Universidad Nacional de Tucumán

Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia

Instituto de Microbiología "Dr. Luis C. Verna"
Cátedra de Microbiología Superior

Tema III
Caracterización molecular. Trazabilidad del
microorganismo responsable del proceso
biotecnológico

1 de 40
 ¿Cómo abordamos el
estudio y comprensión
de un sistema biológico?

2
 Dogma central de la biología molecular

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE
El ADN forma una copia de parte de su
MICROORGANISMOS

mensaje sintetizando una molécula de

ARN mensajero (transcripción), la cual
constituye la información utilizada por
los ribosomas para la síntesis de una
proteína (traducción).
3
Libro

Escherichia coli

4
 Caracterización molecular

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE
MICROORGANISMOS

Detección de colonias
verdes y amarillas en
agares y la observación al
microscopio

5
7
8
Cronómetros evolutivos (secuencias que se
consideran aptas para comparar)
Elección del cronómetro adecuado,
Elección de moléculas con funciones universales
Elección de moléculas con funciones homologas
Elección de moléculas con secuencias factibles de
alinear
Elección de moléculas que cambien con una
frecuencia que guarde relación con la distancia
evolutiva (EO)
Citocromos, ferredoxinas, RNAs ribosomal, ATPasa,
RecA
RNA ribosómico como cronometro evolutivo
Molécula antigua, funcional, distribuido
universalmente y relativamente conservador.
Tiene muchas secuencias posibles sin
embargo tiene grados de semejanza con
distintos organismos dando parentesco
evolutivo
Permite hacer árbol filogenético
Uso del RNA 16S procariotes y 18S en
eucariontes
Sitio RDPWWW.life.uiuc.edu (Carl Worse)
La proteómica es el campo de la biología molecular
que examina las proteínas que se expresan en el
genoma de un organismo. La genómica estudia los
genes dentro de un organismo.
[Boucher & Jenna 2013 Frontiers In Genetics ]
VI – Relaciones entre biomoléculas y
fenotipos
V – Relaciones funcionales de más alto
nivel entre biomoléculas
IV – Relaciones funcionales entre
biomoléculas (ej. redes de
interacción genética, redes de
señalización, vías metabólicas)
III – Patrón de interacciones físicas:
proteína-proteína, proteína-DNA,
proteína-RNA
II – Patrones de expresión génica
I -- Estructura y organización del
genoma (ej. relaciones de cercanía 11
u homología entre genes)
 Genómica.
Análisis de la estructura y función del genoma.

Genómica Estructural Genómica Funcional

Filogenómica

Hasta el 2006, la base de datos Genomes OnLine Database (GOLD)

(http://www.genomesonline.org) presentaba 5558 genomas completos
publicados, en 2018 tiene 313,557 de los cuales 308 correspondían a
genomas procariotas, en este año 147,378. 12
 GENOMICA ESTRUCTURAL
Conocer y analizar la secuencia nucleotídica del genóma de un organismo.

13
Secuenciadores automáticos de DNA

14
Sistemas de secuenciación masiva:
Método convencional
Características:
Basados en la incorporación enzimática de ddNTPs en la síntesis de copias del
ADN molde y posterior electroforesis capilar (1-96 capilares)
Analizan hasta 1000 bp en cada reacción y unas 1000-2000 reacciones al día
(1-2 Mpb).

Aplicaciones:
Conocimiento de la secuencia de un fragmento de ADN o ARN.
Secuenciación completa de genomas.
Caracterización de patógenos.
Identificación de mutaciones y polimorfismos.
Limitaciones:
• Necesidad de conocer la secuencia (productos de PCR), excepto clonacion.
• Tamaño de las secuencias

15
 GENOMICA FUNCIONAL
Establecer los patrones de expresión de todos los genes de un organismo.

Transcriptoma, mas conocido como microarrays de expresión

Permite detectar:
genes expresados por un tipo celular particular
todos los genes del organismo
genes seleccionados que uno quiere investigar 16
 Robot sembrador

Membrana de nylon

Colección de genes
blanco: DNA’s o
Productos de PCR

Siembra generando spots de

aprox 300 µm de diámetro

17
 Microarrays
Los microarrays o ‘chips de ADN’ son slides de vidrio
o siliconas conteniendo miles de moléculas distintas
de ADN. Son colecciones de oligonucleótidos de ADN complementario
dispuestos en hileras fijadas. Estos chips de ADN se usan para el estudio de
mutaciones genéticas de genes conocidos o para monitorizar la expresión
génica de una preparación de ARN.

Pueden contener :
• genes expresados por un tipo celular particular
• todos los genes del organismo
• genes seleccionados que uno quiere investigar

18
 Informatics data management

Array fabrication Image analysis Data mining

Data management (relational database, OO-database, others)

clone data expression data cell data

outside data hybridization data scanner data slide data in-house data

19
 ¿Qué es data-mining?

Es el análisis de la información presente en un volumen

generalmente grande de datos con el propósito de
extraer conocimiento

20
Qué es la proteómica?
El término “proteoma” se usó por primera vez en 1995, para
describir el conjunto de proteínas que se expresan a partir de un
genoma.

La proteómica es el estudio a gran escala de las proteínas,

habitualmente por medio de métodos bioquímicos.

21
¿Por qué Proteómica?
No pueden obtenerse muchos tipos de información
exclusivamente del estudio de genes. Por ejemplo, las
proteínas, no los genes, son responsables para los
fenotipos de las células. Es imposible de elucidar
mecanismos de enfermedad y envejecimiento, y efectos
del ambiente solamente estudiando el genoma. Sólo a
través del estudio de proteínas pueden ser
caracterizadas las modificaciones de la proteína e
identificar los blancos de las drogas.

22
23
 Complejidad del mundo de las proteínas

DNA : 4 Nucleótidos

Proteínas : 20 amino ácidos

El famoso dogma de la biología, un gene –una proteína no es una hipótesis defendible

RNA Splicing
modificación Post-translacional

Fosforilación Maduración Glicosilación …

Proteómica, a diferencia de Genómica, no es una característica fija de un organismo

stress ambiental
24
 Lecturas recomendadas y bibliografía

Defining the Mandate of Proteomics in the Post-Genomics Era: Workshop Report.

http://www.nap.edu/catalog/10560.html
Harry L.T. Lee, y col. 2004. In situ bioprocess monitoring of Escherichia coli
bioreactions using Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy 35:131–137
Karlin S., y col. 2005. Genomic and proteomic comparisons between bacterial and
archaeal genomes and related comparisons with the yeast and fly genomes. PNAS
102:7309-7314.
Mollerach M. 2006. Genómica y Proteómica: oportunidades y desafíos para la
Microbiología. Revista Argentina de Microbiología 38: 1-3.
Paul R. Graves and Timothy A. J. Haystead. 2002. Molecular Biologist’s Guide to
Proteomics. MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, 66: 39–63.
Willem M de Vos. 2001. Advances in genomics for microbial food fermentations and
safety. Current Opinion in Biotechnology 12:493–498.
Yanhui Hu. 2003. Analysis of Genomic and Proteomic Data Using Advanced Literature
Mining. Journal of Proteome Research 2003, 2, 405- 412. 25
 Trazabilidad del
microorganismo responsable
del proceso biotecnológico
• La trazabilidad es un término que
apareció en 1996, respondiendo a las
exigencias de los consumidores, quienes se
implicaron fuertemente a raíz de las crisis
sanitarias que ocurrieron en Europa y del
descubrimiento e impacto de las Vacas Locas
en los distintos países. La trazabilidad es
serie de procedimientos que permiten seguir
el proceso de evolución de un producto en
cada una de sus etapas.

27
 En que consiste la trazabilidad
• “Consiste en procedimientos de medida
preestablecidos y autosuficientes que
permiten conocer el histórico, la ubicación
y la trayectoria de un producto o lote de
productos a lo largo de la cadena de
suministros en un momento dado, a través
de herramientas determinadas”.
28
La definición de trazabilidad esta expresada en las siguientes
normativas:
Se define como trazabilidad metrológica a una propiedad del
resultado de una medición por la cual este puede ser
relacionado a una referencia a través de una cadena
ininterrumpida de calibraciones, cada una contribuyendo con
una incertidumbre de medición. La referencia puede ser la
definición de una unidad de medición por medio de su
realización práctica, un procedimiento de medición incluyendo la
unidad de medición o un patrón de medición.
Cuando la trazabilidad metrológica no es posible el material de
referencia debe proveer evidencias satisfactorias de la
correlación de los resultados con otros valores establecidos, a
través de una evaluación exhaustiva del proceso de medición o
por comparación con MRC (Material de referencia certificado)
aceptables y conocidos. Estos materiales de referencia tienen
valores certificados comparables e incertidumbres pequeñas y
son de una jerarquía en la trazabilidad metrológica con pocos 29
pasos de comparación.
30
 Tema III.
Caracterización molecular.

Trazabilidad del microorganismo responsable del proceso

biotecnológico
Workshop sobre el rol de las mediciones microbiológicas
trazables y confiables para asegurar la calidad y seguridad
de los alimentos.
Disertante: Dr. Celia Puglisi
Departamento de Metrología Científica e Industrial
http://www.inti.gob.ar/lacteos/pdf/seminarioMetrologiaQuimica/PresentacionCeliaPu
glisi.pdf
“Una vez medido, es aceptado en todos lados”

Requiere comparabilidad a través de la trazabilidad

Trazabilidad Metrológica
Propiedad del resultado de una medición, por el
cual este resultado puede ser relacionado a una
referencia a través de una cadena ininterrumpida de
calibraciones, cada una de las cuales contribuye a
la incertidumbre de medición.
JCGM 200:2008 (VIM3)
Comité Conjunto para las Guías en Metrología
En general, en el campo de las mediciones
microbiológicas no se dispone de patrones como en
el campo de las mediciones químicas o físicas. Sin
embargo, con la idea de asegurar la calidad de los
resultados y la comparabilidad entre laboratorios se
han tenido que utilizar algunas herramientas
parecidas y se optó por denominar a los cultivos
microbianos como Cultivos Microbianos de
Referencia (CMR) cuando provienen de una
colección de cultivo reconocida. Estos son
importantes en el aseguramiento de calidad de los
ensayos que el laboratorio realiza cotidianamente y
en los procesos que se describen a continuación,
para confirmar que están bajo control y no influyen en
el resultado final. 33
Contar con un material de referencia de esta naturaleza
permite asegurar la validación de ensayos microbiológicos,
el monitoreo y el control de los equipos críticos y los
involucrados en los procesos de esterilización y
descontaminación, el control interno y externo de los
ensayos o mediciones, el entrenamiento y evaluación de la
competencia técnica del personal.
En esta presentación se discuten los requisitos que debería
cumplir un cultivo microbiano para ser considerado un
material de referencia certificado (MRC) haciendo un
análisis detallado de algunos de los conceptos de la norma
IRAM1 455:2002 o su equivalente la guía ISO2 34:2000 y
evaluando cómo pueden ser aplicados al área de la
microbiología, fundamentalmente a las propiedades
cualitativas. Esta normativa fue considerada como punto
de partida para el desarrollo del trabajo, disponible en ese
momento. 34
Estos sistemas de trazabilidad y el uso de referencias establecidas,
están bien definidos para las mediciones físicas a través de las
unidades SI, así como para algunos casos en las mediciones químicas
presentando mayor dificultad las mediciones microbiológicas.
Sin embargo la norma IRAM 455:2002 no puede aplicarse directamente
a los cultivos microbianos debido a las diferencia en los conceptos o
criterios microbiológicos de trazabilidad, pureza, homogeneidad y
estabilidad, así como en las definiciones de “valores de las
propiedades” entre otras.
Esta falta de unificación de criterios y definiciones deja librados estos
conceptos a la decisión o interpretación al productor. Es necesario
entonces establecer conceptos, criterios y definiciones de consenso
entre microbiólogos expertos, que permitan aplicar la normativa a la
producción de CMR certificados y alcanzar resultados similares en
condiciones similares. Estos criterios armonizados permitirán asegurar
la trazabilidad y calidad de los cultivos microbianos de referencia
producidos.

35
Definición de Materiales de Referencia
La Guía ISO 30:1992 (Mod. 1:2008), Términos y definiciones define:

Material de referencia (MR) es un material o substancia, en la cual uno

o más valores de sus propiedades son suficientemente homogéneos y
estables, y están claramente establecidos como para poder ser utilizados
en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida o
la asignación de valores a materiales.

Material de referencia certificado (MRC) es un material de referencia

que se distribuye acompañado de un certificado, en el cual uno o más
valores de sus propiedades han sido certificados mediante un
procedimiento que establece su trazabilidad con una realización
exacta de la unidad en la que se expresan los valores de dichas
propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre
con las indicaciones de un nivel de confianza.

36
 Cultivos de referencia:
• Definición:
• Término colectivo que se refiere a cepas
de referencia, cepas de reserva y cepas de
trabajo.
Requisitos:
Células microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).
Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas
con instrucciones para su recuperación.

Se debe tratar de un cultivo puro (PUREZA).

Genéticamente estables.( ESTABILIDAD)

( mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas)
¿QUÉ DEBE REQUERIR EL
USUARIO DE UN CULTIVO
DE REFERENCIA?

Que el productor o distribuidor pueda

 Definir correctamente las características del cultivo

 Su alcance en términos de la aplicación

 Su homogeneidad, estabilidad y pureza

Certificado con datos específicos

LOS MICROORGANISMOS DE REFERENCIA PUEDEN PROVENIR DE UNA COLECCIÓN
NACIONAL O INTERNACIONAL DE CULTIVOS DE REFERENCIA O PERTENECER A
COLECCIONES INTERNAS DE CENTROS DE INVESTIGACIÓN.

• Son microorganismos definidos a nivel de

género y especie.
• catalogados.
• muy caracterizados.
• de origen conocido.
• [ISO 11133-1:2000]

• Se comercializan liofilizadas.
 Identificación de la cepa.
Género y especie del
microorganismo
TIPO y Nº de colección.
Nº de lote.
REGISTRO DE
Fecha de recepción.
CEPAS DE REFERENCIA: Control de calidad de la
cepa de referencia
Conforme (SI/NO).
Fecha de caducidad de
la cepa.
Personal responsable.
 MASTER CELL BANK (MCB)

• CEPA GÉNERO/ESPECIE: Lactobacillus plantarum

• NÚMERO/IDENTIFICACIÓN: 90
• ORIGEN DE LA CEPA Liofilizado provisto por: Bio Sidus
• Recibido: 23 / 12 / 97 Identificado como: L. plantarum
• Documentación adjunta  SI  NO
• PREPARACIÓN DEL MASTER CELL BANK (MCB) El cultivo liofilizado fue resuspendido en 0.5 ml de KH 2 PO 4 al 1% (p/v) durante 1 0
• min. Se tomaron alícuotas y realizaron cultivos en medio sólido (LAPTg agar, Raibaud y col. 1961) para obtener el número de células viables,
observar la
• morfología de las colonias y realizar repiques a medio líquido. Se realizaron cultivos en MRS caldo ( para: conocer la morfología de los organismos
mediante microscopía de contraste de fase, realizar coloración de Gram, prueba de catalasa (Whitenbury, 1964) y utilizar el sistema de
identificación de Lactobacillus API 50 CHL, para obtener el perfil de la cepa original.
• Otras alícuotas fueron conservadas en leche 10%, glicerol 10%, glucosa 0.1% a -70°C para la amplificación y elaboración del Master I (cultivos
liofilizados).
• La amplificación de los cultivos para generar los distintos Masters se realizó en fermentadores LH serie 210, en cultivos por lote y medio MRS, con T
37 °C,
• agitación 150 rpm, microaerofilia por pasaje de N 2 estéril y pH 6.0.
• Se procedió del modo descripto para el control de las cepas destinadas a generar los cultivos M I (liofilizados) , M II (cultivos de 1 ml ,en leche
(20%)-glutamato (10%) conservados en crioviales con 1 ml, en N 2 líquido).
• El M III (cultivos de 1ml, en leche (20%)-glutamato (10%) de 1 ml, conservados a –70 °C) fue generado a partir de un criovial de M II, sometido a los
controles mencionados.
• FECHA DE PREPARACIÓN:
• M I : 98/07/22
• M II : 99/10/22
• M III: 99/10/29
• Nº DE LOTE/NOMBRE
• L90-Lote 4
• L90-Lote 2
• L90-Lote 2”
• CONDICIONES DE CONSERVACIÓN
• Conservado a - 20 ºC (M I)
• Freezer N° B33A001
•  Congelado a - 70 ºC (M III)  N 2 Líquido (M II)
• Freezer N° 929000 Tanque N°: T1 5378 41
 Bibliografía

Conceptos generales sobre Trazabilidad

http://www.aecoc.es/web/codificacion.nsf/0/925B46B62071AAB5C1256F2E00506B2E?OpenDocum
ent

Brock. 2000. Biology of Microorganisms. Novena Edición. Prentice Hall. USA.

Bu'lock and Kristiansen. 1991. Biotecnología básica. Ed. Acribia, Zaragoza.

Demain A.L. and Davies J. E. 1999. Industrial Microbiology and Biotechnology. Segunda Edición.
ASM Press, Washington DC.

Liese A. 2004. Industrial biotransformation. Segunda Edición. Wiley-VCH.

Tecnologías Moleculares de Trazabilidad Alimentaria, Informe. de Vigilancia Tecnológica. GENOMA ESPAÑA/

CIBT-FGUAM. www.gen-es.org/02_cono/docs/TRAZABILIDAD_ALIMENTARIA.pdf

http://www.gen-es.org/02_cono/docs/TRAZABILIDAD_ALIMENTARIA.pdf

Sergio Pérez, y col. Aplicación de métodos moleculares en taxonomia y filogenia :

(http://scriptusnaturae.8m.com/Articulos/bac/index.htm).
MUCHAS GRACIAS

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