Manual Bioquímica I

CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I
LICENCIADO EN BIOLOGÍA
3º-A
AGOSTO-DICIEMBRE 2023
PROFESOR: LAQB MARIA DEL ROSARIO LOMELI RODRIGUEZ

TÉCNICO:
ENERO-JUNIO
CENTRO 2020
DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA I
INDICE DE PRÁCTICAS
1 Preparación de soluciones. 3
2 Medición del pH en soluciones acuosas. 10
3 Preparación de un buffer y su acción amortiguadora. 17
4 Propiedades químicas de los carbohidratos. 21
5 Prueba de tolerancia a la glucosa por el método de Folin-Wu. 24
6 Propiedades químicas de lípidos. 32
7 Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina. 35
8 Propiedades físicas y químicas de las proteínas. 38
9 Determinación de proteínas totales en suero por la técnica de Biuret. 41
10 Actividad de la enzima catalasa en diversos tejidos vegetales. 44
Determinación cuantitativa de la actividad de
11 amilasa en líquidos biológicos 48
PRÁCTICA NO. 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
OBJETIVO (S)
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:
a) Definir molaridad, molalidad, normalidad y porcentualidad.

b) En base a estos conceptos teóricos, preparar los tipos de soluciones más frecuentemente empleadas en el
laboratorio de Bioquímica.
INTRODUCCIÓN
En la naturaleza encontramos dos clases de substancias puras: los elementos y los compuestos; las
demás son mezclas. Una mezcla consiste en dos o más substancias puras, separables por medios físicos. Su
composición es variable y sus propiedades dependen de ésta y de las propiedades de las substancias que
forman parte de ella.
Las mezclas son de dos tipos: heterogéneas y homogéneas. Una mezcla heterogénea no es
completamente uniforme y sus componentes son distinguibles, en ocasiones a simple vista (ejemplo: una
mezcla de azúcar y arena). Una mezcla homogénea tiene apariencia uniforme; las llamadas soluciones son
ejemplos de mezclas homogéneas.
De acuerdo a su estado físico las soluciones se clasifican en gaseosas, líquidas y sólidas. Las
soluciones líquidas son las más comunes y, tal vez, las más importantes para el químico.
Generalmente se llama disolvente al componente de una solución que se encuentra en mayor

cantidad; los otros componentes se llaman solutos. El agua es la molécula más abundante en los sistemas
vivientes y de ahí la importancia de abordar el estudio de las soluciones acuosas en un curso de Bioquímica.
Maneras de Expresar la Concentración
El mol
Nos ocuparemos en primer lugar del mol. La razón de su existencia es que los átomos de los diferentes
elementos no tienen la misma masa. Para expresar la masa de los átomos se recurre a una unidad que no es el
gramo (g) ni el miligramo (mg), sino que es la masa de uno de ellos: el átomo de hidrógeno por ser el más
sencillo. A su masa se le da el valor convencional de 1 (uno). Así, el átomo hidrógeno tiene una masa de 1
unidad de masa atómica (uma), también llamada dalton, cuyo símbolo es Da. Por lo tanto, un átomo de
hidrógeno tiene una masa de 1 Da. Las masas relativas de los demás elementos son múltiplos de este número;
así, la masa del átomo de sodio es 23 veces la del átomo de hidrógeno; la del cloro, 35.5 veces la del
hidrógeno, etc. A estas cifras, por referirse a relaciones de masa entre los átomos, se les denomina masas
atómicas.
Teniendo presente esta relación constante entre las masas de los diferentes átomos, se pueden utilizar
cualquiera de las habituales unidades de masa ya que siempre que mantengamos dicha proporción de 1 para el
hidrógeno por 39 para el potasio estaremos poniendo en contacto el mismo número de átomos. Así, 1 kilogramo
(kg) de hidrógeno tendrá el mismo número de átomos que 23 kg de sodio o que 39 kg de potasio o que 35.5 kg
de cloro. Lo mismo se puede afirmar de 1 g de hidrógeno con respecto a 23 g de sodio, o de 39 mg de potasio
con respecto a 35.5 mg de cloro. De todas estas unidades, la perteneciente al Sistema Internacional de
unidades es el gramo (g) y por ello es la que debe utilizarse.
Así pues, un átomo-gramo es la masa atómica expresada en gramos. Por ello se tiene que un átomo-
gramo de hidrógeno es 1 g de hidrógeno; un átomo-gramo de sodio son 23 g de sodio; un átomo-gramo de
potasio son 39 g de potasio; y, un átomo-gramo de cloro son 35.5 g de cloro.
Ahora bien, los átomos se unen para formar moléculas. Por ejemplo, el carbono, el oxígeno y el
hidrógeno se unen para formar, entre otras sustancias, glucosa (fórmula: C 6H12O6). La masa molecular de la
glucosa es la suma de las masas de los átomos constituyentes, es decir: (12x6)+(1x12)+(16x6) = 72+12+96 =
180 Da. Esta masa puede ser expresada en gramos y, si cuando se habla de átomos se le llamaba átomo-
gramo, cuando se refiere a moléculas, se le denomina molécula-gramo o mol. Por el mismo razonamiento se
podría hablar de ión-gramo.
Todas las moléculas-gramo tendrán el mismo número de moléculas y así se cuenta con una unidad que
expresa la proporción de moléculas en una sustancia. En consecuencia, como la masa molecular de la glucosa
es 180, un mol de glucosa pesa 180 g, 2 moles de glucosa pesan 360 g, etc.
Por lo tanto, se puede establecer la fórmula siguiente:
MASA EN GRAMOS = MASA MOLECULAR x NÚMERO DE MOLES
y despejando:
NÚMERO DE MOLES = MASA EN GRAMOS / MASA MOLECULAR
Para usos biológicos la unidad mol es muy grande y entonces se utiliza el milimol (mmol), unidad mil
veces menor. Por lo tanto, un milimol es igual a la masa molecular expresada en miligramos. Así,
NÚMERO DE MILIMOLES = MASA EN MILIGRAMOS / MASA MOLECULAR
Comprendidos los conceptos anteriores, se puede pasar a definir qué es una solución molar.
Soluciones molares (M)
La molaridad de una solución expresa el número de moles de soluto presentes en un litro (L) de
solución final. Esto quiere decir que si se disuelven en agua 1 mol de glucosa (180 g) y se añade agua
suficiente ("se afora") hasta completar un litro, se obtiene una solución 1 molar (1 M) de glucosa.
Para ilustrar más este punto, supongamos que se quieren preparar 500 mililitros (mL) de una solución
0.4 M de cloruro de sodio (NaCl). ¿Cuantos gramos de NaCl deben prepararse, sabiendo que la masa
"molecular" de la sal es de 58.5? El problema puede abordarse siguiendo este razonamiento: si 1 litro de
solución 1.0 M contiene 58.5 gramos de NaCl y 1 litro de solución 0.4 M contiene “x” gramos de NaCl, entonces
x = (0.4)(58.5)/1 = 23.4 g de NaCl.
Estos 23.4 g de NaCl sirven para preparar 1 L (1000 mL) de solución; pero solamente se requiere 0.5 L
(500 mL). Entonces, como 1 L de solución 0.4 M contiene 23.4 g de NaCl , 0.5 L de solución 0.4 M contiene “x”
gramos de NaCl, esto es, x = (0.5)(23.4)/1 = 11.7 g de NaCl. Por lo tanto, se requieren 11.7 g de NaCl y
disolverlos en agua hasta completar un volumen de 0.5 L (500 mL).
En el ejemplo anterior, como se pudo ver, se multiplicó la molaridad del problema (0.4) por la masa
"molecular" (peso fórmula) del NaCl (58.5 Da) y por el volumen del problema (0.5 L). Posteriormente se dividió
entre 1 L. Simplificando el procedimiento, se puede aplicar la fórmula siguiente:
GRAMOS REQUERIDOS DE LA SUBSTANCIA = MOLARIDAD x PESO MOLECULAR x VOLUMEN
En ésta última ecuación, el volumen debe ser expresado en litros (L).
El equivalente (Eq)
Desde el punto de vista electroquímico existen dos clases de substancias: unas, que al estar en
solución permiten el paso de la corriente eléctrica, reciben el nombre de electrolitos; las otras, que no lo
permiten, son llamadas no electrolitos. Ejemplos de electrolitos son el cloruro de sodio, el fosfato de potasio,
etc. La glucosa y la urea son ejemplos de no electrolitos.
Se sabe que una propiedad de los átomos es la de poderse combinar. En términos químicos esta
capacidad de combinación se denomina valencia. La valencia no guarda relación con la masa atómica, sino
con el número de electrones combinables; en otras palabras, existen átomos con gran poder combinatorio cuya
masa ("peso atómico") es menor que la de otros átomos con valencia menor. Por ejemplo, el sodio tiene un
peso atómico de 23 y una valencia de 1; el oxígeno tiene un peso atómico de 16 y una valencia de 2; el carbono
tiene un peso atómico de 12 y una valencia de 4, etc.
Se requiere, pues, contar con una unidad que evite la dificultad de que los átomos no tengan la misma
masa y que permita comparar "actividades" (cargas) por número y no por peso. Por ejemplo, si se tratara de un
regimiento de soldados, se hablaría del número de soldados y no del peso corporal del pelotón. Pero esto no es
todo: los soldados pueden estar armados de manera diferente, valer cada uno por dos o tres, y es esta razón
del valor diferente, de diferente valencia o actividad química, la que lleva a la introducción de una nueva unidad:
el equivalente (Eq).
Se entiende por equivalente químico el peso atómico o molecular de una sustancia, expresado en
gramos, y dividido entre su valencia:
EQUIVALENTE (EQ) = MASA / VALENCIA
Por tratarse de una unidad demasiado grande para usos biológicos, se utiliza una unidad 1000 veces
menor: el miliequivalente (mEq). Otra comparación que ayuda a ilustrar la importancia de determinar
equivalentes en lugar de gramos es la siguiente: si se invita a una fiesta 1000 kg de niños y 1000 kg de niñas,
no se puede estar seguro de que se invitó a cantidades equivalentes de niños y niñas. Pero si se invita a 10
niños y a 10 niñas sin tener en cuenta su peso, se puede tener la seguridad de que en la fiesta la cantidad de
niños será equivalente a la de las niñas.
Si se considera que la actividad fisiológica y química es proporcional a la cantidad de partículas por

unidad de volumen (moles o milimoles por litro), y más directamente al total de cargas eléctricas por unidad de
volumen (equivalentes o miliequivalentes por litro), con esta última unidad se puede tener una mejor idea de la
verdadera acción química que tienen los iones en el organismo. Por ejemplo, en el suero existen 3.65 g de Cl -
por litro y 3.25 g de Na+ por litro, y en apariencia hay un mayor número de iones Cl - que de iones Na+; sin
embargo, si se toma en cuenta que la masa de un ión Cl - es mayor que la de un ión Na+, se puede sospechar
que en el suero existe una menor acción química del primero que del segundo. Expresado en miliequivalentes
ya se expresa esta diferencia, puesto que hay 103 mEq de Cl- por 142 mEq de Na+.
Para obtener la actividad química se divide la cantidad necesaria de sustancia (en gramos) entre la
valencia. Por lo tanto, teniendo en cuenta ambas características de peso y valencia, se puede generalizar el
concepto para todos los elementos, diciendo que las cantidades que representan la masa atómica ("peso
atómico") dividido por su valencia, son químicamente equivalentes. Así, 1 gramo de H/1 = 1 g; 23 gramos de
Na/1 = 23 g; 39 gramos de K/1 = 39 g; 40 gramos de Ca/2 = 20 g; 16 gramos de O/2 = 8 g; y 12 gramos de C/4
= 3 g, son equivalentes; en otras palabras, químicamente valen igual y son capaces de neutralizarse
exactamente. De lo expuesto se deduce que es fácil convertir gramos en equivalentes y viceversa.
Si se quiere saber cuántos equivalentes son 69 g de Na, como el peso atómico de Na = 23 y un

equivalente de Na = peso atómico en gramos / valencia = 23 g/1 = 23 g de Na; entonces, 3 equivalentes tienen
(3)(23) = 69 g de Na.
Si se quiere saber cuántos mEq son 69 g de Ca, dado que el peso atómico de Ca = 40 y un equivalente
de Ca = (peso atómico en gramos) / valencia = 40 g / 2 = 20 g de Ca, entonces 69 g de Ca son:
x = 69 x 1/20 = 3.45 Eq = 3450 mEq
Como se ve, en el caso de átomos monovalentes, moles y equivalentes tienen el mismo valor ya que su
valencia tiene el valor numérico de 1; así, 4 moles de Na son lo mismo que 4 equivalentes de Na. En cambio, 1
mol de carbono (valencia = 4) constituyen 4 equivalentes de carbono.
Soluciones normales (N)
La normalidad de una solución expresa el número de equivalentes de soluto presentes en un litro de

solución final. Por ejemplo, si se disuelve en agua destilada el peso equivalente de una sustancia, a completar 1
L (1000 mL), se habrá preparado 1 L de una solución 1 Normal (1 N).
Como se recordará, la fórmula utilizada para calcular la cantidad de sustancia necesaria para preparar
cualquier volumen de una solución de molaridad determinada es:
VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
cuando el volumen se expresa en litros. Cuando el volumen es expresado en mililitros se usa:
VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
Para calcular la cantidad en gramos de una sustancia necesaria para preparar un volumen determinado
de una solución de cierta normalidad, se pueden usar las fórmulas siguientes:
VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
cuando el volumen se expresa en litros. Cuando el volumen ha sido expresado en mililitros se usa:
VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA
Ejemplo: Preparar 300 mL de una solución 0.1 N de cloruro de calcio (CaCl 2).
Volumen = 300 mL; Normalidad = 0.1 N

Peso equivalente del CaCl 2:
Peso atómico de Ca = 40; peso atómico de Cl = 35.5 x 2 (en CaCl2) = 71.0; peso fórmula = 40+71 = 111.
Valencia (capacidad de combinación) = 2
Peso equivalente del CaCl 2 = 111 g / 2 = 55.5 g
Substituyendo en la fórmula:
gramos de CaCl2 = 300 x 55.5 x 0.1/1000 = 1.665 g
Resultado: Se necesitan 1.665 g de CaCl2 para preparar 300 mL de una solución 0.1 N.
Soluciones porcentuales (%)
En las soluciones, el soluto puede encontrarse a diferentes diluciones en relación con el disolvente. Es
por ello que se recurre a una terminología especial que indica la cantidad de soluto presente en relación al
volumen total de la solución. Dicha relación se puede expresar de varias maneras, una de las cuales son las
llamadas soluciones porcentuales. Este porcentaje puede ser: de volumen en volumen (v/v), de peso en peso
(p/p) y de peso en volumen (p/v).
Soluciones porcentuales de volumen en volumen (v/v)
En general se emplea para soluciones de líquido en líquido. Por ejemplo: soluciones de etanol en agua;
ambos son líquidos.
Para preparar una solución porcentual se considera que las substancias "químicamente puras" están
formadas sólo por soluto; es decir, están al 100%. Para fines prácticos se usan 100 mL como volumen total de
solución; la cantidad de mililitros de soluto empleados en dicha dilución (v/v), se expresa en forma porcentual.
Así, si se tiene una solución de etanol al 96% (v/v), quiere decir que por cada 100 mL de solución total, 96 mL
corresponden al soluto (alcohol químicamente puro) y el resto al agua u otro disolvente empleado.
Ejemplo: Se desea preparar una solución de fenolftaleína al 0.5% (v/v) en alcohol al 96%. En este caso el soluto
es la fenolftaleína, y el disolvente el alcohol (etanol) al 96%.
Si sólo se cuenta con alcohol químicamente puro (al 100%), se debe preparar primero una solución de
alcohol al 96% (v/v). El método a seguir es el siguiente: en una probeta de 100 mL se vierten 96 mL de alcohol
absoluto (100%); posteriormente se añade agua destilada suficiente para completar los 100 mL. Es necesario
que el procedimiento se haga en el orden mencionado para que sea exacto: primero el alcohol y luego el agua.
A primera vista, parecería lo mismo añadir primero 4 mL de agua y a continuación 96 mL de alcohol absoluto,
obteniendo de este modo 4 + 96 = 100 mL de solución. Sin embargo, hay que considerar que puede haber un
margen de error, ya que se trata de dos líquidos cuya densidad es diferente: las moléculas de alcohol no
mantienen la misma "distancia" entre ellas cuando el alcohol es químicamente puro que cuando se encuentra
mezclado con agua. Esta pequeña diferencia puede alterar el volumen final de solución (100 mL).
Una vez preparada la solución de alcohol al 96%, se procede a preparar la solución de fenolftaleína al
0.5% (v/v). En una probeta de 100 mL se coloca 0.5 mL de fenolftaleína, añadiendo posteriormente la cantidad
necesaria de alcohol al 96% para completar el volumen de 100 mL.
Es importante insistir que los términos porcentuales expresan siempre una relación; es decir, se pueden
variar los volúmenes siempre y cuando no se pierda dicha relación. Por ejemplo, si en lugar de 100 mL de la
mencionada solución de fenolftaleína al 0.5% (v/v) en alcohol al 96%, sólo se deseasen preparar 25 mL, se
sigue el planteamiento siguiente: como 100 mL de solución contienen 0.5 mL de fenolftaleína, entonces 25 mL
de solución contienen “x” mL de fenolftaleína, por lo que:
x = 25 x 0.5/100 = 0.125 mL de fenolftaleína

Resultado: se necesita 0.125 mL de fenolftaleína, y suficiente alcohol al 96% para completar un
volumen de 25 mL.
El alcohol etílico común tiene 96% de pureza (v/v). Por lo tanto, si no se cuenta con alcohol puro y se
quiere preparar una solución de alcohol al 24%, el planteamiento es como sigue: como 100 mL de solución
contienen 96 mL de alcohol puro y “x” mL de solución contienen 24 mL de alcohol puro, entonces:
x = 24 x 100/96 = 25 mL de alcohol al 96% (v/v)

Resultado: Se necesitan 25 mL de solución de alcohol al 96% y completar con agua a un
volumen de 100 mL.
Si tan sólo se desean 50 mL de esta nueva solución: como 100 mL de alcohol al 24% tienen 25 mL de
alcohol al 96%, entonces 50 mL de alcohol al 24% tienen “x” mL de alcohol al 96%:
x = 50 x 25/100 = 12.5 mL de alcohol al 96%

Resultado: Se requieren 12.5 mL de alcohol al 96% y completar con agua destilada un volumen
final de 50 mL.
Soluciones porcentuales de peso en volumen (p/v)
Expresa el número de gramos de soluto en 100 mL de la solución final, independientemente de la

naturaleza del disolvente. Son las más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Bioquímica.
Soluciones porcentuales de peso en peso (p/p)
Expresa el número de gramos de soluto en 100 gramos de la solución final. Generalmente estas
soluciones no se preparan en los laboratorios convencionales, pero conviene conocerlas ya que muchos
reactivos comerciales son envasados como soluciones porcentuales de peso en peso. Por ejemplo, el ácido
clorhídrico, al ácido sulfúrico, etc., son envasados de esta manera. Así, para el ácido clorhídrico (HCl) al 37%
(p/p), en cada 100 g de solución, 37 g son de HCl puro.
Soluciones molales (m)
Una solución molal es la que contiene el peso molecular de una sustancia en 1000 gramos de
disolvente; es decir, la cantidad de disolvente es fija y a ella se agrega la sustancia por disolver. Por ejemplo,
una solución 1 molal (1 m) de glucosa, cuyo peso molecular es de 180 Da, se prepara agregando a 1000 g de
agua, 180 g de glucosa.
MATERIAL REACTIVOS
2 matraces volumétricos de 50 mL Cloruro de sodio (NaCl)
2 matraces volumétricos de 100 mL Agua destilada
Espátula Ácido sulfúrico (H2SO4)
1 probeta de 100 mL Ácido clorhídrico (HCl)
1 probeta de 50 mL
2 pipetas de 5 mL
2 pipetas de 10 mL
Charolas de pesaje
PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
Soluciones Porcentuales (%)

a. Preparar 50 mL de solución de cloruro de sodio al 10% (p/v).
b. A partir de la solución de cloruro de sodio al 10%, preparar 100 mL de una solución salina al 1% (p/v).
Soluciones Molares (M)

a. Preparar 100 mL de una solución de cloruro de sodio 0.5 M
b. A partir de la solución anterior, preparar 100 mL de una solución 0.1 M de cloruro de sodio.
c. Preparar 100 mL de una solución 0.1 M de ácido clorhídrico (HCl) considerando que la densidad del HCl
concentrado es de 1.19 g/mL y la pureza es del 37% (p/p).
Soluciones Normales (N)

a. Preparar 50 mL de una solución de NaCl 0.4 N.
b. Prepare 50 mL de solución 0.4 N de ácido sulfúrico (H 2SO4), considerando que la densidad del H2SO4
concentrado es de 1.84 g/mL y la pureza es de 98% (p/p).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Realice y reporte los cálculos para la preparación de cada una de las soluciones del Procedimiento.
Describa la importancia de las diferentes formas de expresar la concentración de solutos en las soluciones
desde el punto de vista clínico o médico.
CUESTIONARIO
1.- Defina los siguientes términos: mol, equivalente químico, normalidad, molaridad, molalidad, solución
porcentual p/p, solución porcentual p/v, solución porcentual v/v.
2.- La concentración de cloruro de sodio en suero de sangre es aproximadamente a 0.14 M. ¿Qué volumen de
suero de sangre contienen 2 g de cloruro de sodio?
3.- Cuantos gramos de HCl están en 225 mL de 6 M de HCl?

PRÁCTICA NO. 2
MEDICIÓN DEL pH EN SOLUCIONES ACUOSAS
OBJETIVOS
Conocer y aplicar algunos métodos para la determinación de pH.

Determinar el pH de varias sustancias problema.
INTRODUCCIÓN
Concepto de pH
Para poder comprender qué es pH, es necesario revisar antes algunos conceptos, tales como: ácido,
base, disociación, ionización y concentración. Por otra parte, resulta indispensable tener una idea precisa
acerca de los logaritmos.
Disociación. La disociación es el proceso de separación de uno o más elementos de una molécula

compuesta, que da como resultado fragmentos más simples: átomos, radicales libres, iones.
En los sistemas biológicos, el agua es el disolvente en el que se encuentran disueltos los compuestos
disociados. Cuando una molécula se separa dando iones positivos (cationes) e iones negativos (aniones), el
proceso de disociación puede ser también llamado ionización.
Ácido y base. Se define como ácido a una sustancia capaz de ceder protones (H+) en solución. El
grado de acidez dependerá del número de protones o hidrogeniones libres.
En general, se consideran dos tipos de ácidos: fuertes y débiles. Un ácido fuerte es el que se disocia casi por
completo y, por tanto, deja libres a prácticamente todos los hidrogeniones que posee. Un ácido débil es aquél
que se disocia parcialmente, de tal manera que la mayoría de los protones se encuentran unidos al anión (base
conjugada) y sólo una pequeña proporción de ellos están libres.
Una base o álcali es una sustancia capaz de aceptar o combinarse con protones y/o capaz de incrementar la
concentración de iones oxhidrilo (OH-) en solución.
Los ácidos y las bases se neutralizan mutuamente, molécula a molécula, ya que las bases aceptan los protones
de los ácidos cuando ambos son mezclados. Como resultado, se establece un equilibrio entre las cargas del
ácido y las de la base y, por consiguiente, la ausencia de protones libres.
Las substancias que pueden actuar indistintamente como ácidos o como bases son conocidas como
anfotéricas.
Grado de acidez o alcalinidad. Para poder valorar el grado de acidez o alcalinidad de una sustancia,
se ideó una escala basada en la concentración de hidrogeniones libres obtenidos por la disociación del agua.
El valor mínimo de pH es 0 y su valor máximo es 14. Asimismo, pOH puede tener un valor mínimo de 0 y un
valor máximo de 14. Al aumentar el valor de pH, disminuye el valor de pOH y viceversa.
pOH
14 7 0
Ácido Neutro Básico (alcalino)
0 7 14
pH
Se dice que el pH = 7 es neutro, ya que en dicha situación [H+] = [OH-]. Un pH menor que 7 es ácido, pues
predominan los protones sobre los oxhidrilos libres. Finalmente, un pH mayor que 7 es básico o alcalino, ya que
predominan los oxhidrilos sobre los protones libres en solución.
Escala de pH.
H+ pH Solución pOH OH 
-14
1 0 Ácida 14 1 x 10
-1 -13
1 x 10 1 Ácida 13 1 x 10
-2 -12
1 x 10 2 Ácida 12 1 x 10
-3 -11
1 x 10 3 Ácida 11 1 x 10
-4 -10
1 x 10 4 Ácida 10 1 x 10
-5 -9
1 x 10 5 Ácida 9 1 x 10
-6 -8
1 x 10 6 Ácida 8 1 x 10
-7 -7
1 x 10 7 NEUTRA 7 1 x 10
-8 -6
1 x 10 8 Alcalina 6 1 x 10
-9 -5
1 x 10 9 Alcalina 5 1 x 10
-10 -4
1 x 10 10 Alcalina 4 1 x 10
-11 -3
1 x 10 11 Alcalina 3 1 x 10
-12 -2
1 x 10 12 Alcalina 2 1 x 10
-13 -1
1 x 10 13 Alcalina 1 1 x 10
-14
1 x 10 14 Alcalina 0 1
*Concentraciones en moles/litro a 25 C.
Indicadores de pH
Existen varios colorantes orgánicos, sintéticos o de origen natural, que cambian de color cuando varía el
pH de la solución en la que se encuentran disueltos. Ya que la mayoría de los ácidos y las bases empleados en
el laboratorio son incoloros, los indicadores son útiles al hacer posible que los cambios de pH sean observables
por las variaciones en la coloración de las soluciones.
Los indicadores de pH son usualmente ácidos o bases débiles. En el caso de un ácido, su disociación puede
representarse como sigue:
HInd H+ + Ind-
Cuando se agrega una base a la forma ácida del indicador (HInd), aquélla reacciona con él para obtener la
forma básica del indicador (Ind-). Se forma de este modo un sistema amortiguador y, por lo tanto, su pH se
puede calcular de la misma forma que en otras soluciones amortiguadoras.
En el caso de algunos indicadores, su color es determinado por la disociación de la sustancia, como sucede con
el rojo de metilo. La forma ácida (no disociada) es roja; la forma básica es amarilla. Dependiendo de la
proporción que guarden las concentraciones de ambas formas, se pueden observar todas las tonalidades
intermedias entre estos colores extremos. En otros casos, como el de la fenolftaleína, una forma del indicador
es incolora y la otra es coloreada (roja). El color final de la solución depende de la cantidad presente de la forma
coloreada.
Los indicadores pueden usarse para determinar el pH de alguna solución, mediante la comparación entre el
color del indicador en una solución de pH conocido y el color del indicador en la solución problema.
Algunos Indicadores de pH de Uso Frecuente
Nombre vulgar pK Color y zona útil de pH

Azul de timol 1.7 Rojo 1.2 Amarillo 2.8
Anaranjado de metilo 3.5 Rojo 3.1 Amarillo 4.4
Verde de bromocresol 4.7 Amarillo 3.8 Azul 5.5
Azul de bromofenol 4.0 Amarillo 3.0 Azul 4.6
Rojo de metilo 5.1 Rojo 4.2 Amarillo 6.3
Rojo de clorofenol 6.0 Amarillo 5.1 Rojo 6.7
Púrpura de bromocresol 6.2 Amarillo 5.4 Púrpura 7.0
Azul de bromotimol 7.0 Amarillo 6.0 Azul 7.6
Rojo de fenol 7.9 Amarillo 6.8 Rojo 8.4
Rojo de cresol 8.3 Amarillo 7.2 Rojo 8.8
Azul de timol 8.9 Amarillo 8.0 Azul 9.6
Fenolftaleína 9.7 Incoloro 8.3 Rojo 10.0
Timolftaleína 9.9 Amarillo 9.3 Azul 10.5
Rojo Congo 4.1 Azul-rojo 3.0 Violeta 5.2
Rojo de alizarina --- Amarillo 3.7 Rosa 4.2
Tornasol --- Rojo 5.0 Azul 8.0
Rojo neutro 6.85 Amarillo 6.8 Naranja 8.0
Preparación de una Escala Colorimétrica de pH Mediante el Uso de Buffer Estándar e Indicadores
Este método de estimar el pH se basa en el hecho de que un indicador ácido-base existe en solución
como dos especies de diferente color en un intervalo de pH alrededor de su pKa.
-
Los indicadores son ácidos débiles cuyas formas no disociadas (Hind) y disociada (Ind ) tienen color
diferente. Por medio de la preparación de una serie de soluciones amortiguadoras cuyos valores de pH son
conocidos y se agrupan alrededor del pKa del ácido indicador, y que contienen la misma concentración del
mismo, se obtiene una escala colorida estándar en la que la tonalidad de cada solución depende de su valor de
pH particularmente añadiendo la misma concentración de indicador que la presente en las soluciones estándar.
El color de la solución problema es entonces comparado visualmente o colorimétricamente con los colores de la
serie de los buffers estándar. De esta manera es posible conocer el pH de una solución con una aproximación
de 0.2 unidades de pH.
Este procedimiento está sujeto a errores. A menudo las soluciones que contienen proteínas muestran
grandes variaciones de pH debido a que las proteínas pueden unirse a una u otra forma del indicador, por lo
que ocurre un desplazamiento en el equilibrio de su disociación. Un segundo error es causado por la presencia
de otras sustancias coloridas en la solución. Este puede cancelarse, si la interferencia no es muy grande,
mediante el empleo de un tubo “blanco” de la sustancia colorida en el que el indicador está ausente.
Uso del Potenciómetro
El pH es formalmente definido como el logaritmo negativo de la actividad del ión hidrógeno. Algunas
aproximaciones a la verdadera actividad del ión hidrógeno pueden ser medidas por medio del electrodo de
hidrógeno. Este consiste en un electrodo platinado sumergido en la solución que va a ser probada. Se hace
pasar gas hidrógeno a través de la solución. La media celda así formada consiste de H 2 gaseoso en equilibrio
con iones H+, generándose un potencial eléctrico medible.
El potencial medido con un electrodo de hidrógeno, a una atmósfera de presión y en una solución que
contiene la unidad de actividad del ión hidrógeno, es considerado igual a cero a todas las temperaturas. Este es
el estándar. En ocasiones, el pH determinado con el electrodo de hidrógeno es arbitrario, y se han adoptado
algunas conversiones para la relación entre el pH y el potencial eléctrico, de manera que los valores de pH
determinados por otros procedimientos y en diferentes laboratorios pueden ser comparados. En todos los
casos, la solución estándar usada para relacionar el pH a la fuerza electromotriz deberá especificarse.
Como el electrodo de hidrógeno no es adecuado para estimar el pH de soluciones que contienen

substancias reductoras, es necesario usar otro método para dichas soluciones. Uno conveniente emplea el
electrodo de vidrio. El electrodo de vidrio es una membrana delgada de un vidrio especial. Esta membrana
encierra una media celda delgada de plata-cloruro de plata (Ag-AgCl). La otra mitad de la celda es un electrodo
de calomel formado por cloruro de mercurio (HgCl 2) sobre mercurio sólido. En el interior de la celda de vidrio
que contiene el electrodo de calomel hay ácido clorhídrico 0.1 M, solución que establece un pH constante y
conocido en un lado de la membrana de vidrio. Un puente de KCl conecta la solución de pH desconocido con la
media celda.
MATERIAL REACTIVOS
15 Tubos de ensaye CH3COOH 0.2 M
1 Gradilla CH3COONa 0.2 M
2 Pipetas de 10 mL KH2PO4 0.1 M
4 Pipetas de 5 mL NaOH 0.1 M
Etiquetas Ácido bórico-KCl 0.1 M
Embudo
Papel filtro Indicadores:
Anaranjado de metilo
Rojo de metilo
Azul de bromotimol
Rojo de cresol
Fenolftaleína
Azul de timol
Dos soluciones problema de pH desconocido.
PROCEDIMIENTO
A. Preparación de una Escala Colorimétrica de pH Utilizando Indicadores
1. Para realizar la escala de pH en un rango de 3.6 - 10, se dividirá el grupo en 3 equipos; cada uno de los
equipos preparará una serie de pH en donde tendrán once valores de pH diferentes; a cada equipo
corresponde preparar lo siguiente:
Equipo No. 1 (Escala No. 1)
CH3COOH 0.2 M
No. de CH3COONa 0.2 M Indicador
pH a preparar Adicionar en 1er
tubo Adicionar en 2° lugar Adicionar en 3er lugar
lugar
1 3.6 9.3 mL 0.7 mL
2 3.8 8.8 mL 1.2 mL
5 gotas de anaranjado
3 4.0 8.2 mL 1.8 mL
de metilo
4 4.2 7.3 mL 2.7 mL
5 4.4 6.3 mL 3.7 mL
6 4.6 5.1 mL 4.9 mL
7 4.8 4.0 mL 6.0 mL
8 5.0 2.9 mL 7.1 mL 5 gotas de rojo de
9 5.2 2.1 mL 7.9 mL metilo
10 5.4 1.4 mL 8.6 mL
11 5.6 0.9 mL 9.1 mL
2. Agitar bien los tubos hasta homogeneidad. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno
de los valores de pH obtenidos.
3. Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de
preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas.
H2O
KH2PO4 0.1 M NaOH 0.1 M Indicador
No. de pH a destilada
Adicionar en Adicionar en Adicionar en 4°
tubo preparar Adicionar en
1er Lugar 2º Lugar lugar
3er Lugar
12 6.0 5 mL 0.6 mL 4.4 mL
13 6.2 5 mL 0.8 mL 4.2 mL
14 6.4 5 mL 1.2 mL 3.8 mL Adicionar 5 gotas
15 6.6 5 mL 1.7 mL 3.3 mL del indicador azul
16 6.8 5 mL 2.3 mL 2.7 mL de bromotimol
17 7.0 5 mL 2.9 mL 2.1 mL
18 7.2 5 mL 3.4 mL 1.6 mL
19 7.4 5 mL 3.9 mL 1.1 mL
Adicionar 5 gotas
20 7.6 5 mL 4.2 mL 0.8 mL
del indicador rojo
21 7.8 5 mL 4.5 mL 0.5 mL
de cresol
22 8.0 5 mL 4.6 mL 0.4 mL
Ácido Bórico- NaOH 0.1 M H2O

Indicador
KCl 0.1 M Adicionar destilada
No. de tubo pH a preparar Adicionar en
Adicionar en en Adicionar en
4° lugar
1er lugar 2º lugar 3er lugar
23 8.2 5 mL 0.6 mL 4.4 mL Adicionar 5
24 8.4 5 mL 0.8 mL 4.2 mL gotas del
25 8.6 5 mL 1.2 mL 3.8 mL indicador azul
26 8.8 5 mL 1.6 mL 3.4 mL de timol
27 9.0 5 mL 2.1 mL 2.9 mL
28 9.2 5 mL 2.7 mL 2.3 mL Adicionar 5
29 9.4 5 mL 3.2 mL 1.8 mL gotas del
30 9.6 5 mL 3.7 mL 1.3 mL indicador
31 9.8 5 mL 4.1 mL 0.9 mL fenolftaleína
32 10.0 5 mL 4.4 mL 0.6 mL
8. Reúnanse los 3 equipos con las series de tubos que prepararon para llevar a cabo la determinación de pH de
sus problemas, primero mediante el potenciómetro y después por comparación visual con las escalas
colorimétricas preparadas, como se describe a continuación.
B. Medición del pH de las Soluciones Problema Usando el Potenciómetro
1. Mida el pH de la solución problema que le tocó a su equipo, usando el potenciómetro (previamente calibrado)
como se describe a continuación:
 Con cuidado, saque el electrodo de vidrio del potenciómetro de la solución en que se encuentre
sumergido y enjuáguelo con agua destilada, recibiendo el enjuague en un vaso designado para
desechos.
 Seque suavemente el agua en exceso del electrodo usando un pedazo de papel suave (papel
sanitario).
 Sumerja el electrodo en la solución problema y agite suavemente, con cuidado de no golpear la punta
del electrodo, hasta que la lectura de pH en la pantalla se estabilice. Anote el pH de la solución
problema.
 Con cuidado, saque el electrodo de la solución problema y enjuáguelo con agua destilada, recibiendo el
enjuague en el vaso de desechos.
 Seque suavemente el agua en exceso del electrodo usando papel sanitario.
 Sumerja el electrodo en un vaso con agua destilada para que enseguida lo usen sus demás
compañeros.
C. Medición del pH de las Soluciones Problema Usando las Escalas Colorimétricas
1. Determine el pH de la solución problema que te tocó a su equipo, por medio de comparación visual con las
escalas colorimétricas, como se describe a continuación.
2. Tome 10 mL de la solución problema y colóquela en un tubo de ensaye.
3. Añada 5 gotas del indicador adecuado al valor de pH obtenido con el potenciómetro para ese problema.
Revise las tablas de preparación de las escalas colorimétricas que aparecen arriba, para saber cuál
indicador agregar a su problema. Agite por inversión.
4. Compare la coloración de la solución problema con la escala colorimétrica de pH adecuada de acuerdo al
valor de pH obtenido con el potenciómetro. No necesariamente será la escala colorimétrica que le tocó
preparar a su propio equipo. Anote el pH del tubo cuyo color más se parece al color de su solución problema
y anótelo en la tabla que aparece abajo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN (REPORTE FINAL)
1. Observe, describa, dibuje y/o tome fotografías de los distintos tonos que adquieren los indicadores en cada
uno de los valores de pH obtenidos.
2. Reportar los valores de pH obtenidos por ambos métodos en la siguiente tabla:
PROBLEMA pH POTENCIÓMETRO pH ESCALA

COLORIMÉTRICA
1
3. Establezca diferencias y similitudes entre los dos métodos empleados en esta práctica. ¿Qué tanto se
parecen los valores de pH obtenidos por cada técnica? ¿Cuál es más exacto y por qué? ¿Por qué no
salieron idénticos los valores?
4. ¿Qué importancia tiene el pH para los fluidos corporales y las células/tejidos vivos?
CUESTIONARIO
1.- ¿Cómo defines el término pH?

2.- ¿Qué diferencia hay entre pH y acidez en una solución?
3.- ¿Cuál es el pH del intestino delgado en humanos y por qué?
4.- Explica en que se basa los diferentes indicadores que utilizaste en esta práctica.
5.- Investiga y explica en que rama de la industria de los alimentos es necesario medir el pH.
6.- Explique que es acidosis y alcalosis.
7. Mencione las tres formas que tiene el organismo para controlar el pH.
PRÁCTICA NO. 3
PREPARACIÓN DE UN BUFFER Y SU ACCIÓN AMORTIGUADORA
OBJETIVOS
Preparar una solución buffer y observar su acción amortiguadora en comparación con la de un material
biológico.
INTRODUCCIÓN
La definición más general de una solución amortiguadora o buffer es que son soluciones que resisten
mucho los cambios de pH cuando se les añaden ácidos o bases. Casi siempre están formadas por ácidos
débiles y sus sales (bases conjugadas).
Al agregar iones hidrógeno en forma de un ácido fuerte a una solución amortiguadora, se descompone
la sal de la solución buffer y se forma un ácido débil que se disocia muy poco y por lo tanto no modifica el pH en
-
forma significativa. Cuando se añade a la misma solución amortiguadora iones OH en forma de una base
fuerte, dichos iones reaccionan con el ácido de la solución buffer y se forma agua y una sal disociada, que
tampoco ejerce una notable variación del pH.
Ejemplo: Se tiene una solución amortiguadora formada por un ácido débil (ácido acético) y una de sus
sales (acetato de sodio) en solución; el ácido acético está débilmente ionizado y el acetato de sodio está
fuertemente ionizado:
+ -
CH3COOH H + CH3COO
+ -
CH3COONa Na + CH3COO
-
La mayor parte de los iones CH3COO provienen del acetato de sodio; si se le añade un ácido fuerte,
por ejemplo HCl, la reacción que ocurre es la siguiente:
- + - -
CH3COO + H + Cl CH3COOH + Cl
Si a ese sistema se le añade una base fuerte, por ejemplo NaOH, se da la siguiente reacción:
+ - - +
CH3COOH + Na + OH CH3COO + Na + H2O
Por lo que los cambios de pH son mínimos en ambos casos.
El pH de cualquier sistema amortiguador puede calcularse con la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

[CH3 COO−]
pH = pKa + log
[CH3 COOH]
Interpretando esta fórmula de otra manera podemos expresar la ecuación de Henderson-Hasselbalch de
una forma válida para todos los amortiguadores de la siguiente manera:
[sal]
pH = pKa + log ( )
[ácido]
A partir de esta fórmula se pueden deducir fácilmente las propiedades de los amortiguadores:
1. El pH de una disolución amortiguadora depende
de la naturaleza del ácido débil que lo integra
(de su pK), de modo que para cantidades
equimoleculares de sal y de ácido, el pH es
justamente el pK de este ácido. Dicho de otra
forma, se puede definir el pK de un ácido débil
como el pH del sistema amortiguador que se
obtiene cuando [sal] = [ácido] pKa
pH
2. El pH del sistema amortiguador depende de la Agotamiento del
proporción relativa entre la sal y el ácido, acido conjugado
pero no de las concentraciones absolutas de
estos componentes. De aquí se deduce que [Ácido]=[Base]
añadiendo agua al sistema, las concentraciones
de sal y ácido disminuyen paralelamente, pero Agotamiento de
su cociente permanece constante, y el pH no la base conjugada
cambia. Sin embargo, si la dilución llega a ser
muy grande, el equilibrio de disociación del ácido
se desplazaría hacia la derecha, aumentando la Base agregada
[sal] y disminuyendo [ácido], con lo cual el
Ácido agregado
cociente aumenta y el pH también, de forma que
se iría acercando gradualmente a la neutralidad (pH 7).
3. Cuando se añaden ácidos o bases fuertes a la disolución amortiguadora, el equilibrio se desplaza en el
sentido de eliminar el ácido añadido (hacia la izquierda) o de neutralizar la base añadida (hacia la derecha).
Este desplazamiento afecta a las proporciones relativas de sal y ácido en el equilibrio. Como el pH
varía con el logaritmo de este cociente, la modificación del pH resulta exigua hasta que uno de los
componentes está próximo a agotarse.
Las sustancias amortiguadoras o buffers tienen un papel importante para la regulación del pH en los
medios biológicos celulares y extracelulares. Su función es reducir al mínimo los cambios en la concentración
de iones hidrógeno y por lo tanto, también en la concentración de iones hidroxilo, cuando se agregan pequeñas
cantidades de ácidos o bases.
Para describir un sistema amortiguador se requieren dos parámetros:
1. El pH de la solución amortiguadora: El cual indica la región de concentración del ión hidrógeno en el cual se
realiza el efecto amortiguador (alrededor de +/- una unidad de pH amortiguador).
2. La capacidad amortiguadora: Es decir, la capacidad de resistir la adición de ácido o base con poco cambio de
pH, lo que se relaciona de manera directa con la concentración de todos los constituyentes del amortiguador.
Para que los procesos bioquímicos se produzcan en forma adecuada es necesario que la concentración
de iones hidrógeno se controle con extrema precisión. Por ejemplo, el pH de la sangre se encuentra dentro de
los límites de 7.3 - 7.5 gracias en buena parte al sistema amortiguador bicarbonato / ácido carbónico. Otro
sistema importante son los grupos laterales de la histidina en la hemoglobina. En la saliva el sistema ácido
carbónico / bicarbonato y fosfato son primordiales.
Algunos amortiguadores y los rangos de pH en que actúan.

Ácido débil Base conjugada pH aproximado
Ácido fosfórico Fosfato diácido 1.8 – 3.8
Ácido acético Acetato 3.6 – 5.6
Ftalato ácido Ftalato 4.0 – 6.0
Fosfato diácido Fosfato monoácido 5.8 – 7.8
Ácido bórico Borato diácido 7.5 – 9.5
Fosfato monoácido Fosfato 10.5 – 12.0
MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS
4 vasos de precipitado de 100 mL Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) sólido
2 pipetas de 10 mL Fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4) sólido.
4 pipetas de 5 mL NaOH 1 M y 0.1 M
6 vasos de precipitados de 50 mL HCl 1 M y 0.1 M
2 pipetas Pasteur con bulbo Albúmina de huevo al 2%, 75 mL por equipo.
1 Vaso de precipitados de 250 mL Agua destilada
1 Potenciómetro previamente calibrado
PROCEDIMIENTO
Experimento A. Preparación de la Solución Buffer de Fosfatos.

1. Realice los cálculos necesarios para preparar 250 mL de solución buffer de fosfatos 0.15 M pH 7.0. Utilice la
ecuación de Henderson-Hasselbalch para hacer dichos cálculos.
2. Pese las cantidades adecuadas de KH2PO4 sólido y de Na2HPO4 sólido y disuélvalos en un vaso de
precipitados de 250 mL con aproximadamente 200 mL de agua destilada.
2. Mida con el potenciómetro el pH de la solución preparada hasta obtener un pH de 7.0. Si fuera necesario
ajustar el pH, utilice HCl o NaOH 1 M y 0.1 M para lograr el pH solicitado. Una vez ajustado el pH a 7.0,
afore a 250 mL con agua destilada. Guarde su solución buffer para el Experimento B.
Experimento B. Acción Amortiguadora del Buffer Preparado y un Buffer Biológico.

1. Numerar una serie de vasos de precipitados de 50 mL del 1 al 6, y seguir con las indicaciones dadas por la
siguiente tabla:
VASO pH
SOLUCIÓN A COLOCAR ADICIONAR pH FINAL
No. INICIAL
1 20 mL H2O destilada 8 gotas HCl 0.1 N
2 20 mL solución buffer preparada 8 gotas HCl 0.1 N
3 20 mL albúmina de huevo 8 gotas HCl 0.1 N
4 20 mL H2O destilada 8 gotas de NaOH 0.1 N
5 20 mL solución buffer preparada 8 gotas de NaOH 0.1 N
6 20 mL de albúmina de huevo 8 gotas de NaOH 0.1 N
1. Realizar primero la medición del pH de las soluciones que se indican en el vaso 1 al 6 antes de agregar el
HCl y el NaOH.
2. Después con el mismo potenciómetro determinar la capacidad amortiguadora de cada solución midiendo el
pH final después de la adición del ácido y la base fuerte.
1. Del experimento B, reportar en la tabla anterior el pH inicial y final obtenido para cada tubo y explicar sus
resultados obtenidos.
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué el agua destilada observa mayor alteración de pH?

2. ¿Por qué considera que la albúmina de huevo debe tener propiedades amortiguadoras?
3. ¿Qué papel desempeñan las soluciones buffer dentro de la bioquímica? (En general).
4. ¿Qué sucede cuando en un sistema amortiguador la concentración molar de la sal y el ácido que integran la
solución son iguales?
PRÁCTICA NO. 4
PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS
OBJETIVO (S)
Caracterizar, hasta donde sea posible, a un carbohidrato problema mediante algunas pruebas químicas
cualitativas
INTRODUCCIÓN
Los azúcares se comportan como ácidos débiles y tienen las características químicas de aldehídos o
cetonas. Por ello, los álcalis aumentan la ionización de los azúcares.
La tautomerización es una reacción típica de los azúcares, los cuales contienen un grupo aldehído libre
o un grupo cetónico. En ausencia de álcali existe un equilibrio entre las formas enólicas y cetónicas,
predominando estas últimas. Cuando se les añade álcali, los enoles ácidos forman una sal y, por efecto de la
acción de masas, se desplaza el equilibrio hacia la derecha. La adición de ácido a una mezcla en equilibrio
alcalino, reestablece el equilibrio tautomérico hacia la forma cetónica.
Otra reacción importante es la que ocurre entre el grupo carbonilo y un alcohol, formando enlaces
hemiacetales y acetales.
Un monosácarido posee ambos grupos funcionales (carbonilo y alcohol) en su molécula y pueden
reaccionar con otros azúcares. La reacción puede ocurrir dentro de una misma molécula de azúcar, dando paso
a la formación de hemiacetales cíclicos. Ahora bien, muchas de las propiedades de los azúcares simples sólo
pueden ser explicadas suponiendo la formación del anillo, siendo ésta la forma más estable de las moléculas.
Los álcalis disminuyen la formación del anillo al favorecer la formación de la sal enólica.
A. PRUEBA DE MOLISCH (presencia de carbohidratos)

La reacción depende de la formación de furfural y sus derivados por la acción deshidratante del ácido sobre un
carbohidrato. El furfural se combina con el alfa-naftol para formar un compuesto coloreado. Aunque no es una
prueba específica, un resultado negativo (ausencia de color) sugiere la ausencia de carbohidratos.
B. PRUEBA DE BENEDICT (azúcares reductores)

Las soluciones alcalinas de cobre son reducidas por azúcares que poseen un grupo aldehído o cetónico libre y
se forma óxido cuproso insoluble.
C. PRUEBA DE BARFOED (monosacáridos vs disacáridos)

La prueba de Barfoed sirve para detectar monosacáridos en presencia de disacáridos. La reacción de Barfoed
difiere de la de Benedict en que la reducción ocurre en medio ácido. IMPORTANTE: Los disacáridos también
responderán a la prueba si la solución de azúcares es hervida durante un tiempo suficiente para producir
hidrólisis.
D. PRUEBA DE SELIWANOFF (cetosas)

Esta prueba depende de la formación del 4-hidroximetil-furfural y de su reacción posterior con el 1,3-
dihidroxibenceno (resorcinol), de la que resulta un compuesto de color rojo cereza.
En general, la prueba es específica para cetosas; sin embargo, grandes cantidades de glucosa u otros azúcares
pueden interferir produciendo compuestos de color similar.
MATERIAL REACTIVOS
1 Gradilla Reactivo de Molisch (solución de alfa-naftol en
20 Tubos de ensayo etanol) recién preparado.
3 Pipetas de 1 mL H2SO4 concentrado.
3 Pipetas de 5 mL Solución de Benedict (contiene sulfato cúprico,
4 Pipetas Pasteur con bulbo carbonato de sodio y citrato de sodio).
1 Baño María Reactivo de Barfoed (sulfato cúprico y ácido
1 Placa de calentamiento láctico disueltos en agua).
Ligas de látex Reactivo de ácido fosfomolíbdico
Reactivo de Seliwanoff (resorcinol en ácido
clorhídrico)
Soluciones de: glucosa, fructosa, galactosa,
maltosa, lactosa, sacarosa, almidón e inulina (1%
p/v).
Solución problema de “carbohidrato”
desconocido.
PROCEDIMIENTO
Para el desarrollo de los siguientes experimentos se utilizarán las soluciones de glucosa, fructosa,
galactosa, maltosa, lactosa, sacarosa, almidón e inulina a una concentración de 1% (p/v). También se correrá al
mismo tiempo, para cada prueba, un tubo con la solución problema del “carbohidrato” desconocido asignado al
equipo.
A. Prueba de Molisch (presencia de carbohidratos)

La reacción depende de la formación de furfural y sus derivados por la acción deshidratante del ácido
concentrado sobre un carbohidrato. El furfural se combina con alfa-naftol para formar un compuesto colorido
violeta/morado. Aunque no es una prueba específica para carbohidratos, un resultado negativo (ausencia de
color) sugiere la ausencia de estos compuestos.
1. A 10 gotas de cada solución de carbohidrato y del problema, añadir una gota de reactivo de Molisch; agitar
muy bien.
2. Haga un tubo control negativo: 10 gotas de agua destilada + 1 gota de reactivo de Molisch; agitar muy bien.
3. Incubar los tubos en baño María hirviendo por 5 min.
4. Añadir, muy cuidadosamente por las paredes, gota a gota y sin agitar para que se formen dos capas, ácido
sulfúrico concentrado (aprox. 15 gotas) hasta obtener un cambio de color en la interfase entre las dos
capas.
5. Anote sus resultados y tome fotografías.
B. Prueba de Benedict (azúcares reductores)

1. A la solución de Benedict (30 gotas), añada exactamente 5 gotas de cada una de las soluciones que van a
ser probadas.
2. Haga un tubo control negativo: 5 gotas de agua destilada +30 gotas de la solución de Benedict.
3. Sumerja los tubos en un baño de agua hirviente durante 10 min.
4. Luego, permita que se enfríen lentamente.
5. Observe color y si se formó un precipitado rojo ladrillo.
6. Un cambio en el color de una solución no indica un resultado positivo.
7. Deberá producirse un precipitado (o turbidez) de color naranja o rojo ladrillo.
C. Prueba de Barfoed (monosacáridos)

La prueba sirve para detectar monosacáridos en presencia de disacáridos. La reacción de Barfoed difiere de la
de Benedict en que la reducción ocurre en medio ácido.
IMPORTANTE: Los disacáridos también responderán a la prueba si la solución de azúcar es hervida durante el
tiempo suficiente para producir hidrólisis.
1. Añada a 5 gotas de cada una de las soluciones de carbohidratos y del problema, 5 gotas del reactivo de
Barfoed.
2. Haga un tubo control negativo: 5 gotas de agua destilada + 5 gotas del reactivo de Barfoed.
3. Agite los tubos y póngalos en baño de agua hirviendo por 10 min o hasta que haya cambio de color.
4. Añadir a cada tubo 10 gotas de reactivo de ácido fosfomolíbdico. Agitar.
5. Un color azul oscuro es indicativo de la presencia de monosacáridos.
D. Prueba de Seliwanoff (cetosas)

Esta prueba depende de la formación del 4-hidroximetil-furfural y de su reacción posterior con el resorcinol (1,3-
dihidroxi-benceno), de la que resulta un compuesto de color rojo cereza.
En general la prueba es específica para cetosas; sin embargo, grandes cantidades de glucosa u otros azúcares
pueden interferir produciendo compuestos de color similar.
1. A 10 gotas del reactivo de Seliwanoff añadir 3 gotas de las soluciones que se van a probar y del problema.
2. Haga un tubo control negativo: 3 gotas de agua destilada + 10 gotas del reactivo de Seliwanoff.
2. Calentar en baño de agua hirviendo hasta que haya cambio de color (aprox. 10 min).
3. Observar el color desarrollado.
Construir una tabla (encabezado anexo) con los resultados obtenidos con las diferentes soluciones (incluyendo
la solución problema) en las diferentes pruebas.
Solución a Pruebas realizadas

Imagen
probar Molisch Benedict Barfoed Seliwanoff
1. Señale qué carbohidrato se encuentra en cada una de las soluciones problema.
2. Explique detalladamente como llegó a esas conclusiones de acuerdo a cada uno de los resultados obtenidos
en las distintas pruebas.
3. Discutir, para cada una de las soluciones problema:

 ¿Contiene carbohidratos?
 Si la respuesta es afirmativa:
 ¿Se trata de un carbohidrato reductor?
 ¿Es un monosacárido?
 ¿Es una cetosa?
CUESTIONARIO
Para cada una de las soluciones de carbohidratos trabajadas, conteste las siguientes preguntas
1. ¿Es un carbohidrato?
2. Si la respuesta anterior es afirmativa,
a. ¿Se trata de un carbohidrato reductor? ¿Qué es un carbohidrato reductor?
b. ¿Es un monosacárido? ¿Qué es un monosacárido?
c. ¿Es una cetosa? ¿Qué es una cetosa?
d. ¿Qué es un oligosacárido? ¿Qué es un polisacárido?
PRÁCTICA NO. 5
PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA POR EL MÉTODO DE FOLIN-WU
OBJETIVOS
Llevar a cabo una prueba de tolerancia a la glucosa midiendo ésta con el método de Folin-Wu usando una
curva de calibración.
INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus (traducción: “una fuente de orina de miel”) se ha convertido en una epidemia mundial
que afecta físicamente a más de 400 millones de personas con un impacto económico en la asistencia sanitaria
en los miles de millones de dólares. A medida que la comprensión de la diabetes ha evolucionado durante los
últimos 25 a 50 años, las opciones para los criterios de diagnóstico también han cambiado. Los días de catar la
orina para determinar su dulzura ha dado paso a dispositivos portátiles de cabecera e instrumentos de
laboratorio que ejecutan cientos de pruebas por hora para diagnosticar y controlar la diabetes.
En algunas circunstancias, cuando una prueba de glucosa en ayunas da un resultado alto, por lo general el
médico procede a ordenar una prueba de tolerancia a la glucosa oral (PTGO). Hay varias versiones diferentes
de la PTGO. Todas implican ayuno durante un mínimo de 8 h, seguido de la ingestión de una cantidad fija de
glucosa y una o más pruebas de glucosa en sangre en momentos específicos (por lo general 1 y 2 h) después
de la ingestión. A veces, se usa una prueba de 75 g para adultos que se sospecha que tienen diabetes. Sin
embargo, las PTGO se utilizan con mayor frecuencia para diagnosticar la diabetes gestacional. A veces se
solicita una prueba de provocación de 50 g como prueba de detección para el seguimiento de un valor de ayuno
anormal. Si resulta anormal, la prueba de provocación de 50 g puede ser seguida de una PTGO más definitiva
con una carga de glucosa de 100 g.
Otras dos pruebas muy importantes que se utilizan para confirmar el control de la glucosa y garantizar una
buena función renal son la hemoglobina A1c (HbA1c) y la albúmina en orina (también conocida como
microalbúmina).
HbA1c es una subfracción específica de hemoglobina glicosilada formada por la unión de la glucosa al N-
terminal de la cadena beta de la hemoglobina (Hb). Se forma cuando la glucosa de la sangre entra en los
glóbulos rojos y se adhiere a la Hb. A medida que aumenta la concentración de glucosa en sangre, más glucosa
reacciona con la Hb. Dado que la mitad de los glóbulos rojos se destruyen y se reemplazan por nuevos cada
tres meses, el grado en que la glucosa ha alterado la Hb refleja el control de la glucosa durante los tres meses
anteriores, influenciado principalmente por los 30 días más recientes. La HbA1c se expresa como el porcentaje
de moléculas de Hb que tienen una molécula de glucosa unida. La HbA1c es adecuada para monitorear a largo
plazo el control de la glucosa en sangre en personas con diabetes. Se recomienda realizar la prueba 2-4 veces
al año. Otra ventaja es que su análisis no requiere ayuno ni ingesta de glucosa de provocación antes de la
prueba. HbA1c predice los riesgos de desarrollo y progresión de complicaciones como la nefropatía diabética y
la retinopatía en personas con diabetes.
La albúmina en orina (microalbúmina) es una prueba para detectar cantidades muy pequeñas de albúmina
que se escapan del riñón hacia la orina. El primer signo de albúmina en la orina es una señal de que la función
renal está comprometida. La detección temprana puede conducir a un tratamiento más agresivo para prevenir
daños continuos al riñón. Se recomienda medirla 1-2 veces por año.
Valores de referencia para adultos para la prueba de glucosa plasmática en ayunas (GPA), prueba de
tolerancia a la glucosa oral (PTGO) y hemoglobina glicosilada (HbA1c).
Diagnóstico GPA (mg/dL) PTGO (mg/dL; 2 h después de HbA1c (%)
tomar 75 g de glucosa)
Normal 70-99 <140 <5.7
Prediabetes 100-125 140-200 5.7-6.4
Diabetes ≥126 >200 en más de un análisis ≥6.5
Valores de referencia para las pruebas de tolerancia a la glucosa oral (PTGO)
para detección de diabetes gestacional.
Diagnóstico Tiempo de muestreo después de la Nivel de glucosa (mg/dL)
ingesta
Prueba inicial: ingesta oral de bebida con 50 g de glucosa.
Normal 1h <140
Prueba diagnóstica: ingesta oral de bebida con 100 g de glucosa.

Diabetes gestacional si dos o Ayunas 95
más valores muestrales son 1h 180
mayores que los de referencia. 2h 155
3h 140
ESPECTROFOTOMETRÍA DE BIOMOLÉCULAS. Tomado de: Boyer, R.F.: Modern Experimental Biochemistry,

1st Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, 1986, pp. 145-157.
Algunas de las primeras mediciones experimentales sobre las biomoléculas incluían un estudio de sus
interacciones con la luz. Las observaciones iniciales mostraron que cuando la luz incide sobre una solución,
ocurren por lo menos dos procesos distintos: la dispersión y la absorción de luz. Ambos fenómenos
constituyen ahora la base de algunas técnicas útiles para analizar y caracterizar biomoléculas.
En el caso de algunas biomoléculas, el proceso de absorción de luz es seguido por la emisión de luz de
una diferente longitud de onda. Este proceso, llamado fluorescencia, depende de la estructura molecular y de
factores ambientales y sirve como una valiosa herramienta para la caracterización y el análisis de moléculas y
procesos dinámicos biológicamente significativos.
Otra técnica que involucra las moléculas y la luz es la polarimetría. En este caso se estudia la
interacción de la luz polarizada en un plano con moléculas ópticamente activas.
A. Principios Básicos de la Espectrofotometría de Absorción
El espectro electromagnético está formado por un continuo de ondas con propiedades diferentes. Las
regiones de importancia primaria en bioquímica incluyen la luz ultravioleta (UV, 180-320 nm) y la luz visible
(320-800 nm). La luz en estas regiones del espectro tiene la energía suficiente para excitar los electrones de
valencia de las moléculas. La longitud de onda de la luz, definida por la ecuación (1) es la distancia entre las
crestas de ondas adyacentes.
 = c/v (1)
donde:  = longitud de onda

c = velocidad de la luz
v = frecuencia, número de ondas que pasan por cierto punto por unidad
de tiempo.
La luz también se comporta como si estuviera formada por partículas energéticas. La cantidad de
energía, E, asociada con estas partículas (o fotones), está dada por la ecuación
E = hv (2)
en la que: h = constante de Planck
Cuando un fotón de cierta energía interacciona con una molécula, puede ocurrir uno de dos procesos.
El fotón puede ser desviado (dispersado), o puede transferir su energía a la molécula, produciendo un estado
de excitación de la misma.
La dispersión de la luz es la base física de varios métodos experimentales empleados para caracterizar
macromoléculas. Antes del desarrollo de la electroforesis, las técnicas de dispersión de la luz eran utilizadas
para determinar las masas moleculares ("pesos" moleculares) de macromoléculas. Las técnicas de difracción
de rayos X, microscopía electrónica, dispersión de luz láser, y dispersión de neutrones dependen en alguna
medida del proceso de dispersión de la luz.
El otro proceso mencionado líneas arriba, la transferencia de la energía de un fotón a una molécula, es
la absorción. Para que un fotón sea absorbido, su energía debe ser igual a la diferencia de energía entre dos
niveles energéticos de la molécula.
Las moléculas poseen un conjunto de niveles cuantizados de energía. Aunque son posibles varios
estados, para los fines presentes consideraremos sólo dos estados electrónicos: un estado basal (B) y el
primer estado excitado (S1). Estos dos estados difieren en la distribución de los electrones de valencia.
Cuando los electrones son promovidos de un orbital en estado basal B a un orbital de mayor energía S1, se dice
que ocurre una transición electrónica. La energía asociada con la luz ultravioleta y la luz visible es suficiente
para promover a las moléculas de un estado electrónico a otro, esto es, desplazar electrones de un orbital a
otro.
En cada nivel energético electrónico existe un conjunto de niveles vibracionales. Estos representan
cambios en el estiramiento y doblamiento de los enlaces covalentes. Las transiciones entre estos niveles son la
base de la espectroscopía infrarroja.
La transición electrónica de una molécula de B a S 1, tiene una elevada probabilidad de ocurrir si la
energía del fotón se corresponde con la energía necesaria para promover un electrón del nivel energético E1 al
nivel energético E2:
E2 - E1 = hc/  (3)
Puede ocurrir una transición desde cualquier nivel vibracional en B a algún otro estado vibracional en
S1. Sin embargo, no todas las transiciones tienen la misma probabilidad. La probabilidad de absorción es
descrita por la mecánica cuántica.
Un espectro UV-visible se obtiene midiendo la luz absorbida por una muestra como función de la
longitud de onda. Como las moléculas de la muestra sólo pueden absorber "paquetes" discretos de energía
(longitudes de onda específicas) teóricamente el espectro debe estar formado por líneas discretas. Sin
embargo, los numerosos niveles vibracionales de cada nivel energético electrónico incrementa el número de
transiciones posibles. Esto da como resultado un espectro de picos amplios.
Un espectro de absorción puede ayudar en la identificación de una molécula, ya que la longitud de onda
de absorción depende de los grupos funcionales o del arreglo de los átomos en la molécula. A lo largo de un
espectro de absorción pueden encontrarse picos de absorción máxima o zonas de mínima absorción.
Un segundo parámetro evaluado en la espectroscopía de absorción es la eficiencia o grado de
absorción a determinadas longitudes de onda. Este parámetro es tradicionalmente llamado coeficiente de
extinción. Es definido por la ley de Beer-Lambert:
A = Ebc (4)
donde A = absorbancia = - log I/I0
I0 = intensidad de luz que incide en la muestra

I = intensidad de luz transmitida a través de la muestra
E = coeficiente de extinción del material absorbente
b = recorrido de la luz a través de la muestra (espesor de la celdilla)
c = concentración del material absorbente en la muestra
Como la absorbancia, A, deriva de un cociente (-log I/I0), no tiene unidades (es adimensional); por lo
tanto, las unidades de E dependen de las unidades de b y c. E es más convenientemente utilizado en forma de
coeficiente de extinción molar () definido como la absorbancia de una solución 1.0 M de la sustancia
absorbente pura en una celdilla de 1 cm bajo condiciones específicas de longitud de onda y disolvente.
B. Instrumentación para Medir la Absorción de Luz UV-Visible
El espectrofotómetro es utilizado para medir experimentalmente la absorbancia. Este instrumento

produce luz de una longitud de onda preseleccionada, la dirige a través de la muestra (usualmente disuelta en
un disolvente y colocada en una cubeta o celdilla) y mide la intensidad de la luz transmitida por la muestra. Sus
componentes principales son: una fuente de luz, un monocromador (que incluye diversos filtros, rejillas y
espejos), una cámara para la muestra, un detector y un registrador.
Fuente luminosa. Para mediciones de absorción en la región UV se usa una lámpara de hidrógeno a
alta presión o de deuterio. Estas lámparas producen radiación en el rango de 200 a 300 nm. La fuente de luz
para la región visible es la lámpara de tungsteno, con un rango de longitudes de onda de 320 a 800 nm. Los
instrumentos con ambos tipos de lámpara tienen mayor flexibilidad y pueden ser empleados para estudiar la
mayoría de las moléculas biológicamente significativas.
Monocromador. Las dos lámparas mencionadas producen emisiones continuas de todas las longitudes
de onda dentro de su rango. Por tanto, un espectrofotómetro debe poseer un sistema óptico para seleccionar
luz monocromática (luz de una longitud de onda específica). Los instrumentos modernos utilizan un prisma o,
más a menudo, rejillas de difracción para producir la longitud de onda deseada. Debe notarse que la luz emitida
por el monocromador no es completamente de una sola longitud de onda, sino que es realzada en dicha
longitud de onda. Esto es, la mayor parte de la luz es de una sola longitud de onda, pero están presentes
longitudes de onda más cortas y más largas.
Antes de que la luz monocromática incida sobre la muestra, pasa a través de una serie de hendiduras,
lentes, filtros y espejos. Este sistema óptico concentra la luz, aumenta la pureza espectral y la enfoca hacia la
muestra. El operador de un espectrofotómetro tiene poco control sobre la manipulación óptica del haz luminoso,
excepto en el ajuste de la anchura de la rejilla. La luz que pasa del monocromador a la muestra encuentra una
"ventana" o hendidura. En algunos instrumentos ésta está ajustada para que pase un haz de luz de cierta
anchura. Los instrumentos más costosos tienen hendiduras variables, lo que permite al operador controlar su
anchura. La anchura de la rejilla determina la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y su pureza
espectral. Al disminuir la anchura de la hendidura, aumenta la pureza espectral de la luz, pero disminuye la
cantidad de luz dirigida hacia la muestra. En este caso, el factor limitante es la eficiencia o sensibilidad del
detector. Establecer la anchura apropiada de la hendidura requiere un equilibrio entre la pureza espectral y la
sensibilidad del detector.
Cámara de la muestra. La luz monocromática procesada es entonces dirigida hacia una cámara de
muestra, que puede acomodar una amplia variedad de porta muestras. La mayoría de las mediciones UV-
visible se hacen en soluciones de las moléculas de interés. La muestra es colocada en un tubo o cubeta de
vidrio, cuarzo, u otro material transparente. Las cubetas de vidrio son las menos costosas, pero, como absorben
luz UV, pueden ser usadas sólo a longitudes de onda superiores a 320 nm. El cuarzo o sílice fundido debe ser
empleado en el rango UV (200-320 nm). La calidad y condiciones de las cubetas son factores críticos en la
espectrofotometría. Las cubetas de alta calidad son muy costosas y deben ser objeto de un mantenimiento
cuidadoso.
Los espectrofotómetros más baratos son instrumentos de "un solo haz" que permiten la inserción de
una sola cubeta a la vez en el porta cubetas. Este es el caso del Coleman Modelo 6/35, del Bausch & Lomb
Modelo 20 o del Seqoia-Turner Modelo 340. Los instrumentos más sofisticados son de "doble haz" y aceptan
dos cubetas a la vez: una que contiene la muestra disuelta en el disolvente y otra que contiene disolvente puro.
Con frecuencia los espectrofotómetros son usados para monitorear velocidades de reacciones
químicas. Cuando se efectúan estas mediciones, la cubeta que contiene la muestra debe tener una temperatura
constante. Muchas cámaras de muestra permiten la circulación de un líquido cuya temperatura es constante
alrededor del porta cubetas.
Detector. La intensidad de la luz que pasa a través de la muestra en estudio depende de la cantidad de
luz que es absorbida por la misma. La intensidad es medida por un detector fotosensible, generalmente un tubo
foto multiplicador (TFM). El TFM detecta una pequeña cantidad de energía luminosa, la amplifica mediante una
cascada de electrones acelerados por dínodos, y la convierte en una señal eléctrica que puede ser transferida
al registrador.
Registrador. Los instrumentos menos costosos dan una lectura directa de absorbancia y/o
transmitancia en forma análoga o digital. Estos instrumentos son apropiados para mediciones a una sola
longitud de onda; sin embargo, si se desea un "barrido" de absorbancia vs longitud de onda, entonces debe
utilizarse un registrador. Algunos espectrofotómetros están equipados con un registrador de pluma. El rango de
absorbancia de la mayoría de los registradores es de 0 a 1, pero los instrumentos más costosos pueden ser
utilizados a niveles superiores de absorbancia (1-2) o niveles inferiores, de mayor sensibilidad (0-0.1, 0-0.01,
etc.).
C. Aplicaciones de la Espectrofotometría de Absorción
Ahora que estamos familiarizados con la teoría y la instrumentación de la espectrofotometría de
absorción, podremos comprender más fácilmente el funcionamiento y las aplicaciones típicas de un
espectrofotómetro. Como virtualmente todas las mediciones UV-visible se hacen en muestras disueltas (en
disolventes adecuados), sólo se mencionarán estas aplicaciones. Aunque pueden hacerse muchos tipos
diferentes de operaciones con un espectrofotómetro, todas las aplicaciones caen en una de dos categorías: a)
medición de la absorbancia a una longitud de onda fija; y b) medición de la absorbancia en función de la
longitud de onda.
Para las mediciones de absorbancia a una longitud de onda fija con un instrumento de "un haz", se
coloca una cubeta que contiene el disolvente puro y se ajusta la absorbancia a "cero". Una cubeta que
contenga disolvente más muestra se coloca entonces en la cámara, y su absorbancia es leída directamente del
registrador. El ajuste a cero con el disolvente puro ("blanco") permite obtener la lectura directa de la
absorbancia de la muestra.
Un espectro de absorción de un compuesto puede obtenerse "barriendo" un rango de longitudes de
onda y graficando la absorbancia obtenida a cada longitud de onda. La mayoría de los espectrofotómetros de
"doble haz" recorren automáticamente el rango deseado de longitudes de onda y registran la absorbancia como
función de la longitud de onda. Si el disolvente es colocado en la cámara de referencia y el disolvente más la
muestra en la posición de la muestra, el aparato restará automáticamente la absorbancia del disolvente de la
absorbancia total (disolvente más muestra) a cada longitud de onda; de aquí que la gráfica del registrador sea
realmente un "espectro diferencial" (absorbancia de la muestra más disolvente menos absorbancia del
disolvente).
Ambos tipos de mediciones (longitud de onda fija y espectro de absorción) son comunes en Bioquímica,
y deberíamos ser capaces de interpretar los resultados de ambas.
Medición de la concentración de una solución. De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, la

absorbancia de un material en solución depende directamente de la concentración de dicha sustancia.
Comúnmente se usan dos métodos para medir la concentración. Si se conoce el coeficiente de extinción de la
especie absorbente, entonces la concentración puede calcularse tras la medición experimental de la
absorbancia de la solución. Sin embargo, esta aplicación tiene limitaciones. La mayoría de los
espectrofotómetros son útiles para medir absorbancias con un valor máximo de 1, aunque los aparatos más
sofisticados pueden medir absorbancias tan altas como 2. Asimismo, algunas substancias no obedecen la ley
de Lambert-Beer; esto es, la absorbancia no aumenta de manera lineal con la concentración. Esto puede ocurrir
con substancias que se asocian o disocian en solución. La linearidad es fácilmente verificada preparando una
serie de concentraciones de la especie absorbente y midiendo la absorbancia correspondiente a cada
concentración. Si la ley de Lambert-Beer es válida, la gráfica de absorbancia vs concentración debe ser lineal.
Si no se conoce el coeficiente de extinción de una sustancia, su concentración en solución puede ser
determinada si se conoce la absorbancia de una solución patrón (estándar) del compuesto. Alternativamente, la
concentración de una especie en solución puede ser determinada preparando una curva estándar (patrón o de
calibración) de absorbancia vs concentración.
Identificación de biomoléculas desconocidas. El espectro UV-visible de una biomolécula revela

mucho acerca de su estructura molecular. Por lo tanto, una de las primeras mediciones experimentales sobre
una biomolécula desconocida debe ser el análisis espectral. Las moléculas naturales a menudo contienen
grupos cromóforos (grupos químicos que dan el color) que tienen espectros característicos. El procedimiento
para obtener un espectro de absorción UV-visible comienza con la preparación de una solución de la especie
en estudio. Una solución estándar debe prepararse en un disolvente adecuado. Se transfiere una alícuota de la
solución a una cubeta, la cual es colocada en la posición de la muestra en la cámara del espectrofotómetro.
Otra cubeta con el disolvente puro es colocado en el porta cubetas de referencia. El espectro es recorrido en el
intervalo deseado de longitudes de onda y se calcula el coeficiente de extinción para cada longitud de onda en
la que la absorbancia es máxima.
Cuantificación de glucosa en sangre por la técnica de Folin-Wu

Para la cuantificación de glucosa en sangre, uno de los métodos más usados es el de Folin-Wu. En esta
técnica primero se obtiene una solución problema libre de proteínas, de concentración desconocida de glucosa,
a partir de cada muestra de sangre. Luego se construye una curva patrón (también llamada “curva de
calibración”) al hacer reaccionar valores conocidos de concentración de glucosa con los reactivos del método,
para luego leer su absorbancia a 540 nm.
El fundamento químico de la reacción es que en un medio alcalino la glucosa reduce al ión cobre II (cúprico),
para formar óxido cuproso insoluble el cual, a su vez, puede reducir al fosfomolibdato formándose un ión
colorido. La intensidad del color depende de la cantidad de glucosa presente; las absorbancias de dichas
soluciones pueden determinarse espectrofotométricamente. La curva de calibración se construye al graficar las
absorbancias medidas contra las concentraciones conocidas de glucosa. Ahora bien, si se tiene una solución
problema de glucosa se le puede someter al mismo procedimiento que a las soluciones de concentración
conocida. Posteriormente, la absorbancia de la solución problema puede interpolarse en la curva patrón para
determinar su concentración. También se puede usar dicha absorbancia para determinar la concentración de
glucosa correspondiente mediante el cálculo de la recta de mejor ajuste por el método de mínimos cuadrados.
Glucosa (monosacárido reductor)

+
Reactivo de cobre (Cu2+)
Incubación e-
Ebullición
Óxido cuproso (Cu2O, rojo ladrillo)

+
Fosfomolibdato
+
Agua destilada
Compuesto colorido en proporción a la concentración

de glucosa (medible espectrofotométricamente a 540 nm)
MATERIAL REACTIVOS
7 Tubos de Folin-Wu de 25 mL con afore a Solución patrón de glucosa (500 µg /mL).

12.5 mL. Reactivo de cobre estabilizado en medio alcalino.
1 Gradilla para tubos de ensaye Reactivo de fosfomolibdato.
1 Pinzas para tubo de ensaye Solución de glucosa de concentración
1 Baño María en ebullición desconocida (problema libre de proteína).
1 Pipeta de 1 mL
1 Pipeta de 10 mL
1 Celdilla de plástico, de 3.5 mL.
1 Espectrofotómetro a 540 nm
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de solución problema libre de proteína: A 1 mL de muestra de sangre añada 8 mL de agua

destilada, 0.5 mL de ácido sulfúrico 0.67 N y 0.5 mL de tungstato de sodio al 10% (p/v) en un tubo de
centrífuga con tapa. Mezcle perfectamente por inversión y centrifugue a 3000 rpm por 10 min. Colecte el
sobrenadante y úselo como solución de glucosa de concentración desconocida (problema) en el análisis.
2. Disponga 7 tubos de Folin-Wu de la manera siguiente:
1 7
TUBO 2 3 4 5 6
Blanco Problema
Patrón de
0 125 250 500 750 1000 0
glucosa (L)
Agua destilada
1000 875 750 500 250 0 0
(L)
Reactivo de
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
cobre (mL)
Sol. problema
--- --- --- --- --- --- 1.0
(mL)
3. Agitar los reactivos e incubar durante 20 minutos a ebullición. Luego permita que los tubos se enfríen.
Reactivo de
fosfomolibdato 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(mL)
Agua destilada
9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5
(mL)
Concentración
de glucosa en 0 ¿?
sangre No se 62.5 125 250 375 500 No se
(mg/dL). grafica. grafica.
(Xexp)
Absorbancia a
No se
540 nm.
grafica.
(Yexp).
4. Agite bien los tubos por inversión.

5. Calibre el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 540 nm usando el tubo blanco (tubo # 1).
6. Enseguida proceda a determinar la absorbancia a 540 nm de cada uno de los tubos que contienen
concentraciones conocidas de glucosa (estándares, tubos # 2 al 6).
7. Finalmente determine la absorbancia a 540 nm del tubo problema (tubo # 7).
8. Tabule las concentraciones de glucosa (mg/dL) de los tubos # 2 al 6 contra sus respectivas absorbancias.
1. Con base a la tabla de resultados, elabore la curva patrón: gráfica de absorbencia vs concentración de
glucosa (miligramos/mL), ya sea en papel milimétrico o grafíquela en la computadora (Microsoft Excel).
2. Determine la concentración de glucosa (mg/mL) de la solución problema interpolando gráficamente la curva

patrón.
3. Compare los niveles encontrados de glucosa en la muestra (sangre) problema con los rangos de referencia
mostrados en la Introducción. ¿Son valores normales? ¿Son demasiado bajos o demasiado altos respecto a
los valores de referencia? ¿Cuál sería el diagnóstico de acuerdo a la comparación realizada? Discuta en
detalle sus aseveraciones.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es una curva patrón y qué utilidad tiene?

2. ¿Cómo se interpola o calcula un valor en una curva patrón?
3. ¿Cuál es el efecto de la glucosa sobre el reactivo de cobre?
4. Mencione la importancia biológica de la glucosa
5. Explique la importancia del monitoreo de los valores de glucosa en la Diabetes Mellitus
PRÁCTICA NO. 6
PROPIEDADES QUÍMICAS DE LÍPIDOS
OBJETIVOS
1. Realizar pruebas generales para identificar algunas propiedades de los lípidos.
INTRODUCCIÓN
Los lípidos son moléculas orgánicas que se caracterizan generalmente por ser insolubles en agua y
muy solubles en solventes orgánicos. Esta propiedad física refleja la naturaleza hidrofóbica de su estructura
hidrocarbonada.
Los ácidos grasos forman parte importante de ciertos lípidos presentes en la naturaleza y en el
organismo. En su cadena alifática (cadena R) pueden tener de 4 a 36 átomos de carbono; sin embargo, los más
comunes son de 12 a 24 carbonos. Se dividen en ácidos grasos saturados e insaturados.
Los ácidos grasos saturados tienen enlaces simples entre los átomos de carbono, es decir no poseen
dobles ligaduras. La mayoría son sólidos a temperatura ambiente. Las grasas de origen animal son
generalmente ricas en ácidos grasos saturados.
Los insaturados presentan por lo menos un doble enlace, es decir una insaturación en su molécula, y se
clasifican en monoinsaturados y poliinsaturados, según el número de enlaces dobles. Los dobles enlaces
pueden halogenarse, o sea, se les adicionan halógenos como el yodo, el bromo, y de esta forma, se satura la
cadena. Así, de acuerdo con la cantidad de halógeno consumido, se conoce el grado de insaturación de una
molécula de ácido graso.
Los aceites, grasas y ceras, animales y vegetales, son ésteres de ácidos orgánicos, pertenecientes a
las distintas series de ácidos grasos, denominados así por su presencia en las grasas. Los aceites y grasas
vegetales están localizados preferentemente en las semillas y en la carne de ciertos frutos (palmera y olivo),
pero también se encuentran en las raíces, ramas, troncos y hojas de las plantas. En algunas semillas, por
ejemplo en las de la mayor parte de cereales, la grasa se halla casi exclusivamente en el germen.
En esta práctica se van a realizar una serie de pruebas cualitativas para poner de manifiesto algunas
propiedades de los lípidos como son: solubilidad, detección de peróxidos, saponificación y la identificación de
insaturaciones en el lípido.
MATERIAL REACTIVOS
15 Tubos de ensayo de 18 x 150 mm Lípidos: ácido oleico, ácido esteárico, aceite de
2 pipetas de 1 mL girasol, aceite de maíz, manteca de cerdo,
4 pipetas de 5 mL aceite de linaza, mantequilla y manteca vegetal
1 Baño María para cocinar.
1 Gradilla para tubos de ensayo Agua destilada
2 Propipetas Etanol
1 Marcador Éter etílico
3 Pipetas Pasteur Tetracloruro de carbono o hexano
2 Espátulas Mezcla de ácido acético y cloroformo (1:1, v/v).
KI al 5 % (p/v)-
NaOH al 20% (p/v).
Cloroformo
Reactivo de Hübl: Se disuelven dos soluciones:
1.3 g de I2 en 25 mL de alcohol etílico al 95% y
1.5 g de HgCl2 en 25 mL de alcohol al 95%,
proteger de la luz).
PROCEDIMIENTO
A. Pruebas de Solubilidad
1. Enumere cuatro tubos de ensayo y prepárelos de la siguiente forma:
Tubo # 1 2 3 4
Aceite vegetal 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Agua 2 mL
Etanol 2 mL
Hexano 2 mL
Éter etílico 2 mL
2. Observe el grado de solubilidad y anote los resultados (tome fotografías),
B. Detección de Peróxidos
1. Preparar la siguiente serie de tubos como se indica en la tabla:
Número de tubo 1 2 3 4
Aceite vegetal Aceite vegetal Grasa animal Grasa animal
Lípido (1 ml)
nuevo rancio nueva quemada
Mezcla de ácido
acético | 2ml 2ml 2ml 2ml
cloroformo
2. Agitar fuerte y agregar 2 gotas de KI a cada uno de los tubos, agitar nuevamente.
3. Esperar 10 minutos. Observar cambios y compararlos entre los diferentes tubos.
C. Saponificación
1. Coloque por separado 0.5 mL de aceite vegetal y 0.5 mL de manteca de cerdo en vasos de precipitados de
50 mL.
2. Agregue 3 mL de NaOH al 20%.
3. Agite para formar una emulsión. Lleve los vasos a la campana de extracción de humos.
4. Calentar en Baño María durante 15 minutos.
5. Dejar reposar el tubo y observar cambios.
6. Repetir los mismos pasos, pero en lugar de emplear aceite vegetal utilizar la grasa animal.
1. Reporte todos los cambios observados en las pruebas químicas realizadas, usando una tabla por prueba.
2. Explique y discuta el grado de solubilidad de los lípidos probados en los disolventes probados.
3. Explique y discuta los cambios observados en la prueba de detección de peróxidos.
4. Explique y discuta los cambios observados en la prueba de saponificación.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la finalidad de la prueba de detección de peróxidos?

2. Explica con reacciones químicas en qué consiste la saponificación.
3. ¿Por qué algunos lípidos son insaponificables?
4. ¿Qué se conoce como ácidos grasos esenciales y cuáles son?
5. ¿Cuáles son las funciones de los lípidos en nuestro organismo?
PRÁCTICA No. 7
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
OBJETIVO (S)
 Comprender las características de los aminoácidos que permiten su análisis por técnicas
cromatográficas.
 Conocer y aplicar un método cromatográfico para separar e identificar aminoácidos.
INTRODUCCIÓN
En 1903 el botánico ruso Mikhail Tswett elaboró la primera técnica para separar distintos componentes
coloreados de un extracto vegetal. A esta técnica se le ha dado el nombre de cromatografía debido a que la
separación de las sustancias da diferentes colores.
Existen diferentes tipos de cromatografía. La cromatografía en papel y en capa fina son formas sencillas
que han llegado a ser un instrumento analítico extraordinariamente valioso para el químico orgánico y para el
bioquímico. En esta técnica se emplea papel filtro ó sílica gel (fase estacionaria), una gota de solución que
contiene la muestra y que se coloca en cierto punto sobre el papel o la sílica de donde hay una migración como
resultado de flujo por un disolvente (fase móvil). El movimiento de la fase móvil es causado por fuerzas
capilares. La gravedad también contribuye al movimiento.
Puede decirse que la cromatografía en papel y la de capa fina son tipos de cromatografía por partición
en el que la fase estacionaria es agua adsorbida sobre la superficie hidrofílica del papel o el gel de sílice. Un
disolvente orgánico actúa como fase móvil. Por tratamiento apropiado del papel o de la sílica, el agua puede ser
sustituida por una fase líquida estacionaria no polar; pueden usarse soluciones acuosas como reveladores. En
otra variación, el papel es impregnado con sílice anhidra o una resina de intercambio de iones.
La trayectoria de una muestra se puede describir en función de su factor de retardo o relación de frentes
que se define como:
Rf = Distancia del movimiento del soluto

Distancia del movimiento del solvente
Para compensar las variables no controladas, la distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente
con la de una sustancia estándar en idénticas condiciones.
La cromatografía presta valiosa ayuda en el análisis de sustancias complejas como aminoácidos,

proteínas, carbohidratos, ácidos grasos, compuestos fenólicos, fármacos, etc.
Los aminoácidos son compuestos sólidos; incoloros; cristalizables; de elevado punto de fusión (habitualmente
por encima de los 200 ºC); solubles en agua; con actividad óptica y con un comportamiento anfótero.
La estructura general de los 20 aminoácidos hallados regularmente en las proteínas, tienen como
denominadores comunes:
 el grupo carboxilo
 un grupo amino unido al carbono alfa
 un átomo de hidrógeno unido al carbono alfa
 una cadena lateral R, que es característica de cada aminoácido
Se han propuesto varios métodos para clasificar los aminoácidos sobre la base de sus grupos R. El más
significativo se funda en la polaridad de los grupos R. Existen cuatro clases principales:
Aminoácidos con grupos R no polares o hidrofóbicos.

Existen 8 aminoácidos que contienen grupos R no polares o hidrofóbicos. Aquí se encuentran la alanina, la
leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina. Estos aminoácidos son
menos solubles en el agua que los aminoácidos con grupos R polares. El menos hidrófobo de esta clase de
aminoácidos es la alanina, la cual se halla casi en la línea fronteriza entre los aminoácidos no polares y los que
poseen grupos R polares.
Aminoácidos con grupos R polares sin carga.

Estos aminoácidos son relativamente más solubles en el agua que los aminoácidos anteriores. Sus grupos R
contienen grupos funcionales polares, neutros que pueden establecer enlaces de hidrógeno con el agua. La
polaridad de la serina, la treonina y la tirosina se debe a sus grupos hidroxilos; la de la asparagina y la
glutamina, a sus grupos amídicos y de la cistina a la presencia del grupo sulfhidrilo (-SH). La glicina, a veces se
clasifica como un aminoácido no polar. La cistina y la tirosina poseen las funciones más polares de esta clase
de aminoácidos, sus grupos tiol e hidroxilo fenólico tienden a perder mucho más fácilmente protones por
ionización que los grupos R de otros aminoácidos de esta clase.
Aminoácidos con grupos R cargados positivamente.

Los aminoácidos en los que los grupos R poseen carga positiva neta a pH 7, poseen todos seis átomos de
carbono. Aquí se encuentran la lisina, la arginina y la histidina. Esta última tiene propiedades límite. A pH 6 más
del 50 % de las moléculas de la histidina, poseen un grupo R cargado positivamente, pero a pH 7 menos del 10
% de las moléculas poseen carga positiva.
Aminoácidos con grupos R cargados negativamente(a pH 6-7, que es la zona del pH intracelular).
Los dos miembros de esta clase son los ácidos aspártico y glutámico, cada uno de los cuales posee un
segundo grupo carboxilo que se halla completamente ionizado y por tanto cargado negativamente a pH 6 y 7.
MATERIAL REACTIVOS
Frasco con tapa de rosca Ácido aspártico (1 mM).
Pipeta Pasteur. Leucina (1 mM).
Atomizador. Mezcla problema de aminoácidos
Parrilla eléctrica. Fase móvil: mezcla de butanol: ácido acético:
Placas de sílica gel G60 de 10 cm × 20 cm agua (4:1:1, v/v/v)
de un grosor aproximado de 0.25 mm. Solución reveladora de ninhidrina al 0.05% (p/v)
(recientemente preparada en acetona).
PROCEDIMIENTO
1. En un extremo del papel filtro en tira haga dos pequeñas marcas con lápiz, a un centímetro de distancia
del borde y separadas entre sí por una distancia de un centímetro.
2. Deposite una gota del aminoácido #1 (ácido aspártico) sobre una de las marcas antes señaladas,
3. Repita la operación con una gota del aminoácido #2 (leucina), aplicándola sobre la segunda marca.
4. En otra tira de papel repita lo mismo, colocando una gota de la mezcla de aminoácidos. Introduzca las
tiras de papel (erectas) en un frasco con tapa de rosca que contenga la mezcla butanol-acético-agua
(4:1:1). Cierre el frasco.
5. Deje avanzar el frente del solvente aproximadamente hasta 1 cm antes de llegar al borde superior.
Saque el papel y señale con lápiz el lugar hasta donde llegó el solvente.
6. Una vez seco el papel, rocíe con solución de ninhidrina al 0.05%, dejándolo secar nuevamente.
7. Caliente las hojas de papel en la parrilla (tenga cuidado de no quemarlas), hasta que aparezcan man-
chas coloreadas. Ellas representan el sitio en que se encuentran los aminoácidos que reaccionaron con
la ninhidrina.
1. Medir la distancia desde el punto de colocación de la solución de los aminoácidos al centro de las manchas
(d).
2. Medir la distancia del sitio de colocación de los aminoácidos al sitio donde llegó el solvente (D).
3. Calcular el Rf para cada aminoácido, de acuerdo a la siguiente fórmula:
Rf = d/D
4. El Rf se calculará para cada uno de los aminoácidos individuales y para las mezclas problemas.
5. Identificar cada aminoácido de la mezcla problema en base a los Rf calculados y al color desarrollado por la
ninhidrina.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál de los aminoácidos corrió más y por qué? ¿Cuál corrió menos y por qué? ¿Cuál tuvo una movilidad
intermedia y por qué?
2. ¿Qué utilidad tiene la cromatografía en su área profesional?
3.- Describa detalladamente los principios químicos de la cromatografía en capa fina.
PRÁCTICA No. 8
PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS
OBJETIVOS
1. Demostrar algunas propiedades de las proteínas por medio de algunas pruebas cualitativas.
2. Verificar el comportamiento de las proteínas en reacciones de precipitación y desnaturalización.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en el interior de las células, pues
constituyen el 50% o más de su peso seco. Son fundamentales en todos los aspectos de la estructura celular y
de su función puesto que constituyen los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa la
información genética. Las proteínas contienen carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno y casi todas también
azufre; hay proteínas que contienen elementos adicionales tales como fósforo, hierro, zinc y cobre. Su peso
molecular es desde 10,000 hasta más de 1 millón de daltones (unidades de masa atómica); el límite superior
del peso molecular de las proteínas sólo puede ser establecido arbitrariamente ya que depende de la definición
de los términos proteína y molécula, como veremos adelante. Las proteínas por hidrólisis dan aminoácidos.
Las proteínas dan reacciones de color con algunos reactivos. Estos colores no son específicos de las
proteínas, sino de algunos de los aminoácidos que las constituyen. Las proteínas forman precipitados con sales
de metales pesados, así como con algunos ácidos inorgánicos y con algunos colorantes; lo anterior se debe en
parte a la formación de complejos y en parte a las propiedades coloidales de las mismas.
Las proteínas son sustancias anfotéricas, combinándose tanto con ácidos como con bases, dando
como resultado sales ionizables. Generalmente son insolubles en su punto isoeléctrico y algunas son
coagulables por el calor, ácidos inorgánicos y alcohol etílico.
Las reacciones para la identificación de las proteínas se dividen en dos grandes grupos:
1. Reacciones de coloración
2. Reacciones de precipitación
1. Reacciones de Coloración
a) Reacción de Millon: Esta reacción emplea el reactivo del mismo nombre, que es una solución de nitrato
mercúrico y mercuroso. Este reactivo nos da un precipitado color blanco que por la acción del calor toma un
color rosado. Es positiva para todas aquellas proteínas o péptidos que contengan tirosina y fenoles.
b) Reacción Xantoproteica: Esta prueba consiste en tratar la proteína con ácido nítrico concentrado y calentar.
El precipitado toma un color amarillo que por la acción del amoníaco pasa a color naranja; esta reacción es
positiva para todos aquellas proteínas que contienen en su molécula núcleos aromáticos.
c) Reacción de Biuret: Se trata la proteína con solución concentrada de sosa para alcalinizar fuertemente;
luego se agregan unas dos o tres gotas de solución diluida de sulfato de cobre; el líquido toma una coloración
violeta. Esta reacción es positiva para los péptidos o proteínas que contienen los siguientes grupos: -CO-NH2;
CH2-NH2-; -C(NH)NH2.
d) Reacción de Ninhidrina: Este es un revelador de aminoácidos. Las soluciones con aminoácidos presentan
coloración morada al agregar ninhidrina y calentar. Reacción específica para el grupo amino que debe ser alfa
respecto al grupo carboxilo.
2. Reacción de Precipitación
a) Desnaturalización: Muchas moléculas proteicas sólo retienen su actividad biológica dentro de una
fluctuación muy limitada de temperatura y de pH. La exposición de proteínas solubles o globulares a pH
extremos, o a temperaturas elevadas, les hace experimentar un cambio conocido como desnaturalización. La
consecuencia más significativa de la desnaturalización es que las proteínas pierden su actividad biológica
característica. Algunos agentes desnaturalizantes son la temperatura, los ácidos y bases fuertes, el etanol y
iones de metales pesados.
MATERIAL REACTIVOS
1 Gradilla Reactivo de Millon

18 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm Ácido nítrico concentrado
2 Pipetas de 10 mL Hidróxido de sodio 0.1 M
3 Pipetas de 5 mL Hidróxido de sodio 1 M
2 Pipetas Pasteur con bulbo Hidróxido de amonio concentrado
1 Perilla Sulfato de cobre saturado (Fehling A)
1 Recipiente para baño María Solución de ninhidrina 0.1% (recién preparada)
1 Vaso de precipitados de 250 mL Ácido clorhídrico concentrado
1 Parrilla Solución de acetato de plomo al 1% (p/v)
Latas para calentar tubos a baño María Ácido clorhídrico 0.1 N
Alcohol etílico absoluto
Solución de gelatina al 2%
Solución diluida de albúmina de huevo
Agua destilada
Ácido tricloroacético al 20% (p/v)
Sulfato de amonio en cristales
Fenol al 20% (p/v)
PROCEDIMIENTO
A. Pruebas de Coloración
1) Prueba con Reactivo de Millon: Coloque en tres tubos de ensaye las siguientes soluciones:
Tubo 1 Solución de albúmina (1 mL)

Tubo 2 Solución de gelatina (1 mL)
Tubo 3 Agua destilada (control) (1 mL)
Después adicione 5 gotas del reactivo de Millon a cada uno de los tubos. Caliente la mezcla en baño
térmico. Observar y anotar cualquier cambio observado. La reacción es positiva con la aparición de un
precipitado blanco que por acción del calor toma un color rosado.
2) Reacción Xantoproteica: Coloque en tres tubos de ensaye las siguientes soluciones:

Es necesario calentar los tres tubos a baño María por 3 min; luego se agrega a cada uno 0.3 mL ( 4 gotas)
de ácido nítrico concentrado (dejándolo resbalar por las paredes del tubo con cuidado). Enfríe los tubos y
agregue cuidadosamente gota a gota la solución de hidróxido de amonio concentrado (10 gotas) observar y
anotar cualquier cambio observado.
La reacción positiva consiste en la formación de un precipitado amarillo que por acción del amoníaco pasa a
color anaranjado.
3) Reacción de Biuret: Coloque en tres tubos de ensaye las siguientes soluciones:

Agregar a cada tubo 0.3 mL de hidróxido de sodio 1 M; mezclar y adicionar gota a gota solución de sulfato
de cobre.(1:1) Observe y anote cualquier cambio observado. La reacción positiva es la formación de una
coloración violeta.
4) Prueba de la Ninhidrina: Coloque en tres tubos las siguientes soluciones:

Agregar a cada tubo 0.3 mL de solución de ninhidrina y calentar en baño María hirviente. Anote cualquier
cambio observado. La reacción positiva es la formación de una coloración violeta.
2. Prueba de Precipitación, Coagulación y Desnaturalización
Prepare tres tubos de ensaye de acuerdo a las siguientes indicaciones:
SUSTANCIA A ADICIONAR TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3

Solución de albúmina 3 mL 3 mL 3 mL
Agua destilada. --- --- 1 mL
HCl 0.1 M 1 mL --- ---
NaOH 0.1 M --- 1 mL ---
¿En qué tubo aparece precipitado? A los tubos 1 y 2 adicione 2 mL de solución de acetato de plomo. Anote
los resultados observados. Después coloque los 6 tubos en baño María hirviente durante 15 min y, después
de este lapso de tiempo, enfríe a temperatura ambiente. ¿En qué tubo aparece precipitado?
1. Describa con dibujos, figuras, diagramas, fotografías y texto todo lo observado en la práctica.
2. Consulte y escriba todas las reacciones de todas las pruebas efectuadas en la práctica. En base a estas
reacciones, explique en detalle lo observado en la práctica.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué se entiende por desnaturalización y cómo influye en las propiedades funcionales de las proteínas?
2. ¿Qué diferencia hay entre coagulación y desnaturalización?
3. ¿Qué factores influyen en la coagulación y cuáles en la desnaturalización?
4. ¿Qué efectos tienen el yodoacetato, el mercurio, el ácido tricloroacético y el fenol sobre las proteínas?
5. Explique qué es la renaturalización y dé un ejemplo de proteína que la lleve a cabo.

PRÁCTICA NO. 9
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR LA TÉCNICA DE BIURET
OBJETIVOS
 Determinar fotocolorimetricamente la concentración de proteína de una solución problema, usando una

curva estándar.
INTRODUCCIÓN
Las cadenas polipeptídicas de las proteínas y sus péptidos, a diferencia de otros compuestos
nitrogenados, en solución alcalina con iones cobre (Cu 2+) forman un complejo químico de color violeta, con
absorbancia máxima a 540 nm.
La determinación de los niveles de proteínas y albúmina en el suero, es útil en el diagnóstico de

enfermedades del hígado, riñón y médula ósea, así como de otros trastornos metabólicos y nutricionales.
Puede haber pérdida de albúmina en el tracto gastrointestinal, en la orina por daño en el riñón o en forma
directa a través de la piel. Las causas de incremento en la concentración de albúmina son la deshidratación y la
alta ingesta de dietas altas en aminoácidos o proteínas.
Fundamento de la determinación de proteína por el método de Biuret. Cuando un compuesto que

contiene dos o más grupos carbamino, unidos directamente o separados por un solo átomo de C o N, es
colocado en una solución alcalina con sales de cobre, se forma un complejo de color violeta. Esta reacción
constituye la base del método cuantitativo de Biuret para determinación de proteína. Esta determinación debe
hacerse en ausencia del ión NH4+, el cual produce un color que causa interferencia. El método de Biuret es la
única técnica que es verdaderamente específica para proteínas, aunque tiene las desventajas de que es poco
sensible, sólo puede cuantificar proteína en solución y no sirve para cuantificar la proteína total en una muestra
sólida.
Otras técnicas de cuantificación de proteína. Otras técnicas espectrofotométricas muy sensibles y

usadas en Bioquímica para la cuantificación de proteína en solución son el método de Lowry y la técnica de
Bradford. El método de Lowry se basa en la formación de un complejo violeta de los aminoácidos aromáticos
con el reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu. La técnica de Bradford se basa en la formación de un complejo azul
de las proteínas con el colorante azul brillante de Coomassie. Ambas técnicas sirven sólo para cuantificar
proteína en solución y no son específicas, lo que significa que compuestos que no son proteína pueden dar el
complejo colorido.
En vista de que las proteínas contienen nitrógeno, las técnicas de cuantificación de nitrógeno tales
como el método de Kjeldahl y el de Dumas también se usan para cuantificar proteínas. Sin embargo estas dos
últimas técnicas no son espectrofotométricas ni específicas para proteína, aunque también son muy sensibles,
muy utilizadas, y tienen la ventaja de poder cuantificar proteína en solución así como en muestras sólidas.
MATERIAL Y EQUIPOS REACTIVOS
10 Tubos de ensaye de 18 x 150 mm Solución patrón para proteínas totales según

1 Gradilla para tubos de ensaye Biuret: 10 mg de albúmina bovina sérica/mL
2 Pinzas para tubo de ensaye en NaCl 0.9% (p/v).
Ligas de hule látex Solución de NaCl al 0.9% (p/v)
2 Pipetas de 1 mL Reactivo de Biuret para proteínas totales.
2 Pipetas de 5 mL Tartrato de Na y K 18 mM; yodato de K 10
1 Celdilla de plástico para espectrofotómetro, mM; sulfato de cobre 12 mM; NaOH 200
de 1.5 o 3.5 mL mM.
1 Espectrofotómetro capaz de leer a 540 nm Solución problema
1 Baño María a 50 ºC Agua recién destilada o desionizada pH 7.0
PROCEDIMIENTO
1. Prepare 8 tubos de ensayo de la manera siguiente:
Tubo # 1 8
2 3 4 5 6 7
Blanco Problema
Problema
0 0 0 0 0 0 0 0.1
(suero, mL)
Solución
patrón de
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0
proteína
(mL)
NaCl 0.9%
3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 2.9
(mL)
Reactivo de
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Biuret (mL)
Conc. de
0
proteína ¿? No se
No se 2 4 6 8 10 12
total en grafica
grafica
suero (g/dL)
Absorbancia 0 No se No se
a 540 nm grafica grafica
2. Caliente los tubos en el baño María (50 ºC) durante 10 min.

3. Enfríe los tubos en agua corriente.
4. Calibre el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 540 nm usando el tubo blanco (tubo # 1).
5. Enseguida proceda a determinar la absorbancia a 540 nm de cada uno de los tubos que contienen
concentraciones conocidas de proteína (estándares, tubos # 2 al 7). Utilice la tabla de arriba para escribir
sus absorbancias.
6. Finalmente determine la absorbancia a 540 nm del tubo problema (tubo # 8). Utilice la tabla de arriba para
escribir la absorbancia.
7. Tabule las concentraciones de proteína total en suero (g/dL) de los tubos # 2 al 7 contra sus respectivas
absorbancias, de acuerdo al material didáctico que el profesor le proporcionará.
1. En base a las tablas de resultados, grafique la curva patrón (concentración de proteína vs. absorbancia), en
la computadora (Microsoft Excel).
2. Determine la concentración de proteína (g/dL) de la solución problema interpolando gráficamente la curva
patrón.
3. Mencione tres patologías en donde los niveles de proteínas totales en suero o plasma se vean afectados.
4. Explique por qué los valores de proteinas totales pueden disminuir o aumentar en suero o plasma.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de interacciones estabilizan la conformación de una proteína?

2. ¿Por qué las proteínas presentan uno o varios extremos carboxilo o amino?
3. Enlista seis funciones de las proteínas?
4. ¿Qué utilidad tiene el tener una curva patrón para el análisis de las proteínas?
PRÁCTICA No. 10
ACTIVIDAD DE LA ENZIMA CATALASA EN DIVERSOS TEJIDOS VEGETALES
OBJETIVOS
Observar cualitativamente la reacción enzimática de la catalasa, comparar la actividad enzimática en diversos

tejidos y observar el efecto de la temperatura sobre dicha actividad.
INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de las enzimas óxido-reductoras encontramos a la catalasa, la cual es una proteína
oligomérica compuesta por cuatro péptidos o subunidades, cada uno con un peso aproximado de 57,500
daltones; es clasificada dentro de las hemoproteínas y posee cuatro grupos hemo.
El sustrato sobre el cual actúa la catalasa es el peróxido de hidrógeno (H 2O2). Dicha enzima es hidrofílica y es
termolábil. Se encuentra abundantemente en tejidos vegetales y animales, pero especialmente en hojas de
tabaco y tejidos hepáticos y renales.
La catalasa se localiza en los peroxisomas, los cuales contienen una gran variedad de enzimas que participan
en las reacciones que degradan peróxidos, siendo la más importante la catalasa. Su importancia radica en su
poder reductor ya que destruye el H2O2 protegiendo a la célula, ya que éste es un producto secundario tóxico
de varias rutas metabólicas. La catalasa además participa en la síntesis de lignina junto con la enzima
peroxidasa. La reacción general de la catalasa es la siguiente:
2 H2O2  2 H2O + O2
MATERIAL REACTIVOS
6 Vasos de precipitados de 250 mL 1 Manzana

1 Cuchillo 1 Plátano
18 Tubos de ensaye de 15 mL 12 Semillas de maíz
Gradilla 1 Tubérculo (papa o camote)
1 Pipeta de 10 mL 1 Zanahoria
Varillas de vidrio 12 Semillas de frijol
Etiquetas o plumón 1 L de H2O2 al 3%
Martillo
Estufa
PROCEDIMIENTO
1. Pese 10 g de cada material vegetal y córtelo en trozos pequeños; y triture las semillas en un mortero o
molino.
2. Coloque 2 g de cada material en tubos de ensaye por triplicado (6 materiales x 3 tubos = 18 tubos). Etiquete
adecuadamente los tubos con plumón indeleble.
3. Coloque un juego de tubos (6 materiales) en el congelador por 30 min; otro juego de tubos debe de ser
hervido en baño María por 20 min; y el juego restante debe de permanecer a temperatura ambiente (aprox.
20-25 ºC).
4. Agregue 5 mL de H2O2 al 3% a cada tubo.

5. Observe y anote la cantidad de burbujeo en los diferentes tubos, indicando con cruces la mayor o menor
actividad enzimática de la catalasa.
1. Realice una tabla en la que se muestre los vegetales probados en las diferentes condiciones de temperatura
indicando con cruces la mayor o menor actividad enzimática de la catalasa (burbujeo).
6. ¿Qué relación tienen las enzimas que destruyen especies químicas y radicales libres de oxígeno con el
envejecimiento, el cáncer u otras enfermedades crónico-degenerativas?
CUESTIONARIO
1. Explique detalladamente en términos bioquímicos y moleculares el efecto de la temperatura sobre la

actividad de las enzimas. ¿Cómo se relaciona su explicación con lo observado en esta práctica de
laboratorio?
2. Describa otras dos enzimas que ayuden a la célula a deshacerse de especies químicas y radicales
libres de oxígeno tóxicos.
3. Explica que es la actividad antioxidante

4. ¿Cuales son los beneficios del consumo de alimentos con propiedades antioxidantes?
5. ¿Como se asocia la actividad antioxidante con los procesos cancerígenos?
PRÁCTICA NO. 11
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA
EN LÍQUIDOS BIOLÓGICOS
OBJETIVO (S)
Determinar cuantitativamente la actividad de amilasa en líquidos biológicos mediante el método

amiloclástico yodométrico.
INTRODUCCIÓN
La amilasa, producida en el páncreas exocrino y en las glándulas salivales, escinde los enlaces
alfa-14 glucosídicos de los polisacáridos (almidón y glucógeno). Se encuentra elevada en el
suero de pacientes con pancreatitis aguda, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30
horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre las 24 y 48
horas siguientes. También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima,
persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado los niveles
normales. También es posible encontrar valores aumentados en cualquier caso de “abdomen
agudo” o intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.
El fundamento de la práctica es el siguiente: el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la

muestra, produciéndose la hidrólisis enzimática. Ésta se detiene agregando reactivo de yodo, que
al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de
color respecto de un sustrato colorido sin muestra (sin amilasa) es la medida de la actividad
enzimática, que se expresa en Unidades Amilolíticas (Smith & Roe)/ 100 mL (UA/dL), comparables
con las Unidades Sacarogénicas (Somogyi)/100 mL.
MATERIAL REACTIVOS
Baño de agua a 37 °C Muestra de suero u orina reciente.

3 Tubos de ensayo (18 x 150 mm) por equipo Sustrato: Solución de almidón 500 mg/L,
2 Tubos de centrífuga (13 x 100 mm) por tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0.1 M en
equipo NaCl 0.15 M. Calentar la solución para poder
disolver el almidón. Centrifugar esta solución
(15 min a 5,000 RPM) antes de usar en el
análisis.
Micropipetas de volumen variable de 10-100 Reactivo de lugol ( I-KI) 1:5 disuelto en ácido
μL (amarilla) y de 100-1000 μL (azul) clorhídrico 0.02 M.
Espectrofotómetro a 640 nm
Pipetas serológicas (1 y 10 mL)
Cronómetro (teléfono celular)
PROCEDIMIENTO
1. Colocar una alícuota de 1 mL de la muestra de suero u orina en un tubo de centrífuga y

centrifugar durante 15 min a 5,000 RPM.
2. Colocar el suero u orina centrifugada en un tubo limpio y seco.
3. Marcar un tubo de ensaye como control (c) y un tubo como desconocido (d).
4. Agregar 1 mL de sustrato a cada tubo.
5. Atemperar los dos tubos por 5 min en baño de agua a 37 °C.
6. En este paso, el tiempo se comienza a contar con un cronómetro en el momento de agregar el
agua destilada al sustrato del tubo c. Agregue 0.02 mL (20 L) de agua destilada al tubo marcado
como c (control) sin sacarlo del baño; comience a contar el tiempo, agite el tubo suave pero
rápidamente para mezclar el agua con el sustrato, y deje el tubo incubando en el baño de agua
a 37 °C exactamente 7.5 min (es decir: 7 min 30 seg). Use un cronómetro para
medir el tiempo exacto. Deje transcurrir exactamente 30 seg y proceda al
siguiente paso.
7. Mientras transcurren los 30 seg prepárese para llevar a cabo este siguiente
paso. En este paso, el tiempo se comienza a contar con un cronómetro en el
momento de agregar el suero o la orina (enzima) al sustrato. Agregue 0.02 mL (20
L) del suero o la orina centrifugada al tubo marcado como d sin sacarlo del baño;
comience a contar el tiempo, agite el tubo suave pero rápidamente para mezclar el
suero u orina con el sustrato, y deje el tubo incubando en el baño de agua a 37 °C
exactamente 7.5 min (es decir: 7 min 30 seg). Use un cronómetro para medir el
tiempo exacto.
8. De esta manera, los dos tubos se incuban a 37 °C por 7.5 min exactamente,
separados por unperiodo de 30 seg.
9. Terminado el tiempo de incubación (7.5 min) para cada tubo, agregar 1 mL del
reactivo de yodo a cada uno y mezclar. Es decir: esto se hará primero para el tubo
c, y 30 seg después para el tubo d. La adición del yodo permite la formación del
complejo azul amilosa-yodo y al mismo tiempo detiene la reacción enzimática de
la amilasa sobre el almidón, debido al pH ácido del reactivo de yodo.
10. Agregar 8 mL de agua destilada a cada tubo.
11. Mezclar por inversión y leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 640 nm
ajustando a cero con agua destilada.
Nota: El color a medir deberá ser ligeramente azulado, ya que el almidón
está muy diluido. El color de la reacción es estable durante 1 hora. Si la
temperatura ambiente es superior a 25 °C, la lectura deberá efectuarse
dentro de los 20 min siguientes.
12. Cálculo de los Resultados
Definición de Unidad Amilolítica: Una unidad amilolítica (UA) es la cantidad

de enzima contenida en 100 mL (1 dL) de muestra, que puede hidrolizar 10
mg de almidón en 30 min, en las condiciones de la reacción. En esta técnica
se incuban 0.02 mL de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos en 1 mL
de sustrato durante 7 min y medio, lo que equivale a incubar 100 mL de
suero con 10,000 mg de almidón durante 30 min. Si todo el almidón fuera
hidrolizado, la actividad amilolítica de la muestra sería de 1000 UA/dL. Para
las unidades de actividad amilolítica, la fracción de almidón digerido se
multiplica por 1000.
13. Valores / Rangos de Referencia
Condición clínica Suero (UA/dL) Orina (UA/hora)

Normal <120 <260
Pancreatitis aguda 300 a 12,000 Más de 900
Pancreatitis crónica hasta 200 Más de 300
Parotiditis 200 a 350 350 a 750
Parotiditis c/complicación
pancreática más de 350 más de 750
Procesos abdominales agudos
(sin pancreatitis) normal normal

Indicaciones por el maestro
CUESTIONARIO
Proporcionado por el maestro
Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09

Manual Bioquímica I

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CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

PROFESOR: LAQB MARIA DEL ROSARIO LOMELI RODRIGUEZ

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

Al término de esta práctica, el alumno será capaz de:

a) Definir molaridad, molalidad, normalidad y porcentualidad.

Generalmente se llama disolvente al componente de una solución que se encuentra en mayor

Maneras de Expresar la Concentración

Por lo tanto, se puede establecer la fórmula siguiente:

MASA EN GRAMOS = MASA MOLECULAR x NÚMERO DE MOLES

NÚMERO DE MOLES = MASA EN GRAMOS / MASA MOLECULAR

NÚMERO DE MILIMOLES = MASA EN MILIGRAMOS / MASA MOLECULAR

Soluciones molares (M)

GRAMOS REQUERIDOS DE LA SUBSTANCIA = MOLARIDAD x PESO MOLECULAR x VOLUMEN

En ésta última ecuación, el volumen debe ser expresado en litros (L).

EQUIVALENTE (EQ) = MASA / VALENCIA

Si se considera que la actividad fisiológica y química es proporcional a la cantidad de partículas por

Si se quiere saber cuántos equivalentes son 69 g de Na, como el peso atómico de Na = 23 y un

x = 69 x 1/20 = 3.45 Eq = 3450 mEq

La normalidad de una solución expresa el número de equivalentes de soluto presentes en un litro de

VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA

cuando el volumen se expresa en litros. Cuando el volumen es expresado en mililitros se usa:

VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA

VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA

VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA

Volumen = 300 mL; Normalidad = 0.1 N

Soluciones porcentuales (%)

Soluciones porcentuales de volumen en volumen (v/v)

x = 25 x 0.5/100 = 0.125 mL de fenolftaleína

x = 24 x 100/96 = 25 mL de alcohol al 96% (v/v)

x = 50 x 25/100 = 12.5 mL de alcohol al 96%

Soluciones porcentuales de peso en volumen (p/v)

Expresa el número de gramos de soluto en 100 mL de la solución final, independientemente de la

Soluciones porcentuales de peso en peso (p/p)

Soluciones molales (m)

Soluciones Porcentuales (%)

Soluciones Molares (M)

Soluciones Normales (N)

3.- Cuantos gramos de HCl están en 225 mL de 6 M de HCl?

Conocer y aplicar algunos métodos para la determinación de pH.

Disociación. La disociación es el proceso de separación de uno o más elementos de una molécula

Ácido Neutro Básico (alcalino)

Algunos Indicadores de pH de Uso Frecuente

Nombre vulgar pK Color y zona útil de pH

Preparación de una Escala Colorimétrica de pH Mediante el Uso de Buffer Estándar e Indicadores

Uso del Potenciómetro

Como el electrodo de hidrógeno no es adecuado para estimar el pH de soluciones que contienen

Dos soluciones problema de pH desconocido.

A. Preparación de una Escala Colorimétrica de pH Utilizando Indicadores

Equipo No. 1 (Escala No. 1)

Equipo No. 3 (Escala No. 3)

Ácido Bórico- NaOH 0.1 M H2O

C. Medición del pH de las Soluciones Problema Usando las Escalas Colorimétricas

RESULTADOS Y DISCUSIÓN (REPORTE FINAL)

PROBLEMA pH POTENCIÓMETRO pH ESCALA

1.- ¿Cómo defines el término pH?

Por lo que los cambios de pH son mínimos en ambos casos.

El pH de cualquier sistema amortiguador puede calcularse con la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

Para describir un sistema amortiguador se requieren dos parámetros:

Algunos amortiguadores y los rangos de pH en que actúan.

Experimento A. Preparación de la Solución Buffer de Fosfatos.