo de insumos y son acordes con el uso sostenible de los
recursos naturales
Confiamos que la aplicación de un novedoso y práctico equipo de técnicas permita

vislumbrar horizontes de mayores beneficios para los pequeños productores.
Nuestra misión es promover el desarrollo e implementar participativamente

biotecnologías de punta, simples, eficientes y de bajo costo en los procesos productivos,
como una herramienta tecnológica que permita incrementar rendimientos, reducir
costos de producción y mejorar la calidad de los procesos productivos de los pequeños
agricultores.
Sandra Sharry, Editora.

Autores
Juan Izquierdo Fernández
Presidente, Fundación REDBIO Internacional

Director del Magister de Gestion Tecnológica-Biotecnología, Universidad de Talca, Chile
juanizquierdo813@gmail.com / jizquierdo@talca.cl
Licenciada en Ecología
CEPROVE, Centro Experimental de Propagación Vegativa
Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad nacional de La Plata
maribasiglio@hotmail.com
Alejandro Escandón
Instituto de Genética Ewald Favret (INTA-Castelar)

REDBIO de Argentina Asociación Civil
aescandon@cnia.inta.gov.ar
Rosa María Oviedo de Cristaldo
Ingeniero Agrónomo, Doctor en Fitotecnia. Docente-Investigador

Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas (CEMIT) Universidad Nacional de
Asunción (UNA). Campus Universitario, San Lorenzo, Paraguay
rosa.cristaldo@gmail.com
Teresa Avila Alba
Ing. Agronoma, Master en Biotecnología.

Responsable del Area de Recursos genéticos y Biotecnología
Centro de Investigaciones Fitoecogenéticas de Pairumani
Casilla de correo 128, Cochabamba, Bolivia
t.avila@fundacionpatino.org
Iselen Trujillo
Dra en Ciencias. Mencion Botanica. Area Biotecnologia Agricola. Profesor Asociado. Investigadora.
Universidad Nacional Experimental Simon Rodriguez
Instituto de Estudios Cientificos y Tecnologicos-IDECYT. Altos de la Mariposa. Sector El Cuji.Via
San Antonio de los Altos. Edo. Miranda. Venezuela
iselen03@yahoo.com
Irapuato Km. 9.6 lib NTe Carretera Irapuato - Leon. Irapuato, Gto. Mexico
mail de contacto: ali.raca@hotmail.com
Técnico de Investigación
Departamento de Inegniería Genética
Alicia Rangel Cano
Irapuato Km. 9.6 lib NTe Carretera Irapuato - Leon. Irapuato, Gto. Mexico
mail de contacto: ali.raca@hotmail.com
Técnico de Investigación
Departamento de Inegniería Genética
Centro de Investigación en Biotecnología,

Instituto Tecnológico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica.
aabdelnour@itcr.ac.cr
Elizabeth Hodson de Jaramillo
Profesora Emérita Facultad de Ciencias - Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia

Carrera 7 Nº 40-62 Tel 571 3208320 Ext 4042
ehodson@javeriana.edu.co
Sandra Sharry
Secretaria Ejecutiva, Fundación REDBIO Internacional y Profesora

Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata
ssharry@gmail.com
Marcos Rodríguez Fazzone
Consultor FAO en Buenas Prácticas Agrícolas y Agricultura Familiar

marcos.rod@gmail.com
Lorena Mejía
Licenciada en Biotecnologia Universidad San Francisco de Quito.

Asistente de Laboratorio de Biotecnologia Vegetal USFQ.
Maestrante de Maestria en Microbiologia USFQ
marilo.mc@gmail.com
María de Lourdes Torres
Maria de Lourdes Torres

Vicedecana, Coordinadora Biotecnología
Colegio de Ciencias Biológicas y Ambientales
Universidad San Francisco de Quito
ltorres@usfq.edu.ec
Lucia Ana Díaz-Ariza
Profesora Asociada, Coordinadora Laboratorio Asociaciones Suelo-Planta-Microorganismo

LAMIC. Unidad de Biotecnología Vegetal, Departamento de Biología - Facultad de Ciencias,
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia
Carrera 7 Nº 40-62 Tel 571 3208320 Ext 4056
luciana@javeriana.edu.co
Capítulo I
La pequeña agricultura
un escenario para la intensificación sostenible de la producción
incluyendo la aplicación de las biotecnologías simples
Juan Izquierdo Fernández

Sandra Sharry
Marcos Rodríguez Fazzone
19
El presente artículo se ha preparado como capítulo introductorio al presente

manual de biotecnologías simples para la agricultura familiar que ha sido
compilado y editado bajo al coordinación de la Fundación REDBIO internacional
y la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata,
Argentina. El documento recoge la acción anterior de la secretaria técnica de la
red REDBIO realizada por el autor principal en apoyo al desarrollo y aplicación
de biotecnologías simples y apropiadas a las condiciones de la pequeña
agricultura familiar.
1 FAO. 2011. Ahorrar para cre-

Antecedentes y contexto cer. http://www.fao.org/ag/save-
and-grow/es/index.html
2 FAO. 2010. El estado de la in-

En el contexto global, los sistemas actuales de producción y distribución de alimentos no están seguridad alimentaria en el mun-
consiguiendo alimentar correctamente al mundo1. El número total de personas subnutridas en 2010 do: La inseguridad alimentaria en
se estimó en 925 millones, cifra mayor que la existente hace 40 años, y en los países en desarrollo la crisis prolongadas. Roma.
prevalencia de la subnutrición asciende al 16%2. Cerca del 75% de las personas más gravemente afec-
tadas viven en zonas rurales y sus medios de subsistencia dependen directa o indirectamente de la 3 Naciones Unidas. World urba-
agricultura. nization prospects, the 2009 revi-
sion population database (http://
esa.un.org/wup2009/ unup/).
Adicionalmente, se estima que la población de la Tierra pasará de aproximadamente 6 900 millones
de personas en 2010 a unos 9 200 millones en el 20503, por lo que la seguridad alimentaria mundial se 4 Rosegrant, M.W., Ringler, C.
verá amenazada por diversos acontecimientos. y Msangi, S. 2008. International
model for policy analysis of agri-
El empleo de productos agrícolas en la producción de biocombustibles también continuará aumen- cultural commodities and trade
tando. En 2020, en los países industrializados se podrían consumir 150 kg per cápita anuales de maíz en (IMPACT): Model description.
forma de etanol, cifra similar a los índices de consumo de cereales en los países en desarrollo4. Washington, DC, IFPRI.
Tales cambios en la demanda motivarán la necesidad de aumentar notablemente (70%) la produc-

5 Bruinsma, J. 2009.The resource
ción mundial de todos los principales cultivos para la alimentación de las personas y los animales y en
outlook to 2050: By how much
especial en la pequeña agricultura. Dicha cifra equivale a una producción anual de 1 000 millones de
do land, water and crop yields
toneladas adicionales de cereales y 200 millones de toneladas adicionales de carne para 2050 en com- need to increase by 2050? Do-
paración con la producción registrada entre 2005 y 20075. cumento presentado en el Foro
de Expertos de Alto Nivel de la
Este escenario ha llevado a revalorizar la vigencia de la Agricultura Familiar (AF) como un sector FAO sobre como alimentar al
fundamental en el abastecimiento de alimentos para la sociedad y más aún, como actor protagónico en mundo en 2050, 24–26 de junio
de 2009. Roma, FAO
20
la lucha contra la inseguridad alimentaria. Es que su importancia en Agricultura familiar: estrategias de desarrollo rural
América Latina es indudable: en promedio las unidades productivas basadas en la seguridad alimentaria
en manos de este grupo representan el 80%; absorben más del y las buenas prácticas
60% del empleo sectorial y aportan entre e 30 y el 40 % del valor
bruto de la producción agropecuaria. (FAO BID, 2007). En este contexto, surgen la Buenas Prácticas Agrícolas (BPA)6
como un desafío adicional para la pequeña agricultura, en especial
En Argentina, el 66% de las unidades agropecuarias son ma- para aquellas explotaciones que no han logrado una consolidación
nejadas por agricultores familiares; absorben más del 53% del em- de su actividad agrícola. Pero desde otra perspectiva, las BPA tam-
pleo permanente rural, el 29% del empleo transitorio, y aportan el bién pueden transformarse en una oportunidad para desarrollar
20% del valor bruto de la producción agropecuaria. En la cadena el potencial productivo de este grupo e impulsarlo hacia procesos
hortícola, especialmente en zonas peri urbanas de la Provincia de más competitivos y sostenibles.
Buenos Aires, concentran entre 70 y 80% de las unidades, lo que
representa el 47% del total de la superficie dedicada a esta activi- Las BPA consisten, en una visión amplia, en “la aplicación del
dad (IICA/PROINDER, 2007). conocimiento disponible a la utilización sostenible de los recursos na-
turales básicos para la producción, en forma benévola, de productos
A pesar de que aún no existe un concepto claro y consensua- agrícolas alimentarios y no alimentarios inocuos y saludables, a la vez
do sobre este grupo, los valores mencionados son un indicativo de que se procuran la viabilidad económica y la estabilidad social”7.
que la Agricultura Familiar excede ampliamente a los productores
vinculados con la pobreza rural y por el contrario, se evidencia un De esta definición se desprende que las BPA no deben ser con-
claro potencial productivo. FAO identifica una tipología que permite cebidas solamente como una norma o un requisito estrictamente
concluir que, si bien un 52% del total de las unidades de la AF en Ar- comercial para acceder a mercados externos exigentes. En el pla-
gentina está relacionada con estados de subsistencia, el 48% restante no operativo, la aplicación y cumplimiento de las BPA enfrenta un
se encuentra en una situación de transición y consolidación de su ac- conjunto de dificultades que no necesariamente se relacionan con
tividad económica, siendo la agricultura comercial su principal fuente la buena voluntad de los productores. Los problemas se vinculan
de ingresos. En este segmento es posible encontrar una estructura con deficiencias productivas, económicas y con aspectos sociocul-
heterogénea de producción que, en función de sus activos, puede turales y ambientales que hoy caracterizan a gran parte del sector
ir desde explotaciones minifundistas hasta niveles más elevados de rural. Por lo tanto, si bien el marco regulatorio es importante, desde
tierra y capital, pero con similares problemas de gestión, manejo téc- la acción, las BPA deben ser fomentadas como una estrategia de
nico y comercialización que no les permite prosperar. desarrollo rural integral.
Lo anterior deja de manifiesto la necesidad de priorizar el dise- Por lo tanto el desafío es im- 6 www.rlc.fao.org/es/agricultu-
ño de programas específicos para cada subgrupo tipológico, pero plementar BPA a partir de tec- ra/bpa/docfao.htm
con un mismo objetivo de inclusión, sostenibilidad y producción nologías sostenibles (incluyendo
con inocuidad. en su posición como productores y abastecedores a las biotecnologías simples) y 7 www.rlc.fao.org/es/agricultura/
de alimentos para la sociedad. programas de incentivos para bpa/docfao.htm
21
la Agricultura Familiar, más que como una norma En la mayoría de los países en desarrollo exis-
8 Una experiencia valiosa en o exigencia que pueda excluir de la dinámica de te poco margen para ampliar las tierras cultivables.
terminos de metodologías de los mercados a los productores que no cumplen. En América Latina en cambio, aunque existen
extensión y asistencia técnica Estos incentivos implican necesariamente una es- tierras disponibles, la gran mayoría de ellas están
para el pequeño productor, se
trategia integral, guiada por la innovación tecno- afectadas por la degradación o sufren limitaciones
viene desarrollado en Antioquia,
Colombia, Uno de los enfoques
lógica, el uso de semillas y propágulos mejoradas relativas al suelo y al terreno. Por lo tanto, entre
de formación de los agricultores de calidad controlada, bioinsumos( biopreparados, 2015 y 2030 aproximadamente el 80% del incre-
para incorporar prácticas de ges- bioinóculos, bioprocesos) y un eficiente manejo mento necesario de la producción de alimentos
tión sostenible de los recursos del cultivo, junto a un constante acompañamiento tendrá que proceder de la intensificación en for-
naturales a sus sistemas agrícolas de la gestión predial, la organización y la comer- ma de aumento del rendimiento y de la intensidad
que ha obtenido mejores resulta- cialización. del cultivo a través de prácticas sostenibles. Cate-
dos, es la metodología de exten- góricamente no se pueden continuar con las prác-
sión conocida como Escuelas de Ello implica un desarrollo endógeno e inte- ticas de degradantes de monocultivo, cultivo con-
Campo para agricultores. El en- gral, donde en una primera instancia, las BPA se vencional del suelo, uso irracional de insumos. En
foque de las escuelas de campo enfoquen en mejorar la productividad de la Agri- este sentido PNUMA ha calculado que las prác-
para agricultores, introducido por
cultura Familiar y sus vínculos con los mercados ticas actuales insostenibles de uso de las tierras
primera vez en Asia suroriental
a finales de la década de 1980 locales formales y más competitivos, para en una cultivadas resultan en pérdidas netas de del 0,2%
como parte de un programa segunda etapa acceder a procesos de certifica- anual. En los próximos años la intensificación de
regional de la FAO de manejo ción y acercarse a las exigencias de las cadenas la producción agrícola será necesaria de manera
integrado de plagas para el arroz, agro-exportadoras. creciente en zonas de producción más marginales
ha sido adoptado en más de 75 con unas condiciones productivas menos fiables,
países y en la actualidad abarca Intensificación sostenible de la produc- como menor calidad del suelo, menor acceso a
una gran variedad creciente de ción agrícola (ISPA) incluyendo la aplica- agua y climas menos favorables.
cultivos y cuestiones relativas a la ción de las biotecnologías simples.
producción agrícola. Un reciente Un desafío de magnitud global es la necesa-
proyecto de FAO en Antioquia,
La intensificación sostenible ha sido descri- ria adaptación al cambio climático en escenarios
Colombia ha demostrado la
ta por FAO como un proceso de “aprendizaje variables de alteración de la temperatura, precipi-
generación de ingresos signifi-
cativos en cadenas agrícolas en social”, dado que los conocimientos necesarios taciones e incidencia de las plagas, lo que deter-
donde a través de BPA y comer- suelen ser más amplios que los empleados en la minará qué cultivos se pueden producir y cuándo,
cialización de productos inocuos mayoría de los enfoques agrícolas convencionales. además de su rendimiento potencial. A corto pla-
diferenciados con una marca Por ello, la ISPA requerirá un refuerzo notable de zo se prevé que aumenten la variabilidad climática
social, asociaciones de pequeños los servicios de extensión de fuentes tanto tradi- y los episodios meteorológicos extremos en to-
agricultores familiares están me- cionales como no tradicionales para respaldar su das las regiones y que tengan efectos negativos en
jorando su seguridad alimentaria adopción por parte de los agricultores8. los rendimientos.
y ofreciendo al mercado produc-
tos sanos y de calidad.
22
Es conocido que la agricultura produce cerca El enfoque ecosistémico debe aplicarse a lo

de una tercera parte de las emisiones de gases largo de toda la cadena alimentaria con vistas a
de efecto invernadero lo que supone un reto aun incrementar la eficiencia y a reforzar el sistema
mayor para los sistemas agrícolas convencionales alimentario, especialmente a nivel de la pequeña
que requieren una gran cantidad de recursos que agricultura. Entre tales sistemas y prácticas se in-
además se mueven en niveles de incertidumbre cluyen el mantenimiento del suelo sano para me-
debido al precio y la disponibilidad de la energía jorar la nutrición de los cultivos, el cultivo de una
necesaria para garantizar el funcionamiento de gran diversidad de especies y variedades en aso-
las explotaciones. Esto hace necesario considerar ciaciones, rotaciones y secuencias, el uso de varie-
diversificar notablemente las fuentes de energía dades bien adaptadas y de alto rendimiento y de
para reducir el costo de los combustibles con vis- semillas de buena calidad, el manejo integrado de
tas a incrementar la intensificación agrícola. plagas, enfermedades y malas hierbas y la gestión En un sentido amplio,
eficiente del agua.
biotecnologías incluye
En este escenario anterior, los pequeños pro-
ductores, quienes dependen en gran medida de Lo anterior implica la identificación de los sis- por lo tanto conoci-
los bienes y servicios ecosistémicos para propor- temas productivos insostenibles que requieren mientos tradicionales y
cionar alimentos, combustible y fibra para sus fa- atención prioritaria (salud del suelo, calidad del locales, prácticas orgá-
milias y el mercado, son más vulnerables a la re- agua, conservación de la biodiversidad, etc.). nicas y agroecológicas,
ducción de la calidad y la cantidad de los recursos mejoramiento genético,
naturales y a los cambios climáticos. En todos ellos y aunque el documento citado
aplicación de cultivo de
de FAO no lo menciona, la aplicación de biotec-
La intensificación sostenible propuesta por nologías simples apropiadas cobra relevancia a la tejidos y de técnicas ge-
FAO se ha definido como el incremento de la hora de elaborar este tipo de programas. nómicas, mejoramiento
producción a partir de la misma área de tierra al con ayuda de marcado-
tiempo que se reducen los efectos negativos para El International Assessment of Agricultural res e introducción de
el medio ambiente y se aumenta la contribución al Knowledge, Science and Technology for Develo- genes, por ejemplo.
capital natural y el flujo de servicios ambientales9. pment, por sus siglas IAASTD10, definió las biotec-
En línea con lo anterior los estudios demuestran nologías en la forma en que lo hace la Convención
que los sistemas agrícolas que conservan servicios sobre diversidad biológica (CBD), esto es, como
ecosistémicos mediante el empleo de prácticas “cualquier aplicación tecnológica que usa sistemas
como la labranza de conservación, la diversifica- biológicos, organismos vivientes, o derivados de estos, 9 FAO. 2011. Ahorrar para cre-
ción de cultivos, la intensificación de las legumino- para elaborar o modificar productos o procesos para cer. http://www.fao.org/ag/save-
sas y el control biológico de las plagas obtienen un uso específico.” and-grow/es/index.html
tan buenos resultados como los sistemas intensi-
10 http://www.agassessment.org/
vos que requieren gran cantidad de insumos.
23
En cambio las “biotecnologías modernas” son definidas por el Protoco-

lo de Cartagena sobre Bioseguridad y se conocen comúnmente como “la
manipulación de material genético y fusión de células más allá de las barreras
normales de mejoramiento genético”, y el ejemplo más común es la ingeniería
genética que se utiliza para generar organismos genéticamente modificados
11 Ingeniería genética es la tec-
(OGM). La IAASTD observa que el uso del término moderno es sólo con- nología que permite la manipu-
vencional y que en ninguna forma sugiere que estas técnicas son más sofisti- lación y transferencia de ADN
cadas o pertinentes que otras biotecnologías con una historia más extensa. de un organismo a otro, lo que
La biotecnología ha hecho
permite la creación de nuevas
contribuciones enormes a variedades de plantas, animales
Resumiendo, las biotecnologías comprenden el uso de los organismos
la agricultura y hay algunas y microorganismos, la corrección
o partes de los seres vivos con el fin de obtener bienes y servicios. Su
biotecnologías tan antiguas de defectos genéticos y la fabrica-
zona de estudio está entre la biología, la bioquímica y la ingeniería y tiene ción de numerosos compuestos.
como la fermentación
además gran repercusión en la farmacia, medicina, microbiología, acuicul- La tecnología de ADN recombi-
tura, la ciencia de los alimentos y la agricultura, entre otros campos. nante permite aislar y manipular
un fragmento de ADN de un
organismo para introducirlo en
Las nuevas biotecnologías comprenden el uso de tecnologías de ADN otro
recombinante o ingeniería genética asociadas con la bioinformática y las Omicas: El término “ómicas” hace
omicas11. Las biotecnologías se asocian a los animales transgénicos o plantas referencia a las disciplinas como
transgénicas, siendo estos sólo uno de los productos biotecnológicos de la genómica, la proteómica, la
avanzada. Las biotecnologías también están, por lo común, asociadas con la transcriptómica y la metabolómi-
investigación de nuevas terapias y dispositivos de diagnóstico12. ca. A estas tres últimas también
se las agrupa bajo la denomina-
ción de “genómica funcional”, ya
Según la FAO (ABDC-2010), el objetivo de las biotecnologías, tanto
que estudian a los productos de
la convencional como la moderna, debería reorientarse en beneficio de la expresión de los genes. Todas
los campesinos pobres en los países de escasos recursos. las “ómicas” se basan en el análisis
de un gran volumen de datos, y
por lo tanto se valen de la bioin-
Las biotecnologías agrícolas en los países en desarrollo deben abordar formática y de técnicas rápidas y
las necesidades específicas de los pequeños productores, por lo que deben automatizadas de alto rendimien-
fomentar su participación y la de todas las partes interesadas en el proceso to (high-throughput techniques).
de toma de decisiones y la necesidad de políticas nacionales efectivas y fa- http://www.argenbio.org/
vorables que faciliten el desarrollo y uso de biotecnologías apropiadas en los
países en desarrollo, es imperativo. Las biotecnologías agrupan a una amplia 12 Sharry S. 2011. Biotecnologìas
gama de herramientas y metodologías que se aplican en cierta medida en modernas: la responsabilidad del
“no hacer”.In press
24
mente seguras, y socio económicamente y

cultivos, ganadería, sector forestal, pesca y acuacul-
tura, y agroindustrias, para contribuir a la reducción culturalmente aceptables. Son aquellas bio-
Las biotecnologías pueden
del hambre y la pobreza, la adaptación y mitigación tecnologías que promueven el desarrollo de
coadyuvar al desarrollo del cambio climático y para mantener la base de una agricultura sostenible a través del uso de
sustentable: desde marca- recursos naturales en los países en desarrollo.  El recursos genéticos y procesos de transforma-
dores de ADN para apo- debate que rodea a los organismos genéticamen-
ción de dichos recursos considerando la cul-
yar al fitomejoramiento, la te modificados (OGM) frecuentemente dificulta
tura y tecnología local13.
micropropagación, hasta la el desarrollo de otras biotecnologías agrícolas en
donde no existe controversia sobre sus posibles
caracterización molecular
impactos ambientales y sus beneficios para los pe- Para que la aplicación de las técnicas biotec-
para desarrollar cultivos queños productores, así como sobre su importante nológicas no resulte en actividades aisladas con
microbianos mejorados papel frente al cambio climático. poca relevancia y con aceptación por parte de
para alimentos, biocontro- los productores y consumidores, es necesario en-
ladores, biofertilizantes y Los productos y servicios agrobiotecnológicos marcar dichas tecnologías en el concepto de una
bebidas fermentadas. comerciales (cultivos transgénicos, agentes de biotecnología apropiable y apropiada. Este con-
biocontrol, métodos de diagnósticos, bioprospec- cepto tiene como objetivo orientar la aplicación
ción, propágulos “indexados” y micropropagación de la biotecnología de una manera responsable y
13 IZQUIERDO, Juan and DE LA masificada), están siendo gradualmente comercia- viable, orientada a las necesidades reales, tanto de
RIVA, Gustavo A. Plant biotech- lizados en el sector agrícola latinoamericano. Sin los productores como de los consumidores.
nology and food security in La- embargo, para su inserción como biotecnología
tin America and the Caribbean. apropiadas a las condiciones de producción y a la La biotecnología tiene que verse desde la
Electronic Journal of Biotechno- realidad socioeconómica y cultural de la Región, perspectiva de los impactos de la investigación en
logy [online]. 15 April 2000, vol. se deben superar un conjunto de obstáculos cien- los beneficiarios, la aceptación del producto por
3, no. 1 [cited February 2006].
tíficos y tecnológicos, legales y regulatorios, que parte de los beneficiarios y consumidores fina-
Available from Internet: http://
www.ejbiotechnology.info/con-
impiden la eficiente y equitativa utilización de es- les, la concreción de capacidades en investigación
tent/vol3/issue1/full/1/index.html. tos productos y servicios. conjuntamente con la viabilidad científica y econó-
ISSN 0717-3458. mica y finalmente con la evaluación de los riesgos
Biotecnologías “apropiables” significan he- potenciales para la salud y el medioambiente.
14 Wendt, J. Izquierdo, J. 2003. rramientas biotecnológicas que contribuyen
Management of appropriate En éste contexto, según Wendt e Izquierdo
al desarrollo sostenible al ser técnicamente
agricultural biotechnology for (2002)14, es sumamente importante que antes de
small producers: case study – factible dentro del nivel de desarrollo técni- realizar cualquier actividad se deba analizar:
Ecuador. Electronic Journal of co-científico de un país; al proveer beneficios • La relevancia de la investigación para los be-
Biotechnology Vol. 6 No. 1, Abril tangibles a los destinatarios y ser ambiental- neficiarios
15 de 2003.
25
• La aceptación del producto por parte de los 3. Dependiendo de la respuesta de la

beneficiarios y consumidores especie a factores bióticos y abióticos, la
• La disponibilidad real de insumos para reali- búsqueda de soluciones mediante aplica-
zar la investigación (recursos humanos y financie- ción de bioinsumos, sistemas de control
ros, tecnologías, etc.) y su viabilidad integrado de plagas y enfermedades y el
• El riesgo potencial para el medio ambiente mejoramiento genético convencional o
y la salud moderno.
• La oportunidad y pertinencia según el culti- 4. Multiplicación de la especie por mé-
vo y el estado de avance tecnológico local. Antes todos convencionales o por cultivo de te-
de soluciones biotecnológicas pueden haber al- jidos para incrementar la oferta de mate-
ternativas más baratas y viables desde tecnologías rial vegetal, lo que contribuye a fortalecer
tradicional y/o convencional para responder a un los programas de fomento, y 15 www.argenbio.org/adc/
determinado problema. 5. Implementación del paquete tec- uploads/pdf/manejo_y_gestion.
doc
• La sostenibilidad económica, en la medida en nológico y prácticas culturales apropiadas
que la solución debe tender al auto sostenimiento para el establecimiento del material pro-
16 http://www.redbio.org/
y permanecer en el tiempo, aun cuando el apoyo misorio en campo. estud_casos.htm
o soporte inicial termine y el proceso quede en
manos de los agricultores o autoridades locales. Los estudios de caso realizados por REDBIO 17 www.cauca.gov.co/.../
• La sostenibilidad ambiental, en la medida en en Argentina15, Bolivi16, Colombia17, Ecuador18 y Manejo_y_gesti_n_de_la_
que la biotecnología clásica o moderna puede te- Perú19 demuestran que si bien en la aplicación biotecnolog_a_agr_cola_
ner un impacto ambiental en el corto, mediano y de la biotecnología moderna ha habido impor-
largo plazo que debe ser evaluado antes de iniciar tantes influencias de las multinacionales que con- 18 www.rlc.fao.org/es/agricultu-
su aplicación. trolan el mercado de las semillas transgénicas ra/pdf/ecuador.pdf
con avances muy significativos en la siembra de
19 http://www.bio-nica.info/
Con base en esta concepción, la biotecnología variedades geneticamente modificadas (OGMs),
biblioteca/Pastor2004Biotenolo-
ofrece oportunidades para la pequeña agricultura existen oportunidades para la utilización sosteni- giaPequeños.pdf
dentro del siguiente marco: ble de la agrobiodiversidad a través de las bio-
tecnologías simples y que es necesario un marco 20 Izquierdo, J y de la Riva, G.
1. Selección del material en campo institucional y político que permita el estable- 2000. Plant biotechnology and
con base en sanidad y productividad en cimiento de las capacidades necesarias para el food security in Latin America
diferentes regiones geográficas. aprovechamiento efectivo del potencial que re- and the Caribbean. EJB Electronic
2. Conocimiento del nivel de diversi- presenta la biotecnología en especial enfocando Journal of Biotechnology, 3 (1)
dad genética y tamizaje de la especie. a la seguridad alimentaria20. April 15.
26
En particular el cultivo de células y tejidos Las biotecnologías simples, como se verán

Para que la biotecnología
vegetales in vitro incluyendo la micropropaga- en el presente manual representan un apoyo
beneficie a los pequeños
ción, la embriogénesis somática, el rescate de directo a la intensificación sostenible de la pro-
agricultores, sus reque-
embriones, la regeneración de plantas a partir ducción para la pequeña agricultura. El objetivo
rimientos, capacidades,
del callo y suspensiones celulares, así como el es no sólo valorar el conocimiento científico
prioridades y limitaciones
cultivo de protoplastos, anteras y microsporas, que sustenta cada una de las biotécnicas (com-
deben ser incorporados
están permitiendo la conservación y multipli- pila los desarrollos de destacados investigado-
en los proyectos de desa-
cación a mayor escala de numerosas especies res de América latina), sino especialmente el
rrollo de esta tecnología.
y la obtención de material vegetal libre de vi- conocimiento práctico que permite el empleo
Por añadidura, y para el
rus. La conservación de germoplasma in vitro de varias biotecnologías con sentido de utilidad
caso de las agrobiotecno-
ha sido trabajada con éxito en la región, tanto social-productiva, amigable con el ambiente: un
logías, en general la gente
para plantas cultivadas como silvestres. conocimiento práctico que ofrezca respuesta a
local sabe priorizar las
los siguientes interrogantes del saber y, espe-
soluciones que le harán Estas estrategias de conservación a través de
cialmente, del saber hacer: qué es… cómo es…
economizar esfuerzos y biotecnologías simples constituyen un complemen-
to y soporte de los sistemas tradicionales para el cómo se usa… cómo se mantiene… para qué
dinero. Es el entramado
mantenimiento de muchos fenotipos, en especial es… para qué se hace… … para quién es…
social el que tracciona
para que estos cambios para aquellos que presentan problemas fisiológi-
cos, en particular aquellos relacionados con la via- Las biotecnologías simples son las biotecnologías
se produzcan y para que
bilidad de las semillas. Las biotecnologías simples, que la gente común puede utilizar para su propio
la generación, adopción o como se verán en el presente manual representan beneficio y en beneficio de su comunidad”
adaptación de nuevos pro- un apoyo directo a la intensificación sostenible de
ductos biotecnológicos se la producción para la pequeña agricultura. Ello implica el diseño de programas que vincu-
concrete. len a la Agricultura familiar en procesos competiti-
vos y sostenibles, reconociendo su heterogeneidad
A manera de conclusión y con el objetivo dar garantías sobre la calidad e
El acceso a la tecnología
inocuidad de los alimentos. Es responsabilidad de
es clave: siempre que se En un contexto global caracterizado por el rit- los actores del desarrollo, el de generar, adaptar y
garantice dicho acceso, las mo acelerado y no planificado de la urbanización, promover prácticas simples y tecnologías que favo-
biotecnologías represen- el aumento en el precio de los alimentos y los im- rezcan este proceso.
tan una oportunidad para pactos del cambio climático, las políticas comienzan
que el pequeño agricultor a revalorizar la importancia de la pequeña agricul- La intensifica- 21 Severino de Melo Araujo,
tura como sector estratégico para la seguridad ali- ción sostenible, la Subdirector General, Represen-
rompa el círculo vicioso
mentaria. adopción de Bue- tante Regional para América
de la pobreza rural21“ Latina y el Caribe, FAO. 1995
27
nas Prácticas y la promoción de biotecnologías simples asumen

un rol preponderante para impulsar a la nueva agricultura.
Ante estos desafíos, debemos ser capaces de dejar los dog-

mas de lado, y orientar todo el conocimiento disponible hacia la
búsqueda de la seguridad y la soberanía alimentaria
Capítulo 2
Cultivo de Tejidos Vegetales

31
Antecedentes y contexto
El concepto de cultivo de tejidos vegetales in- vegetal, todas ellas relacionadas a lo que hoy conoce-
cluye las técnicas y procedimientos de laboratorio mos como Biotecnología Vegetal. Cultivo de tejidos
utilizados en el cultivo In vitro de células, órganos y/o puede definirse como el
plantas completas. Dichas técnicas son utilizadas am- Para el establecimiento de los cultivos utilizando conjunto de técnicas que
pliamente en biotecnología y fisiología vegetal. cualquiera de los sistemas existentes es necesario te- permiten el cultivo en
ner en cuenta algunos aspectos generales comunes condiciones asépticas de
Es un conjunto muy heterogéneo de técnicas relacionados con:
órganos tejidos, célula y
donde se aísla una porción de la planta o explan-
to (pueden ser protoplastos- células desprovistas de • el explante (planta donante, estado fisiológico, po- protoplastos.
pared-, células, tejidos u órganos) proporcionándo- sición de las yemas, tamaño del explante)
les todas las condiciones físicas y químicas para que •Factores físicos (luz, fotoperiodo, calidad, tempera-
las células expresen todo su potencial, cultivándolas tura, humedad) El Cultivo de Tejidos
asépticamente en un medio artificial de composición • la asepsia. Vegetales es, desde
química definida e incubándolas en condiciones am- •el medio de cultivo (selección, composición quími- muchos puntos de vista,
bientales controladas. (Mroginsky, L et al; 2004). ca, forma física) una tecnología sustentable
• condiciones de incubación. que representa una buena
También se lo conoce como “cultivo In vitro de
respuesta a muchos pro-
plantas” por realizarse en recipientes de vidrio. Existen tres conceptos básicos que fundamentan
el cultivo In vitro de células y tejidos vegetales: blemas de suministro de
El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como •Totipotencialidad celular alimentos y de materias
herramienta fundamental en un número importante •Desdiferenciación / Rediferenciación primas para la industria y
de áreas y técnicas de la investigación y producción •Balance de reguladores del crecimiento vegetal consumo humanos.
32
La teoría de la totipotencialidad celular, postula que toda célula Esquema básico de uso de regula-
vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de dores de crecimiento para obtener
un cultivo In vitro, sin importar el grado de diferenciación alcanzado. plantas In vitro.
Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio

del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.
La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida

de las características de especialización de un tipo celular para dar
lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado
en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células
previamente desdiferenciadas.
La totipotencialidad celular es carac-
Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance terística de un grupo de células vege-
entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamental- tales conocidas como meristemáticas,
mente de auxinas y citocininas. presentes en los distintos órganos de
la planta.
Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
• Auxinas La potencialidad de una celula diferenciada (una celula de con-
•Citoquininas ducción, epidérmica, etc) para generar tejidos nuevos y eventualmen-
• Giberelinas te un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación
• Acido abscísico alcanzado por esa celula, pero puede revertirse parcial o completa-
• Etileno mente según las condiciones de cultivo a las que se la someta.
El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibili-

Generalidades: dad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas
células recuperen su condición meristemática. (Segretin, M; 2008).
• Actúan a bajas concentraciones
• Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por Los métodos de cultivo de tejidos vegetales In vitro tienen nu-
las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). merosas aplicaciones, entre ellas:
• Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la • Obtención de plantas libres de virus
planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. • Producción de semillas sintéticas
Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de • Propagación masiva de plantas
la planta y en cada uno de los órganos de ésta. • Clonación de individuos con características deseadas
• Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos. • Mejora genética
33
• Conservación de germoplasma producción de polímeros biodegradables

En todo cultivo de tejidos vegetales • establecimiento de plantas transgénicas
pueden identificarse distintas etapas o plantas resistentes a virus
fases bien definidas, cada una con sus plantas con rutas metabólicas modificadas
objetivos específicos. Dos de ellas son plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas,
comunes a todos los protocolos se- aceites, etc.
guidos, son las Fase 0 o preparativa y • fitorremediación
la Fase I también llamada de estableci- remoción de xenobióticos
miento o iniciación de los cultivos. remoción de metales pesados
Fase 0
Es preparativa. Se seleccionan y Ventajas de la tecnica:
preparan las plantas donantes, según
el estado fisiológico de las mismas. • Incremento acelerado del número de plantas derivadas por ge-
notipo.
Fase 1 • Reducción del tiempo de multiplicación.
Establecimiento de los cultivos • Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una
axenicos: Se elige el explanto más superficie reducida, a bajos costos y en tiempos económicamente
adecuado y se lo somete al proceso costeables.
de desinfección para eliminar los mi- • Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga.
croorganismos con el menor daño • Facilidad para transportar el material In vitro de un país a otro, con
posible. menos restricciones aduaneras.
• Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual
solo existan pocos individuos.
¿Qué se puede hacer con una tecnología que multiplica plantas a
una velocidad alta y exponencial, que permite obtenerlas a partir inclu-
so de una sola célula, y que permite manipular incluso dicha célula? Vías de Regeneración de plantas mediante CTV.
Para la obtención de individuos por medio del CTV existen dos

Aplicaciones del CTV líneas de regeneración, llamadas organogénesis y embriogénesis.
• micropropagación Ambas pueden darse de manera directa o indirecta:
• mejoramiento de plantas
• producción de compuestos de interés comercial Posibles vías morfogenéticas:
producción de metabolitos secundarios • Organogénesis
producción de proteínas • Embriogénesis
34
La directa supone la formación de

órganos directamente del explanto
La via indirecta se produce a través

de la formación de un callo.
35
Cultivo de callos
1) Embriogénesis somática:
La embriogénesis somática
(asexual o adventicia, consiste
en el desarrollo de embriones
a partir de células que no son
el producto de una fusión ga-
mética, o en otras palabras, es
un proceso por el cual se pro-
duce una estructura bipolar (em-
brión) a partir de una célula somática.
Es la vía más conveniente

debido a que permite
saltar las etapas de forma-
ción de yemas y enrai-
Embriones zamiento regenerando
somáticos en di- plantas en una forma mu-
ferentes estadios cho más rápida y eficiente,
de desarrollo. disminuyendo el riesgo de
variación somaclonal.
Esquema de embriogénesis somatica. Agrobiotecnologia, UBA.
Diferencias entre las dos posibles vías:

2) Organogénesis:
• La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de
Es el crecimiento de brotes y raíces en forma sucesiva. Puede células del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego
darse por inducción de yemas axilares o adventicias. La organogé- rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen
nesis directa sucede cuando los órganos se originan directamente por esta vía plantas completas.
del explanto en ausencia de la proliferación del callo. Cuando suce- • La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula
de con fase de callo la organogénesis es indirecta. del explanto se aísla y constituye el punto de partida para la obten-
ción de un embrión somático.
36
Se diferencian embriones o estructuras bipolares que comple-

tan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un em-
brión cigótico. El resultado es una planta completa.
Organogenesis
Embriogenesis
Tipos de cultivos Vegetales:

Cultivo de Meristemas. (ver capitulo 6)
Esta técnica consiste en el aislamiento del domo apical, más

uno o dos primordios foliares. El cultivo de meristemas fue uti-
lizado en un inicio, para la eliminación de hongos y bacterias en
plantas, y poco después, para la producción de plantas libres de
virus. Utilidad:
• obtención de plantas libres de patógenos

• mantenimiento de plantas libres de enfermedades
• clonación
• conservación de germoplasma
Esquema de embriogénesis somatica. Agrobiotecnologia, UBA. Cultivo de semillas, cotiledones y embriones

(Rescate de embriones):
37
Es posible rescatar al embrión inmaduro y cultivarlo In vitro has- frutícolas (manzano, vid, cerezo), cereales (trigo, centeno, cebada,
ta obtener una planta completa. El cultivo de cotiledones y em- maíz), forrajeras (ray grass, festuca), forestales (álamo).
briones permite, también obtener respuestas que con otro tipo de
explante no se obtendrían o se demoraría mucho más tiempo. Utilidad:
• Producción de haploides
Utilidad: • Obtención de plantas homocigotas en todos sus caracteres
• acortar el ciclo de reproducción • Acortar los ciclos de mejoramiento
• prevenir el aborto embrionario
• material de partida para la obtención de callos y embriones
somáticos Cultivo de embriones somáticos.Semillas sinteticas
• superar la latencia de algunas semillas
• rescate de embriones híbridos derivados de cruzamientos Los embriones somáticos tienen, al igual que los cigóticos, la
interespecíficos e intergenéricos capacidad de formar una nueva planta después de un proceso de
• estudios de requerimientos nutricionales de embriones en germinación, con la diferencia de que la embriogénesis somática es
desarrollo un proceso asexual por lo que la nueva planta será exactamente
igual a la donadora de la célula inicial. Este no es un pro-
ceso que sucede únicamente en cultivos In vitro, de hecho es rela-
Cultivo de anteras y granos de polen: tivamente común en algunas familias de plantas y se conoce como
apomixis.
Al comienzo se induce la formación de microcallos colocando
las anteras en un medio de cultivo cuya composición estimule se- Como embriones somáticos, asexuales o adventicios se han de-
lectivamente la división celular mitótica. El medio para inducir esa finido los iniciados a partir de células que no son el producto de
formación debe tener una alta concentración de auxinas. Una vez la fusión de gametos. Son estructuras bipolares con un eje radical-
que los microcallos han alcanzado una longitud de 2mm. son trans- apical, y no poseen conexión vascular con el tejido materno; las
feridos a un medio de cultivo con menor concentración de auxinas, estructuras bipolares deben ser capaces de crecer y formar plantas
pero alto en citoquininas, para su propagación. normales.
El sueño de todo fitomejorador es la obtención de un nuevo Utilidad:

cultivar mejorado en el menor número posible de generaciones. •altísima tasa de multiplicación
Con esta técnica, es posible la obtención de plantas haploides, me- •selección de super genotipos
diante el cultivo de células sexuales, ya sean las microsporas o los •obtención de semillas de especies que no las forman
óvulos (aunque es más común el cultivo de anteras y granos de •desarrollo de semillas artificiales
polen), y la subsiguiente regeneración de plantas. El número de
especies en la que se produjeron plantas haploides es importante
e incluye a plantas hortícolas (ají, tomate, berenjena, papa, nabo),
38
Cultivo de callo en medio líquido.
Se inicia por transferencia de callos friables a un medio en es-

tado líquido, que se disgregan para formar agregados celulares y
células libres. Las células en suspensión tienen mayor disponibili-
dad de nutrientes, se dividen y crecen rápidamente, tienen mayor
inestabilidad genética y bioquímica y requieren de una re-selección
continua de líneas celulares.
Utilidad:
•obtención de protoplastos
•obtención de material de partida para crioconservación
•producción de metabolitos secundarios
•biotransformación
•estudios fisiológicos
Cultivo in vitro
de plantas
Capítulo 3
Infraestructura para aplicar biotécnicas simples.

Ideas para el diseño de un laboratorio económico
de cultivo in vitro de tejidos vegetales
Alejandro Escandón
41
Este capítulo tratará sobre el diseño y la organización del laboratorio

sencillo y económico de CTV que permita iniciarse en la actividad
con la inversión más baja posible.
Introducción
El desarrollo del cultivo de tejidos vegetales (CTV) denomina explanto) proporcionándole en esterilidad
comenzó al principio del siglo XX con los trabajos de y de forma artificial, todas las condiciones físicas y Definido de esta forma, el
Haberlandt (1902), quien intentó, por primera vez químicas para que las células expresen todo su po- CTV, es un conjunto de
(sin mucho éxito), cultivar callos con la tecnología y tencial. técnicas que permite la
la infraestructura disponible en esa época. propagación de una planta
en forma controlada y li-
Posteriormente el trabajo de investigación lleva- Flujo de trabajo y laboratorio
do a cabo en la primera mitad del siglo pasado por bre de patógenos. Se hace
botánicos y fisiólogos vegetales, el descubrimiento de Un laboratorio de CTV debe disponer al menos evidente que el desarrollo
las hormonas vegetales y el aprendizaje sobre el uso de tres sectores: uno para la preparación del medio de esta actividad requiere
de los reguladores del crecimiento vegetal, por un de cultivo y lavado y esterilización del material de de una infraestructura
lado, y por el otro, el avance de la tecnología (cáma- vidrio, otro microbiológicamente limpio, para el esta- mínima que permita la
ras de cría; zonas estériles; instrumentos de precisión, blecimiento y la transferencia del cultivo y el tercero,
manipulación, en forma
entre otros), hicieron posible el desarrollo, a partir destinado al cultivo propiamente dicho.
de los ’50, de esta disciplina biotecnológica (el CTV) adecuada, del material
que, actualmente, se ha convertido en una muy po- Cada uno, como se verá más adelante, adecuado vegetal de interés.
derosa herramienta para la selección, cruzamiento, y equipado para la actividad correspondiente.
control de enfermedades y producción en masa de
diferentes especies vegetales, tanto agrícolas, hortíco- La Figura 1 muestra el sentido del flujo de la
las, forestales, ornamentales y frutales. secuencia de la propagación in vitro de plantas, esta
secuencia se corresponde con las cinco etapas esta-
Básicamente, el CTV es una práctica por medio blecidas para una micro propagación (ver capitulo 5):
de la cual se aísla una porción de la planta (que se preparación de la planta madre, introducción in vitro,
42
multiplicación, enraizamiento y aclimatación. Cada una con sus dife- La Figura 2 muestra el plano de un laboratorio tipo que re-
rentes grados de complejidad y dificultad. Esto será determinante úne los requisitos propuestos. El sector de laboratorio debe ser el
en el diseño de un laboratorio de CTV, dado que la ubicación de nexo entre el resto de los componentes del edificio, el vestuario
los sectores donde se lleven a cabo las actividades correspondien- del personal, así como el sector de lavado y esterilización tiene un
tes a cada etapa, deberían ajustarse a la secuencia en cuestión. contacto directo y libre con el laboratorio, en cambio los sectores
de los cuartos de cultivo y de flujos, si bien adyacentes al labora-
torio, el acceso a estos debe ser restringido y controlado, con un
compartimento estanco entre ambos locales a fin de minimizar
el intercambio con el exterior, esto es una puerta será bloqueada
hasta no cerrar la otra.
Este mismo criterio deberá aplicarse con la conexión entre el

laboratorio y el sector fitosanitario, todo material que salga de ese
sector debe ser rigurosamente controlado en cuanto a su sanidad
y el personal responsable deberá mudar de ropa al entrar y salir
de ese sector.
Es importante remarcar algunos detalles a tener en cuenta, tan-

to la zona estéril y el sector de cuarto o cámaras de cultivo, así
como el sector de cuarentena/fitosanitario, tienen que estar ubi-
cados de tal forma que queden como fondo de saco o sea, no
deben ser lugares de tránsito, también esto se debe a una cuestión
de mantener los sectores lo más limpios posible, para el sector de
cámaras y estéril, por lo que se recomienda es que ambos locales
tengan, cada uno, su puerta independiente y además una conexión
entre ellos.
El local correspondiente al laboratorio propiamente dicho de-

bería ser un ambiente amplio y bien iluminado a fin de permitir un
sector de observación y análisis de los materiales. Debe contar con
dos locales anexos, uno para lavado y esterilización del material y
otro para depósito de insumos y reactivos, en ambos casos se debe
prever una muy buena ventilación de los locales, del lavadero en fun-
Figura 1. El esquema indica los pasos y el flujo de trabajo en un ción del bienestar de los operadores y el depósito para la evacuación
proceso de rutina de multiplicación in vitro de plantas. adecuada de la posible evaporación de algunos solventes. Por su par-
43
te, el área de aclimatación y el invernáculo normal pueden ubicarse Elementos que componen un laboratorio de CTV
adyacentes al edificio principal y levantarse ambos en una misma (insumos e instrumental)
estructura acondicionando cada sector según corresponda.
Siendo el laboratorio de CTV un lugar destinado al cultivo de
células y de órganos, los elementos básicos para tal fin son: conte-
nedores para cultivo (frascos y tubos), gradillas. A continuación se
hará una revisión sobre el instrumental e insumos con los que se
debe equipar el laboratorio de CTV.\
• Área de laboratorio y preparación de medio:

Mesadas.
Reactivos en uso.
Heladeras, freezer.
Destilador.
Balanzas (granataria y de precisión).
pHmetro, agitador magnético.
Vortex.
Sonicador.
Dispensador.
Juego completo de pipetas automáticas esterilizables.
Horno micro ondas y anafe.
Material de vidrio (volumétrico, cultivo, etc.).
Material descartable.
• Área de esterilización y lavado

Mesadas.
Autoclave y/o olla de presión.
Destilador de agua.
Estufas de esterilización y secado.
Bandejas y/o gradillas de secado,
Lavavajilla y Lava pipetas.
Dispensador de agua destilada.
Cinta indicadora de esterilización.
Bandejas para el descarte del material contaminado.
Figura 2. Diagrama de laboratorio. Ver texto principal Guantes.
44
• Área estéril reducidos; pero presenta el inconveniente que sus

Flujo laminar costos son muy elevados respecto a los de los mé-
Microscopios estereoscópicos todos convencionales tanto para el montaje de un
Herramientas para disección laboratorio como para el proceso de producción en
Mesadas si mismo. En los países en desarrollo, tanto los reacti-
Mechero vos, como los insumos, así como la energía eléctrica
Área de cultivo son ítems relevantes en la composición de ese costo
Buen aislamiento térmico (Góes Junghams et al, 2009).
Estantes
Luces fluorescentes Para iniciar un emprendimiento comercial de
Acondicionadores de aire micropropagación es relevante buscar la manera de
Temporizador incrementar la eficiencia de producción y la dismi-
Indicador de temperatura nución de sus costos, por lo que se deberá buscar la
manera de optimizar cada etapa del proceso a fin de
incrementar su productividad.
Disminuyendo costos y simplificando el proceso
Los componentes del costo para una micropro-
Hasta aquí se han volcado ideas y conceptos ge- pagación, se reparten según la siguiente proporción:
nerales para el diseño de un laboratorio de investi- mano de obra: 40%; gastos administrativos: 30%; gas-
gación/producción, esto no es más que la opinión tos varios (electricidad, mantenimiento): 20% y 10%
del autor y se pueden hacer muchas variantes sobre para insumos y reactivos (Ahloowalia y Savangikar,
la aquí propuesta, con la salvedad que la experiencia 2004), estas proporciones pueden modificarse se-
acumulada remarca fuertemente sobre la importan- gún de que país se trate, pero la tomaremos como
cia de acomodar las estructuras del laboratorio al referencia en función de mostrar, en los párrafos si-
flujo del proceso rutinario del cultivo de tejidos, in- guientes, algunas estrategias para reducir los costos
dependientemente de la escala que se intente alcan- de producción.
zar. Incluso en el montaje de un laboratorio “casero”,
con un mínimo de compartimentos, se recomienda
seguir estas indicaciones. Medios y recipientes de cultivos La ejecución adecuada
de cada una de ellas es la
La micropropagación ofrece una serie de venta- El proceso de micropropagación de plantas,
jas sobre la propagación tradicional, entre otras, la como se indica en la Figura 1, incluye 5 etapas bien primera herramienta que
posibilidad de producir un elevado número de plan- definidas: se dispone para disminuir
tas homogéneas y de una muy alta calidad fitosani- los costos de producción
taria en un menor plazo de tiempo y en espacios de un laboratorio de CTV.
45
Etapa “0”, el precultivo, que se refiere al trata- Alternativas para el agar

miento de la planta madre.
Etapa “1”: introducción in vitro, que incluye al pro- El desarrollo de yemas o raíces bajo condiciones
ceso de desinfección y establecimiento del cultivo. in vitro está altamente influenciado por la consisten-
Etapa “2”: multiplicación: implica el incremento cia física del medio de cultivo. Asimismo, se debería
de la masa de material vegetal. considerar que la disponibilidad de los nutrientes
Etapa “3” de enraizamiento: se induce el desarro- está altamente afectada por el potencial agua del
llo de raíces y, por último, la medio y en esto el soporte utilizado es fundamental.
Etapa “4” de aclimatación: en la que se adapta a la Varios autores han probado el reemplazo del agar
planta a vivir fuera de la condición in vitro. por diferentes gomas vegetales y almidones, como
el de mandioca al 8%, que dio buenos resultados en
En la etapa 2 en la que se desarrolla la fase cultivo in vitro de papa (Góes Junghams et al, 2009).
de multiplicación, que justifica todo el proceso, La fibra de algodón es una buena alternativa para el
el medio de cultivo juega un papel fundamental, reemplazo del agar y según Prakash et al. (2004) ha
sus componentes principales son, básicamente, el sido probado con éxito en la multiplicación de varios
agua, las sales minerales y la fuente de carbono cultivos, como papa, orquídeas, crisantemo y banana.
La estrategia que se
(sacarosa, en general). Además, se utilizan vita-
propone es que, para el minas (suplementos orgánicos), reguladores del
ajuste inicial de un pro- crecimiento y agentes gelificantes (ver capitulo 4). Fuentes de carbono alternativas
tocolo de multiplicación, Si bien la proporción de sus componentes depen-
se recomienda utilizar los de de cada especie, la formulación propuesta por El azúcar más utilizado en el cultivo de tejidos
reactivos testados como Murashige y Skoog (1962) es, por lejos, la más vegetales es la sacarosa. En su estado de máxima
utilizada. En este contexto es impor tante señalar pureza es un producto cuyo precio oscila entre los
aptos para cultivo de
que los costos del medio de cultivo pueden al- 10,00 y los 120 us$ de acuerdo a su calidad, es posi-
tejidos, una vez ajustado canzar el 15% de los costos de producción y que ble reemplazarlo por el azúcar común, de consumo
el protocolo se puede el agente gelificante contribuye con un 70% de humano, el producto más refinado que se consiga en
comenzar a introducir, de ese porcentaje. Existen alternativas para reducir el mercado local, cuyo precio es alrededor de 1,00
a una, variantes de menor los costos, reemplazando el agente gelificante y us$ el kilogramo.
costo y comparar con la sacarosa, disminuir el costo del agua empleada
(Prakash et al. 2004), así como también, probar De todas formas, dada la posible presencia de in-
el protocolo original la
con marcas alternativas de reactivos (i.e.: sales mi- hibidores del crecimiento vegetal en estas sustancias,
relación costo/beneficio nerales) de producción nacional, cuyo costo es es aconsejable previamente probar el agente gelifi-
que se obtenga. sensiblemente más bajo que las marcas de los dis- cante sustituto con el cultivo de interés.
tribuidores tradicionales.
46
Otros componentes del medio

de lluvia en zonas urbanas dado que el alto conteni-
Como se indicó antes, es posible disminuir los do de contaminantes de la atmósfera, pueden afectar
Cualquier recipiente
costos de producción utilizando reactivos de pro- el desarrollo de los cultivos.
de vidrio transparente
ducción local e incluso aquellos de menor pureza
(probar previamente), la diferencia de costos puede y de tamaño adecuado,
ser hasta 10 veces menor para alguna de las sales. Recipientes para el cultivo es apropiado como frasco
También es posible encontrar reportes donde se de cultivo.
indica el reemplazo de la sacarosa, las vitaminas y Durante la etapa de multiplicación el uso de fras-
los micro-nutrientes, por la melaza de caña de azú- cos de vidrio de 250-300 ml de capacidad, con boca
car (Dhamankar, 1992, citado por Góes Junghams ancha, que permiten introducir y cultivar varios brotes
et al, 2009). Quizás sean las orquídeas el cultivo en cada uno, son los más adecuados.
para el cual se desarrollaron la mayor cantidad de
medios de menores costos, como el Phytamax
™, el KC (Knudson, 1946) el V&W (Vacin y Went,
1949). Incluso muchas especies de orquídeas tro-
picales fueron multiplicadas en medio conteniendo,
peptona, inositol, agua de coco o pulpa de banana,
estas dos últimas, muy ricas en hormonas vegetales
(Prakash et al. 2004).
El agua
Es el componente mayoritario del medio de cul- Los frascos de cultivos denominados Magenta™,
tivo, normalmente se utiliza agua bidestilada, desti- son muy utilizados en algunos países desarrollados,
lada o deionizada para la preparación del medio, es pero su costo es muy alto y si vida útil relativamente
posible reemplazarla por agua común de red (libre corta, dado que se van opacando con los continuos la-
de metales pesados y contaminantes), de hecho, este vados y esterilizaciones, lo que afecta la luz que reciben
tipo de agua, ha sido utilizado para la multiplicación los explantos en cultivo.
de jengibre y banana (Góes Junghams et al, 2009).
Para micropropagación a gran escala es posible el
En zonas rurales puede usarse el agua de lluvia uso de sacos de plástico transparente y estéril o en
recolectada en recipientes adecuados libres de óxi- bolsas tipo Ziploc™, con cierre hermético. Esto aba-
do u otra fuente de contaminación tanto orgánica rata considerablemente los costos pero tiene el incon-
Diferentes tipos de
como inorgánica. No se recomienda el uso de agua veniente que el plástico no permite el intercambio de
envases para CTV
47
gases, por lo que el uso de esta alternativa implica prestarle mucha atención a la
evolución del cultivo a fin de evitar el fenómeno de vitrificación.
En este contexto es apropiado remarcar la importancia que tiene la tapa del

frasco de cultivo, para la elección de este ítem se debe priorizar la capacidad del
elemento para aislar microbiológicamente al explanto tanto como la de permitir el
intercambio de gases con el exterior, favoreciendo la disponibilidad de oxígeno y
dióxido de carbono, evitando la acumulación de etileno (hormona vegetal respon-
sable de la senescencia y que produce un fenómeno en las plantas in vitro, llamada
vitrificación, dando un aspecto de vidrio a las células vegetales) y la condensación
de la humedad en el interior del envase (gotas de agua cerca de la tapa son buenos
Frascos de cultivos vehículos para el ingreso de contaminantes).
denominados
Existen diversas clases de tapas, de algodón envuelto en gasa, de metal, de poli-
Magenta™,SIGMA
propileno, de espuma de poliuretano, film de polietileno, entre otras.
En la opinión del autor las más apropiadas son las de algodón/gasa, permiten un
muy buen intercambio de gases, son una buena barrera microbiológica, son eco-
nómicas (salvo el hecho que hay que fabricarlas), pero tienen el inconveniente que
no son las más adecuadas para la producción en masa ya que se adaptan mejor en
tubos y no en frascos de boca ancha, de todas formas, para los frascos de produc-
ción, es posible perforar el centro de las tapas de polipropileno o de metal y colocar
algodón en el centro de la misma a fin de permitir el intercambio de gases en este
tipo de envases.
Bolsas tipo Ziploc™
Sector de multiplicación
Tubo de
ensayo Es el sector más delicado del laboratorio, tiene, como mínimos requerimien-
con tos, que ser una habitación sin corrientes de aire, con superficies fáciles de lim-
piar y desinfectar, además se debe contar con las herramientas de disección, un
tapón de
microscopio estereoscópico y una cámara de flujo laminar, estos dos últimos son Diferentes tipos de tapas
algodón. los elementos más costosos del equipo, si bien con el microscopio se puede con- para envases utilizados
seguir uno económico en plaza (us$ 650), es de por si un artículo caro pero casi en el CTV.
imprescindible para ciertos trabajo de micropropagación.
48
Cuartos y cámaras
de cultivo
La cámara de flujo laminar Figura 3. Esquema y
medidas de una cámara En general el cultivo in vitro se lleva a cabo en cuar-
puede improvisarse
aséptica casera. A) Con tos de cultivos que requieren disponer de una buena
utilizando una pecera de la cortina plegada. 1) Ac- iluminación, fotoperiodo controlable y un buen sistema
vidrio volteada de lado, de ceso. 2) Cortina. B) Con de control de temperatura (Figura 5).
tamaño adecuado, la me- la cortina desplegada. 3)
dida del espesor mínimo Cortina. 4) Ojales para Si bien en países en desarrollo la construcción del
estará dada por el tamaño introducir las manos del cuarto de cultivo es relativamente económica, se re-
operador. quiere de una habitación bien aislada y de fácil limpieza,
de la lupa binocular que
estanterías con un sistema de iluminación adecuado
se disponga. La cara de cuyos costos dependerán de la cantidad de estantes
acceso puede cubrirse con y, por supuesto, tendrá variaciones por países, en Ar-
una cortina de plástico gentina, por ejemplo, el precio por una estantería de 2
transparente que pueda m de altura y 0,90 de ancho por 0,43 de profundidad
plegarse y desplegarse de con 5 estantes us$ 55,00 + us$15 por dos lámparas
“bajo consumo” + us$ 20,00 por un temporizador y
acuerdo a las necesidades
us$ 5 de cables.
(Figura 3). Cámara aséptica
casera realizada en El principal problema del cuarto de cultivo radi-
plástico. Se utiliza en ca en los costos de la energía que se consume para
Esta cámara representa reemplazo de la cam- la iluminación y la aclimatación, que pueden alcanzar
una muy interesante pana de flujo laminar. hasta 60% y 25%, respectivamente, de los costos de
producción (Dooley, 1991, citado por Góes Junghams
alternativa que permitirá,
Una vez limpia y desinfectada la superficie externa et al, 2009).
sumada las condiciones
e interna de la cámara con alcohol 70% o lavandina al
enunciadas previamente, 20% a lo que se le puede sumar el uso de una lámpara La Figura 4 muestra una estantería de un cuarto
poder iniciar la actividad UV portátil y la utilización de un mechero en el interior de cultivo típico, nótese que los tubos de luz fluores-
de la micropropagación sin para generar una zona de esterilidad, se considera que centes han sido reemplazados por lámparas de bajo
desembolsar los us$5.000 la cámara es apta y adecuada para realizar la siembra o consumo con las que se logra un importante ahorro
multiplicación de material bajo condiciones in vitro. de mantenimiento tanto en dinero (se prescinde de los
promedio, que cuesta una
arrancadores y balastos y su correspondiente cablea-
cámara de flujo laminar
do) como en trabajo.
horizontal.
49
De todas formas es importante dejar en claro que la ilumina-

Los colegas cubanos han diseñado y montado “biofábricas”
ción artificial es un método poco eficiente (para la planta) y muy
costoso (para el productor). para la multiplicación de plantas que basan su funcionamiento
en los bajos costos de producción debido a la implementación
Se han desarrollado diseños de cuartos de cultivo que permi- y utilización de cuartos de cultivo iluminados por luz natural,
ten el aprovechamiento de la luz natural lo que implica un impor- que de acuerdo a su propuesta presenta las siguientes ventajas:
tante ahorro de energía y una considerable merma en los costos
de producción (Pérez Ponce et al. 2000).
1) No requiere instalaciones complejas y costos de construc-
En efecto, debido a que proveen poca energía en el color rojo ción menores,
del espectro la luz de las lámparas fluorescente son poco eficientes 2) no hay costos para iluminar los cultivos,
para activar el sistema fotosintético, así como tampoco al fitocro- 3) Bajo mantenimiento, y
mo, lo que trae como consecuencia una pobre fotomorfogénesis; 4) debido a su menor grado de estrés, el cultivo supera mejor
a esto se suma que la luz artificial genera calor que es necesario la fase de aclimatación (Pérez Ponce et al. 2000).
contrarrestar
La iluminación natural se logra a partir de luz zenital, sea por una

o varias claraboya/s, de buenas dimensiones, en el techo del cuarto;
también, es posible recurrir a sistemas pre armados capaces de direc-
cionar la luz exterior al interior del cuarto, existen varias alternativas
en el mercado, como ser: http://www.solatube.com/ o http://natural-
light.com.mx/, entre otras (Figura 5).
Al sistema de luz zenital se puede agregar una amplia superficie

vidriada en los laterales que den al exterior, a fin de lograr un mayor
aprovechamiento de la luz del día. Como todo, este sistema tiene sus
Figura 4. Cuarto de cultivo clásico. Construido con carpintería aspectos negativos y es que si bien se gana en calidad lumínica, se
metálica estándar pintada de blanco con pintura antióxido. Cuenta hace más difícil el control de temperatura, dado que el vidrio no es
con 2 o 4 lámparas larga vida según estante en particular, este po- un buen aislante, a no ser que se coloque doble cristal con aislamien-
see una irradiancia de 3500 lux en la zona del explanto. to, pero eso encarece los costos de instalación. También es posible
colocar placas de vidrio en el techo de la cámara, siempre teniendo
Con una mayor potencia de los acondicionadores de aire, lo que en cuenta la consideración hecha previamente respecto del control
trae como consecuencia un mayor gasto de energía restándole efi- de temperatura.
ciencia al sistema de producción.
50
Control de temperatura
A C
Es un hecho generalizado la utilización de acondicionadores de
aire para el control de temperatura de los explantos cultivados in vitro,
a pesar de esto, hay opiniones que cuestionan esta costumbre argu-
mentando que esto lo único que genera es incremento en los costos
y no contribuye en nada a la calidad de los cultivos.
B De hecho, el control de temperatura se efectúa, más que nada,

para contrarrestar el calor generado por el sistema de iluminación ar-
tificial. Sería importante probar el cultivo de interés bajo condiciones
de iluminación con luz natural y sin control de temperatura.
Las alternativas propuestas en este capítulo pretenden mostrar

que es posible la incorporación de tecnología accesible, en cuanto a
Figura 5.Tubos para luz zenital A) Modelo para techo a dos aguas. costos, e los procesos de producción de plantines, lo que contribui-
B) Para techo plano. C) Esquema de del funcionamiento del difusor rá largamente en el incremento de la calidad del producto ofrecido
de luz desde el exterior hacia el interior del ambiente. y en la productividad del emprendimiento.
Capítulo 4
Cultivo de Tejidos vegetales

Medios de cultivo para plantas
Alicia Rangel Cano

53
Introducción
Como se vio en el capitulo anterior, los cultivos Son esencialmente una mezcla de nutrientes en
de tejidos vegetales llamados también cultivos “in vi- los que se encuentran macro (nitrógeno, fosforo, po-
tro” involucran el manejo en condiciones controladas tasio, etc.) y micronutrientes (magnesio, manganeso,
de células, tejidos, órganos y plantas completas para zinc, etc.) y carbohidratos como el azúcar o la glucosa,
poder obtener, células, tejidos, órganos y/o plantas también se pueden agregar vitaminas y algunos otros
completas en condiciones asépticas. aditivos, que en el caso de las plantas pueden ser regu-
ladores de crecimiento y/o extractos de frutos cono-
Para llevar a cabo esto debemos de cuidar tanto cidos. Además del elemento que le de consistencia al
condiciones físicas (la temperatura, la humedad la luz, medio que puede ser agar, algodón, vermiculita, entre
etc.) como químicas (nutrientes, azucares y vitaminas otros. La adición de extracto de levadura es beneficio-
y/o aditivos). sa ya que le proporciona al medio de vitaminas, algo
de nitrógeno en forma de aminoácidos, oligoelemen-
Los cultivos in vitro se hacen en frascos cerrados y tos y cofactores.
en condiciones controladas y estériles que contienen
el sustrato o medio de cultivo, que contiene todo lo
necesario, donde la plantas deberá crecer sana. Antecedentes El objetivo final siempre
será, obtener una mezcla
Los medios de cultivo, han sido utilizados en di- Los medios de cultivo destinados a las plantas adecuada para el creci-
ferentes organismos, y pueden estar formulados con han sido elaborados por múltiples investigadores con
miento y proliferación
materiales netamente naturales o con componentes recetas muy variadas. Podemos decir que a inicios del
completamente artificiales. siglo pasado fue cuando los intereses hacia los orga- de un organismo deter-
nismos en general se potenció gracias a entre otras minado (bacteria, hongo,
cosas a los diferentes avances en las ciencias. plantas o células animales).
54
Schleiden y Schwan (1887) en su teoría celular, mencionaron Overbeek en 1941, observa el efecto de una sustancia pre-
que la célula es capaz de subsistir por si sola siempre y cuando las sente en el agua de coco, que estimulaba la división celular (efecto
condiciones externas le sean favorables, fijando las bases para lo citocínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2, 4, D (un
que posteriormente se atribuye a Morgan (1901) el término de herbicida con efecto de regulador de crecimiento) tenía un efecto
la “totipotencialidad celular” propiamente dicho, “donde menciona positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y
que cada célula contiene la información necesaria para poder de- Steward 1948, 1952).
sarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones
ambientales le son favorables y si se le aplican los estímulos ade- Skoog y col. observaron que el esperma de arenque desnatu-
cuados”. Ver capitulo 2 ralizado por medio de calor, tenía un efecto muy marcado en la
formación de brotes a partir de tejidos de tabaco. De este ácido
Pero no fue hasta 1934 cuando Gautheret logra la prolifera- desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores
ción celular in vitro de tejidos provenientes de plantas adultas. En en 1955 aislaron un compuesto de naturaleza purínica denomina-
1939 tanto Gautheret y Nobecourt en Francia usando tejidos de do, 6 – furfuril-amino-purina o cinetina.
zanahoria y White en estados unidos con tejidos de tabaco, pu-
blican casi simultáneamente la formación de una masa de células Steward en1952, utilizó agua de coco como medio enriquece-
parenquimatosas llamado callo a partir de los explantes (trozos dor (endospermo líquido). Este se ha usado dentro de diferentes
de planta) utilizados en sus experimentos usando un medio semi- formulaciones de medios de cultivo con buen éxito.
sólido. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las
técnicas de cultivo in vitro.
¿Cómo hacer un medio de cultivo casero?
Aunque al inicio los avances en el área fueron muy lentos, fue
White en 1934, el primero en cultivar tejidos vegetales con éxito, Materiales que se necesitan:
logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos
con sales, azúcares y levadura. Demostró además, que las levadura • Olla de presión común de casa, entre más grande mejor.
se pueden sustituir por tres vitaminas del grupo B:Tiamina, Piridoxi- • Estufa, cocina y/o microondas.
na y Niacina y que son necesarias en el desarrollo de las plantas. • Balanza
• Pinzas de metal de punta delgada
Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo • Bisturí y tijeras pequeñas de punta afilada
de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de • Frascos de vidrio de diferentes tamaños hasta un litro para este-
crecimiento, compuestos internos que ayudan al desarrollo y or- rilizar los medios, botes desechables de plástico nuevos con tapa en
ganización de las células en tejidos, para formar plantas completas. su bolsa (de esos donde se venden postres)
A un inicio se les llamo hormonas vegetales, ya que se comportan • Hojas de papel aluminio
como las hormonas animales, en el sentido de que se producen en • Bandas elasticas medianas
un sitio y actúan en otro. • Plástico adherible del que se usa para cubrir alimentos (un rollo)
55
Nota importante.
• Mechero
• Frasco con etanol; absoluto para • El agua de coco ha sido más usada para la germinación o
flamear las pinzas y al 70% para lim- cultivo de tejidos.
piar el área de trabajo. • El plátano es mejor para el desarrollo de plántulas. No
• Toallas de papel deberán usarse juntos.
• El agua destilada es importante aunque puede usarse una
comercial baja en sales o bien agua de lluvia colectada en
Olla a presión para esterilizar recipientes limpios y sin basura.
los medios de cultivo • Si se usa vermiculita no se le agrega agar y se usa sin
calentar, únicamente se disuelven los componentes y se le
agregan los aditivos y se reparte en los frascos para su es-
Material para los medios de cultivo terilización.
• La papa se usa para el cultivo de algunas bacterias y hon-
• Agar o vermiculita gos, como Agrobacterium.
• Agua destilada • El abono mineral puede conseguirse en cualquier comer-
• Abono mineral comercial 20 – 20 – 20 (sin urea) 1 gr/L cio de agroquímicos y si contiene magnesio, hierro y otros
• Azúcar comercial 20 gr/L (se consigue en cualquier tienda) elementos mejor.
• Extracto de levadura 1 gr/L • El agar, la vitamina B y el extracto de lavadura se consiguen
• Una ampolla de complejo de vit B. en tiendas para deportistas y nutrición.
Uno de los siguientes aditivos

por litro medio de cultivo Preparación
• Agua de coco proveniente de un coco tierno 200 o, La forma de preparar los medios de cultivo es simplemente
• Jugo de piña natural pasado por un filtro de papel, del que se usa mezclar todo en una parte de agua, disolver y mezclar los compo-
para preparar café (25 mL/L) solo si se cuenta con material para nentes, ajustar al volumen final y agregar el agar, para luego calentar,
controlar el pH, potenciómetro o tiras de pH, y reactivos (hidróxi- esto puede hacerse en el horno de microondas, dándole pulsos
do de sodio y ácido clorhídrico) ya que este es muy ácido (el pH de 1 minuto y agitando en cada intervalo o bien en una estufa
deberá estar entre 5.5 y 6) o, o plancha caliente. Se debe hacer con agitación constante así se
• Plátano entre verde y amarillo (medio plátano mediano por litro incorporarán de forma homogénea además que se evitará que se
de medio) pelado y en trozos pequeños, o peguen y/o se caramelicen los componentes del medio.
• Papa 200 g/L (pelada y en trozos pequeños)
Si se cuenta con bolsas de plástico y/o botes de plástico nuevos
se pueden considerar como estériles (siempre y cuando sus empa-
56
ques no hayan sido violados) y usarse de inmediato, tenga el etanol alejado del fuego), ayudado de una
por lo que el procedimiento cambia de la siguiente tolla de papel eliminar el exceso de etanol y suciedad
manera. y deje que el resto del etanol se evapore comple-
tamente. Posteriormente, coloque el material estéril
Una vez hecha la mezcla de los componentes se (frascos, bolsas o empaques) y el medio de cultivo,
pone en frascos de vidrio de un litro, se tapan con cuando éste se enfríe pero antes de gelificarse, se
su tapa (sin apretarla) o con papel aluminio y se es- vierte en los recipientes (cuando usted pueda man-
teriliza. tener su mano en el frasco por 30 segundos tendrá
NOTA una temperatura entre 45 y 50C).
Una vez incorporados
todos los componentes se
reparte en frascos (entre Nota importante:
20 y 40 mL c/u) se tapan Un mechero da un diámetro de aproxi-
ya con hojas de papel madamente 50 cm de protección estéril, de
aluminio y se acomodan tal manera que usando 2 en cada lado y el
en la olla de presión. Se material estéril en medio podemos trabajar
con seguridad, si además limpiamos perfecta-
esterilizan durante 20 mi-
Frascos con medio mente manos y espacio.
nutos, se espera a que baje
de cultivo
la temperatura, se abre la Podemos también hacer una especie de
olla, se sacan con cuidado Una vez transcurrido el tiempo de esterilización campana, delimitando los lados y la parte su-
de no quemarse y de que y enfriamiento de la olla se saca y se lleva a la zona perior con acrílico, para proteger aún más,
no se derramen y se dejan de trabajo, si hay campana de flujo en ese lugar y si evitando así contaminación por corrientes
enfriar.
no en una mesa perfectamente limpia con dos me- de aire.
cheros y con mucho cuidado se vierte el medio en
los recipientes.
Detalles prácticos
Antes de iniciar cualquier trabajo, lavarse perfec-

tamente con jabón manos, uñas y antebrazos y se-
carlos con toallas de papel, limpiar la zona de trabajo
completa con una solución de etanol al 70% (man-
Capítulo 5
MICROPROPAGACIÓN
Rosa María Oviedo

de Cristaldo
59
Introducción
La propagación de plantas utilizando partes de La macropropagacion utiliza propagulos de

ella es una práctica antigua y tradicional entre los mayor tamaño y se realiza “in vivo” ( esquejes, esta-
agricultores, sobre todo entre los que se dedican a la cas, estolones, bulbos, tubérculos o rizomas)
producción de plantas frutales, ornamentales, algunas
hortalizas y especies forestales. Se utilizan partes de La micropropagación es una técnica de propa-
la planta o propágulos, con el objetivo de obtener gación de plantas a gran escala, utilizando plantas
nuevas plantas idénticas a la planta madre de la cual seleccionadas y técnicas de cultivo de tejidos. Con Clon: Palabra griega
fueron extraídos. Las plantas resultantes son clones, ella se consigue la obtención de un gran número
que significa retoño,
de manera que son todas iguales, con el mismo ciclo de individuos con características deseables de alto
rama o brote.
de producción, manejo agronómico, características valor agronómico, ornamental y forestal.
sanitarias y rendimiento. En el lenguaje científico
Consiste en colocar el propágulo, en este significa estirpe celular
• ¿Qué es la clonación? caso llamado explanto, segmento más pequeño o serie de individuos
• Para entenderlo puede ser útil que los usados en la propagación convencional, pluricelulares nacidos de
pensar en el proceso de fotoco- en medios nutritivos ar tificiales y en condiciones
ésta, absolutamente ho-
piado... este consiste en obtener controladas de ambiente. De este modo, en lugar
mogéneos desde el punto
copias de un mismo original de esquejes, estacas, estolones, bulbos, tubérculos
o rizomas se utilizan pequeños segmentos de al- de vista de su estructura
En las plantas, el proceso de gún tejido de la planta, asociadas a técnicas que genética. (Diccionario de
“fotocopiado” lleva el nombre son propias de los laboratorios en lugar de las la Real Academia Española,
de propagación vegetativa. Esta agronómicas tradicionales. XXI Ed., 1992).
propagación puede ser macro o micropropagación...
60
Finalmente se obtiene el mismo resultado: rege-

nerar una planta completa a partir de sus partes.
Explante Porción de tejido

u órgano que se separa
de la planta para iniciar el
cultivo.
Micropropagacion
Método especial de
propagación en un medio
aséptico para obtener
plantas con características
genéticas iguales a la de
sus progenitores.
Esquema de Macro y micropropagacion

61
Es frecuente observar que los vecinos se intercam- Además de las yemas, también pueden utilizarse
bian ramas de las plantas de sus jardines que cuando co- en la micropropagación segmentos de hojas, entrenu-
locadas en recipientes con agua, al poco tiempo emiten dos, nudos, embriones, cotiledones, anteras y granos
raíces, hojas nuevas y están listas para ser plantadas. de polen, entre otros. En estos casos deben pasar por
una etapa de callo, que consiste en una masa de tejido
Los que trabajan con plantas ornamentales y fruta- indiferenciada semejante al meristema, a partir de la
les en general saben que, dependiendo de la especie, cual se puede regenerar la planta completa.
existen partes de la misma a partir de la cual se pue-
den obtener nuevas plantas o mudas.
Esta propiedad de las células vegetales se

llama totipotencia, o capacidad de originar una
planta completa. Las yemas son las estructuras
vegetales que conservan esta capacidad inclusi-
ve en plantas adultas y es por ese motivo que,
cuando se multiplica una planta en forma vege-
tativa, siempre se considera un segmento de ta-
llo o rama que las contenga.
Las yemas pueden encontrarse en las axilas de Fuente: Agrobiotecnología, UBA

las hojas y en la parte terminal de las ramas, las pri-
meras se denominan yemas axilares y las segundas • La micropropagación es un sistema de multiplica-
yemas apicales. Tejido similar al de las yemas, llamado ción en un medio artificial y aséptico y a partir de muy
meristema, también se encuentra en las puntas de las pequeñas porciones de plantas, tales como: semillas,
raíces lo que les permite seguir creciendo en busca embriones, tallos, brotes de tallos y de raíces, células
de agua y nutrientes. y polen.
La propagación usando tejidos merístemáticos no • Cualquiera de las partes antes mencionadas de-
presenta en general dificultades, debido a que aún no ben producir una planta entera
se han diferenciado o especializado en tejidos con
funciones determinadas como las correspondientes Tamaño del explante Posibilidad de contaminación
al tallo, hojas o flores. Sin embargo, cuando se usan Paralelamente se trabajó con diferentes tamaños de
tejidos ya diferenciados, es necesario recuperar la to- explantes, encontrándose que la contaminaci6n au-
tipotencia de las células mediante técnicas y estímulos mentaba a medida que el tamaño del explante era
adecuados. mayor, resultando más apropiados los explantes de ta-
62
maño entre 0,5 y 1,0 milímetros (caña de azucar)Ca- Planta madre

pacidad de regeneraciónExiste un tamaño mínimo de
explante que depende de la especie, y del material La planta o plantas madres deben sanas, vigoro- Elección de la planta ma-
vegetalNecesidad de medios complejos o acondicio- sas y en fase activa de crecimiento. En el caso de dre. Especie Edad Estado
nados si son muy pequeños especies leñosas que han pasado de su fase juvenil fisiológico Lugar en que
a adulto, las podas son un mecanismo para obtener
crece Habito (herbaceo,
La micropropagación no puede ser utilizada en brotación y tejidos jóvenes nuevamen
todos los cultivos. En las plantas que habitualmen- leñoso)
te se multiplican en forma vegetativa, las técnicas de Preparación de la planta madre Recomen-
micropropagación son más fácilmente aplicadas. Es dable que crezca en invernadero o cámara de
el caso de la caña de azúcar, la mandioca, la papa,
crecimiento En maceta con sustrato estéril Usar
banano, ornamentales como orquídeas, petunias,
claveles, crisantemos, helechos, frutales y algunas es- material homogéneo Elegir plantas vigorosas
pecies forestales. En cambio, en los cereales como Promover nuevas brotaciones: podas Programa
el trigo, especies anuales como la soja y en general sanitario Controles y manipulación de intensidad
las que se reproducen estrictamente por semillas es de luz, fotoperíodo y temperatura Aplicación de
más difícil de aplicar técnicas de micropropagación. fitoreguladoresPrevenir insectos de cualquier ti-
Además de la especie, la facilidad de regeneración
poPrevenir hongos y bacterias Regar sólo en la
también está condicionada a la edad de la planta de
la cual se extrae el explante y a la época del año en la maceta (evitar riegos por encima)Mantener baja
cual se realiza la extracción. Plantas jóvenes propor- la humedad
cionan mejores explantes y las colectas realizadas en
primavera o verano tiene mejores resultados que las
realizadas en el invierno. Selección y colecta de explantos
En la selección de los explantos deben ser con-

Descripción de la técnica siderados el tipo de tejido colectado, la edad de la
En general la micropropagación se describe en planta, la estación del año y la sanidad de la planta
cuatro etapas principales: establecimiento del cultivo, madre. Cualquier tejido podría ser usado como ex-
desarrollo y multiplicación de los propágulos, el en- planto, pero en la práctica los que contengan mayor
raizamiento y por último, la aclimatación de las nue- proporción de tejidos jóvenes son los más adecuados.
vas plántulas. Previa a éstas etapas, existe una muy Las partes jóvenes, rejuvenecidas o en crecimiento de
importante que se relaciona con la planta madre de la planta son las que proporcionan mejores explan-
donde serán extraídos los explantos y adecuación tos. En algunos cultivos las yemas apicales son mejo-
del explanto extraído. res que las axilares, como en las rosas, mientras que,
63
para las especies arbóreas frecuentemente son mejores las axila- • Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas
res. Se recomienda colectarlos en la primavera o verano cuando por microorganismos (bacterias y hongos).
las plantas están en activo crecimiento. Cualquiera sea el explanto • Los explantes antes de ser introducidos en el medio de cultivo
seleccionado, cuando se colectan de plantas sanas tendrán menos han de ser esterilizados.
problemas de contaminación durante el establecimiento del cultivo • Posteriormente se introducirán en el medio a su vez estéril y se
de tejidos. Una vez colectados los explantos deben ser colocados mantendrán allí en condiciones asépticas.
en recipientes o bolsas de plástico para evitar la desecación.
Los explantos se pueden lavar con agua corriente, luego se
Recolección del los explantesUna vez escogida la planta ma- los coloca en una solución con etanol al 70% durante 1 mi-
dre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obten- nuto, seguido de soluciones con concentraciones de 0,5 a 2,5
drán los explantos.Antes de extraer los explantes se hará una % de hipoclorito de sodio, frecuentemente encontrado en las
desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los formulaciones de agua sanitaria a la cual se agregan unas gotas
contaminantes externos. Soluciones desinfectantes de detergente líquido. Después de la desinfección deben ser en-
juagados con agua destilada y esterilizada, tantas veces como sea
1.- Alcohol etanol: 70% para material vegetal y al 96% para ins- necesario, a fin de remover los restos de del material usado para
trumentos 2.- Hipoclorito de sodio (NaClO) al 1 ó 2 % y con la desinfección.
tiempos variables (10-20 min.) dependiendo del material
El proceso de esterilización de los explantes puede resumirse
3.- Hipoclorito de calcio Ca (ClO2) 35-100g/l en tiempos varia- en los siguientes pasos:
bles (5-30 min) según material
1. Lavado del material con agua corriente, para retirar restos de
4.- Bicloruro de Mercurio (HgCl2) 0.01-0.05% ya no se utiliza por tierra u otras partículas (opcional).
su toxicidad.
2. Eliminación de las partes muertas e infectadas de la planta.
Establecimiento del cultivo 3. Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al 70%

durante unos segundos.
Los explantos colectados deben pasar por procesos de desin-
fección superficial para evitar la contaminación durante la fase de 4. Sumergir la planta en una solución de hipoclorito de sodio (por
cultivo. El área de trabajo de debe estar desinfectada con alcohol ejemplo al 1%) con un agente humectante (por ejemplo Tween
y los instrumento utilizados, como pinzas y frascos esterilizados. 20 o Tween 80), durante 10-30 minutos.
• El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extraídos de 1. La fuente más utilizada de hipoclorito de sodio es la lavan-
la planta madre. dina comercial. Ésta contiene un 5% de hipoclorito de sodio
• Estos pequeños órganos o trozos de tejido se llaman explantes. como agente activo, con lo que la solución estará formada por
64
un 10-20% (v/v) de lavandina. mg/L a pH 6. El medio de cultivo utilizado se dejó

enfriar a una temperatura de ca 37ºC. De inmediato,
2. Para una mayor eficacia se recomienda agitar la la mezcla antibiótico-antifungico fue añadida en for-
solución mientras dura el proceso. ma aséptica al medio con ayuda de una inyectadora
estéril
5. Enjuague del material con agua estéril para elimi-
nar la solución de hipoclorito de sodio. El enjuague Para la preparación de los tallos se debe trabajar
debe tener lugar bajo condiciones de asepsia, y suele bajo condiciones estériles, lavar bien las manos, y lim-
realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos piar el lugar de trabajo con etanol al 70%.
cada una.
Los tallos se desinfectan bien sumiéndolos duran-
te un par de horas en el fungicida común preparado
Otros ejemplos… posteriormente se lavan bien con agua corriente.
Esterilización de yemas laterales Luego se sumergen los tallos en etanol al 10%

(10 ml alcohol + 90 ml agua) durante cinco minutos
Hipoclorito de calcio. Se utilizó a las concentra- agitando constantemente.
ciones de 60, 90 y 120 g/L, durante tiempos de aplica-
ción entre 30 y 1200 min. El material vegetal (yemas Se enjuaga con agua destilada 3 veces por 3 mi-
midiendo 15 x 3,5 mm) fue colocado en un recipien- nutos cada lavado. Inmediatamente se sumergen los
Los tiempos y las concen-
te conteniendo la solución de hipoclorito de calcio a tallos en cloro comercial al 15% (preparar) y se agita
la concentración conveniente durante un tiempo de- cuidadosamente por 10 minutos. traciones dependerán del
finido, añadiendo dos gotas del surfactante Tween 80. material a desinfectar.
La desinfección fue seguida por tres enjuagues con Se enjuaga con agua destilada estéril durante cin-
agua destilada estéril y en condiciones de asepsia. co minutos tres veces.
Fuentes de contaminantes
Agua oxigenada. Las yemas se colocaron en un Ejemplos
1. Microorganismos
recipiente conteniendo una solución de agua oxige-
nada (10 volúmenes) durante 60, 120 y 360 min. • Hojas de Anthurium andreanum: 30 min. 1% de Na- presentes en el interior o
ClO exterior de los explantes
Mezcla antibiótico-antinfúngico. Esta mezcla fue • Escamas de Hyacinthus: 15 min. 1% NaClO Bacterias y hongos.
preparada con la siguiente composición: Penicilina • Tallos de Rhododendron: 20 min. 1% NaClO 2. Fallas en los procedi-
600 mg/L + Estreptomicina 100 mg/L + Fungizones- • Hojas de Strelitzia: 45 min. 1% NaClO mientos de cultivo en el
Anfotericina-B (43%) + Oxiclorato de Sodio (35,3%)
laboratorio
+ Fosfato de Sodio (21,7%) con NaCl excipiente 850 Consideraciones para establecer
65
un cultivo libre de contaminantes visibles se lleva a cabo con presiones de 1.0 a 1.2 Kg/cm2 a
temperatura de 120 °C y durante 20 a 40 minutos.
• Conocer el material vegetal y sus posibles • Algunos medios pueden incluir sustancias inestables
contaminantes específicosAcondicionar la a altas temperaturas (antibióticos, giberelinas, algunas
planta dadora de explantes vitaminas, zeatina, etc.), que por tal razón no deben
• Desinfectar el explante ser sometidas al proceso de autoclavado.
• Emplear medios e instrumentos de cultivo • En este caso se aconseja la esterilización del medio
esterilizados en autoclave y los productos termolábiles deben ser
• Cultivar los explantes en una cámara de esterilizados por medio de filtración.
transferencia con aire estéril
• Mantener los ambientes limpios
• Incubar los cultivos en cuartos cerrados, li-
bres de corrientes
• Atender las manipulaciones del operador
Algunas soluciones…
• Lavado del material
• Secado en estufa
• Uso de UV
• Etanol y desinfectantes
Esterilización: procedi- • Evitar las corrientes de aire y la circulación de per-
miento para la eliminación sonas
• Los instrumentos de trabajo deben ser esteriliza-
de microorganismos.
dos
• Uso de mechero Una vez terminada la desinfección se los coloca
Autoclave: aparato en el • Desinfección de superficie del explanto en recipientes que contienen los medios de cultivo.
que el medio, material d • Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida Los recipientes pueden ser, placas de petri, tubos de
vidrio, instrumental, etc., estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire ensayos o simplemente frascos del tamaño adecua-
es esterilizado por vapor estéril. do. Cualquiera sea el recipiente, debe estar esterili-
bajo presión (121oC, 15
• La esterilización de medios, de herramientas (bistu- zado para evitar contaminación. Los medios de cul-
rí, pinzas, agujas de disección, etc.) como de vidriería y tivos utilizados contienen sales minerales, vitaminas,
psi, 10-20 min.).
agua, se realiza en autoclave y en términos generales azúcares y hormonas reguladoras del crecimiento de
66
las plantas. El medio más frecuentemente usado es el MS con di- para la mayoría de las especies. Algunas especies requieren de un
ferentes diluciones y modificaciones adaptadas a gran cantidad de periodo inicial en oscuridad, pero en gran parte de ellas se utiliza
especies. Ver capitulo de Medios de Cultivo luz que puede ser blanca fría del tipo proporcionado por lámparas
fluorescentes. En esta etapa se inicia la multiplicación acelerada y
los nuevos brotes pueden consumir por completo los nutrientes y
el agua del medio de cultivo. Si ello ocurre, es necesario cambiarlos
a nuevos medios de cultivo antes de iniciar la fase de enraizamiento.
Es aquí cuando los cuidados en la manipulación son importantes
para evitar contaminación de los nuevos brotes.
Cuarto de crecimiento
• Deben ser mantenidos en las

Multiplicación mayores condiciones asépticas
posibles.
El objetivo de esta etapa es aumentar la cantidad de brotes • Uso de pinturas resistentes al
para los sucesivos ciclos de multiplicación, de manera a producir el lavado
mayor número de plantas posibles en el menor espacio y tiempo. • Las mesas y estanterías de los
El medio de cultivo, las hormonas y reguladores de crecimiento, las cuartos de cultivo deben ser li-
condiciones del ambiente y los cuidados en la manipulación son sas, lo cual permite una mayor
importantes para el logro de la multiplicación de los clones a gran asepsia de las áreas.
escala. En general temperaturas entre 20 y 27°C son adecuadas • Periódicamente deben reali-
67
zarse inspecciones en los cuartos de crecimiento y reti-

rar los distintos materiales contaminados.
• La limpieza de los cuartos debe ser frecuente y pre-
feriblemente deben utilizarse en estas limpiezas solu-
ciones de hipoclorito, alcoholes u otros desinfectantes
superficiales.
Enraizamiento y aclimatación
Métodos alternativos
En esta etapa se forman las raíces adventicias, simi- de enraizamiento
lares a la que se producen cuando se coloca una rama
en un frasco con agua. Los brotes que se multiplicaron
Fuente; Rudoy V.
en la etapa anterior emiten raíces que van a permitir el
transplante de las nuevas plantas en condiciones fuera del Micropropagacion
laboratorio, en macetas para finalmente ser trasladarlas comercial,
a su lugar definitivo. El enraizamiento puede realizarse Agrobiotecnologia,
utilizando medios de cultivo o soluciones con concentra- UBA
ciones de hormonas que favorecen el enraizamiento.
Una vez conseguida la formación de las raíces, las

nuevas plantas están podrán sobrevivir en condiciones
normales de cultivo. Sin embargo, el proceso debe ser
gradual debido a la gran perdida de agua que sufren en
las etapas iniciales del transplante reduciendo de ma-
nera considerable la tasa de supervivencia. Es por ese
motivo que no pueden ser expuestas directamente a las
condiciones de ambiente natural, sino que deben pasar
por etapas intermedias, como invernaderos o áreas con
cobertura de media sombra hasta que las plantas estén
Fuente: http://
suficientemente fortalecidas para tolerar las condicio-
nes ambientales. Por el mismo motivo, los sustratos uti- www.etsea2.
lizados para las macetas que pueden contener mezclas udl.es
de arena y abonos, deben estar esterilizados.
Esquema de las etapas de una micropropagación
68
Posibles respuestas
Fuente. Agrobiotecnología, UBA-
Tipos de micropropagación
Propagación vegetativa
a partir de yemas preexistentes
• Proliferación de yemas apicales o axilares
- Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas

axilares preexistentes.
- Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de
dichas yemas.
- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con base en el nú-
mero de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explante
inicial, entre una resiembra y otra sucesiva. Esta tasa puede va-
riar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en
cuestión, entre otras variables.
- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían
obtenerse10.000.000 plantas en un solo año, a partir de una
única yema inicial.
- El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta
técnica. (ver capitulo 5)
69
70
Usos y ventajas de la micropropagación
Durante los procesos de propagación

de plantas resulta frecuente la contamina-
ción de las nuevas plantas con enfermeda-
des que normalmente se transmiten por las
partes de la planta utilizadas para la multi-
plicación o bien por los instrumentos, como
tijeras de podar, cuchillos, machetes usados
en las tareas. Uno de los beneficios de la
micropropagación está relacionado con la
La micro-propagación obtención de mudas sanas, libres de pató-
requiere una genos que garantizan la implantación de un
infraestructura
cultivo. Se han conseguido con éxito plantas
libres de virus en cultivos de frutilla y papa
mínima especializada y
entre otros, utilizando el cultivo de yemas
condiciones controladas apicales.La limpieza de clones utilizando
de cultivo (ver capitulo 3) micro injertos es frecuente en cultivos de
manzano, durazno, cítricos y uvas.
El impacto más importante de la mi-

cropropagación está en la producción co-
mercial de plantas que ha posibilitado a los
viverista la multiplicación a gran escala de
mudas de calidad. Actualmente pueden ser
usadas técnicas de micropropagación en
gran cantidad de especies ornamentales,
frutales y plantas leñosas. Son significativos
los avances con especies forestales que
incluyen a más de 80 especies entre los
cuales se encuentran eucaliptos, araucaria,
pinos, álamo y acacias.
Las mudas producidas por micropro-

pagación normalmente son más caras que
71
las obtenidas por métodos tradicionales porque tienen un valor Estudio de caso
adicional relacionado con la selección cuidadosa de las plantas ma-
dres o clones de los que provienen que se traducen en materiales MICROPORPAGACIÓN DE ORQUÍDEAS
homogéneos y de buena sanidad.
Introducción
A partir de hojas Las orquídeas son plantas ornamentales de gran valor comer-
cial, sean éstas como plantas completas o bien como flores de
corte. Existen varios métodos de propagación que incluyen el uso
brotes o semillas. El uso de brotes es tradicional y se obtienen
plantas idénticas a la planta madre o clones. Como las orquídeas
producen semillas es posible hacer hibridaciones combinando ca-
racterísticas, de manera que se pueden obtener nuevos colores o
tamaños de flores. Una vez conseguido el híbrido se vuelve a multi-
plicar utilizando los vástagos. La micropropagación permite obtener
gran cantidad de clones, agregando a ello una mayor sanidad de las
mudas producidas, que representa una gran ventaja para disminuir
la contaminación con virus, frecuentemente observada en los vive-
ros, que se traducen finalmente en disminución de la productividad
y calidad de las orquídeas.
Laboratorio
• Area de preparación de medios
• Area de lavado y esterilización Instalaciones
• Cuarto de cultivo
• Area de rusticación Se debe acondicionar un espacio o habitación para que cuente
con área de preparación de medios, área para lavado y esteriliza-
Material Vegetal ción, una zona estéril, un área para el cultivo y otra para el proceso
• Plantas madres seleccionadas de rusticación. Para la esterilización del medio de cultivo y los ma-
• (preacondicionamiento) teriales, en lugar de la autoclave, puede utilizarse una olla a presión
• Explantos (elección, disección, esterilización, etc) y en lugar de tubos de ensayo pueden usarse frascos de vidrio
reciclados de la casa y tapas de papel de aluminio que se encuentra
Condiciones de cultivo en los supermercados. Si no se cuenta con cámara de flujo laminar,
• Aspsia se puede destinar un espacio de alrededor 1 metro cuadrado, en
• Recipientes una superficie azulejada y aislarlo. Si la superficie azulejada es bien
• Temeperatura desinfectada con alcohol puro y se utiliza un mechero de alcohol
• Luz y fotoperíodo para flamear todos los instrumentos, es posible disminuir la inciden-
72
cia de contaminantes. El área de cultivo debe contar con estantes, Procedimiento

donde se colocarán los frascos, además la temperatura, humedad
y luz deben ser controladas. La luz puede estar proporcionada por • Para preparar el medio de cultivo disuelva en agua destilada el
tubos fluorescentes de 40 watts y se deben colocar tres en cada azúcar, la sal del medio M & S. Antes de llevar a volumen final ve-
uno de los estantes. Para controlar la cantidad de horas de luz re- rificar el pH con una tirita del indicador a fin de que se encuentre
querida por la variedad se puede colocar un dispositivo automático en 5,5.
para el encendido y apagado de las luces.
• Agregar el agar, hervir para disolver totalmente y distribuir en los
frascos. Tapar frascos con papel de aluminio. Coloque los frascos
Materiales cerrados en una olla a presión por 20 min desde el inicio del her-
vor. Cuando estén fríos pueden guardarse en un refrigerador hasta
• Brotes de la planta de orquídea que sean utilizado.
• Agua destilada esterilizada
• Etanol al 70 % • Todos los materiales que serán utilizados deben ser esterilizados
• Hipoclorito de sodio de 0,5 a 2,5 % que puede ser reemplazado por el mismo procedimiento durante 50 minutos para el agua y la
por blanqueador o Lavandina. vidriería.
• Una gotas de detergente par ayudar a la acción del Etanol y el
Hipoclorito • La desinfección del material vegetal se hará primero con el alco-
• Frascos de vidrios lavados y esterilizados hol al 70% por 30 segundos y un enjuague con agua estéril y luego
• Pinzas, bisturí o cualquier otro instrumento que ayude a la remo- por 5 minutos en el hipoclorito o lavandina.
ción y manipulación de las yemas
• Algodón hidrófilo • Enjuague las yemas en agua destilada y esterilizada colocada en
• Papel aluminio tres recipientes, en forma sucesiva, para eliminar los restos de la
• Papel indicador de pH 0 a 14 lavandina. Los explantes pueden dejarse en el recipiente final de
• Mechero o una fuente de gas para flamear los instrumentos agua estéril cubiertos con una tapa también estéril hasta que se
• Medio de Cultivo necesiten.
- Medio comercial Murashige y Skoog (MS)
- Azúcar granulada (sacarosa) 30 gr por litro • Extraiga el tejido de una yema de la planta con ayuda de un bistu-
- Puré de bananas 200 gr. Como fuente adicional de carbono rí previamente flameado, sin calentar al rojo vivo y enfriado.
- Agar 8 gr
• Tome uno de los frascos con el medio de cultivo, retire la tapa y
flamee ligeramente la boca del mismo.
• Coloque rápidamente el segmento de tejido en el frasco con la

ayuda de una pinza, también flameada y enfriada.
73
• Vuelva a colocar las pinzas en el recipiente con alcohol. Flamee

nuevamente la boca del recipiente y tápelo.
• El procedimiento se repite con cada uno de los frascos, hasta

completar la cantidad prevista.
• Los frascos se depositan en los estantes del área destinada al

cultivo, con temperatura de 27 ° C y 16 horas de luz.
• Cuando las plantas han desarrollado tres pares de hojas se pasa

a la fase de rusticación, que debe ser un lugar acondicionado para
que las plantas comiencen a adaptarse al ambiente de manera gra-
dual. Pequeños invernaderos, áreas protegidas de las casas como
corredores o áreas cubiertas con media sombra. Las macetas o
bandejas donde serán trasladadas la mudas pueden contener, sus-
tratos como xaxim, musgo, tergopol y carbón vegetal
Normas de seguridad
• Utilizar guardapolvo y guantes plásticos de los que se usan

para cirugías
• Mantener el alcohol lejos de las llamas
• Proteger los ojos, si fuera posible con anteojos de seguridad
Capítulo 6
CULTIVO DE MERISTEMAS
Teresa Avila Alba

77
Introducción
La principal causa de pérdidas en la agricultura es la incidencia Los progresos alcanzados en la aplicación del cultivo de me-
de enfermedades ocasionadas por diferentes microorganismos pa- ristemas, han hecho posible propagar material libre de virus de un
tógenos entre los que se encuentran hongos, bacterias y virus. gran número de especies de importancia económica, con benefi-
cios para el pequeño agricultor.
Las enfermedades causadas por virus ocasionan una reducción
de la producción, además que pueden ser transmitidas hacia plantas
sanas. Para la recuperación del potencial productivo de estas plantas Cultivo de meristemas
y evitar la diseminación de enfermedades a otras zonas libres de
éstas, es primordial la utilización de técnicas de cultivo in vitro como El cultivo de meristemas es una técnica que permite el sanea-
el cultivo de meristemas, que permite la obtención de plantas sanas miento de plantas, especialmente de virus. Los meristemas son
que pueden ser micropropagadas (multiplicadas in vitro) y así llegar al aislados y sembrados en un medio de cultivo que posibilita el de-
agricultor con material promisorio a nivel sanidad y a nivel genético. sarrollo de una planta completa, como puede observarse en el
esquema siguiente:
Los métodos de propagación a través de la biotecnología ve-
getal, se caracterizan por obtener en corto tiempo grandes volú-
menes de plantas de alta calidad genética y fitosanitaria, por tanto
resulta indispensable iniciar la propagación con plantas libres de
microorganismos patógenos. Contar con un material de partida
óptimo es el resultado de la integración de diferentes aspectos
como la selección adecuada en campo de las plantas donadoras, la
utilización de técnicas de diagnostico confiables y métodos eficien-
tes de saneamiento que garanticen la eliminación del patógeno. Tomado de Porqué Biotecnología, Cuaderno N°35
78
El meristema es un tipo de tejido vegetal en el que sus células su ubicación y manipulación adecuada, con el objetivo de facilitar
conservan la capacidad de dividirse, es un tejido formativo, lo en- su extracción. Existen meristemas muy fáciles de localizar, como
contramos en zonas de crecimiento tales como el ápice de raíces y son los expuestos, tal es el caso de la papa, en otros cultivos
tallos y está conformado por células que se dividen continuamente pueden estar más internamente protegidos y se necesita separar
para originar otros tejidos. En el siguiente grafico se observa la mayor cantidad de pequeñas hojas para encontrar la zona me-
estructura de un meristema. ristemática, ese es el caso de los bulbos como el ajo y la cebolla
(García, 1999).
Sacar el meristema es un proceso delicado, requiere de mu-

chas horas de práctica y debe realizarse con el apoyo de un mi-
croscopio estereoscopio, en una cámara de flujo laminar a fin de
asegurar un área de manipulación estéril.
La técnica de cultivo de meristemas tiene mejores resultados

cuando está asociada a termoterapia (tratamientos con altas
temperaturas), la cual consiste en exponer plantas a una tempe-
ratura de 37°C durante 3-4 semanas antes de la escisión de las
puntas meristemáticas. La termoterapia tiene el objetivo de redu-
cir o inhibir la multiplicación viral en los tejidos tratados y que los
brotes nuevos que se desarrollen durante la misma, tengan una
menor concentración de virus que los tejidos iniciales. Es a partir
de estos brotes nuevos, que se realiza el cultivo de meristemas.
Estructura de un ápice mostrando los primordios Las plantas obtenidas mediante cultivo de meristemas deben
foliares y el meristema ser evaluadas para asegurar que no tienen virus, mediante técnicas
que identifican la presencia del virus en la planta. Solamente las
Se considera que los meristemas suelen tener pocos o ningún plantas que pasan este diagnostico de manera favorable, pueden
virus, fundamentado en que la distribución de los virus en los teji- considerarse limpias de virus y ser propagadas in vitro o en inver-
dos de una planta no es uniforme y que su concentración tiende a nadero. Este diagnóstico de enfermedades se realiza a través de
disminuir progresivamente hacia el meristema; por este motivo, el pruebas serológicas como Enzyme-linked immunosorbent assay
cultivarlos aislados en un medio artificial permite que el tejido y las (ELISA), que detecta la presencia de un antígeno producido por
plantas que se regeneren a partir del mismo, estén libres de virus. un organismo infectado por virus o también mediante la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), que es una técnica molecular
El reconocimiento de la zona meristemática varía entre espe- que detecta ADN viral.
cies, por lo tanto se requiere de estudios preliminares que revelen
79
La técnica de ELISA detecta la reacción del organismo infectado

con virus o el virus mismo y lo hace visible por medio de una enzima
que puede dar coloración o fluorescencia en una placa plástica. El
procedimiento puede observarse en el siguiente grafico:
Preparación Las muestras están siendo

de muestras de plantas sembradas en una placa
de ELISA
La PCR es una técnica que utiliza un equipo de laboratorio que se

llama termociclador, en el que cuando se analiza una planta que tiene vi-
rus, se multiplica un pedazo del virus, de tal manera que pueda hacerse
visible en una gelatina utilizada para este fin. En caso de que la planta no
tenga virus, nada se amplifica y nada se hace visible en el gel.
Las muestras están siendo Gel de agarosa mostrando

colocadas en un termoci- resultados de una PCR
clador para realizar la PCR para detectar virus
La banda que se encuentra a la altura del peso molecular (PM)

Esquema que muestra el procedimiento 390 es la que significa que la muestra es positiva, por lo tanto las
que sigue un test de Elisa muestras 1-8 son positivas y la 9 negativa.
80
Aplicación del cultivo de meristemas cosechan en la casa de malla son sembrados en campo para la pro-
ducción de semilla comercial. Los agricultores pueden adquirir las
El cultivo de meristemas es una técnica delicada, costosa y que plantas in vitro o los tuberculos libres de virus, el hecho de partir de
requiere de mano de obra calificada, sin embargo las plantas que un material saneado, permite mejorar considerablemente los rendi-
se obtienen a través de él, constituyen un material que puede ser mientos en campo del agricultor, ya que la papa tiende a acumular
propagado muchas veces, lo que significa que se constituye en un enfermedades y después de varias generaciones se tiene una semilla
material de partida. “cansada” como le dicen los agricultores de los andes, que va a dar
lugar a bajos rendimientos y a veces a pérdidas considerables.
Esto permite al agricultor beneficiarse de material libre de virus,
es decir el cultivo de meristemas puede realizarse en un laboratorio y
el agricultor adquirir las plantas saneadas para multiplicarlas y producir Selección del material a sanear mediante cultivo de meristemas
flores, frutos, entre otros. Se tienen varios ejemplos de esto, como
el caso de los agricultores que cultivan árboles frutales, los cuales Las técnicas de limpieza viral, por su elevado costo (aproxima-
adquieren plantines libres de virus y los utilizan para tener una mayor damente de 500 dólares por variedad) y por el tiempo que deman-
producción, más uniforme y libre de enfermedades virales, esta técni- dan (aproximadamente un año), no se pueden utilizar en cualquier
ca es muy utilizada en la producción de porta injertos de cítricos por material vegetal, por lo que la metodología requiere priorizar el
ejemplo. De igual manera, en el caso del cultivo de flores y forestales, material a ser saneado en base a los siguientes criterios:
el cultivo de meristemas permite obtener plantines sanos que son
adquiridos por agricultores para su posterior producción. a) Por la importancia económica de la especie a sanear, la mis-
ma que debe responder a una demanda del sector productivo agrí-
El cultivo de meristemas es un paso fundamental no solamente cola o forestal.
en la producción de plantines de alta calidad genética y sanitaria, sino b) Por la importancia social y cultural, como en el caso de varie-
también en la producción de semilla de alta calidad genética y sanita- dades nativas, que significan uno de los pocos sustentos para familias
ria. Se utiliza fundamentalmente en plantas de reproducción asexual campesinas y que han garantizado desde siempre su seguridad ali-
o vegetativa, como la papa, el camote o batata, la yuca y el banano, mentaria, además de significar un invalorable recurso genético.
entre otros. Las plantas de reproducción asexual son aquellas que no c) Por la cobertura geográfica, que significa un beneficio y/o
se transmiten por semilla, sino por una porción de la misma planta participación de varias comunidades.
como un tubérculo o una raíz. También se utiliza cultivo de meriste-
mas para limpiar plantas que transmiten virus de una generación a la En el caso de los bancos de germoplasma, donde se conservan
otra mediante semilla, como es el caso de las habas. y salvaguardan un número importante de muestras que constituyen
la riqueza genética de un país, la necesidad de contar con material
La producción de semilla de papa es imprescindible que se reali- libre de virus radica en: 1) la posibilidad de que las muestras sean
ce a partir de plantas libres de virus, propagadas in vitro en un labo- devueltas y reintroducidas a su zona de origen, 2) el material sea
ratorio de cultivo de tejidos y que luego se trasplantan y se cultivan, utilizado en programas de mejoramiento genético y 3) que éste
para su multiplicación, dentro de una casa de malla que no permite sirva de material madre dentro de un programa de producción de
el ingreso de insectos vectores de los virus. Los tubérculos que se semilla (Aguirre y Coca, 2010).
81
Estudio de Caso: Protocolo para la preparación

Cultivo de Meristemas de Haba del medio de cultivo de establecimiento
Se utiliza cultivo de meristemas en haba debido a que existen

virus que se transmiten por medio de semilla como los Potyvirus.
Las plantas libres de virus, sirven como plantas madres para la pro-
ducción de semilla de alta calidad genética y sanitaria.
La extracción de los meristemas puede realizarse en plantas

provenientes del invernadero o en plantas in vitro, en habas se ob-
tiene una mejor respuesta cuando son extraídos a partir de plantas
establecidas in vitro y multiplicadas en el laboratorio. Tabla 1. Composición del medio de cultivo de establecimiento
El siguiente protocolo para el establecimiento, multiplicación, Metodología para preparar el medio de cultivo
enraizamiento, cultivo de meristemas y aclimatación de plantas in 1. Sobre un agitador magnético con calentador, en un vaso de pre-
vitro de habas, ha sido desarrollado en el Centro de Investigaciones cipitado mezclar las sales minerales MS y la sacarosa (azúcar) con
Fitoecogenéticas de Pairumani, Cochabamba, Bolivia. agua destilada
2. Ajustar el pH a 5.6 y adicionar el agar
3. Calentar el medio de cultivo para diluir el agar y posteriormente
1. Establecimiento del cultivo in vitro de habas dispensarlo en envases
4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121°C y 15
El primer paso para el establecimiento del cultivo de tejidos en libras de presión
habas es desinfectar las semillas que serán introducidas al laborato-
rio. Estas semillas desinfectadas deben ser tratadas con un antioxi- Protocolo de desinfección y tratamiento antioxidante
dante y colocadas en un medio de cultivo para su germinación. de semillas de haba
1. Colocar las semillas en el fungicida Benomyl por 2 horas (1gr/l)
Condiciones de incubación de las semillas: temperatura 25°C y 2. Enjuagarlas 3 veces con agua destilada
fotoperiodo de 16 horas de luz. 3. Remojar las semillas en el acaricida Vertimex (1ml/l) durante 10
minutos
4. Enjuagarlas con agua destilada
5. A partir de este paso se realizan las manipulaciones en la cámara
de flujo laminar
6. Sumergir las semillas en alcohol al 70% por 5 minutos
7. Remojar las semillas en hipoclorito de sodio al 1% con Tween 20
(3 gotas) durante 15 minutos
82
8. Enjuagarlas 5 veces en agua destilada estéril Protocolo de preparación del medio de cultivo
9. Remojar las semillas en agua destilada estéril por 24 horas para para la multiplicación y el cultivo de meristema
facilitar el pelado
10. Una vez peladas las semillas, remojarlas durante una hora en
una solución de polivinil pirrolidona (PVP) a una concentración de
1g/litro, solución esterilizada en autoclave
11. Colocar las semillas en papel filtro ó en medio de cultivo para
su germinación
Semilla de haba germinada Semilla de haba germinada

en un papel filtro en medio de cultivo Tabla 2. Composición del medio de cultivo para la multiplica-
ción y el cultivo de meristemas de habas
2. Multiplicación in vitro
y cultivo de meristemas de plántulas de haba Metodología para preparar el medio de cultivo
Las plantas obtenidas a partir de las semillas germinadas, se 1. Sobre un agitador magnético con calentador, en un vaso de
colocan en un medio de cultivo que asegure la multiplicación de precipitado mezclar todos los componentes del medio con excep-
las mismas. ción del agar y ajustar el pH a 5.6
2. Adicionar el agar a la mezcla anterior
El cultivo de meristemas se realiza a partir de las plantas esta- 3. Calentar el medio de cultivo para diluir el agar y posterior-
blecidas y multiplicadas in vitro, utilizando el mismo medio de cultivo mente dispensarlo en envases
que se usa para la multiplicación. 4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121°C y 15
libras de presión
83
2.1. Multiplicación in vitro o micropropagación mente antes de ingresarlo a la cámara de flujo laminar utilizando
La multiplicación o micropropagación de las plantas se realiza hipoclorito de sodio. Los instrumentos que se utilizan en el proceso
mediante esquejes, los cuales serán colocados en un medio fresco. son: pinzas , bisturís y una aguja de punta fina como la de la jeringa
Este procedimiento debe realizarse en la cámara de flujo laminar para insulina. Esta última se usa para realizar los últimos cortes que
con ayuda de pinzas y bisturís estériles. tienen que ser más precisos.
Las plantas micropropagadas deben incubarse a 25°C con un

fotoperiodo de 16 horas de luz, durante dos meses.
Este proceso puede repetirse varias veces hasta obtener el nú-

mero de plantas deseado. Una vez haya ocurrido esto, las plantas
pueden ser utilizadas para el cultivo de meristemas y en el caso
que se trate de plantas libres de virus, es decir que provienen de
cultivo de meristemas, deberán ser trasladadas al medio de enrai-
zamiento.
Manipulaciones para extraer el meristema dentro de una cámara

de flujo laminar con ayuda de un esteroscopio
En una placa petri se coloca la yema apical de la planta in vitro.

Con la ayuda de una pinza fina y una hoja de bisturí tamaño 11,
se corta una a una las hojas hasta llegar a los primordios foliares.
Plántulas de haba micropropagadas Al descubrir el domo meristemático, se debe realizar un corte del
domo con mucho cuidado para no destrozarlo, colocarlo en el
medio de cultivo y incubarlo a 25°C con un fotoperiodo de16
2.2. Cultivo de meristemas horas de luz. Se debe realizar cada semana un cambio de medio de
cultivo a medio fresco, durante dos meses. Luego de este tiempo
En la cámara de flujo laminar y utilizando instrumentos estériles, el meristema va a brotar y se va a convertir en una pequeña planta
se extraen los meristemas de las plantas in vitro, bajo un microsco- que deberá ser trasladada a un medio de cultivo fresco para su
pio estereoscopio. El estereoscopio debe ser limpiado cuidadosa- multiplicación.
84
Protocolo de preparación del medio de cultivo

Para el enraizamiento
Vista en el estereoscopio de un meristema de haba rodeado

de los primordios foliares
3. Enraizamiento in vitro de plántulas de haba

Tabla 3. Composición del medio de cultivo para el enraizamiento
Las plantas micropropagadas o multiplicadas se trasladan al me-
dio de enraizamiento hasta alcanzar la formación de raíces suficien-
te para soportar la aclimatación. Este periodo es de aproximada- Metodología para preparar el medio de cultivo
mente 2 meses, pero en algunos casos puede alargarse.
1. Sobre un agitador magnético con calentador, en un vaso de pre-
El traslado de las plantas micropropagadas al medio de enraiza- cipitado mezclar todos los componentes del medio con excepción
miento debe realizarse en la cámara de flujo laminar con ayuda de del agar y ajustar el pH a 5.6
pinzas y bisturís estériles. 2. Adicionar el agar a la mezcla anterior
3. Calentar el medio de cultivo para diluir el agar y posteriormente
Las plantas en formación de raíces deben incubarse a 25°C con dispensalo en envases
un fotoperiodo de 16 horas de luz. 4. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121°C y 15
libras de presión
85
4. Aclimatación de plántulas de habas en el

laboratorio Lavado de las raíces
con agua destilada estéril
Las plántulas con raíces se aclimatan de acuerdo al siguiente
protocolo:
1. Esterilizar en autoclave, tierra vegetal mezclada con un poco de are-

na
2. Bajo la cámara de flujo laminar con luz ultravioleta y por una
hora, colocar un recipiente de vidrio (tipo pecera), juntamente con
los envases en los que se aclimatarán las plantas
3. Dispensar la tierra estéril en los envases humedeciendo con agua
destilada estéril
4. Con mucho cuidado sacar las plántulas sin dañarlas ni quebrarlas Plántula en tierra estéril
5. Enjuagar las raíces con agua destilada estéril
6. Colocar las plántulas en medio del envase y añadir más tierra si
es necesario
7. Colocar los envases en el recipiente de vidrio y tapar con un Plantas de habas libres de virus
pedazo de plástico el recipiente
8. Durante los primeros días, destapar el plástico durante unos
cuantos minutos y así progresivamente hasta que la planta ya no
necesite del plástico
9. Las plantas aclimatadas se llevan a la casa de malla para la pro-
ducción de semilla de alta calidad genética y fitosanitaria, posterior-
mente a que hayan pasado el diagnostico para detectar presencia
de virus
Plántula con raíces lista

para la aclimatación
en aclimatación en el laboratorio
Capítulo 7
BIORREACTORES PARA MICROPROPAGACIÓN

Elaboración de sistemas de inmersión temporal de bajo costo
para micropropagación
Iselen Trujillo
89
Ficha técnica
Innovación tecnológica: Experiencia en el uso de la tecnología:

Biorreactores de bajo costo para micro propagación Tecnología adoptada por productores organizados y diversas
instituciones
Especies donde se puede aplicar:
Frutales, ornamentales, hortícolas
Introducción
Usuarios del sistema:
Pequeños y medianos productores, Este capítulo es una recopilación de experiencias provenientes
asociaciones de productores, laborato- de diversas unidades de investigación con la intención de que pue-
rios de bajo presupuesto dan ser implementados por pequeños o medianos productores o
por asociaciones de dichos productores para la producción in vitro
Generador de la Tecnología: de plantas con una eficiencia mayor que por técnicas de propaga-
Universidad del Zulia (Venezuela), ción in vitro convencionales
INIA-CENIAP (Venezuela), Universi-
dad Nacional Experimental Simón El incremento de las áreas de siembra y la expectativa de un
Rodríguez (Venezuela), Centro sistema de mayor eficiencia para la propagacion de plantas in vitro
de Investigación en Biotecno- los sistemas convencionales no satisfacían las expectativas, ni en
logía del Instituto Tecnológico cantidad ni en calidad, de aquellos materiales de interés comercial
de Costa Rica, Universidad ha planteado la necesidad de implementar sistemas que puedan
Militar Nueva Granada (Co- incrementar esa eficiencia (Buitrago 1999).
lombia).
Trujillo y col.(2007)
90
El desarrollo de tecnologías de gran eficiencia desde el punto aireación (bomba), a una presión de salida que permita impulsar el
de vista biológico,cuantitativo y económico , que faciliten un mayor medio del compartimento inferior al superior durante un periodo
grado de automatización en los procesos de almacenamiento y corto (periodo de inmersión). Este baño temporal que reciben
multiplicación de germoplasma valioso, permitirán a su vez dismi- los explantes, se controla por un reloj programable que permite
nuir los costos en la producción de plantas in vitro. La propagación la abertura automatizada de una electro-válvula que controla el
in vitro permite la obtención de altas tasas de multiplicación y de sistema Fig 1(Escobar y col, 2000).
una gran estabilidad genética al compararse con los sistemas de
reproducción agámica y clonal, donde se ha facilitado la reducción
en costos de manipulación, sin disminuir la eficiencia biológica y
productiva, específicamente a nivel de plantas agrícolas y de uso
industrial (Pérez Ponce,1998) . El cultivo in vitro de un órgano o de
un fragmento de un órgano, con el objeto de lograr su reproduc-
ción vegetativa, se desarrolla siguiendo una estrategia constituida
por pasos esenciales: la iniciación del cultivo en condiciones in vitro,
la multiplicación activa de las estructuras capaces de desarrollar-
se como individuos idénticos a la planta donante y el paso de la
heterotrofia a la autotrofia, con la consiguiente adaptación de las Figura 1. Esquema de
plántulas obtenidas a las condiciones de cultivo in vivo. funcionamiento del sistema
de inmersion temporal RITA®
Es en la etapa de multiplicación de la propagacion in vitro, donde
es necesario implementar alternativas que favorezcan la eficiencia
del proceso.
Por este motivo, se plantearon como objetivos en este traba-
El desarrollo de los sistemas de inmersión temporal o perio- jo presentar alternativas de bajo costo para la micropropagación
dos cortos y determinados, pueden proveer un medio rápido y de especies de interés, ofertando un prototipo económico para la
eficiente para la propagación de plantas en condiciones in vitro, propagación in vitro a través del sistema de biorreactores
por medio de la inducción de órganos (brotes o raíces) en forma
directa en medio líquido; sin embargo, el alto costo de los sistemas La tecnología de los sistemas de inmersión temporal puede
comerciales desarrollados para tal fin, como lo es caso de siste- presentarse como una alternativa viable que permitirá mejorar los
ma RITA® ha limitado su uso. El sistema consiste en un recipiente coeficientes de multiplicación, el desarrollo de brotes y plántulas
plástico (RITA®) dividido en dos compartimentos. En el superior y la calidad fisiológica de las plántulas obtenidas por este procedi-
se coloca el tejido o segmento de la planta a multiplicar (por ejem- miento. La construcción de un sistema prototipo de biorreactor de
plo brotes) y en la parte inferior el medio de cultivo. Este sistema inmersión temporal de bajo costo, en el que se pueda garantizar
cuenta con dos filtros reutilizables: uno central (entrada de aire) y además de un óptimo funcionamiento y proveer condiciones esté-
uno lateral (salida de aire). El filtro central se conecta al sistema de riles para el cultivo, resulta ser altamente viable desde el punto de
91
vista económico y práctico, ya que al comparar este prototipo con tiempo de contacto con el medio de cultivo.
el sistema comercial RITA®, su costo es al menos 3 veces menor
que el sistema comercial, con una vida útil mas prolongada, permi- Diseño de un sistema de inmersión temporal
tiendo muchos ciclos de esterilización, mientras que los filtros para
el sistema RITA® son muy limitados (aproximadamente 10 ciclos) El sistema de inmersión temporal puede ser construido con
(Giménez y Colmenares, 2004) frascos de vidrio para almacenar alimentos, con capacidad diversa
(una buena recomendación es 500 gr), cubiertos por tapas de plás-
tico (envases). Las tapas son horadadas para abrir dos orificios a
Problema que resuelve través de las cuales se colocaran conexiones plásticas de polipropi-
leno de ¼ pulgada con tuercas y empacaduras de goma (Nalgene
El uso de Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT) disminuye 6149-0002).
los costos y aumenta los volúmenes de producción en limitados
espacios físicos, la combinación de estos factores constituyen una Una de las conexiones se usará para recircular el medio de cul-
garantía en la obtención de plantas de alta calidad a bajo costo. Este tivo entre los frascos. La otra conexión del envase corresponderá
tipo de tecnología ha sido empleada como complemento impor- a la entrada de aire que es esterilizado por filtración a través de un
tante y denominado tecnología superior en la propagación masiva filtro de goma espuma de varias capas. Los filtros pueden ser dise-
de varias familias botánicas de plantas ornamentales, frutales, orna- ñados con tubos cilíndricos de vidrio de 7 cm de largo y 5 mm de
mentales y de interés agrícola en general . (Pérez-Ponce, 1998) diámetro, rellenos con un cilindro de 70 mg de goma espuma del
mismo tamaño del tubo de vidrio. La circulación del medio se logra
al conectar los frascos por intermedio de estas conexiones con una
Descripción de la tecnología manguera de silicona tratada con níquel (Nagelne 50, 8060-0060)
que recorre desde el fondo de un frasco al fondo del otro.
La propagación masiva in vitro de plantas se puede realizar en
biorreactores de inmersión temporal, conocidos comercialmente En este sistema un frasco contiene los explantes, o sea, los seg-
como Recipientes de Inmersión Temporal automatizados. mentos de la planta que se quieren propagar, y el otro el medio de
cultivo líquido (Figura 2).
Los recipientes poseen doble compartimiento y se conectan El flujo de aire que entra por el filtro aumenta la presión en
a un sistema de inyección de aire, con frecuencia y duración con- el recipiente e impulsa el líquido a través de la tubería de silicona
trolada por un reloj programable. El aire suministrado al recipiente, hacia el envase que contiene los explantes , en donde el aire es
impulsa el medio de cultivo líquido del compartimiento inferior al desplazado por el medio de cultivo y sale por el filtro de aire de
superior, sumergiendo el tejido vegetal; cuando el suministro de goma espuma, durante este proceso las válvulas se abren, por una
aire finaliza, el medio de cultivo regresa por gravedad al compar- entra el aire y por la otra sale (Figura 2).
timiento inferior del recipiente. De esta manera, el tejido vegetal El sistema completamente armado debe ser esterilizado en
absorbe los nutrientes necesarios para su crecimiento durante le autoclave a 120°C, 1,5 kg/cm2 durante 15 min, o en una olla de
92
presión para cocinar alimentos, por un periodo de 20 min luego como objetivo desarrollar un vaso fermentador de bajo costo para
que la valvula de la olla comienza a sonar. la micropropagación masiva de jengibre.
Para el control de la inmersión en este sistema de doble en- El vaso fermentador propuesto en este trabajo manejo una
vase se emplean cuatro electro-válvulas plásticas, un temporizador capacidad de 50 a 75 brotes como material de partida en 350 ml
programable digital de 6 ciclos de encendido/ apagado con tiempo de medio de cultivo líquido. Se diseñaron cuatro modelos de vasos
mínimo de 1 min, un compresor de aire y mangueras plásticas de fermentadores con base en un recipiente de vidrio de cuatro litros
polietileno rígido de 5/8 pulgadas, unidas con conexiones T para la de capacidad y todos ellos con dos fi ltros millipore de 0,2 μm en
distribución del aire a los sistemas. la parte superior, uno para la entrada de aire y otro para la salida de
gases. Para la provisión de aire y la oxigenación del medio de cultivo
Estas mangueras y conexiones las distribuyen los comercios de- se utilizó un motor eléctrico funcionando permanentemente.
dicados a sistemas de riego (Giménez y Colmenares, 2004).
La variación entre los modelos utilizados consistió en el tipo
de aglomerante empleado: sin soporte (modelo simple), rejilla
de polipropileno (modelo rejilla), espuma de algodón (modelo
espuma) y piedras de material inerte de 1 cm de largo y 3 mm
de ancho (modelo piedras inertes). El modelo de piedras inertes
para la micropropagación de jengibre permitió que los explantes
no estén en constante contacto con el medio de cultivo en esta-
do líquido por lo que se disminuyen los problemas asociados con
la hiperhidricidad. En comparación con los explantes propagados
en medio semisólido, el modelo de piedras inertes presentó cier-
tas ventajas: se puede cultivar un mayor número de explantes con
una menor cantidad de medio líquido (de 50 a 75 explantes por
350 ml de medio), se disminuyó el costo debido a la ausencia de
gelificante y a la reducción de mano de obra. Además, los explan-
F i g u - ra 2. Prototipos tes tuvieron la posibilidad de alcanzar una mayor altura debido
constr uidos en el Laboratorio al mayor tamaño e intercambio gaseoso del recipiente del vaso
de Biotec- nología Vegetal fermentador en comparación con los envases convencionales de
(BioVeLUZ)- Universidad del menor tamaño (Hernández-Soto y col, 2008).
Zulia para procesos de inmersión temporal (Giménez y Colmena-
res, 2004) En el laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de
Ciencias en la Universidad Militar Nueva Granada se diseñó y cons-
Otra alternativa fue desarrollada por el Centro de Investigación truyó un sistema prototipo de inmersión temporal con insumos
en Biotecnología del Instituto Tecnológico de Costa Rica, y tuvo nacionales, demostrándose con esto que es posible tener un sis-
93
tema de bajo costo en el cual se lograron mantener condiciones Estudios de caso

totales de asepsia, además de demostrar ser un sistema fácil de
manipular y que puede escalarse con facilidad (Fig. 3) (Monroy y A continuación se describe la metodología de propagación in
Filgueira , 2010). vitro a través de biorreactores de inmersión temporal para tres
rubros de gran importancia para la seguridad alimentaria, sin em-
bargo, igualmente se describe un paso previo relativo a la des-
infección de los biorreactores que es importante para todas las
especies a ser propagadas por este sistema:
Desinfección de los biorreactores
Para obtener resultados óptimos se esterilizan los biorreacto-

res de acuerdo al siguiente procedimiento:
Se emplea agua jabonosa y cloro comercial en una primera

etapa de desinfección.
Posteriormente tubos y conectores de plástico se lavan con

un cepillo especial cilíndrico y los filtros se autoclavan juntos con
los envases empleados como base para la multiplicación previa-
mente armados (120 ºC a 15 atm de presión por 30 minutos).
Luego se someten a la exposición de luz ultravioleta (16 h) y

luego se agregan los medios líquidos. A cada envase se le agregan
200 ml de medio y se autoclavan nuevamente por 15 minutos.
Los medios empleados pueden elaborarse a partir de jugos de
frutas y no de reactivos comerciales, que proporcionarían macro
y micronutrientes para el crecimiento y multiplicación del mate-
Figura 3. Prototipo construido en el Laboratorio de Biotecno- rial vegetal, añadiendo agua de coco como fuente de vitaminas y
logía Vegetal de Universidad Militar Nueva Granada (Monroy y Fil- hormonas, como una opción para disminuir costos del proceso .
gueira , 2010)
94
Propagación de bananos a partir del cultivo llados se cultivaron en un medio MS sin sustancias de crecimiento
de ápices caulinares en sistemas de biorreactores para lograr el enraizamiento de estos.
de inmersión temporal
Material vegetal -Cultivo de ápices caulinares en biorreactores

Hijuelos de Banano, Clon Pineo Gigante de inmersión temporal
Se cultivan los ápices caulinares con proliferación de yemas
Metodología (obtenidos previamente en medio semisólido) en cada uno de los
biorreactores de inmersión temporal. Se utilizan tiempos de inmer-
-Aislamiento de ápices caulinares a partir de cormos obtenidos sión diaria de 5 min cada 4 horas y 10 min cada 4 horas.
en campo.
Los cormos o “hijuelos” (tallo engrosado subterráneo, de base
hinchada y crecimiento vertical que contiene nudos y abultamientos -Aclimatación de vitroplantas
de los que salen yemas, y que constituye excelente material para Las vitroplantas obtenidas a partir de biorreactores de inmer-
iniciar un proceso de multiplicación) se trasladan a un lugar limpio y sión temporal se aclimatan abriendo la tapa de los recipientes para
adecuado para este procedimiento, donde se les realiza la limpieza adaptarlas a las condiciones ambientales, y luego se transfieren a
total de hojas del pseudotallo, dejándolos de un tamaño aproximado cuartos de aclimatación durante 2 semanas para ser luego llevadas
de 7 cm. Seguidamente se procede a la desinfección, la cual puede al umbráculo en bolsas de vivero con una mezcla de tierra, arena y
ser realizada con jabón liquido comercial durante 1 min., seguido fibra de coco en proporción 1:1:1 durante un mes. En esta etapa de
de un lavado con agua corriente, alcohol 90% durante 1 min., y se crecimiento las plantas están listas para ser llevadas a campo o para
procede a su aislamiento en un área estéril (campana de flujo lami- ser utilizadas nuevamente como fuente de explante para la extrac-
nar o zona aislada con presencia de mecheros) agregándole cloro ción de ápices caulinares en un segundo ciclo de propagación in
comercial al 50 % durante 30 min. Después se realizan tres lavados vitro. (Fig.4)(González y col, 2006; Silva y col, 2007)
con suficiente agua destilada estéril, y se procede a quitar los restos
de pseudotallo con la ayuda de un bisturí en condiciones asépticas,
hasta obtener ápices de aproximadamente 3 - 5 mm.
-Cultivo de ápices caulinares en medio de cultivo semisólido

Los ápices se cultivan en un medio MS con citocininas y vi-
taminas, se incuban en un cuarto climático o de crecimiento en
oscuridad durante 1 mes a 27± 1°C de temperatura, y luego son
cambiados a 12 horas de luz diaria y doce de oscuridad durante 1
o 2 meses con subcultivos mensuales de los explantes en el mismo Fig. 4 Plantas de Banano Clon Pineo Gigante obtenidas por bio-
medio de cultivo mencionado. Posteriormente los brotes desarro- rreactor de inmersión temporal creciendo en cuarto climático.
95
Propagación de piña a partir de yemas -Enraizamiento y aclimatación

en sistemas de biorreactores de inmersión temporal Las plantas obtenidas in vitro se transplantan a vasos plásticos
que contienen una mezcla de arena y tierra abonada en propor-
Material Vegetal ción 2:1 con la adición de humus en un porcentaje de 50 %. Estos
envases se colocan en cajones de aclimatación con aserrín donde
Plantas de piña de las variedades Valera Amarilla y Valera Roja se registraba una humedad relativa de 85 % y una temperatura de
fueron empleadas como plantas madres para la iniciación de este 27 ºC. Durante esta etapa, las plantas propagadas in vitro son so-
proceso. metidas a períodos de luz cortos (30 min) tres veces al día durante
la primera semana. En la segunda semana, los períodos de luz se
incrementan a dos horas tres veces al día, y en la tercera semana
-Multiplicación en biorreactores de inmersión temporal las plantas son sometidas a un período de luz de 8 h por día. Pos-
Las vitroplantas se sometieron a un proceso de multiplicación teriormente, las plantas son trasladadas a condiciones de vivero.
utilizando un medio liquido a base de sales de Murashige y Skoog, (Trujillo y col, 2007)
suplementados con tiamina 5 mg/l, mioinositol 100 mg/l, sacarosa
30 gr/l y BA 2 mg/l. Los explantes se cultivaron a 26 ºC bajo luz
blanca fluorescente con un período de 16 horas luz y 8 horas de Propagación in vitro de de Plátano Hartón
oscuridad.
Iniciación del cultivo
En una segunda etapa de multiplicación, se estandarizó el nú- Los explantes, se desinfectan en una solución de cloro comer-
mero de yemas por biorreactor, cultivando 6 por envase en el mis- cial al 50 % en un área limpia y estéril (cámara de flujo laminar o
mo medio de cultivo descrito anteriormente pero disminuyendo la zona acondicionada) y posteriormente se sumergen en agua estéril.
concentración de BA a 1 mg/l. (Fig. 5) (Trujillo y col, 2007). En estas condiciones se procede asépticamente a reducir el tama-
ño a 1 cm. de longitud. Adicionalmente, os explantes se someten a
un tratamiento antioxidante, sumergiéndolos en una solución esté-
ril de cisteína 60 mg/l, en donde permanecen por un período de 10
minutos, para luego ser transferidos al medio de cultivo.
Los explantes se cultivan en un medio básico de Murashige y

Fig.5 Multiplicación de Skoog (1962), suplementado con vitaminas, azúcar (30 gr/l )como
Piña en biorreactores de in- fuente de carbohidratos y agar (9 gr/l) como agente gelificante. A
mersión temporal este medio se adicionó benciladenina (BA) 0,5 mg/l como fuente
de citocininas.
Luego de la siembra, los explantes permanecen en oscuridad

por 48 horas para disminuir daños por oxidación e inmediatamen-
96
te se pasan a cámaras de crecimiento y se mantienen a una tem- a las condiciones ambientales y luego se transfieren a un cuarto de
peratura promedio de 26 °C y a una intensidad lumínica continua aclimatación durante 2 semanas. (Fig. 6). Posteriormente se trasla-
por un periodo de 30 días. dan al umbráculo en bolsas de vivero con una mezcla de tierra y
arena en una proporción 1:1 durante quince días. Posterior a esta
etapa de de endurecimiento, las plantas están listas para ser llevadas
Proliferación de brotes en medio sólido a campo. (Silva y col, 2006; Trujillo y col, 2007)
En esta fase se obtiene la proliferación de brotes que originan
nuevas plántulas. Esto puede ser obtenido a través de la formación
de brotes axilares y por la inducción de brotes adventicios.
Después de cumplida la etapa de iniciación, los explantes se

transfirieron a un medio de cultivo con las mismas concentraciones
de sales, vitaminas, sacarosa y agar que se utilizaron en el medio de Fig. 6. Plantas propaga-
iniciación, pero aumentando las concentraciones de citocininas a 5 das de Plátano Hartón en
mg/l, ya que se ha señalado que un incremento en la producción de biorreactores de inmersión
brotes se logra aumentando las dosis de citocininas en cada subcul- temporal a iniciar el proceso
tivo, posterior al período de iniciación. Los explantes fueron sembra- de aclimatación
dos en frascos de vidrio que contenían 50 ml de medio de cultivo, a
razón de 4 explantes por envase. Las condiciones de cultivo fueron
las mismas que las descritas durante la fase de iniciación. Contexto de uso o adaptación
Los frutales son de gran importancia al momento de evaluar
perspectivas para el desarrollo de la seguridad alimentaria en nues-
Multiplicación de brotes en biorreactor de inmersión temporal tro país. En el caso de las musáceas son consideradas como un
Los brotes empleados para la multiplicación en biorreactores rubro alimenticio de gran importancia a nivel mundial, siendo su
se aislan a partir de plantas cultivadas in vitro en medio sólido. Los producción superada solamente por los cítricos. Constituyen un
explantes fueron cultivados en un medio liquido base de Murashige componente importante de la dieta de los pobladores de aquellos
y Skoog (1962), al que se le añade vitaminas, azúcar (30 g/l) como lugares donde se cultiva, debido a su gran contenido de vitaminas
fuente de carbohidratos y se ajusta el pH a 5.8. Se emplea una con- y potasio, constituyendo a su vez una fuente de empleo y de di-
centración de BA de 5 mg/l y períodos de tiempo con frecuencias visas por su alto nivel de comercialización. Sin embargo, el ataque
de inmersión preestablecidas (2 min cada 2 horas; 5 min cada 4 de insectos, plagas y enfermedades ha ocasionado pérdidas en las
horas y 6 min cada 6 horas). Las plantas crecieron a 26 ºC bajo luz cosechas. Debido a diversos problemas que presenta el mejora-
blanca fluorescente con 16 horas luz y 8 de oscuridad. miento por métodos tradicionales, las técnicas utilizadas en Biotec-
nología Vegetal plantean nuevas alternativas y ofrecen un inmenso
Las plantas propagadas en biorreactores de inmersión tempo- potencial, ya que han permitido acortar el tiempo requerido para
ral se aclimatan abriendo la tapa de los recipientes para adaptarlas generar plantas en especies agrícolas de interés como Musa, piña,
97
papa, café, entre otras. El desarrollo de sistemas de inmersión tem- Adicionalmente, los filtros de goma espuma utilizados en algu-
poral para la optimización de la multiplicación de especies bajo nos de los prototipos permiten esterilizar el aire que entra tanto
condiciones óptimas es una buena alternativa de propagación a a los recipientes RITA® como a los prototipos, con un costo más
escala comercial. económicos, son mas duraderos, y es un material de fácil acceso.
La utilización de biorreactores en el proceso de obtención de

Costo estimado de aplicación de la tecnología plantas de frutales in vitro puede mejorar sustancialmente el rendi-
El equipo necesario para la instalación de un sistema de inmer- miento y el ingreso de las personas dedicadas al comercio de esos
sión temporal de las características señaladas en esta ficha tiene rubros, lo que indirectamente ha contribuido a seguir impulsando
un valor aproximado entre 30-40 U$ en todas las experiencias la investigación en el área, lo cual genera un interesante círculo de
referidas. Los sistemas de inmersión temporal comerciales tienen desarrollo productivo–científico.
un costo aproximado por unidad entre 100 y 140 $USD, más el
costo del compresor de aire y la instalación eléctrica, por lo que se • Incrementar considerablemente el coeficiente de multiplica-
puede señalar que los prototipos cuestan un tercio del costo del ción de brotes en comparación con las formas convencionales
recipiente RITA® . • Reducción de costos por vitroplantas
• Reducción del número de frascos y estantes en las cámaras
de cultivo
Resultados esperados, ventajas o Impactos potenciales • Mayor producción por metros cuadrados
Con el uso de biorreactores de inmersión temporal, se ob- • Mejor nutrición mineral
tiene un mayor número de plantas por recipiente, el reemplazo • Un contacto estrecho entre la superficie de los explantes y el
del medio de cultivo es sencillo y demanda poca mano de obra. medio durante la fase de inmersión
Dependiendo de la especie, el periodo de tiempo empleado para
la regeneración de plantas utilizando biorreactores pueden ser re-
lativamente cortos y genera gran cantidad de plantas, lo cual influye
drásticamente en la disminución de los costos de producción. El
material vegetal propagado por inmersión temporal presenta un
mejor crecimiento durante la fase de aclimatación comparado con
el material obtenido en medio semisólido o líquido (Berthouly y
Etienne, 2002).
La eliminación del agar en el medio de cultivo, y el uso de luz

natural en cuartos de crecimiento pueden disminuir hasta un 90 %
de los costos empleados para establecer el sistema (Kodym and
Zapata, 2001).
Capítulo 8
MARCADORES MOLECULARES
María de Lourdes Torres

Lorena Mejía
101
Introducción
Desde el inicio de la civilización, el ser humano gramas de mejoramiento genético, pues permite,
ha ido seleccionando características de interés prin- además de la organización del material la selec-
cipalmente de plantas y animales, eligiendo así rasgos ción adecuada de obtener plantas superiores o
físicos, como forma, color, tamaño, entre otros, para elite y la complementación con datos fenotípicos
su beneficio (Picca et al, n.f.).
y agronómicos para el desarrollo de una pobla-
Estas características deseadas son conocidas tam- ción mejorada.

bién como marcadores morfológicos, porque por Esta forma de selección
ejemplo, una determinada variedad de planta puede
basada en los denomina-
ser reconocida por este rasgo.
dos marcadores morfoló-
Para entender mejor este concepto, analicemos gicos, ha sido muy utiliza-
el siguiente caso: una variedad de maíz es más alta da, porque ha contribuido
que otras, y se distingue además por ser una varie- al mejoramiento de anima-
dad con un grano más grueso. Entonces el marca- les y plantas, y de esta
dor morfológico: mayor tamaño está asociado a una
manera ha colaborado
mejor calidad de grano, por lo tanto, los agricultores
usarán este marcador para seleccionar su material para que los agricultores y
vegetal, ya que si seleccionan plantas altas, también ganaderos manejen varie-
estarán seleccionando mejores granos. dades con características
Fuente: Descriptores de quinua, Consejo interna- superiores.
Conocer la similitud entre los individuos y cional de recursos fitogeneticos International board
las poblaciones es de gran utilidad en los pro- for plant genetic resources (cirf/ibpgr), 1984
102
A lo largo de la historia del mejoramiento gené- Estos marcadores permiten conocer la infor-
tico, se han desarrollado otros tipos de marcadores, mación genética que los organismos poseen y evi-
más allá de los morfológicos, que han sido utilizados denciar las diferencias entre un grupo de organis-
principalmente en la agricultura siempre con el fin de mos dentro y entre especies (Picca et al, n.f.). La
obtener variedades con nuevas características. importancia de estos marcadores es que no son
afectados por el ambiente ni por las condiciones del
cultivo y pueden ser utilizados en fases tempranas
Los marcadores bioquímicos de desarrollo de las plantas (Martínez, n.f.).
a) Proteínas de reserva en semilla. el uso de pro-
teínas de almacenamiento se basa en el hecho que Para comprender mejor cómo funcionan los
las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y marcadores moleculares, empecemos conociendo
especies son homólogas, y que al separarse en un la estructura del ADN que es el material genético
gel producirán bandas similares o diferentes.Ellas son de todos los seres vivos.
detectadas en el gel por medio de técnicas generales
de teñido.
ADN =Acido desoxirribonucleico.
b) Isoenzimas.Con el avance tecnológico ocurrido
en los años 70, el uso de geles de almidón y la tinción
histoquímica de las proteínas, se demostró dentro de En 1953, después de muchos años de investiga-
un organismo la existencia de las isoenzimas, formas ción, James Watson y Francis Crick de la Universi-
moleculares múltiples dentro de un organismo que dad de Cambridge, determinaron la estructura del
catalizan una misma reacción. El efecto de una modi- ADN analizando la información previa que habían
ficación alélica puede ser detectado con certeza, de- obtenido muchos científicos.
bido a un cambio de movilidad electroforética. Esta
sensibilidad electroforética hizo que la técnica haya La unidad de construcción de esta macromolécu-
revolucionado los estudios de diversidad genética en la es el nucleótido, el mismo que está constituido por
diversas especies. un azúcar de 5 carbonos, la desoxirribosa, a la cual se
une un grupo fosfato y una base nitrogenada (Figura
En la actualidad, debido al conocimiento de la es- 1). Hay cuatro bases nitrogenadas que intervienen
Se los conoce con el nom- tructura del ácido desoxirribonucleico (ADN) y a la en la estructura del ADN: Adenina (A), Timina (T),
disponibilidad de varias técnicas moleculares, se han Citosina (C) y Guanina (G), por lo tanto, hay cuatro
bre de marcadores mole-
desarrollado los denominados marcadores molecula- tipos diferentes de nucleótidos (Figura 2).
culares y funcionan como
res que han demostrado ser más exactos y eficientes
señaladores de diferentes para llevar a cabo procesos de mejoramiento animal
regiones del genoma y vegetal.
103
El ADN está formado por una doble hélice, es decir, por dos
cadenas de nucleótidos que se enrollan alrededor de un eje central.
En cada cadena los nucleótidos se van uniendo a través de enlaces
que se producen entre los átomos del azúcar de los nucleótidos
adyacentes, lo que permite que se produzcan largas cadenas lineales,
las mismas que tienen una polaridad ya que un extremo de la cadena
lineal tiene un grupo 5’-0H libre (carbono 5 del azúcar) y el otro ex-
tremo tiene el grupo 3’-OH libre (carbono 3 del azúcar). Cuando se
unen las dos cadenas para formar la doble hélice el sentido de éstas
es antiparalelo, es decir, la una cadena va en dirección 5’ → 3’ y la otra
Fig. 1. Nucleótido. Unidad que conforma el ADN. Constituido en dirección 3’ → 5’, además las cadenas se unen a través de las bases
por un grupo fosfato, un azúcar de 5 carbonos y una base nitroge- nitrogenadas (puentes de hidrógeno) y lo hacen específicamente, la
nada (National Institutes of Health, n.f.). adenina solo se puede unir con la timina y la citosina solo con la gua-
nina. Por lo tanto, si analizamos la Figura 3 vemos que el esqueleto de
la molécula de ADN está formado por los azúcares y grupos fosfatos
hacia el exterior y las bases nitrogenadas hacia el interior. Dentro de
esta estructura se puede decir que los grupos de azúcar y fosfato
tienen una función estructural, mientras que la secuencia de las bases
nitrogenadas, que es propia
para cada individuo, es la
portadora de la información
genética (Torres, 2008).
Fig. 3. Estructura del

ADN. Molécula formada
por un esqueleto de grupos
fosfato y azúcar en la parte
externa, y en su interior se
encuentran las bases nitro-
genadas unidas por puentes
Fig. 2. Tipos de Bases Nitrogenadas. Adenina, Timina, Guanina y de hidrógeno (National Ins-
Citosina (National Institutes of Health, n.f.). titutes of Health, n.f.).
104
Seguramente hemos escuchado hablar de genes y cromosomas, secuencia RAPD y se trata de ver si ésta se encuentra dentro de
entonces ahora podemos complementar esta información sabien- un determinado genoma, se debe realizar una reacción de amplifi-
do que una molécula de ADN es un cromosoma y que si una cación del ADN que en términos sencillos implica que se expone
especie tiene por ejemplo 20 cromosomas tendrá 20 moléculas a un genoma determinado a la secuencia de 10 nucleótidos y se
de ADN. Cada cromosoma contiene diferente número de genes, analiza en qué partes del genoma se pega esta secuencia. Depen-
entendiéndose por gen un segmento de ADN que sirve como una diendo del RAPD y del genoma, cada secuencia de este tipo puede
unidad de información hereditaria. La definición de gen es muy encontrarse una o varias veces dentro de un genoma determinado
compleja y de acuerdo a los avances científicos ésta se sigue am- (Picca et al, n.f.). En la Figura 4 se puede observar el genoma del
pliando, pero para fines de esta publicación se define al gen como organismo de color naranja, y las líneas irregulares de color blanco
una secuencia de ADN (un segmento) de la cual se obtiene una que corresponden a la amplificación de la secuencia de 10 nucleó-
proteína o una molécula de ARN con una función específica. tidos. En la parte derecha de las dos figuras se encuentra una ma-
triz con líneas que varían entre color amarillo y naranja que indican
Conociendo la estructura del ADN se puede entonces inferir los tamaños de los segmentos amplificados en los organismos es-
dónde se encuentra y guarda la información genética de un indivi- tudiados. En la segunda figura podemos observar que el individuo
duo. La secuencia (el orden) de las bases nitrogenadas es el lengua- 2 carece de la segunda línea lo que demuestra diferencias en sus
je de los seres vivos y lo que difiere entre un individuo y otro. genomas. Conociendo entonces los patrones generados por este
tipo de marcador molecular, claramente se observa que se pueden
Otro término que debemos conocer antes de hablar sobre distinguir dos individuos, dos variedades, dos especies diferentes.
marcadores moleculares es genoma que se lo puede definir como
toda la información genética que posee un organismo, es decir
todo el ADN que tiene un individuo.
Marcadores Moleculares de fácil aplicación

A continuación se describen los tipos de marcadores molecu-
lares que se utilizan más comúnmente para caracterizar individuos,
variedades, especies y lograr a través de este análisis molecular, por
ejemplo, mejorar plantas y animales.
RAPDs (Siglas en inglés que en español se llaman

ADN Polimórfico Amplificado al Azar)
Son secuencias únicas de ADN de aproximadamente 10 nu- Fig. 4. Representación de la localización de secuencias RAPDs
cleótidos que hibridan al azar con el ADN del organismo estudiado en genoma de dos individuos y patrón de bandas generado utili-
generando segmentos de distintos tamaños. Así, si se utiliza una zando estos marcadores (Décima-Oneto y Bossio, n.f.)
105
Una de las ventajas más importantes de este

marcador molecular es que no se requiere co-
nocimiento previo del genoma de los organis-
mos que serán analizados y es un ensayo cuyos
resultados pueden obtenerse de manera rápida
y económica; mientras que una desventaja es
que es una técnica muy sensible a cambios en el
protocolo, es decir no es fácil replicar los resulta-
dos obtenidos entre un laboratorio y otro.
AFLPs (Siglas en inglés que en español se

llaman polimorfismos en la longitud de
fragmentos amplificados)
El procedimiento para utilizar este tipo
de marcador molecular consiste primero en
cortar al genoma de un individuo en una serie de frag- Fig. 5. Esquema del proceso de am-
mentos utilizando unas enzimas que se llaman enzimas plificación de AFLPs que inicia con la di-
de restricción. Luego a los extremos de los fragmentos gestión del genoma con enzimas de res-
de ADN cortado se adhieren un pedacitos cortos de tricción, ligación de los adaptadores y los
ADN de cadena doble llamados adaptadores. Poste- dos procesos de amplificación. (Décima-
riormente, se realizan dos etapas de amplificación del Oneto y Bossio, n.f.)
ADN utilizando unas secuencias de ADN que se lla-
man iniciadores y que son las responsables de unirse
al ADN que se está analizando de forma específica Microsatélites
para obtener patrones de bandas que nos permitan Son repeticiones de secuencias cor-
diferenciar individuos, variedades, especies entre sí (Ver tas de ADN, una junto a la otra, (de 1a
Figura 5 y Figura 6). 10 nucleótidos) que forman fragmentos
de menos de 150 pares de bases en dife-
Los AFLPs son una herramienta poderosa para rentes sitios del genoma de una especie.
analizar genomas, dado que poseen un alto poder A través del uso de este marcador molecular se
Fig. 6. Patrón de bandas
de detección de la variabilidad genética. Sin embargo puede ver la variación que existe entre un individuo
presenta también algunas desventajas. Es una técnica y otro ya que el número de repeticiones de un mi- obtenidas por la amplifica-
compleja que requiere mayores recursos de infraes- crosatélite determinado varía entre individuos. En- ción de AFLPs. (Décima-
tructura y económicos (Picca et al, n.f.). tonces si se conocen las secuencias microsatélites Oneto y Bossio, n.f.)
106
de una especie, se pueden buscar éstas en diferentes individuos

y ver la variabilidad genética que existe entre ellos y entre varie-
dades de una misma especie. Nuevamente se utiliza la reacción
de amplificación del ADN, para obtener patrones de bandas que
variarán de tamaño dependiendo de las diferencias que existan
en la cantidad de repeticiones de estas secuencias cortas en cada
individuo analizado. (Ver Figuras 7 y 8).
Fig. 8. Esquema del patrón de bandas obtenidas utilizando mar-

cadores microsatélites (Décima-Oneto y Bossio, n.f.).
Como ya se mencionó anteriormente, la aplicación más im-

portante de los marcadores genéticos en la agricultura es que se
los utiliza como apoyo para lograr mejoramiento genético, es decir
obtención de variedades mejoradas de forma más eficiente y en
menos tiempo.
Fig. 7. Representación de marcadores microsatélites en el geno-

ma (Décima-Oneto y Bossio, n.f.) Mejoramiento Asistido por Marcadores
Esta metodología se basa en la selección de organismos que
Estos marcadores de ADN, permiten determinar un alto gra- presentan una característica de interés agronómico ligada a un
do de variabilidad, y son muy buenos para determinar diferencias marcador molecular.
entre individuos y variedades, pero se requiere previamente co-
nocer las secuencias microsatélites que son específicas para cada Para mencionar un ejemplo, el Instituto Nacional de Tecnología
especie, lo que implica mayor conocimiento científico y tecnoló- Agropecuaria de Argentina ha trabajado en el mejoramiento de
gico, lo que a su vez demanda mayor infraestructura y cantidad trigo para lograr una variedad mejorada que contenga mayor con-
de recursos económicos. tenido proteico. Se identificaron marcadores moleculares ligados
al gen que confiere esta característica “mayor contenido proteico”,
y así podrán utilizar esta información para obtener variedades de
trigo con un 13% más de proteína y con un rendimiento adecua-
107
do (Nisi et al, n.f.). Este ejemplo demuestra claramente la utilidad sarrollo tecnológico como en el que vivimos actualmente. Este tipo
de esta herramienta molecular para obtener variedades vegetales de colaboración seguramente es el mejor camino para lograr dos
nuevas que satisfagan las necesidades de los agricultores y consu- objetivos importantes: que los agricultores dispongan de varieda-
midores. des vegetales que respondan a sus requerimientos de producción
y calidad, y que la investigación local esté ligada a las necesidades
Otro ejemplo interesante es el mejoramiento de fréjol utilizan- de las comunidades.
do marcadores moleculares en Colombia. El cultivo de fréjol en
Colombia es muy importante no solo por el volumen de produc-
ción y valor alimenticio sino también por el fuerte consumo de este
producto en las comunidades populares. Una de las enfermedades
más limitantes de este cultivo es la llamada antracnosis causada
principalmente por el hongo Colletotrichum lindemuhtianum y se
han identificado 61 razas diferentes de este patógeno. Por otro
lado, se han descubierto varios marcadores moleculares ligados a
genes de resistencia a esta enfermedad con los que se trabaja para
obtener nuevas variedades de fréjol con índices altos de resistencia
a la antracnosis (Nayibe, Blair y Ligarreto, 2007).
Al momento se trabaja con 6 variedades comerciales de frijol

colombiano (Agrario, Comerical, Cabrera, Cargamento, D. Moreno,
Pesca y Simijaca) con el fin de lograr que estas, a través de cruces
convencionales, adquieran la mencionada resistencia y sean varie-
dades con un buen rendimiento (Nayibe, Blair y Ligarreto, 2007).
Es evidente que el aporte de los marcadores moleculares hoy

en día es fundamental para obtener procesos de mejoramiento ge-
nético de forma más eficiente. Sin embargo, es importante recalcar
que el uso de marcadores moleculares no sería posible sin el apoyo
de las técnicas de mejoramiento convencional, que los agricultores
las han practicado desde hace mucho tiempo.
El uso de esta tecnología implica que los agricultores interac-

túen con grupos de investigación de universidades o centros de
investigación locales que manejen estas herramientas. Se debe pro-
mover este tipo de asocianciones, sobretodo en un mundo de de-
Capítulo 9
BIOFERTILIZANTES
Microorganismos benéficos en agricultura
Elizabeth Hodson de Jaramillo

Lucia Ana Díaz-Ariza
111
Introducción, conceptos básicos
La producción agrícola debe realizarse en un Los microorganismos pueden ser procarióticos

concepto de sostenibilidad de manera tal que sea (como las bacterias) o eucarióticos (como los hongos).
ecológicamente amigable y que proporcione rentabi-
lidad adecuada a los productores y por consiguiente Se encuentran ampliamente distribuidos en la na-
su beneficio. turaleza, en mares, ríos, aire, suelos y dentro de otros
organismos incluidas las plantas (Díaz, 2011). La diver-
La aplicación de bioinsumos naturales en la agri- sidad microbiana en el suelo es mucho mayor que la
cultura, ecológicamente amigables y de costo redu- de plantas y animales juntos. Un solo gramo de suelo
cido es uno de los elementos fundamentales para puede albergar hasta diez mil millones de microor-
garantizar la sostenibilidad de la producción agrícola ganismos (10¹º), los cuales pertenecen a diferentes
y una aplicación sencilla de las agrobiotecnologías. Su especies. En el suelo se pueden encontrar bacterias, Una de las alternativas que
uso adecuado facilita incrementar los rendimientos y hongos, algas, protozoos y virus. Debido a su amplia se ha venido intensificando
reducir la contaminación ambiental que conlleva el diversidad y altas poblaciones, se hace importante en las últimas décadas es
uso de fertilizantes químicos. el estudio de la interacción de los microorganismos el uso de productos bio-
con las plantas y el suelo (Madigan et al, 2004).
lógicos como los biofer-
Los microorganismos son un grupo muy amplio y
diverso de organismos microscópicos que existen como El suelo es el lugar donde se encuentra la mayor tilizantes que se refiere a
células aisladas o asociadas. En general, a diferencia de diversidad de microorganismos particularmente en la utilización de microor-
los macro-organismos (plantas y animales), los micro- la zona de alrededor de las raíces (la rizosfera), los ganismos que favorecen el
organismos son capaces de realizar la totalidad de sus cuales contribuyen en conjunto en un amplio rango crecimiento y estimulan la
procesos vitales de crecimiento, generación de energía de servicios esenciales para el funcionamiento y la producción de las plantas.
y reproducción, independientemente de otras células. sostenibilidad de los ecosistemas.
112
que son capaces de tomar el nitrógeno atmosférico y lo

convierten en amoníaco y nitratos disponibles para las
plantas. Otras pueden producir metano como producto El papel de las comunida-
de desecho (metanogénicas). des de microorganismos
en el suelo es crítico para
Los microorganismos del suelo pueden consu-
el crecimiento y desa-
mir una amplia gama de materiales orgánicos como
celulosa y lignina de tejidos leñosos, quitina de los rrollo adecuado de los
hongos y los insectos, proteínas de cualquier tipo de cultivos y los procesos
tejidos, carbohidratos, queratina de cabello y uñas, hi- mediados por ellas son
drocarburos del petróleo o sus derivados, plaguicidas, indispensables para el fun-
detergentes, en fin compuestos orgánicos de diversa cionamiento del ecosiste-
La utilización de hongos que se asocian naturaleza (Madigan et al, 2004).
ma del suelo (edáfico) y
con las raíces de las plantas se ha conver-
su productividad.
tido desde no hace muchos años en una El papel de los microorganismos del suelo en la
técnica para estimular el crecimiento y la nutrición y desarrollo de las plantas es muy diverso.
floración de las plantas y árboles de una
El funcionamiento de los ecosistemas está gober- Los microorganismos
forma puramente biológica, natural y eco-
nado ampliamente por la dinámica de los microor- benéficos del suelo
lógica mediante la formación de micorrizas. ganismos del suelo, debido a la enorme variedad de
desempeñan un papel
procesos de los cuales son responsables. Las funcio-
muy importante para
La presencia de materia tanto orgánica como in- nes microbianas importantes en los ecosistemas del
orgánica permite la actividad de una extraordinaria suelo se encuentran distribuidas entre diferentes gru- las plantas porque al
población de microorganismos. Los desechos y resi- pos tróficos e incluyen: formación de humus median- asociarse con ellas en una
duos humanos, animales y vegetales son procesados te descomposición de exudados y restos vegetales y relación mutualista (los
y descompuestos por los microorganismos quienes síntesis de nuevos compuestos, producción de hor- dos se benefician de esta
liberan sustancias útiles para las plantas y contribuyen monas vegetales, facilitar la disponibilidad de algunos relación), les ayudan a su
a la formación y el mantenimiento de la estructura nutrientes (por su capacidad de solubilizar minerales)
desarrollo adecuado al fa-
del suelo. a partir de formas inorgánicas insolubles, transforma-
ción del nitrógeno (N2) atmosférico a N disponible cilitarles la disponibilidad
Su papel en la descomposición de materiales es para las plantas, mejoramiento de la agregación, airea- de nutrientes a través de
fundamental porque con su actividad (metabolismo) ción, e infiltración de agua en el suelo. la descomposición y mi-
permiten los ciclos biológicos de los elementos nu- neralización de la materia
trientes requeridos por las plantas. Por ejemplo se También se encuentran en el suelo microorga- orgánica en putrefacción.
encuentran grupos de bacterias fijadoras de nitrógeno nismos capaces de ocasionar enfermedades (pató-
113
genos), pero igualmente se encuentran algunos otros Biofertilizantes:

que pueden presentar acción antagónica –denomi- Microorganismos promotores
nada control biológico- con los nocivos mediante la del crecimiento vegetal
producción de sustancias que protegen a las plantas
contra insectos, patógenos de plantas o contra ma- La fertilización es una práctica indispensable para
lezas (Díaz, 2008). la producción de cultivos, siendo la fertilización nitro-
genada la más importante, debido a los altos reque-
Esta actividad de los microorganismos descom- rimientos de nitrógeno que tienen las plantas y a sus
ponedores –saprofitos- es fundamental para permitir evidentes efectos sobre el rendimiento.
el reciclaje de materia orgánica fijada en las plantas
superiores, (ciclos del nitrógeno, carbono, fósforo y El nitrógeno es un elemento que se pierde muy
azufre) función que realizan tanto en presencia de rápidamente del suelo. La forma más corrientemente
aire (microorganismos aerobios), como en ausencia utilizada para cubrir las necesidades de nitrógeno es la
de aire (microorganismos anaerobios o microaero- utilización de fertilizantes químicos, la cual representa
fílicos). una manera rápida de reponer el nitrógeno perdido
del suelo, sin embargo, bajo un manejo inadecuado
Adicionalmente contribuyen a la fijación de CO2 representa un riesgo ambiental por contaminación
en ausencia de aire con producción de metano (me- del suelo y del agua.
tanogénesis), proceso de gran importancia ecológica
por su papel en el ciclo del carbono. Adicionalmente también se debe considerar que
los fertilizantes químicos representan altos costos
Es importante recordar que algunos de estos económicos para los productores.
microorganismos pueden combinarse, resultando
en efectos sinérgicos cuando se aplican de manera Bajo la consideración de promover una agri-
conjunta. Alrededor de un 40% de los productos de cultura sostenible así como amigable y respetuo-
la fotosíntesis y otros compuestos vegetales pueden
sa con el ambiente, el uso de biofertilizantes se
ser secretados a la zona cercana a la raíz (rizosfera) El uso de bioinsumos o
lo cual sirve de alimento a los microorganismos del ha intensificado en los últimos años como op-
ción viable para reducir los costos económicos bioinoculantes se refiere
suelo (Nelson, 2004).
y ecológicos que implica la utilización de abonos a la utilización y aplicación
químicos. Adicionalmente los biofertilizantes han de bacterias promotoras
mostrado su importante papel en la recupera- del crecimiento vegetal
ción de suelos degradados o marginales. en cultivos agrícolas y
forestales.
114
Estas bacterias aportan significativamente al cre- Se ha encontrado también que algunos microor-
cimiento y desarrollo de las plantas por mecanismos ganismos producen compuestos capaces de funcio-
Estas bacterias se de- de acción directos o indirectos. Entre los directos se nar como antagónicos de microorganismos perjudi-
nominan genéricamente encuentran la fijación de nitrógeno, la síntesis de hor- ciales, lo que permite mejor crecimiento y desarrollo
como “bacterias promo- monas como auxinas, su capacidad de aumentar la vegetal al estar las plantas libres de patógenos.
toras del crecimiento disponibilidad de nutrientes a través de la solubiliza-
ción y movilización de fosfato y de hierro. Para considerar a una bacteria de la rizosfera
vegetal” BPCV (PGPR
como BPCV bacterias promotoras del crecimiento
en inglés por sus siglas Entre los mecanismos indirectos se encuentra la vegetal- deben cumplirse varias características:
plant growth promoting protección frente a patógenos por interacciones de
rizobacteria). Algunos antagonismo con otras bacterias y hongos del suelo, 1- que tengan capacidad de colonización efectiva
estudios han mostrado la producción de antibióticos, la liberación de enzi- y eficiente en la superficie de la raíz y por consi-
que la utilización de estas mas como quitinasas, pectinasas y glucanasas, además guiente de permanecer en la rizosfera y realizar
de la inducción de resistencia sistémica en la planta, su función benéfica en las plantas
bacterias pueden incre-
por lo cual se conocen como agentes de bioprotec- 2- que sea capaz de presentar una alta población
mentar los rendimientos ción (Castro et al, 2007). en la rizosfera después de su inoculación
de algunos cultivos (papa, 3- que tenga potencial para controlar microor-
rábano, tomate, trigo y Desde 1978 el investigador Kloepper describió ganismos fitopatógenos del suelo (causantes de
soja entre otros) hasta este grupo de bacterias de vida libre como “promo- enfermedades)
en un 30% (Bach & Díaz, toras del crecimiento vegetal” por su capacidad de 4- que sean innocuas tanto para las plantas como
aumentar el crecimiento de las plantas y favorecer su para el ser humano y los animales domésticos
2008).
respuesta contra organismos del suelo causantes de
enfermedades. Entre los géneros más conocidos de rizobacterias
promotoras del crecimiento vegetal –BPCV- por sus
Un ejemplo de sistemas Algunos ejemplos de BPCV son algunas bacte- efectos beneficiosos para las plantas se encuentran
de control biológico rias del género Pseudomona, las cuales, al solubilizar Burkholderia, Pseudomonas, Azospirillum, Herbaspiri-
natural ha sido el uso algunos nutrientes poco móviles del suelo, como el llum, Acetobacter, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobac-
fósforo, mejoran el ingreso de este elemento hacia la ter, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, Pantoea y Serratia, y
comercial por más de
planta, lo que se traduce en una mayor cantidad de las cianobacterias Anabena y Nostoc.
50 años de la bacteria
biomasa.
Bacillus thuringiensis para También se han descrito un gran número de es-
el control de plagas tipo Otras especies, las fijadoras de nitrógeno como pecies bacterianas adicionales a las mencionadas que
insectos (principalmente Rhizobium sp. y Bradyrhizobium sp., aumentan el apor- son capaces de producir precursores de auxinas bajo
lepidópteros). te de nitrógeno, influyendo directamente en el creci- condiciones “in vitro”.
miento, desarrollo y rendimiento.
115
Algunas especies de los géneros Pseudomonas, Azospirillum,

Las bacterias fijadoras de nitrógeno se inoculan en la semilla para
Azotobacter y Bacillus favorecen el crecimiento de la planta, me- que la planta entre en contacto con ellas desde su germinación. Su uso
diante la producción de AIA, giberelina y citoquininas (hormonas adecuado ha mostrado que puede reducir notablemente los reque-
vegetales) en la rizosfera de las plantas cuando éstas están en es- rimientos de fertilizante nitrogenado comercial e inclusive se utilizan
tado de plántulas. Como ejemplo,Torres et al., (2000) encontraron para fitorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos.
que bacterias pertenecientes a las especies: Azotobacter chrooccum,
A. vinelandii, P. putida, Serratia spp. y K. pneumoniae, aisladas de la
En términos generales es muy importante conocer las con-
rizosfera de arroz en Colombia fueron capaces de producir AIA diciones específicas del cultivo, el suelo, el clima y el manejo
en concentraciones que van de 3,5 mg/L a 32 mg/L. para obtener el máximo beneficio en términos de ahorro en
la aplicación del fertilizante nitrogenado, rendimiento rentable
Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) se y conservación de la capacidad productiva del suelo.
destacan por sus efectos beneficiosos tanto para las plantas como
para los ecosistemas.
• Producción de sustancias que facilitan la disponibilidad de
La función que las rizobacterias benéficas cumplen se debe a nutrientes tales como ácidos orgánicos, enzimas, aminoácidos que
diversos mecanismos entre los cuales se encuentran: pueden movilizar o solubilizar compuestos insolubles como el fós-
foro, el hierro, el aluminio entre otros.
• Producción de compuestos tipo reguladores de crecimien-
to vegetal: Se conocen varias bacterias asociativas con capacidad Un ejemplo son las bacterias solubilizadoras de fósforo que facilitan
de producir fitohormonas como auxinas, giberelinas y citoquininas. que este elemento se encuentre disponible para las plantas. Se utilizan
Estas sustancias son capaces de estimular la germinación, el cre- cuando las semillas se siembran en suelos ácidos o alcalinos de pH 5
cimiento, la producción de raíces laterales, así como la cantidad a pH 8, lo cual ocasiona que los fosfatos no se encuentren disponibles
y longitud de los pelos radiculares lo cual facilita e incrementa la para las plantas, las cuales pueden presentar carencia o insuficiencia
absorción de agua y de nutrientes para las plantas y les permite de este elemento. Si el suelo carece de suficiente fosfato disponible o
crecer más vigorosas y fuertes. móvil, se recomienda la inoculación de los microorganismos solubiliza-
dores de fósforo a la siembra de la semilla.
• La fijación biológica de nitrógeno la cual puede realizarse
mediante asociaciones simbióticas como es el caso de las legumi- Representantes de bacterias de que cumplen esta función son
nosas (frijol, soya, maní, habas y otros) con bacterias del género las de los géneros Bacillus spp, Arthrobacter spp, Azotobacter spp en-
Rhizobium y Bradyrhizobium, o bacterias de vida libre que se asocian tre otros. Debe destacarse que el grupo más conocido para re-
con las raíces de varias plantas como es el caso de las bacterias de solver el problema de movilidad de fosfatos en el suelo son los
los géneros Azospirillum, Azotobacter, Gluconacetobacter, Beijerinkia, hongos que forman micorrizas en las raíces de las plantas, tipo ecto
Burkholderia, Frankia entre otras. como endotrofico.
116
• Producción de sideróforos que son sustancias que Estas asociaciones microbianas posibilitan mejo-
presentan alta afinidad por el hierro. Son compuestos ras en el crecimiento y producción de las plantas, así
quelantes del hierro que por diversas acciones pueden como mayor tolerancia a condiciones adversas como
suministrar hierro en forma disponible para las plantas, plagas y enfermedades o situaciones climáticas tales
así como promover el crecimiento vegetal y restringir el como sequía o salinidad.
crecimiento de organismos del suelo patógenos para las
plantas, principalmente por inmovilizar el hierro requeri- La inoculación con bacterias beneficiosas se reali-
do por los patógenos. za desde finales del siglo XIX en los Estados Unidos,
donde iniciaron la mezcla de suelo inoculado en for-
- Por ejemplo en el caso de Pseudomona fluo- ma natural con semillas de leguminosas. Fue entonces
rescens cepa ZUM80 se encontró que su pre- cuando se patentaron y se desarrollaron comercial-
sencia podía inhibir el crecimiento de algunas mente inoculantes para leguminosas con cepas de
cepas de Colletotrichum y Phytophtora bacterias del género Rhizobium, las cuales se asocian
con leguminosas como frijol, soya, habas, porotos en-
• Producción de sustancias antibióticas. Muchos tre otras. Posteriormente se comercializaron produc-
microorganismos del suelo son capaces de elaborar tos con cepas de Bacillus, Azotobacter y Pseudomonas,
compuestos que son antibióticos para organismos bacterias encontradas comúnmente en el suelo.
nocivos (patógenos).
El uso comercial de las bacterias promotoras del
• Estímulo de protección de las plantas contra crecimiento vegetal (PGPR) se encuentra en desarrollo
agentes perjudiciales. Muchas plantas activan sus me- y en América Latina se encuentran varias compañías
canismos de defensa interna contra enfermedades que tienen en el mercado bioinsumos de este tipo. Actualmente se en-
estimuladas por las sustancias secretadas por los mi- cuentran dos tipos de
croorganismos del suelo. En relación con los inoculantes que estimulan el inoculantes: los que tienen
crecimiento, se han formulado diversos productos, la
como objetivo fundamen-
mayoría a base de bacterias y hongos, los más co-
Utilización de biofertilizantes nocidos son las bacterias fijadoras de nitrógeno que tal la promoción y estí-
como bioinsumo en la agricultura hacen disponible el nitrógeno atmosférico, también mulo del crecimiento de
sostenible aquellas que facilitan la asimilación del fósforo por las plantas y los utilizados
parte de las plantas. como sistemas de control
Las plantas, de la misma manera que los animales, biológico (bioplaguicidas,
necesitan asociarse con bacterias benéficas que les Según Bach & Díaz (2008) en la Argentina se en- que se utilizan para el
facilitan la asimilación de alimentos a través de enzi- cuentra una amplia variedad de inoculantes de uso
mas, vitaminas o minerales. control de enfermedades).
agrícola entre los que se encuentran: DIMARGON
(Azotobacter sp.); BIOFERT (Rhizobium phaseoli);
117
AZOSPIRILLUM (Azospirillum brasilense) AZOFER (Bradyrizobium

campo han sido menos consistentes, lo cual representa un reto
sp.), AZOFER (Rhizobium sp.) y AZOFER (Azospirillum sp.); FOS-
en el estudio evaluación, formulación y aplicación del potencial de
FORINA (Pseudomonas sp.). Muchos de estos productos se co- estas rizobacterias como inoculantes comerciales. Los mayores
mercializan en el exterior y aunque los buenos resultados aun avances y buenos resultados en campo han sido con los inoculan-
son iniciales, han demostrado su efectividad en otras regiones y tes de leguminosas tipo Rhizobium, los cuales llevan en el mercado
condiciones de suelo y clima (edafoclimáticas). comercial más de siete décadas (Nelson 2004).
Para obtener los mejores resultados del potencial de los mi-

Bach y Díaz (2008) mencionan a modo de ejemplo el desa-
croorganismos promotores de crecimiento vegetal, es necesario
rrollo de biofertilizantes en un esfuerzo conjunto entre el Institu-
realizar estudios de caracterización de los microorganismos na-
to de Suelos y la empresa RIZOBACTER ARGENTINA S.A. Los
tivos en el sitio, sobre las condiciones específicas del entorno y
productos se obtienen a partir de cultivos de la bacteria Pseudo-
sobre el efecto en los cultivos de interés en cada localidad en
monas fluorescens, que ha mostrado su capacidad de estimular el
donde se vaya a utilizar la aplicación de biofertilizantes.
crecimiento vegetal y solubilizar el fósforo haciéndolo más dispo-
nible para las plantas. Estos biofertilizantes se comercializan con
Es fundamental conocer la diversidad de microorganismos y
el nombre de Rizofos Liq. Trigo y Rizofos Liq. Maíz, con destino al realizar una evaluación de su potencial para promover el crecimien-
mercado argentino y países del MERCOSUR. to y desarrollo del cultivo en cuestión. La aplicación de métodos
moleculares ha facilitado en gran medida esta caracterización en
A pesar del enorme impacto benéfico que puede presen- muchos casos porque ya se han identificado algunos genes espe-
tar el uso de biofertilizantes, aún es muy insuficiente el nivel cíficos que facilitan la colonización de las raíces de las plantas (ver
de conocimientos sobre las poblaciones microbianas asociadas capitulo de Marcadores moleculares).
a las raíces de los cultivos, y no se conoce suficientemente sobe
los factores que inciden en la interacción planta–bacteria, ra-
zón que explica los resultados variables que se han obtenido La investigadora Gina Holguín-Zehfuss (2008) describe muy
con la aplicación de bioinsumos. Es necesario profundizar los gráficamente la interacción microorganismo-planta:
estudios sobre los requerimientos nutricionales y las condiciones
fisicoquímicas de los microorganismos del suelo, así como de sus ...“Es claro que las bacterias y plantas, antes de prometerse
complejas interacciones, puesto que al presente solamente se amor eterno, se cortejan; sólo si la relación es mutuamente
puede cultivar en el laboratorio un porcentaje muy bajo de esta benéfica trasciende, forjándose de mecanismos de recono-
variadísima microflora. cimiento y colaboración mutua. Algún día conoceremos tan
bien el lenguaje bacteria-planta que sabremos cómo con-
Aunque en condiciones de laboratorio y de invernadero se ha vencerlas de asociarse y ayudarse”...
demostrado claramente el efecto en promoción del crecimiento
vegetal y en control de patógenos de las BPCV, los resultados en
118
En resumen, entre las múltiples ventajas de utilizar Desarrollo de bioinoculantes

biofertilizantes en la producción vegetal las más desta- (biofertilizantes)
cadas son: su beneficio ecológico por ser respetuosas
con el ambiente al tratarse de productos naturales que El procedimiento general a seguir para la selec-
no son contaminantes; sus efectos positivos como esti- ción y definición de cepas microbianas a ser utilizadas
mulantes del crecimiento y producción vegetal; su me- como biofertilizante implica:
nor costo comparado con el de los insumos químicos; el
mantenimiento del suelo productivo; su inocuidad para 1. Caracterización inicial de los microorganismos
la salud humana y animal. Es decir promueven el desa- (microflora) de la rizosfera y del interior –en-
rrollo sostenible y el bienestar para los agricultores con dófita- de la planta en cuestión en la zona de
rendimientos rentables. estudio.
Uno de los mayores retos en el desarrollo co- 2. Aislamiento y caracterización de los organis-
mercial de BPCV es asegurar que se cuenta con me- mos promotores del crecimiento vegetal
todologías efectivas de evaluación y de selección y ta-
mizaje que permitan identificar los microorganismos 3. Ensayos de inoculación de las cepas en las plan-
más promisorios con actividad biológica demostrada. tas de interés (estudio de la interacción planta-
microorganismo) y evaluación de su potencial
En la industria agroquímica se evalúan anualmente para favorecer el crecimiento vegetal.
miles de compuestos para seleccionar solamente uno Para recordar….
o dos al final de los estudios. Igualmente se requiere 4. Selección de las cepas más promisorias y mul- Los biofertilizantes, o
de este tipo de estudios para los microorganismos tiplicación en medios de cultivo adecuados y de abonos biológicos, están
considerados como biofertilizantes potenciales. bajo costo para obtención del bioinsumo basados en microorga-
nismos que promueven y
Investigadores de la Universidad de la Habana y 5. Evaluación de inoculación en plantas de interés
benefician la nutrición y el
del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas INCA y estudio de la respuesta
crecimiento de las plantas.
(Cuba) han venido desarrollado metodologías que Se trata de microorganis-
Desarrollo a mayor escala del bioinoculante (for-
de acuerdo con los resultados que informan, per- mulación de acuerdo con estabilidad, soportes iner- mos del suelo, general-
miten aislamiento, identificación y evaluación rápida tes requeridos, viabilidad, definición del mejor siste- mente hongos y bacterias,
de PGPB de los géneros Burkholderia, Pseudomonas, ma de inóculo, efectividad entre otros). que se asocian de manera
Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter, Rhizobium, natural a las raíces de las
Bradyrhizobium y Azotobacter, a través del uso de plantas de una forma más
técnicas inmunoquímicas y de biología molecular o menos íntima.
119
Ejemplo de caso y biomasa de las plantas micorrizadas. En términos generales, los

trabajos tienen como objetivo determinar la presencia y caracteri-
Aplicación en vivero de bioinoculantes zar los microorganismos benéficos asociados naturalmente con las
basados en microorganismos nativos especies de interés y establecer sistemas iniciales de propagación,
inoculación y manejo de estos microorganismos en la producción
Los bioinoculantes son productos cuyo principio activo son en vivero de plantas de las especies en estudio (Díaz, 2008).
microorganismos vivos (bacterias y/o hongos), no patógenos de
humanos, animales o plantas, que favorecen la nutrición y/o el de-
sarrollo de las plantas, permitiendo así un mejor aprovechamien-
to de los recursos naturales del suelo y del ambiente” (BIOFAG,
2008). Los microorganismos que hacen parte del principio activo
de algunos inoculantes fijan nitrógeno, solubilizan fósforo, produ- Estudios con micorrizas
cen sideróforos solubilizando hierro, entre otras actividades. Estos, en el Laboratorio de
deben ser llevados a las plantas con ayuda de un portador que
Asociaciones Planta-Suelo-
mejore su establecimiento en el suelo o en la rizosfera y asegure
su acción benéfica. Microorganismo, Unidad
de Biotecnología Vegetal,
Los microorganismos benéficos del suelo se asocian de ma- Pontificia Universidad Jave-
nera natural con diferentes especies forestales y constituyen una riana (Díaz et al, 2010)
alternativa ecológicamente amigable al uso de insumos químicos
durante su propagación. Se han desarrollado técnicas para la deter-
minación, aislamiento, identificación, multiplicación e inoculación de Se ha trabajado en estudios con fines biotecnológicos, de la aso-
microorganismos asociados con algunas de especies forestales. La ciación natural de hongos de micorriza arbuscular y bacterias pro-
Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Jave- motoras de crecimiento vegetal con Tectona grandis, Decussocarpus
riana, Bogotá, Colombia en su Laboratorio de Asociaciones Planta- rospigliosii, Cedrela montana, Myrica pubescens y M. parvifolia, Cordia
Suelo-Microorganismo ha trabajado en la valoración de la partici- alliodora,Tabebuia rosea y Guadua angustifolia. Complementariamente,
pación de microorganismos del sistema suelo-raíz en el reciclaje de se han desarrollado diferentes trabajos de reintroducción de estos
nutrientes y la determinación del potencial biotecnológico de esos microorganismos en el sistema suelo-raíz de la especie hospedera
microorganismos como bioinsumos en la propagación de plantas con resultados promisorios para Cedrela montana, Cordia alliodora,
de interés agroecológico para regiones específicas. Las bacterias Tabebuia rosea, Gmelina arborea, Maclura tinctoria y Tectona grandis.
promotoras del crecimiento vegetal pueden presentarse en siste- Las alternativas biotecnológicas desarrolladas en los estudios reali-
mas radicales micorrizados, lo cual es la asociación ideal. Dentro zados incluyen el uso de hongos de micorriza arbuscular (HMA) y
de los principales beneficios de la micorriza están la reducción del de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) asociados
tiempo de manejo en vivero y el establecimiento exitoso en campo naturalmente con las especies en estudio (Castro et al, 2007; Díaz et
de las especies forestales, atribuidos a mayores valores en altura al, 2011; Zambrano & Díaz, 2008).
120
El uso de las cepas nativas que los estudios muestren como pruebas de antagonismo entre ellas y con otros microorganismos
más eficientes ha mostrado ser importante en la respuesta de las benéficos asociados a la planta, patogenicidad para la planta y acti-
plantas y en la adaptabilidad de los microorganismos al suelo. Es vidad biológica especifica.
importante desarrollar sistemas de cultivo de bajo costo para la
multiplicación de los microorganismos a ser utilizados como bio-
insumo. De otra manera se corre el riesgo de no obtener los be- Evaluación de actividad biológica de microorganismos benéfi-
neficios potenciales por desconocimiento de las cos: Determinación del potencial promotor de crecimiento de los
condiciones adecuadas para cada caso. aislamientos según cada grupo funcional (Díaz et al, 2011)
Halos de solubilización de Fósforo inorgáni-

co de una bacteria fosfato solubilizadora, en dos Bacterias solubilizadoras de fósforo inor-
diferentes medios que contienen fosfato gánico: La solubilización de fósforo se evalúa
tricálcico como fuente de P. Fuente: inicialmente en medio definido para este fin
Laboratorio Asociaciones Planta- (SMRS) y la cepas que cambien el color del
Suelo-Microorganismo, Unidad de medio de morado a amarillo se evalúan en
Biotecnología Vegetal, Pontificia Uni- el medio sólido Pikovskaya, midiendo el halo
versidad Javeriana (Díaz et al, 2010) de solubilización que se presenta alrededor
de las colonias.
Muestreos y aislamientos de los microorganis- Bacterias fijadoras de nitrógeno: Para es-

mos de interés según la actividad biológica tablecer si una bacteria es fijadora de nitró-
(Díaz et al., 2011) geno se evalúa la presencia de una película
blanca en el medio NFB, posteriormente se
Lo primero que se debe definir es qué tipo de microorganismo realiza en un cromatógrafo de gases un aná-
se desea estudiar teniendo como criterios su actividad biológica y lisis de reducción de acetileno para deter-
la asociación con una planta determinada. Se recomienda que los minar el potencial de fijación de nitrógeno
aislamientos de las bacterias se realicen de la misma zona del culti- por parte de la bacteria.
vo a inocular o de la rizosfera de esta planta. Actualmente también
se estudian microorganismos que crecen en el interior de dife- Bacterias productoras de sideróforos:
rentes tejidos vegetales, denominados endófitos. El objetivo de la En el medio de cultivo KB se evalúa la pro-
utilización de bacterias nativas es la bio-aumentación (aumento de ducción de fluorescencia por parte de las
poblaciones naturales) de las mismas y su reintroducción al sistema bacterias, posteriormente estas bacterias se
suelo-raíz de las plantas. Los muestreos se realizan a nivel de rizos- evalúan en otros medios para determinar la
fera, raíces, tallos y hojas, y para la selección de los microorganismos producción y el tipo de sideróforos que pro-
se tiene en cuenta su manejo con técnicas cultivo-dependientes, ducen.
121
REQUISITOS TÉCNICOS PARA EL REGISTRO

Controladores biológicos: Para evaluar DE BIOINOCULANTES (BIOFAG, 2008)
el potencial como controladores biológicos
de las bacterias, estas se enfrentan ante un • Deberán estar formulados con cepas autorizadas y sumi-
hongo fitopatógeno (en este caso Fusarium nistradas por la Institución de Referencia IR.
oxysporum) en medios de cultivo a nivel de • Es recomendable que estén libres de contaminantes.
laboratorio, y se determina el porcentaje de • La concentración de microorganismos en los inoculantes
inhibición de crecimiento del hongo prontos para su comercialización, deberá cumplir con las
exigencias definidas por la IR.
• El producto debe especificar los cultivos vegetales a los
cuales está destinado.
• Se sugiere proporcionar información sobre condiciones
de uso y manejo del inoculante y sobre la susceptibilidad/
resistencia del microorganismo utilizado a agroquímicos
usados comúnmente en la protección de la semilla.
En un trabajo con Gmelina arborea, (Zambrano & Díaz, 2008) se

planteó la inoculación de bacterias rizosféricas promotoras de creci-
miento vegetal (BPCV) y de hongos de micorriza arbuscular (HMA).
Se trabajó con Glomus sp para la asociación micorrizal y con la

bacteria Azospirillum brasilense por su capacidad de incrementar la
emergencia de las semillas. Ambos microorganismos son de amplia
distribución en diferentes suelos y se han encontrado asociados
con gran variedad de especies vegetales. Se realizó la inoculación
de Azospirillum brasilense inmovilizado en microperlas de alginato
y de los hongos Glomus manihotis y Glomus occultum en semillas
de Gmelina arborea en tres grados diferentes de madurez. Las se-
millas inoculadas se sembraron en suelo y en turba compactada.
Cuarenta y un días después de la siembra se determinó el efecto
de los sistemas de siembra y de los microorganismos sobre la ger-
minación. Cuarenta y siete días después del transplante a bolsa se
Pasos iniciales en el laboratorio para el desarrollo de un bioino- determinaron las variables de micorrización y altura de las plantas.
culante (Díaz et al, 2010) Los resultados mostraron que el sustrato de siembra y la inocu-
122
lación de A. brasilense influyeron en la germinación

de las semillas de G. arborea. Se presentó correlación Ensayo de enraizamiento empleado
positiva entre micorrización y la altura de las plantas microorganismos benéficos de suelo
durante el establecimiento en vivero. Además se pre- Evaluación de inoculación
sentó un efecto favorable –sinérgico- de los microor- - Laboratorio de Aso-
ganismos sobre la micorrización. ciaciones Planta-Suelo-
Microorganismo, Unidad
Para estudios con teca, un árbol maderable tro-
pical, (Díaz et al, 2010) se caracterizó el suelo de la de Biotecnología Vegetal,
plantación y se utilizaron técnicas cultivo descritas Pontificia Universidad
para aislar BPCV. Para el análisis de micorrización se Javeriana (Díaz et al, 2010)
evaluó colonización en raíces y se cuantificó el mice-
lio externo, la glomalina y las esporas en suelo. Los Inoculación de
mejores aislamientos de BPCV y los HMA propaga- microorganismos
dos en suelos de la plantación, se inocularon sobre
miniestacas de teca para evaluar su efecto sobre el
crecimiento de la planta y sobre la micorrización.
Siembra en turba bajo
Las bacterias aisladas presentaron actividades de
cámara húmeda
promoción del crecimiento vegetal como fijadoras
Enraizamiento
de nitrógeno, productoras de auxinas, solubilizadoras
de fósforo y de hierro. Se obtuvieron 528 aislamien- luego de 13 días
tos bacterianos de morfotipos diferentes, el grupo
funcional con mayor número de aislamientos fue el
de fijadores de nitrógeno, con 239 aislamientos y la
mejor fuente, el suelo (293 en total). En vivero el
mejor comportamiento lo presentaron bacterias so-
lubilizadoras de fósforo y las productoras de auxinas.
123
BIOINOCULANTES PARA CULTIVOS

Productos elaborados con base en una o más cepas de microorganis-
mos benéficos que, al aplicarse al suelo, raíces o semillas, promueven
el crecimiento vegetal y favorecen la disponibilidad y movilidad de
nutrientes hacia la planta en asociación con micorrizas. Esquema de microorganismos benéficos para las plantas
(RED BIOFAG-CYTED, 2008). (biofertilizantes)
Capítulo 10
CONSERVACIÓN In vitro
DE LOS RECURSOS GENÉTICOS VEGETALES

127
Introducción
La pérdida de la diversidad genética, especialmente los acervos riales genéticos para el mejoramiento, el acceso continuo y seguro
genéticos de las especies cultivadas, puede considerarse uno de a los recursos fitogenéticos deberá garantizarse. Por lo anterior,
los principales problemas ambientales que enfrenta la humanidad. el desarrollo de métodos cada vez más seguros y eficientes de
Tomando en cuenta que los altos rendimientos en la agricultura conservación es una prioridad y la biotecnología tiene mucho que
dependerán de la disponibilidad de una fuente adecuada de mate- ofrecer en este campo.
Métodos de conservación
Para facilitar su estudio y comprensión, los métodos de conser- tan contra la seguridad de estos materiales. Como resultado de las
vación se dividen en dos grandes categorías: diferentes experiencias se señala que, para garantizar la existencia
del recurso, se requiere de otros métodos de conservación.
• In situ
• Ex situ Conservación ex situ
Es la conservación de los recursos fuera de su hábitat natural, por
Conservación in situ ejemplo, los materiales se mantienen como colecciones en huertos,
Es la conservación de la diversidad vegetal en su hábitat natural, fincas de agricultores, fincas experimentales, bancos de semillas, etc.
bosques, selvas, praderas, costas, etc. Se considera el método ideal
de conservación, ya que el recurso se mantiene coexistiendo con Dentro de esta categoría, el método de conservación a utilizar
otros organismos en su ambiente natural. Sin embargo, la presión dependerá del tipo de semilla que presenta la especie de interés.
por la tierra, tanto para agricultura como para urbanizar, los cam- Por lo anterior, las especies se clasifican dependiendo del su com-
bios en las políticas gubernamentales y los desastres naturales aten- portamiento de sus semillas durante el almacenamiento.
128
Clasificación de las especies con relación al comportamiento de Dentro de esta categoría se incluyen también todas aquellas
sus semillas durante el almacenamiento (Roberts, 1973) especies propagadas vegetativamente y aquellas producidas en el
laboratorio utilizando las técnicas del cultivo de tejidos o cultivo In
• Especies con semillas ortodoxas: sus semillas resisten la de- vitro. Una característica de los cultivos propagados vegetativamente
secación hasta contenidos bajos de humedad (5% de contenido es que, tanto el agricultor como el ambiente, a través de los siglos,
de agua o menos) y su viabilidad se prolonga por décadas y aún han venido seleccionando genes y combinaciones alélicas especí-
siglos, si se almacenan a baja temperatura (5°C a —20°C) y baja ficas que han mantenido su viabilidad gracias a la reproducción
humedad relativa. Especies como el maíz (Zea mais), chile, arroz vegetativa. Estas especies son estériles o no tienen una reproduc-
(Oriza sativa), trigo (Triticum aestivum) y muchas otras se incluyen ción sexual estable, por lo que la semilla no es importante para la
en esta categoría. conservación de la especie. Ejemplos de este tipo de especies son
papa (Solanum tuberosum), bananos y plátanos (Musa spp), yuca
• Especies con semillas recalcitrantes: se caracterizan porque (Manihot esculenta), ñame (Dioscoria spp), tiquizque (Xanthosoma
presentan alto contenido de humedad a la hora de la cosecha. No sagittifolium), etc. (Villalobos y Engelmann, 1995).
resisten alto grado de desecación, ni el almacenamiento a bajas
temperaturas. Cuando se almacenan bajo condiciones de alta hu- • Especies con semillas intermedias: Resisten alto grado de
medad y temperaturas cálidas, permanecen viables solamente por desecación, pero no resisten el almacenamiento a bajas tempera-
pocas semanas o meses. Muchas especies tropicales como el cacao turas. Se señalan especies como el café y la papaya dentro de esta
(Theobroma cacao), aguacate (Persea americana), palmas, chayote categoría (Ellis y colaboradores, 1990). Sin embargo, las semillas
(Sechium edule), mango (Mangifera indica) y coco (Cocus nucifera) de muchas especies tropicales también presentan este compor-
entre otras, son clasificadas como recalcitrantes. tamiento.
Métodos de conservación ex situ

Como ya se mencionó, se cuenta con varios métodos para la deshidratadas hasta bajos contenidos de humedad se almacenan a
conservación ex situ de los recursos fitogenéticos, que son: bajas temperaturas (5°C a —20°C) y baja humedad relativa. Este
• los bancos de semillas material puede permanecer almacenado por largos periodos sin
• las colecciones de campo que sufra grandes pérdidas de viabilidad (Villalobos y Engelmann,
• conservación In vitro, que comprende las técnicas más recien- 1995).
temente desarrolladas y se basan en el cultivo de tejidos.
Para que una especie se considere ortodoxa debe cumplir cier-
tas reglas generales durante el almacenamiento:
Bancos de semillas
Es el método más recomendado para el almacenamiento de 1. Por cada 1% de disminución en el contenido de humedad de
especies que presentan semillas ortodoxas. Por lo tanto, las semillas las semillas, la viabilidad durante el almacenamiento se duplica.
129
2. Por cada 10oF (5.6 oC) de disminución en la temperatura de Colecciones de campo

almacenamiento, se duplica la vida de las semillas.
3. La suma aritmética de T (oF) y el % de HR no puede ser Hasta hace pocos años, se consideraba como el único método
mayor a 100, y la temperatura no puede ser mayor que la mitad disponible para la conservación de especies con semillas recalcitran-
del resultado de ese suma. tes, intermedias y propagadas vegetativamente. Es una opción válida
para el mantenimiento de colecciones valiosas y permite además de
Cálculo del contenido de humedad de las semillas (%H) la conservación, el estudio de los materiales, por lo que se convierte
en una muestra importante para trabajos de mejoramiento y eva-
% H = Peso fresco semillas – Peso seco x 100 luaciones. Sin embargo, resultan bastante costosas de mantener por
Peso fresco los requerimientos de terreno (en especies arbóreas se recomienda
de 3 a 5 especímenes/accesión) y pueden presentar pérdida de he-
Condiciones ideales para el almacenamiento en bancos de se- terocigocidad (por el bajo número de especímenes), el alto costo
millas: en insumos que demandan y por lo general, el bajo retorno por la
comercialización de la cosecha y el personal involucrado. La mayor
• Cuartos con temperatura y humedad controladas (12ºC a desventaja de estas colecciones es que no aseguran el mantenimien-
-20º C) to de los materiales a largo plazo, ya que están expuestas a plagas, en-
fermedades y desastres naturales, como sequías, inundaciones, fuego,
Ejemplo: Laboratorio Nacional de Semillas, Fort Collins Colo- etc. y debido a que están fuera de su habitad natural, algunas veces
rado, EEUU: Cuartos 4oC a 12oC, humedad relativa no mayor a las condiciones no son favorables para su crecimiento (Engelmann
35%. 2000). Por último, estas colecciones están sujetas a cambios en polí-
ticas institucionales y gubernamentales que pueden atentar contra su
• Envases de almacenamiento permanencia (Abdelnour, 1999).
Frascos de vidrio (1/4 de litro) herméticamente cerrados, bol-

sas de papel aluminio selladas). Conservación In vitro
Es importante controlar el contenido de humedad durante el El desarrollo de las técnicas del cultivo In vitro, también cono-
almacenamiento, ya que si el contenido es alto (> 30%) las semillas cidas como cultivo de tejidos, abrió nuevas posibilidades para la
podrían germinar. Si el contenido de humedad es intermedio (18 - conservación de los recursos genéticos vegetales, especialmente
30%) ocurre un rápido deterioro por microorganismos e insectos para la conservación de especies consideradas problemáticas para
que trae la semilla del campo, como Altenaria, Helminthosporuim el almacenamiento, es decir, las especies clasificadas como recalci-
y Fusaruim, o microorganismos que infectan durante el almacena- trantes y las propagadas vegetativamente.
miento como Aspergillus y Penicillium. Por otra parte, si el contenido
de humedad es bajo, las semillas se vuelven inmunes a hongos e Esta modalidad de conservación ofrece muchas ventajas; el al-
insectos (si se almacenan a baja H.R). macenamiento de un gran número de especies y accesiones se
130
realiza en un espacio relativamente pequeño, se elimina el riesgo de des cuentan con este tipo de laboratorio, por lo que contar con la
ataques de plagas y enfermedades, para especies con un ciclo corto infraestructura adecuada no sería un problema para implementar
es posible extender el periodo entre transferencias y se reducen las técnicas.
los costos de labor y mantenimiento.
Otro punto a considerar cuando se utiliza esta modalidad de
Las técnicas del cultivo In vitro ofrecen dos modalidades de con- conservación es que a pesar de que los riesgos de pérdida se re-
servación y almacenamiento: ducen al permanecer bajo condiciones asépticas, siempre existe
incertidumbre durante el proceso de subcultivo y la estabilidad
• La conservación a corto o mediano plazo, que utiliza procedi- genética del material así conservado, deberá monitorearse regular-
mientos tendientes a reducir o retardar el crecimiento. mente (Engelmann 1991).
• La conservación a largo plazo o crioconservación, que utiliza
el congelamiento a ultra bajas temperaturas para detener el cre- Las técnicas que se utilizan para reducir el crecimiento del ma-
cimiento. terial vegetal incluyen:
• Modificación de las condiciones físicas en las que crece el

Conservación In vitro a corto y mediano plazo cultivo, por ejemplo, reducción de la temperatura, reducción de la
luminosidad y cambios en el ambiente gaseoso.
Los materiales que crecen bajo condiciones normales de cultivo
de tejidos, es decir, bajo condiciones asépticas en presencia de su La reducción de la temperatura ha sido uno de los recursos
dieta óptima de nutrientes, vitaminas y reguladores de crecimiento más utilizados para disminuir el crecimiento de los cultivos. La ma-
y bajo condiciones de alta iluminación y temperatura adecuada, se yoría de los cultivos In vitro son mantenidos a temperaturas en-
caracterizan por su alta tasa de crecimiento. Por lo tanto, el objeti- tre 20°C y 30°C; a temperaturas más bajas la tasa de crecimiento
vo de las técnicas de conservación In vitro es extender el periodo disminuye. Sin embargo, la temperatura utilizada para lograr este
de subcultivo de la especie, lo que reduce considerablemente los objetivo dependerá de la sensibilidad de la especie de interés a las
insumos, el tiempo que debe dedicar el personar del laboratorio a bajas temperaturas.
estas labores y el espacio requerido, si se compara con el método
de conservación en colecciones de campo. También presenta otras • Modificación en las condiciones químicas en las que crece el
ventajas muy valiosas como son que los materiales se mantienen cultivo, por ejemplo, en la composición del medio de cultivo. Adi-
bajo condiciones estériles, en un ambiente controlado (libre de ción de inhibidores osmóticos o de crecimiento, la deshidratación
plagas y cambios climáticos) y las plantas pueden ser rápidamente de tejidos, la modificación y combinaciones de éstos en la com-
propagadas cuando se requiera. La desventaja de esta modalidad posición del medio de cultivo, por ejemplo, cambios en la relación
de conservación es su costo, ya que demanda infraestructura y carbohidratos y componentes minerales del medio pueden tener
equipo especializado y la estabilidad genética de cultivos debe ser efectos sobre las tasas de crecimiento y la morfogénesis en los
analizada periódicamente (Engelmann, 1997). Sin embargo, muchos cultivos In vitro. Cambios en la concentración de sacarosa también
institutos y centros de investigación, escuelas técnicas y universida- es una estrategia utilizada. Cuando la reducción del crecimiento
131
es causada por la concentración osmótica del medio, es decir, por los brotes bajo conservación y después de dos meses en cultivo el
la adición de altas concentraciones de sacarosa (azúcar altamente material fue desechado por oxidación y muerte (Cruz et al., 2011).
metabolizable por las plantas), u otros agentes osmóticos difíciles
de metabolizar como el manitol y el sorbitol, es posible que la limi- Actualmente existen colecciones de varias especies tropicales
tación del crecimiento se deba a la reducción de la absorción de de interés agronómico almacenadas bajo esta modalidad.
agua y nutrientes del medio (Roca y Mroginski, 1991).
• La colección de café es mantenida por brotes a 27°C con la
En chayote (Sechium edule, Cucurbitaceae), la modalidad de concentración de citocininas reducida.
conservación In vitro a mediano plazo fue examinada. Para ello se • Gengibre por brotes a una temperatura entre 24°C y 27°C con
determinó la supervivencia de los brotes después de la adición de manitol y bajo una capa de parafina.
altas concentraciones de sacarosa (0, 30, 50, 60, 70 y 80 g/l) y ácido • Piña a 25° con la concentración de sales reducida a la cuarta
acetil salicílico (10-9, 10-6 y 10-3 M) al medio de cultivo, de dismi- parte.
nuciones en la temperatura de crecimiento (16, 18, 20, 22 y 25ºC) • Banano a 16°C en presencia de reguladores de crecimiento.
y combinaciones de estos factores. Se encontró que los brotes • Fresa y mora a 4°C también en presencia de reguladores de
mantuvieron altos porcentajes de viabilidad después de ser conser- crecimiento.
vados durante seis meses en los tratamientos evaluados. Debido a
la menor longitud, la apariencia más vigorosa y a la coloración más También existen colecciones de brotes y microtubérculos de
verde que presentaron las plántulas, se consideró que el mejor papa, brotes de tiquisque, yuca, caña de azúcar (Saccharum offici-
tratamiento fue la adición de 60 g/l de sacarosa al medio de cultivo narum) y otras.
combinado con la incubación a 16ºC (Alvarenga et al., 2007).
Es importante considerar que para utilizar esta modalidad de
Varios investigadores han utilizado cambios en la concentración conservación se debe contar con una fuente de poder continuar y
de los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, princi- confiable, lo que no es factible en muchos países. Además se debe
palmente reducción en la de las citocininas También se han incor- controlar cuidadosamente las condiciones de esterilidad del labo-
porado al medio de cultivo del crecimiento como el cido abscísico ratorio durante los periodos de transferencia de los cultivos y du-
(ABA), el cloruro de fosfonio o clorfosfonio (Pospon-D), la hidraci- rante el mantenimiento de las colecciones, ya que el germoplasma
da maléica o daminazida (B995), el cicocel o 2-cloroetil-cloruro de podría perderse, como ocurrió con el 90% de la colección de caña
trimetil (CCC), el ácido acetil salicílico (ASA) entre otros. de azúcar por problemas de ácaros (Engelmann, 1997).
Como resultado de años de experiencia en este campo, recien-

temente se ha recomendado evitar la adición de reguladores de
crecimiento (si el cultivo lo permite), retardadores de crecimiento y Figura 1: Plántulas bajo condicio-
retardadores osmóticos como el manitol y el sorbitol para reducir o nes de conservación In vitro a media-
evitar la aparición de variantes somaclonales (Ashmore, 1997). En uña no plazo.
de gato (Uncaria tomentosa), la adición de manitol resultó tóxica para
132
Crioconservación grandes daños en las membranas de la gran mayoría de las células

(Villalobos y Engelmann 1995, Abdelnour, 1999).
Como proceso natural todo material biológico está sujeto al
envejecimiento; la estructura y la función de los organismos cam- Inicios de la crioconservación
bian y se pierde con el tiempo, hasta alcanzar la muerte. Lo mismo • El desarrollo de estrategias de crioconservación siguió los pa-
sucede en los laboratorios con los materiales que los científicos sos que fueron estableciéndose para mamíferos, pero décadas más
estudian y manipulan. Por estas razones, desde tiempos remotos se tarde.
han realizado esfuerzos para detener el reloj biológico de los or- • Descubrimiento de químicos con propiedades crioprotectoras
ganismos y en la mayoría de los casos, se ha experimentado con la (mamíferos) → paso importante para el desarrollo y afinamiento
temperatura y el contenido de agua para lograr este propósito. Las de las técnicas de crioconservación.
técnicas de refrigeración permiten retardar el proceso de deterio- • Glicerol → protector de células de esperma de aves contra
ro, pero la utilización de temperaturas mucho más bajas permite el el daño por frío → biología y medicina.
almacenamiento de organismos vivos en un estado de suspensión • 50s →, DMSO o Me2SO (sulfóxido de dimetilo) y glicerol para
animada por periodos extensos. Este proceso de congelamiento a glóbulos rojos de humanos y animales, esperma de toros.
ultra bajas temperaturas ha probado ser un método eficiente y se • Actualmente → grandes avances en este campo, pero criocon-
le conoce como crioconservación o sistema criogénico de almace- servación de órganos a ultra baja temperatura con poco éxito →
namiento (McLellen y Day 1995). contrario a los trabajos con plantas.
La crioconservación se define como un grupo de técnicas que

permiten el almacenamiento de organismos vivos en un estado Crioconservación
de suspensión animada por periodos extensos. El almacenamiento
se realiza a ultra bajas temperaturas, por lo general en nitrógeno • Sakai, 1956 → brotes de mora deshidratados → sobrevivieron el
líquido (-196ºC) (Engelmann, 2004 ). congelamiento en NL → comprender el mecanismo de resistencia
de las plantas a ese tipo de estrés.
Por lo tanto, el método de crioconservación consiste en llevar • Sun, 1958 → éxito parcial al desecar y congelar plántulas de
material biológico desde su temperatura fisiológicamente normal, arveja.
hasta ultra bajas temperaturas (generalmente en nitrógeno líquido, • Se continuó estudiando el comportamiento del tejido de varias
-196°C). A esta temperatura la división celular y los procesos meta- plantas bajo condiciones de congelamiento.
bólicos cesan, por lo que el material puede permanecer almacenado • Quatrano, 1968 → células de linaza con DMSO fueron capaces
por tiempo indefinido sin que sufra modificaciones o alteraciones. de sobrevivir al congelamiento a —50°C.
Sin embargo, el éxito del proceso dependerá del acondicionamiento • Latta, 1971 → cultivo de células de Ipomoea sp. → -40°C,
que se dé al material para que resista tanto el congelamiento como Daucus carota → NL.
la descongelación. El acondicionamiento consiste en provocar una • Nag y Street, 1973 → regeneración de embriones somáticos a
deshidratación protectora en las células y tejidos de manera que partir de células de zanahoria congeladas a —196°C.
se evite o diminuya la formación de cristales de hielo que provoca • Crioconservación de otros tipos de materiales.
133
Aplicaciones de la crioconservación selectivo que mantiene una concentración desigual de iones en am-
bos lados de ésta y permite la entrada de nutrientes y otros solutos
Desde hace más de cincuenta años, cuando se demostró por y la salida de productos secundarios del metabolismo.
primera vez la posibilidad de crioconservar eficientemente esper-
ma animal, la técnica se ha experimentado en campos diversos Todas las membranas biológicas poseen en común la misma
para almacenar células vivas por largos periodos y aún indefinida- estructura: lípidos y proteínas unidas por enlaces no covalentes. El
mente. La crioconservación se emplea para el almacenamiento de modelo del Mosaico Fluido se utiliza para ilustrar la estructura de
esperma y embriones de animales y humanos, que se utilizan para la membrana celular. Como se observa en la Figura 2, la membra-
inseminaciones artificiales y fertilizaciones In vitro. También se utiliza na está compuesta por una doble capa de fosfolípidos que tiene la
para el almacenamiento de eritrocitos y ha sido aceptado como el consistencia de un aceite liviano y grandes proteínas inmersas en la
método óptimo para la conservación de la diversidad microbiana. doble capa de fosfolípidos. Además de esteroles que ayudan a man-
En plantas, la posibilidad de crioconservar desde células hasta órga- tener la integridad de la membrana. La consistencia de los lípidos es
nos ha sido demostrada ampliamente, al igual que su utilidad para lo que permite el movimiento lateral de las moléculas de proteína y
la conservación de germoplasma y de material generado en condi- originó el nombre del modelo (Taiz and Zeiger 2008).
ciones de laboratorio (McLellen y Day 1995, Engelmann, 2000).
Debido a que la membrana celular es selectivamente permeable,
regula el paso de moléculas hacia adentro y hacia fuera de la célula.
La crioconservación de plantas En general, las moléculas pequeñas cruzan esta membrana más fácil-
mente que las grandes. Como los fosfolípidos y las proteínas tienen
La mayoría de los sistemas experimentales utilizados para la regiones hidrofílicas e hidrofóbicas, la membrana interactúa con sus-
crioconservación (suspensiones celulares, callos, ápices, meristemas, tancias tanto polares como no polares, cambiando, sus propiedades.
embriones y semillas) son materiales con altos contenido de hu-
medad, por lo tanto son extremadamente sensibles al daño por La temperatura es un factor que tiene gran influencia en el es-
congelamiento, ya que la gran mayoría no son inherentemente tado físico de la membrana. Conforme la temperatura disminuye la
tolerantes al congelamiento y en consecuencia deben ser deshi- fluidez de la membrana también disminuye y pasa a un estado crista-
dratados artificialmente, para protegerlos del daño que causa la lino cuando se alcanzan las temperaturas para la crioconservación.
cristalización del agua intracelular al pasar al estado sólido (hielo)
(Engelmann 2000)
La célula
En general, las células están compuestas de fluidos biológicos,

proteínas y metabolitos encerrados en la membrana celular y en cé-
lulas vegetales existe además, la pared celular. Al contrario de la pared Figura 2. Modelo de mosaico
celular, la membrana no es una barrera pasiva, es un filtro altamente fluido para la estructura de la membrana.
134
El agua constituye el mayor componente del contenido celular Al ser comparado con el método de conservación In vitro a
y en ella se encuentran disueltos sales y varios tipos de solutos. mediano plazo, el método de crioconservación presenta ventajas
Como la molécula de agua es pequeña y relativamente neutra se considerables. Como el material se almacena en tanques, el espacio
difunde rápidamente a través de la membrana. Cuando la mem- para mantener la colección en el laboratorio es considerablemente
brana separa dos soluciones de diferente composición, los cam- menor (0,5 m2 para un tanque de almacenamiento con capacidad
bios en el sistema conforme se acercan al punto de equilibrio, de- para 100 l de nitrógeno líquido y miles de muestras), el costo por
penderán de la permeabilidad de la membrana a los diferentes labor y mantenimiento es mínimo, siendo la única labor rutinaria el
solutos. Cuando la membrana es impermeable a los solutos, los llenado del tanque cada semana o semana de por medio, para que
cambios dependerán de la ósmosis. Debido a que el agua se mueve el nitrógeno líquido permanezca a un nivel mínimo de seguridad, lo
libremente a través de esta membrana, se moverá de regiones de que no toma más de 15 minutos del tiempo del asistente o técnico
mayor concentración a regiones donde se encuentre en menor del laboratorio (Abdelnour, 1999).
concentración (de regiones donde el potencial hídrico sea mayor
(menos negativo) a regiones donde el potencial hídrico sea menor Además, una vez almacenados los materiales, no se manipulan,
(más negativo). Ahora bien, cuando la concentración de solutos en se encuentran protegidos de posibles agentes contaminantes y en
el exterior de la célula es muy alta, la célula puede sufrir plasmólisis caso de necesitarse una muestra específica, ésta puede ser descon-
y muerte (Azcón-Bieto y Talón, 2008; Taiz y Zeiger, 2002). gelada y las plantas recuperadas y multiplicadas en corto tiempo
(Abdelnour, 1999; Engelmann, 2000).
Las ventajas de la crioconservación

La crioconservación se reconoce como la única opción dis- El proceso de crioconservación
ponible para el almacenamiento, a largo plazo, del germoplasma Como el proceso de crioconservación consiste en llevar mate-
de especies propagadas vegetativamente y especies con semillas rial biológico desde su temperatura fisiológicamente normal hasta
clasificadas como recalcitrantes e intermedias en cuanto al almace- ultra bajas temperaturas y de nuevo al punto ¡nidal sin causar daño,
namiento (Engelmann, 2000). es indispensable acondicionar los materiales para que resistan el
proceso y es por esto que una de las etapas más importantes es
En la crioconservación, el almacenamiento a ultra bajas tem- inducir cierto grado de deshidratación en los materiales para evitar
peraturas permite la suspensión del metabolismo, no ocurriendo los daños causados por la formación de grandes cristales de hielo
división celular y por lo tanto, el material permanece sin modifica- durante el congelamiento y descongelamiento de los materiales
ciones o alteraciones por tiempo indefinido. (Benson, 1990).
La utilización de nitrógeno líquido asegura las ultra bajas tem- Las técnicas clásicas de crioconservación comprenden varias
peraturas (entre -196°C y -150°C dependiendo de que el material etapas que se citan a continuación, sin embargo, no todas las técni-
permanezca en la fase líquida o gaseosa del nitrógeno respectiva- cas desarrolladas más recientes requieren de la secuencia completa
mente) y la no dependencia de la electricidad. Además, el nitrógeno de estas etapas, lo que las hace más atractivas y prácticas:
líquido puede adquirirse fácilmente y no es inflamable ().
135
• Selección y aislamiento del explante El pretratamiento y la crioprotección

•Pretratamiento y crioprotección El pretratamiento consiste en cultivar el material biológico du-
•Congelamiento y almacenamiento rante unas horas o días en presencia de sustancias llamadas crio-
•Descongelamiento protectores, de manera que el material se prepara para soportar
•Recuperación el proceso de crioconservación. Si estas sustancias no penetran
la membrana (crioprotectores extracelulares), ejercen una acción
osmótica ayudando a la célula a perder agua e incrementan la
La selección del material a crioconservar viscosidad extracelular lo que resulta en un congelamiento más
Para la selección del material a crioconservar se deberán tomar uniforme de los especímenes. Entre los crioprotectores extrace-
en cuenta factores como la estructura genética de la población lulares se encuentran algunos azúcares, azúcares alcoholados, PVP,
y el germoplasma disponible. Se pueden almacenar ápices, meris- sacarosa, etc. Los crioprotectores capaces de penetrar al interior
temos, semillas, embriones cigóticos y somáticos, polen, células y de la célula (crioprotectores intracelulares), como el glicerol y el
protoplastos. Sin embargo, para conservación de germoplasma, la sulfóxido de dimetilo (DMSO), aumentan la concentración interna
estabilidad genética intrínseca del sistema es importante de con- de solutos y promueven la formación de cristales de hielo peque-
siderar. Como regla general se recomienda que el material sea tan ños. Además, son capaces de formar puentes de hidrógeno con los
joven y meristemático como sea posible, ya que así resisten mejor fosfolípidos de las membranas ayudando a mantener su estabilidad
el congelamiento, los especímenes son más pequeños, las células y protegiendo los sitios de enlace de las enzimas. Debido a que los
contienen vacuolas pequeñas con poca agua y citoplasma denso. crioprotectores incrementan significativamente la osmolaridad del
Pueden utilizarse muestras in vivo o In vitro, pero el material In medio es recomendable adicionarlos en forma gradual, de manera
vitro es preferible, debido a que ya están miniaturizados y libres de que las células tengan suficiente tiempo para equilibrarse. También
contaminantes. En el caso de crioconservación de suspensiones se recomienda agregarlos a temperaturas menores a la ambiental
celulares, el estado fisiológico es también muy importante, siendo para evitar intoxicaciones. En muchos casos, el uso de mezclas de
el estadio de crecimiento exponencial mas adecuado para lograr crioprotectores, como el Polietilenglicol (PEG) (10%), glucosa (8%)
la sobrevivencia al congelamiento. Para los embriones somáticos y DMSO (10%) han resultado en mayor porcentaje de sobreviven-
el estadio globular es el más recomendado (Engelmann, 1991). cia (Reed y Lagerstedt, 1987).
Sin embargo el factor decisivo en la selección del material a

conservar es la disponibilldad de la técnica de cultivo In vitro para
la especie de interés, con el fin de regenerar fácilmente plantas a
partir del material almacenado. Por lo tanto, para lograr el éxito
en un programa de crioconservación es indispensable establecer
a priori un protocolo eficiente para la micropropagación de la
especies. (Ashmore, 1997).
Cuadro 1: Viabilidad de meristemas de Rubus spp después del
congelamiento en nitrógeno líquido (Reed y Lagerstedt, 1987).
136
* DMSO: Sulfóxido de dimetilo, PGD: 10% PEG, 10% Glucosa y • El congelamiento rápido que es el método más simple y por
10% DMSO. PTD: 10% Trehalosa y 10% DMSO. lo tanto el más utilizado en los protocolos desarrollados más re-
cientemente. Consiste en sumergir el material a conservar direc-
Estudios de aclimatación al frío llevados a cabo con cultivos tamente en nitrógeno líquido. Un requisito a cumplir por los ex-
creciendo bajo condiciones In vitro han mostrado efectos tanto plantes es que deben estar en el estado de deshidratación óptimo
positivos, como negativos sobre su sobrevivencia al congelamiento antes del congelamiento para evitar la formación de cristales de
en NL. Algunas especies han mostrado incrementos considerables hielo dañinos.
en la sobrevivencia, por ejemplo, la aclimatación de callos de varios
cultivares de Chrysanthemum y Populus a temperaturas de -16°C • El congelamiento escalonado, bajo este esquema el mate-
incrementó la tasa de sobrevivencia de los mismos. De igual ma- rial se somete a sucesivas temperaturas por debajo de 0°C y se
nera, meristemas de Dianthus, Rubus y de manzana por lo menos mantiene en cada una de ellas durante cierto tiempo, para luego
duplicaron el porcentaje de sobrevivencia al congelamiento des- almacenarse en nitrógeno líquido.
pués de un periodo de 4 a 10 semanas de aclimatación a 4°C. Sin
embargo, antes de aplicar este pretratamiento es recomendable • El congelamiento lento es el procedimiento utilizado en las
tomar en cuenta el hábitat de la especie de interés. técnicas clásicas de crioconservación. Se utilizan congeladores pro-
gramables de manera que la velocidad de enfriamiento de la mues-
tra pueda ser controlada y los resultados precisos y reproducibles.
Las velocidades de enfriamiento, por lo general, están comprendi-
das entre 0,1°C/min y 3°C/min. El congelamiento lento permite
que conforme se va reduciendo la temperatura, el agua intracelular
se movilice al exterior donde el agua se congela más rápidamente,
es decir, los cristales de hielo se forman extracelularmente. Una
vez que la muestra alcanza una temperatura determinada (general-
mente - 40ºC), se almacena en NL.
Cuadro 2: Efecto de la aclimatación al frío sobre la sobreviven-
cia al congelamiento en nitrógeno líquido (NL) de meristemas de El almacenamiento
Rubus spp. (Reed, 1988).
El almacenamiento de los materiales se realiza en nitrógeno
El congelamiento líquido. Puede ser en la fase líquida (- 196°C) o en la fase gaseosa
(- 150°C) y siempre que el material se mantenga bajo estas con-
Para esta etapa del proceso de crioconservación se utilizan tu- diciones podrá ser almacenado por tiempo indefinido. El mercado
bos de polipropileno de varios volúmenes, siendo los de 1 ml y 2 ofrece una gran variedad de tanques de almacenamiento que se
ml los más utilizados. Los procedimientos de congelación se descri- caracterizan por ser livianos y permitir maximizar el tiempo de
ben a continuación. conservación por una cantidad determinada de nitrógeno líquido.
137
Figura 3. Estructura de un tanque para

el almacenamiento de muestras en nitróge-
no Líquido (NL).
El descongelamiento
En la mayoría de los casos se realiza

por inmersión de los criotubos que con-
tienen las muestras en baños de agua a
40°C por 1 ó 2 minutos. Sin embargo, en
algunos casos un descongelamiento más
rápido o lento ha sido favorable.
La recuperación
Es cualquier tratamiento al que se so-

meta el material después del congelamien-
to. Puede ser el lavado o dilución de los
crioprotectores para evitar efectos tóxi-
cos debidos al contacto del material por
largo tiempo con esas sustancias (Engel-
mann, 1991), o el cultivo del explante bajo condiciones diferentes como los obtenidos con el recultivo. Están basadas en la incu-
a las normales como oscuridad para evitar la fotooxidación de los bación de las muestras en sustratos de enzimas. La viabilidad se
tejidos (Benson y colaboradores, 1989). determina con base en la acción de éstas.
Pruebas de viabilidad El diacetato de fluoresceína (FDA), es una prueba muy utili-

zada con células o pequeños agregados de 2 ó 3 células y proto-
Varios métodos pueden ser empleados para estimar la via- plastos. Este compuesto es absorbido por células vivas y transfor-
bilidad del material que fue congelado. Sin embargo, el método mado a fluoresceína por acción de las esterasas; la fluorescencia
más recomendado es su recultivo bajo condiciones óptimas de es medida bajo un microscopio con luz ultravioleta y se hace una
crecimiento y así evaluar su capacidad de regeneración (Roca y relación entre células observadas bajo luz de tungsteno y las ob-
Mroginski, 1991). servadas bajo luz ultravioleta. Todas aquellas observadas bajo luz
ultravioleta son viables.
Las pruebas de viabilidad pueden aplicarse poco tiempo des-
pués del descongelamiento, pero no dan resultados tan precisos
138
El cloruro de trifenil tetrazolio (TTC), compuesto incoloro, es Procedimientos utilizados

para la crioconservación
reducido a formazán, un compuesto de coloración roja, en mito-
condria de células vivas por enzimas deshidrogenasas. Esta prueba
es utilizada con embriones y meristemos. • Los métodos clásicos
Consisten en el pretratamiento del material con sustancias
Preparación de la solución de diacetato de fluoresceína crioprotectoras como el sulfóxido de dimetilo (DMSO), el glicerol,
(FDA) (Wildhom, 1972; Roca y Mroginski, 1991) la sacarosa y el polietilenglicol y mezclas de ellas durante unos mi-
nutos, horas o días, para lograr la deshidratación lenta de las célu-
• Preparar una solución madre de FDA al 0,5% en acetona. Con- las. El pretratamiento es seguido por un congelamiento controlado
servarla en el congelador a — 20°C. que se lleva a cabo lentamente (0,3°C a 2°C/mm) hasta - 40°C,
• A la hora de utilizar, agregar 0,5 ml de la solución madre a 25 ml luego se almacenan las muestras en nitrógeno líquido. Este pro-
de medio de cultivo, de manera que la solución final de FDA sea cedimiento ha resultado más eficiente con unidades pequeñas de
de 0,01%. morfología uniforme como cultivos de protoplastos, suspensiones
• Sobre un portaobjetos, mezclar una gota de esta solución con de células y callos y menos eficiente con unidades mayores como
una gota de la suspensión celular o de protoplastos. Colocar el embriones cigóticos, embriones somáticos maduros y brotes. Otra
cubreobjetos. Esperar de 5 a 20 minutos. Con un microscopio con limitante de estos métodos es la inversión que se debe realizar en
lámpara de tungsteno y UV, observar las células. Primero obser- un congelador programable, para poder obtener resultados preci-
varlas bajo la luz de la lámpara de tungsteno y contarlas. Realizar la sos y reproducibles.
misma operación bajo la luz UV.
• Calcular el porcentaje de viabilidad como se muestra en la fórmula:
%viabilidad = # de células que emitieron fluorescencia bajo UV x100

# de células observadas bajo luz de tungsteno
Preparación del cloruro de trifenil tetrazolio

(TTC) (Stemponkus y Lamphear, 1967)
• Preparar una solución de TTC al 0,6% en una solución buifer (8,9

g/l de Na2HPO4 + 6,8 g/l de KH2PO4).
• Incubar los especimenes por 20 horas a temperatura ambiente.
• Los explantes viables se colorearán de rojo. Figura 5: Congelador
• Calcular el porcentaje de viabilidad. programable
• Si se desea recuperar los especímenes para pruebas posteriores
de germinación y crecimiento, la solución de TTC debe ser esteriliza-
da por filtración y la prueba realizada bajo condiciones asépticas.
139
• Los nuevos métodos Figura 6: Extracción de semillas y preparación de endocarpos

de teca (tectona grandis) para la crioconservación. A) Extracción
Para los materiales de mayor tamaño, como meristemas, ápices de semillas, se utiliza un martillo para romper el endocarpo duro.
recientemente se han desarrollado procedimientos eficientes y re- B) Semillas aisladas. C) Lijado de endocarpos, utilizando lija # 100.
producibles sin necesidad del congelador programable. D) Endocarpos lijados y listo para el congelamiento o para el pre-
tratamiento con GA3.
Desecación A
Este es un procedimiento muy sencillo y eficiente, utilizado prin-
cipalmente para la crioconservación de semillas y embriones cigó-
ticos. Consiste en la deshidratación de las semillas y por varios pe-
riodos, bajo un flujo de aire estéril o utilizando envases con sílica gel
herméticamente cerrados. El congelamiento es rápido, directamente
en nitrógeno líquido (Abdelnour-Esquivel, 2007; Rojas y Abdelnour,
2000; Engelmann, 2000; Abdelnour y colaboradores, 1992).
Figura 5: Esquema de la técnica de crioconservación utili-

zando la metodología de desecación y congelamiento rápido en
nitrógeno líquido. Esta técnica es muy utilizada para la conser-
vación de embriones cigóticos y semillas de café. (IPGRI/CATIE/
IRD, 2000).
140
Figura 7. A. Porcentaje de germinación de la semilla desnuda de

teca durante 28 días en condiciones In vitro. B. Número de hojas
promedio por brote. C. longitud promedio de brote. D. longitud
promedio de raíz de plántulas de teca germinadas a partir de semi-
lla desnuda de teca congelada (NL+) y no congelada (NL-), evalua-
das durante 28 días en condiciones In vitro (Hine, 2011).
141
Precultivo/deshidratación timiento consta de dos partes, una Iámina externa la cual fortalece
y protege la semilla y una solución interna con los nutrientes re-
Consiste en combinar el precultivo en sacarosa u otra sustancia queridos por el explante para su desarrollo (endospermo artificial).
crioprotectora con la desecación, para aumentar el éxito en la crio- Por lo general, esta solución interna también contiene reguladores
conservación de ápices y embriones (Ashmore 1997). de crecimiento y pueden adicionarse otros componentes como
funguícidas, antibióticos y otros (Gray y Purohit, 1991; Rodríguez,
2000). Esta tecnología tiene muchas aplicaciones: en investigación,
Encapsulamiento/Deshidratación propagación directamente en invernadero o campo y en la conser-
vación a largo plazo del germoplasma vegetal entre otras (Gonza-
Se basa en la tecnología desarrollada para la producción de lez-Arnao y Engelmann, 2006).
semillas sintéticas consiste en encapsular meristemas, ápices y em-
briones somáticos en alginato cultivarlos en medio líquido con con-
centraciones altas de sacarosa durante diferentes periodos. Antes
de congelarse rápidamente en nitrógeno líquido, la cápsulas son
parcialmente deshidratadas bajo el flujo laminar de aire estéril d
una cámara de transferencia o utilizando sílica gel. Para la recupera-
ción, la muestras se colocan en el medio de cultivo estándar (Fabre
y Dereuddre 1990)
La semilla es una unidad formada por un embrión cigótico y su

provisión de alimento almacenado, rodeados por cubiertas pro-
tectoras. En su mayoría tienen un porcentaje de humedad bajo,
un metabolismo reducido y no presentan actividad aparente de
crecimiento sino hasta la germinación. La semilla sintética mantiene
muchas de estas características, pero presenta algunas adicionaI por
su naturaleza somática o de propagación vegetativa. Inicialmente
los investigadores utilizaban este concepto para definir el encap-
sulamiento de embriones somáticos utilizados para la propagación.
Sin embargo, d concepto de semilla sintética se utiliza hoy día para
definir también, de encapsulamiento de otro tipo de tejidos u ór-
ganos vegetales.
Por lo tanto, se define como tecnología de semillas sintéticas el Figura 6: Esquema de la técnica de crioconservación utilizando
revestimiento de cualquier material vegetal meristemático como la metodología de encapsulamiento en alginato y deshidratación.
embriones somáticos, meristemas, brotes o microestacas. El reves- (IPGRI/CATIE/IRD, 2000)
142
Vitrificación
La vitrificación es un proceso físico en el cual una solución

acuosa pasa de la fase líquida, por una fase de transición, a una fase
de sólido amorfo vítrio o vidrioso.
Consiste en el pretratamiento de las muestras con soluciones

concentradas de crioprotectores (sacarosa, glicerol y DMSO) por
unos minutos, seguido por el congelamiento en nitrógeno líqui-
do para alcanzar un estado de vitrificación de los solutos internos.
Como estas soluciones son tóxicas para las células es importante Cuadro 3. Composición de algunas soluciones vitrificadoras uti-
controlar cuidadosamente el tiempo de incubación y removerlas lizadas para la crioconservación de material vegetal.
gradualmente después de descongelar las muestras (Sakai y cola-
boradores 1990). Las soluciones vitrificadoras se enfrían fácil y rápidamente has-
ta temperaturas menores de -100 °C y finalmente se solidifican
Esta técnica ha permitido la crioconservación de muchas espe- en un vidrio metaestable a la temperatura de transición del vidrio
cies subtropicales como manzana, uva, pera, té, ajo y fresa y algunas (-110°C).
especies tropicales como piña, ñame, ñampí, banano y chayote (En-
gelmann y Takagi, 2000; Abdelnour y Engelmann, 2002).
Ventajas
Características: 1. Mayor supervivencia en el congelamiento de órganos más com-

plejos (brotes, embriones somáticos).
1. Evita la formación de cristales de hielo durante congelamiento. 2. El meristemo apical permanece vivo y la regeneración es llevada
2. Aumenta la supervivencia de células, tejidos y órganos hidratados a cabo en forma directa y organizada.
cuando se utiliza el congelamiento rápido en nitrógeno líquido. 3. Simplifica el proceso de crioconservación.
3. Una sustancia vitrificada es una sustancia extremadamente visco-
sa que presenta un potencial hídrico menor que el correspondien-
te sólido cristalino y por lo tanto, evita una mayor deshidratación. Adquisición de tolerancia a la deshidratación
4. Elimina la preocupación por la formación intra y extracelular de
cristales de hielo. 1. Precultivo del explante en concentraciones crecientes de sacaro-
5. Posee un gran potencial de aplicarla, con pequeñas modificacio- sa por varios periodos (horas o días).
nes en diferentes tipos de células, etc. 2. Tratamiento con solución cargadora (loading solution LDS) 2M
glicerol + 0.4M sacarosa.
143
Encapsulamiento/vitrificación Figura 6: Crioconservación utilizan-

do la metodología de congelamiento
Es otro método que se ha desarrollado recientemente y compor microgotas. Se utilizan pequeños
bina los procedimientos utilizados en las técnicas descritas ante- trozos de papel aluminio, sobre los
riormente, las muestras encapsuladas se congelan en presencia de que se colocan las microgotas del
las soluciones vitrificadoras y el porcentaje de recuperación es ma- crioprotector y luego los meristemas
yor que utilizando cada procedimiento por separado; al parecer, el a congelar.
encapsulamiento en alginato reduce la toxicidad de las soluciones
vitrificadoras y como la manipulación de las muestras es menor an- Algunos de los métodos desa-
tes del congelamiento, se disminuye la duración del procedimiento rrollados más recientemente requie-
(Matsumoto y colaboradores 1995). ren una mayor manipulación de las
muestras y el tiempo inver tido antes
de la congelación es mayor (encapsulamiento, precultivo/en-
Congelamiento por microgotas capsulamiento); sin embargo, todos presentan la gran ventaja
de no requerir el costoso congelador programable y permitir
Este procedimiento ha sido utilizado exitosamente con 150 la regeneración de materiales de tamaño considerable. Estas
variedades de papa; ha permitido la recuperación de meristemas características de los nuevos procedimientos de crioconserva-
en porcentajes considerablemente altos. Consiste en pretratar los ción los hacen accesibles a países y laboratorios con recursos
meristemos por un periodo de 2 a 3 horas con DMSO en medio económicos limitados.
líquido, para luego colocarlos en gotas de 2.5 µl del mismo medio
sobre papel aluminio y congelarlos rápidamente en nitrógeno líqui- Para la mayoría de las especies vegetales los protocolos de
do (Schafer-Menuhr 1995). crioconservación están en estado de experimentación; sin em-
bargo, esta técnica de conservación ya se utiliza de manera ruti-
naria para el almacenamiento de un gran número de genotipos
de los géneros Rubus, Pyrus, Solanum spp. y Elaeis guineensis
(Ashhmore, 1997). Al presente, Costa Rica no mantiene colec-
ciones vegetales en nitrógeno líquido, pero la investigación en
este campo está tomando mayor impor tancia, conforme se va
desper tando el interés y conciencia en la impor tancia de salva-
guardar nuestros recursos fitogenéticos.
144
Algunas conclusiones sobre la crioconservación y ápices) indican claramente la factibilidad de implementarla en

bancos de germoplasma. La investigación en crioconservación se
La crioconservación, como método para el establecimiento de ha caracterizado por desarrollarse a través de proyectos coftos
bancos de germoplasma de especies problemáticas para el alma- con reducido apoyo financiero, lo que no ha permitido optimizar
cenamiento, presenta gran potencial, especialmente para países las metodologías básicas establecidas durante el periodo de ejecu-
en desarrollo, en donde la diversidad de plantas es una de las ción del proyecto (Abdelnour, 1999).
mayores riquezas.
Entre las ventajas de establecer este tipo de conservación en

el país se puede mencionar que, la mayor parte del equipo reque-
rido para ejecutar los procedimientos se encuentra en los labora-
torios de cultivo de tejidos, infraestructura que existe en muchas
instituciones nacionales; lo mismo que personal entrenado en las
técnicas del cultivo In vitro, que son básicas para desarrollar los
procedimientos de crioconservación. La inversión en equipo es-
pecífico, un tanque de almacenamiento de muestras y un tanque
surtidor de nitrógeno líquido, es mínima, ya que actualmente se
utilizan metodologías eficientes de crioconservación que no re-
quieren el uso del costoso congelador programable.
Como el método de crioconservación consiste en el alma-

cenamiento en nitrógeno líquido, frecuentes interrupciones en el
fluido eléctrico no tienen consecuencias negativas sobre los ma-
teriales conservados. El bajo costo de mantenimiento de la colec-
ción, que comprende únicamente la compra del nitrógeno líquido
para el llenado periódico del tanque de almacenamiento y el poco
tiempo que invierte el técnico de laboratorio en esta labor, repre-
sentan otras de las grandes ventajas de la crioconservación, sobre
todo para países como los nuestros, donde los recursos econó-
micos y el personal asignado a conservación de germoplasma son
limitados.
En Costa Rica, la crioconservación para la conservación de

material vegetal - está en etapa experimental, pero los resultados
obtenidos con una variedad de especies y materiales (embriones
cigóticos, somáticos, callos, suspensiones celulares embriogénicas
Capítulo 11
AGROINFECCION
Una técnica sencilla para el mejoramiento de plantas

147
Introducción
En los últimos 30 años las técnicas de mejoramiento de plantas Para la incorporación de una o varias nuevas características
por medio de métodos alternativos al mejoramiento tradicional (genes) en especies vegetales, la bacteria Agrobacterium posee una
han sido aplicadas en una gran cantidad de especies vegetales. Esto gran habilidad natural de transferir e incorporar material genético a
debido a la incapacidad de tener plantas mejor adaptadas a las las plantas, dicho material genético está contenido en un plásmido
condiciones medioambientales de forma eficiente, así como a los extracromosómico (ADN circular en la bacteria).
tiempos requeridos para la obtención de nuevas variedades (de 7
a 10 años) en los métodos tradicionales. En el plásmido llamado pTi (por inductor de tumores) se en-
cuentra o se puede incorporar la información nueva que queremos
Dentro de las técnicas alternativas tenemos la que involucra a incorporar en las plantas.
la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
Fuente: Agrobiotecnología, UBA Fuente http://biologiasb.blogspot.com/

148
Esta bacteria al encontrarse normalmente en todos los suelos

del mundo, es capaz de infectar a más de 350 géneros diferentes de
plantas, principalmente dicotiledóneas (plantas de hoja ancha).
Para aplicar esta tecnología, basta con tener un cultivo de ésta

bacteria (la cual se le incorporó la información que queremos in-
troducir a la planta) en presencia de porciones de tejido llamados
explantes, para que la maquinaria de Agrobacterium se active, infec-
te y transfiera la información genética a las células de la planta que
han sido superficialmente dañadas por el corte.
Una vez infectados los explantes se transfieren en un medio de

cultivo que contenga todos los nutrientes necesarios para obtener
plantas, además del compuesto que permita la selección de los
transformantes (ver capitulo de micropropagacion). Metodología para agro-infectar plantas
Materiales
• Pinzas de metal de punta delgada
• Bisturí y tijeras pequeñas de punta afilada
• Asa bacteriológica
• Cajas de petri estériles de vidrio o plástico
• Círculos de papel filtro estériles de diámetro del tamaño interno
de la placa de petri.
• Mechero
• Frasco con etanol; absoluto para flamear las pinzas y al 70% para
limpiar el área de trabajo.
• Toallas de papel
• Papel de filtro estéril (de 5 a 10 cm2)
• Papel de aluminio para envolver las cajas de petri.
• Sales basales Murashige & Skoog (Sigma #5519)
• Solución Stock de 2 mg/L de BAP (Sigma #B9395)
• Agar
• Solución Stock de 100 mg/L de kanamicina (Sigma # K4378)
• Solución Stock de 100 mg/L de de cefotaxime comercial (marca
Tomado de http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm libre de farmacia).
149
Para el crecimiento de Agrobacterium. minuto) se vacía en cajas de petri en campana de

flujo laminar, se dejan enfriar y se les colocan los cír-
• 2 tubos de ensayo conteniendo 2mL de medio Yeb culos de papel filtro en la superficie, ayudados con las
líquido adicionado de los antibióticos necesarios se- pinzas estériles y frías.
gún la cepa
• 2 matraces o frascos de 50 mL, conteniendo 20 mL
de medio Yeb líquido adicionado de los antibióticos Medio líquido MS.
necesarios según la cepa • Para un litro de medio:
• Cajas de Petri con medio Yeb solido conteniendo • Azúcar granulada (sacarosa) 2 g.
un cultivo fresco de Agrobacterium. • Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 0.5 g.
• Agua destilada cbp 1000mL
• Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min.
Se puede utilizar cualquier Para el manejo del material vegetal y la infección. Medio de selección e inducción de brotes
planta, pero el protocolo • Cajas de petri conteniendo medio de co-cultivo (tejidos vegetales)
aquí descripto utiliza • Cajas de petri con medio de selección e inducción
como modelo plantas de brotes y/o callo. Para un litro de medio:
asépticas de tabaco en • Medio MS líquido • Azúcar granulada (sacarosa) 20 g.
• Frascos conteniendo medio de elongación y en- • Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g.
frasco de cultivo
raizamiento • Agua destilada cbp 1000mL
• Cajas de petri conteniendo medio de comproba-
ción de la transformación Soluciones Stock de:
• BAP 2mg/mL (bencil amino purina) - 1 mL/L
• Agar 8 g.
Preparacion de medios de cultivo • Se mezcla todo y se esteriliza 121o C por 15 min.
• Medio de cocultivo. Soluciones Stock de:

• Para un litro de medio: • Antibiótico cefotaxime comercial (marca libre), no
• Azúcar granulada (sacarosa) 2 g. expirado diluido a 100 mg/ml.
• Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 0.5 g. • Antibiótico kanamicina 100 mg/mL para una cepa
• Agua destilada cbp 1000mL que contenga el gen de resistencia NPTII.
• Agar 8 g.
• Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min.
Procedimiento:
El medio de cultivo MS (Murashige-Skoog) estéril El medio de cultivo estéril y caliente (a tempe-
y caliente (a temperatura que la mano resista medio ratura que la mano resista medio minuto), se le adi-
150
cionan 2ml de cefotaxime, se agita y se dispensan 4 placas (control Procedimiento:

de la transformación) y al resto del medio se adicionan 2 ml de El medio de cultivo estéril y caliente (a temperatura que la
kanamicina, se mezcla perfectamente y se vacía en cajas de petri mano resista medio minuto), se le adicionan 2ml de la solución
(15 a 20 mL) en campana de flujo laminar, se dejan enfriar, se sellan stock de cefotaxime y 4 ml de de la solución stock de kanamicina,
y se guardan en refrigerador (15 C). se mezcla perfectamente y se vacía en cajas de petri estériles (20 a
40 mL) en campana de flujo laminar, se dejan enfriar, se sellan y se
guardan en refrigerador (15 C).
Medio de elongación y enraizamiento
• Para un litro de medio: NOTA: Este medio sirve para comprobar la transformación
• Azúcar granulada (sacarosa) 30 g. en forma eficiente y barata, debido a que por un lado estamos
• Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g.
subiendo la concentración de la kanamicina al doble, y estamos
• Agua destilada cbp 1000mL
• Agar 8 g. exponiendo material dañado (al cortar), de tal manera que solo
• Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min. aquel que realmente sea transgénico desarrollará un callo en la
zona de corte. Eliminando así los posibles escapes que se hayan
Procedimiento: obtenido durante la primera parte.
El medio de cultivo estéril y caliente (a temperatura que la
mano resista medio minuto), se le adicionan 2ml de la solución
stock de cefotaxime y 2 ml de de la solución stock de kanamicina, Detalles prácticos
se mezcla perfectamente y se vacía en frascos estériles (15 a 20 Antes de iniciar cualquier trabajo, lavarse perfectamente con
mL) en campana de flujo laminar, se dejan enfriar, se sellan y se jabón manos, uñas y antebrazos y secarlos con toallas de papel, lim-
guardan en refrigerador (15 C). piar la zona completa con una solución de etanol al 70% (mantenga
el etanol alejado del fuego), ayudado de una tolla de papel eliminar
el exceso de etanol y suciedad y deje que el resto del etanol se
Medio de comprobación de la transformación evapore completamente. Posteriormente, coloque en una caja de
(inducción de callo) petri un poco de etanol absoluto, coloque las pinzas y tijeras en el
• Para un litro de medio: interior y encienda el etanol teniendo cuidado de no dejar el frasco
• Azúcar granulada (sacarosa) 20 g. de etanol absoluto cerca de la placa encendida, deje que el etanol
• Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g. se evapore y el material se enfríe. Este proceso nos asegurará de
• Agua con destilada cbp 1000mL contar con el material estéril desde el inicio del trabajo. Además,
• Agar 8 g. se mezcla todo y se adicionan 5 mL de la solución stock al hacerlo de esta manera, también contaremos con un recipiente
de ANA (ácido naftalen acético) 0.1mg/mL estéril donde podremos cortar tejido o simplemente colocar nue-
• Se mezcla todo y se esteriliza 121 C por 15 min. vamente nuestro material que requiera condiciones de esterilidad.
151
Con ayuda de las pinzas y bisturí (flameados) y en la cámara

de flujo, se corta una hoja de tabaco, de preferencia las más jóve-
nes cultivadas en condiciones asépticas y con ayuda de las tijeras
también flameadas previamente, se van cortando fragmentos de
aproximadamente 0.5 cm de lado y se coloca en la caja de petri,
sobre el medio líquido.
Cuando se tienen suficientes cuadros se adicionan 2 mL del

cultivo de Agrobacterium y 13 mL más de MS líquido, se mezclan
con movimiento suave y se dejan en reposo 30 minutos.
Pasado el tiempo se retira el liquido y los explantes de colocan

en los medios de cocultivo, sobre el papel filtro. Se cubren con
papel aluminio y se cultivan a 25 C durante 24hr.
Después de ese tiempo, los explantes se transfieren a las placas

de petri conteniendo el medio de selección e inducción de brotes
y/o callo. Se coloca de 10 a15 explantes por placa teniendo cuida-
do de ponerlos con la parte del envés de la hoja (parte superior)
en contacto con el medio. Cultivarlos a 25 C durante 2 semanas a
25 C con fotoperiodo de 16 h luz / 8 h oscuridad. Después de las
Desarrollo de la técnica dos semanas se transfieren a medio nuevo. Se cultivan nuevamente
durante 2 a 3 semanas, plazo en el cual se iniciara la producción de
Dos días antes de cortar los explantes, se coloca una colonia brotes supuestamente transformados.
de la bacteria en el tubo de medio Yeb con 2 mL (precultivo), y se
cultiva en agitación a 28 C durante toda la noche, al día siguiente se Los brotes se cortan y se transfieren al medio de elongación y
adiciona este cultivo al frasco que contiene los 50 mL de medio Yeb enraizamiento manteniéndolos en las mismas condiciones de cultivo.
y se vuelve a cultivar en las mismas condiciones una noche más.
Cuando las plantas estén grandes será posible realizarles las
Ya con el cultivo bacteriano listo se procede a la obtención de pruebas pertinentes para comprobar si son o no transformadas.
los explantes. Una forma simple, práctica y sobre todo barata es colocar peque-
ños fragmentos (0.5 mm) de las hojas de las plantas elongadas en
En una caja de petri estéril se adicionan 5 mL de medio MS el medio de comprobación, también con el envés en contacto con
líquido. el medio. Y cultivarlas en las condiciones ya mencionadas.
152
Este medio al poseer mayor cantidad de kanamicina, permitirá

la formación de callo solo en las plantas que posean el gene de
NPTII, eliminando aquellos escapes que se hayan presentado en el
medio de inducción de brotes.
Tener cuidado de siempre marcar el explante con el mismo

número o letra que posee la plata, para no mezclar positivos con
negativos.
Detalles prácticos
Para el cultivo inicial de la bacteria, antes de la primera asada, el asa
se calienta al rojo vivo, y se deja enfriar, antes de tomar la bacteria.
En la obtención de los explantes, preferentemente usar pocos

explantes por placa para evitar contaminaciones y después de usar
una hoja en una placa, es recomendable volver a flamear los ins-
trumentos metálicos. La forma correcta de hacerlo es, sumergir en
etanol absoluto las puntas de los instrumentos y en posición incli-
nada a 45 grados ponerlos encima de la llama, hasta que el etanol
se evapora completamente, no es necesario llevarlos al rojo vivo.
NOTA: el frasco del etanol deberá estar alejado siempre de la fla-

ma y con tapa, nunca adicione etanol a las manos, si cree necesario
lávelas nuevamente, si cree que pudo contaminar los utensilios,
flaméelos nuevamente y déjelos enfriar, nunca use guantes de lá-
tex para este proceso.
Tomado de Agrobiotecnologia, UBA

153
Agrobacterium rhizogenes (actualmente reclasificada y re-

nombrada como Rhizobium rhizogenes)
Agrobacterium rhizogenes es otra bacteria muy importante en

agricultura, debido a la capacidad que posee, al igual que A. tu-
mefaciens de transferir información genética dentro de las células
vegetales.
A B La diferencia entre éstas bacterias es que entre la información

transferida a plantas por A. rhizogenes se encuentran presentes ge-
nes involucrados en el desarrollo de raíces adventicias, las cuales
pueden ser activas en la incorporación de nutrientes y agua dentro
de las plantas, sobre todo en aquellas cuyas raíces originales son
ineficientes durante el proceso de propagación que es el caso de
algunos tipos de árboles o bien pueden ser usadas en algunas es-
pecies vegetales tanto para la regeneración de plantas transgénicas
como para la producción de metabolitos secundarios.
C D
Tumor de raí-
ces producido por
Agrobacterium rhi-
zogenes en discos
E F de remolacha
Al igual que con A. tumefaciens, A. rhizogenes se encuentra nor-

malmente en suelo y al sufrir la planta un daño, ésta libera sustancia
Tomado de Agrobiotecnologia, UBA fenólicas, las que sirven de atrayente para a la bacteria, haciendo
que ésta se dirija, se acopla a las células dañadas, logrando la infec-
ción e introducción del fragmento de información genética.
154
Desarrollo de la tecnica
Para fines demostrativos se llevará a cabo dos tipos de prácti-
cas, uno usando una planta completa que puede estar in vivo y una
planta in vitro.
Cultivo de raíces de
tabaco transformadas Materiales y métodos.
por Agrobacterium rhi-
zogenes • Cepa de Agrobacterium rhizogenes A4 (*), en suspensión con dos
días de cultivo (de la misma forma que lo descrito para A. tume-
faciens.
Esto se aprovecha en el laboratorio, de tal manera que hacien- • Plantas de chile, jitomate, y/o papa de 20 días de cultivo las dos
do una pequeña incisión en el tejido vegetal y poniendo en con- primeras y 30 las de papa en suelo (**).
tacto con un cultivo bacteriano, al cabo de pocos días después se • Plantas de ají (chile o pimieto), tomate y/o papa cultivadas in vitro
iniciara la producción de raíces adventicias, que serán transgénicas (***) en medio de cultivo MS sin reguladores de crecimiento.
y podrán ser utilizadas para los fines que se deseen. • Jeringa de insulina
• Pinzas
Si el explante fue un fragmento nodal, podremos obtener una • Bisturí
planta lista para transferir a suelo, y si fue en otro tejido, la produc- • Claforán comercial
ción de raíces puede seguir un cultivo continuo para la producción
de sustancias de interés. (*) Cepa de tipo agropina que posee el plásmido pRiA4, que
confiere la característica de raíces pilosas
(**) 20 o 30 días antes se colocan las semillas en suelo para
germinar tanto las semillas de chile como de jitomate o bien cual-
quier variedad de papa con los ojos prominentes en señal de pre
germinación.
(***) Plántulas germinadas de semilla, de chile y/o jitomate, de
20 a 30 días de germinación, en condiciones asépticas.
Estacas de pawpaw o banano Esto se logra limpiando las semillas con una solución de cloro al
de montaña enraizadas con A. ri- 20 % (20 mL de cloro comercial más 80 mL de agua. Se agita du-
zhogenes. 1 rante 30 minutos y se lavan 3 veces con agua estéril en condiciones
de asepsia. Las semillas se colocan en medio de cultivo MS sólido.
155
Procedimiento Los explantes (tallos) Se colocan en un medio MS sin regula-

dores de crecimiento.
Practica demostrativa fenotipica
Se incuban a 25 C durante 24 horas, al día siguiente se transfie-
La jeringa de insulina se carga con la suspensión bacteriana, y en ren a medio MS adicionado de Claforán.
las diferentes zonas de la planta, puede ser tallo y/u hoja, se inocula
con un pequeño pinchazo una gota de la misma. Al cabo de 2 a tres semanas se observara la presencia de raí-
ces en la zona de corte, y se diferencian de las raíces normales no
Nota: Se coloca un pedazo de cinta adhesiva para tener control transgénicas por ser más pilosas y desordenadas. Para poder hacer
de localización. una comparación más exacta se deberán poner controles que no
hayan estado expuestos a la bacteria en los mismos medios, de tal
Las plantas se mantienen en buenas condiciones de cultivo y manera que se podrán hacer observaciones tanto de diferencias
observación (riego y nutrientes). como de similitudes.
Al cabo de 2 a 3 semanas se observara en las zonas de inocu- Cabe mencionar que ésta técnica es más usada para plantas
lación la aparición de raíces adventicias. difíciles de propagar y/o con raíces no eficientes o profundas, como
es el caso de algunas especies de árboles.
NOTA: En esta parte del experimento deberemos usar una

jeringa de insulina sin bacteria y hacer pinchazos en las diferentes
zonas de la planta y señalar de la misma forma que los hechos con
la bacteria para que nos sirva de control. Cabe hacer notar que
de preferencia deberán presentarse o en plantas diferentes o bien
en zonas opuestas de la misma planta.
En el laboratorio
Las plantas germinadas in vitro, se cortan en la parte del tallo, de-
jando dos nodos, haciendo el corte con cuidado con ayuda del bistu-
rí y de un solo tajo, sin dañar los tejidos en condiciones asépticas.
La parte del corte se sumerge en la suspensión bacteriana, se

deja 15 minutos.
Glosario
Adaptadores: fragmentos de ADN de doble cadena que utilizado para iniciar procesos de cultivo de tejidos o mi-
se ligan de manera específica a los extremos de frag- cropropagación.
mentos de ADN cortados con enzimas de restricción
(término utilizado en el procedimiento de AFLPs). Gen: una secuencia de ADN (un segmento) de la cual se
obtiene una proteína o una molécula de ARN con una
ADN: ácido desoxirribonucleico, material genético de función específica.
los seres vivos.
Genoma: toda la información genética que posee un or-
Agrobacterium: bacteria natural del suelo que puede ser ganismo, es decir todo el ADN que tiene un individuo.
utilizada para transferir genes a las células vegetales. Iniciadores: secuencias cortas de ADN que hibridan con
una cadena de ADN complementaria molde y represen-
Aséptica; libre de contaminación tan el punto de inicio para la amplificación de la misma.
Auxinas y Citocininas: reguladores de crecimiento tam- Ingeniería genética: es la tecnología que permite la ma-
bién llamadas hormonas vegetales, que están involucradas nipulación y transferencia de ADN de un organismo a
en la elongación y multiplicación celular. La combinación otro, lo que permite la creación de nuevas variedades de
de éstas promueven el desarrollo de las diferentes plantas, animales y microorganismos, la corrección de de-
respuestas en cultivo de tejidos vegetales. fectos genéticos y la fabricación de numerosos compues-
tos. La tecnología de ADN recombinante permite aislar y
Callo: Masa de células indiferenciadas, provenientes del manipular un fragmento de ADN de un organismo para
tejido vegetal y formado por influencia del medio de introducirlo en otro
cultivo.
In vitro: crecimiento o manejo de organismos en un re-
Cromosoma: Molécula de ADN que contiene un núme- cipiente cerrado, en condiciones controladas de esteri-
ro determinado de genes. lidad.
Enzimas de restricción: enzimas que cortan al ADN en Kanamicina. Un antibiótico de la familia de los aminogli-
sitios específicos. cósidos que puede interferir con los procesos celulares
de traducción mediante enlace con los ribosomas. Las
Explante: Porción de tejido vegetal (hojan tallo, raíz, etc.) plantas en forma natural no son resistentes a este anti-
158
biótico por lo que la resistencia específica a este antibió- Plásmido: Un elemento genético extracromosómico
tico puede usarse como marcador de selección usado presente en muchas cepas bacterianas. Los plásmidos
frecuentemente en células transgénicas. son pequeñas moléculas circulares de ADN utilizados
Plásmido Ti (inductor de tumor): Información genética como vectores para la transferencia de genes de un or-
extracromosómica, natural presente en Agrobacterium ganismo a otro.
tumefaciens responsable de la formación de tumores en
las plantas infectadas, enfermedad llamada “Agalla de la Variabilidad Genética: la variación en el material genéti-
Corona”. Plásmidos Ti, modificados genéticamente, se co entre individuos de una población o especie.
utilizan como vectores para introducir ADN foráneo a
células vegetales.
Marcador Molecular: segmento de ADN que permite

conocer la información genética que los organismos po-
seen y evidenciar las diferencias entre organismos dentro
y entre especies.
Nucleótidos: unidad de construcción del ADN, la misma

que está constituido por un azúcar de 5 carbonos, la
desoxirribosa, a la cual se une un grupo fosfato y una
base nitrogenada.
Omicas: El término “ómicas” hace referencia a las discipli-

nas como la genómica, la proteómica, la transcriptómica
y la metabolómica. A estas tres últimas también se las
agrupa bajo la denominación de “genómica funcional”,
ya que estudian a los productos de la expresión de los
genes. Todas las “ómicas” se basan en el análisis de un
gran volumen de datos, y por lo tanto se valen de la bio-
informática y de técnicas rápidas y automatizadas de alto
rendimiento (high-throughput techniques). http://www.
argenbio.org/
Pares de bases: unión de 2 bases nitrogenadas. Esta unión

se realiza mediante puentes de higrógeno y es específica
entre la timina y la adenina, y entre guanina y la citosina.
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Capítulo I La pequeña agricultura: un escenario para la intensificación sostenible 17

Capítulo II Cultivo de Tejidos Vegetales 29

Capítulo IV Cultivo de Tejidos vegetales. Medios de cultivo para plantas 51

Capítulo VI Cultivo de meristemas 75

Capítulo VII Biorreactores de bajo costo para micropropagacion. Elaboracion de biorreactores 87

Capítulo VIII Marcadores moleculares 99

Capítulo X Conservación in vitro de los recursos genéticos vegetales 125

Capítulo XI Agroinfeccion: una tecnica sencilla para el mejoramiento de plantas 145

Conocimiento Biotecnológico Integrado

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Son objetivos de Fundación Redbio Internacional el promover la concreción de los fines

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Se ha basado en la transferencia de conocimientos desde el sector académico al productivo mediante

Su edición ha respondido a las siguientes preguntas:

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Las biotecnologías comprenden el uso de organismos (también partes de organismos

De esta manera, se recomienda acercarse al manual desde la perspectiva de la duda o la necesidad de

Confiamos que la aplicación de un novedoso y práctico equipo de técnicas permita

Nuestra misión es promover el desarrollo e implementar participativamente

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Profesora Emérita Facultad de Ciencias - Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia

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Marcos Rodríguez Fazzone

Consultor FAO en Buenas Prácticas Agrícolas y Agricultura Familiar

Licenciada en Biotecnologia Universidad San Francisco de Quito.

María de Lourdes Torres

Maria de Lourdes Torres

Lucia Ana Díaz-Ariza

Profesora Asociada, Coordinadora Laboratorio Asociaciones Suelo-Planta-Microorganismo

Juan Izquierdo Fernández

El presente artículo se ha preparado como capítulo introductorio al presente

1 FAO. 2011. Ahorrar para cre-

2 FAO. 2010. El estado de la in-

Tales cambios en la demanda motivarán la necesidad de aumentar notablemente (70%) la produc-

Es conocido que la agricultura produce cerca El enfoque ecosistémico debe aplicarse a lo

En cambio las “biotecnologías modernas” son definidas por el Protoco-

mente seguras, y socio económicamente y

• La aceptación del producto por parte de los 3. Dependiendo de la respuesta de la

En particular el cultivo de células y tejidos Las biotecnologías simples, como se verán

nas Prácticas y la promoción de biotecnologías simples asumen

Ante estos desafíos, debemos ser capaces de dejar los dog-

Cultivo de Tejidos Vegetales