GUIA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Facultad de Ciencias de la Vida

Modificado en 2023 por profesores M. Vargas- N. Bruna- H. Mendoza.

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 INTRODUCCIÓN

SOLUCIONES

Una solución es una mezcla homogénea de dos o más componentes. El

componente que está en mayor proporción se llama solvente y el o los
componentes que están en menor proporción se llaman solutos. En soluciones
líquidas, el solvente es un líquido, mientras que los solutos pueden ser sólidos,
líquidos o gases. La gran mayoría de las soluciones usadas en bioquímica son
soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solución no basta con
indicar sus componentes sino que también la proporción en que estos están
presentes en la solución, es decir, la concentración de cada uno de los solutos
en la solución.

UNIDADES DE CONCENTRACIÓN

Las más usadas en la práctica son de dos tipos:

- Unidades de concentración referidas a volumen: indican cantidad de soluto

disuelto por unidad de volumen de solución.

Ejemplo: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.

- Unidades de concentración referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto

por unidad de peso de solución o de solvente.

Ejemplo: % p/p, molalidad.

1. Molaridad (M): número de moles de soluto por litro de solución.

Para preparar una solución de molaridad dada es necesario conocer el peso

molecular (PM) del soluto.

Peso soluto (g) = número de moles de soluto PM ( g/mol)

M = moles de soluto / volumen de solución (L) (1)

Ejemplo: Una solución 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58.44 g) de NaCl

por litro. Un mol de NaCl corresponde a un valor igual al número de Avogadro
de moléculas, que es 6.023 x 1023. La concentración de iones en solución
también se indica en unidades molares, en este caso el ión es la molécula.

Ejemplo: Consideremos la solución 1 M de NaCl. Los enlaces iónicos de la red

cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal.
1
 NaCl ! Na+ + Cl-

Por cada mol de NaCl sólido se formó 1 mol de Na+ y 1 mol de Cl-. Luego:
Concentración de Na+ = 1 mol
-
Concentración de Cl = 1 mol

Ejemplo: Para moléculas distintas, como MgCl2

MgCl2 !" Mg+2 + 2 Cl-

Una solución de cloruro de magnesio 1 M contiene:

Concentración de Mg+2 = 1 mol

Concentración de Cl - = 2 mol

La concentración de soluciones diluídas se suele expresar en unidades que

son submúltiplos de M:

1 mmol en 1 L de solución
1 Milimolar (mM) significa:
(1 mmol = 10-3 moles)
1 μmol en 1 L de solución
1 Micromolar (μM) significa
(1 μmol = 10-6 moles)
1 nmol en 1 L de solución
1 Nanomolar (nM) significa
(1 nMol = 10-9 moles)
1 pmol en 1 L de solución
1 Picomolar (pM) significa
(1 pMol = 10-12 moles)

2. Normalidad (N): Número de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro

de solución. Solamente para algunos compuestos se define un Peq y este
siempre tiene relación con la reactividad del compuesto.

En general : Peq = PM / n

Para ácidos y bases n = número de protones que puede ceder (el ácido) o captar
(la base) por molécula.

Para compuestos que sufren reacciones redox n = N° de electrones captados

(agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molécula.

2
3. Peso de soluto / volumen de solución en g/l, mg/l, etc.: es la forma
más sencilla de indicar la concentración de una solución, además de la
molaridad.

4. Porcentaje peso / volumen (% p/v): peso de soluto en gramos por 100

mL de solución (% g). Se habla de porcentaje, ya que 100 mL de una solución
acuosa relativamente diluída pesan aproximadamente 100 gr. Para soluciones
muy diluídas se usa el submúltiplo mg % = peso del soluto en mg por 100 mL de
solución.

5. Porcentaje peso / peso (% p/p): peso en gramos de soluto por 100

gramos de solución. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales
viene dada en % p/p. Aquí la proporción de soluto puede ser mayor que la
proporción de solvente.

Ejemplo: H2SO4 al 96%. Para transformar % p/p a concentración molar o normal

es necesario conocer la densidad de la solución.

Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial de 28 % densidad 1.15 (Kg/L).

1. Calculamos cuánto pesa un litro de la solución:

L x 1.15 (Kg/L) = 1.15 kg = 1.150 g.

2. Ahora calculamos el peso de HCl (HCl puro) contenido en este litro: 100
g de solución contienen 28 g, 1.150 g de solución contienen:

1.150 g. x 0.28 = 322 g.

3. Finalmente, calculamos a cuantos moles corresponde este peso de HCl:

322 g / 36.5 (g/mol) = 8.82 moles

Hemos calculado que el litro del ácido comercial contiene 8.82 moles de HCl, es
decir, es 8.82 M.

6. Molalidad (m): número de moles de soluto por 1000 g de solvente. Esta

unidad de concentración se usa solamente para ciertos cálculos fisicoquímicos.
Expresar la concentración en estas unidades presenta la ventaja de que se hace
independiente de la temperatura. Al contrario, una concentración expresada en
unidades referidas a volumen, como la molaridad, varía con la temperatura, ya
que esta afecta el volumen. En soluciones acuosas diluídas m es prácticamente
igual a M.

3
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro
(generalmente sólido) o una solución concentrada de él, en el mismo solvente
(solución stock). Este último caso constituye una dilución.

Para diluciones rige la relación:

V1 x C1 = V2 x C2 (balance de masa soluto)

V1= volumen de la solución concentrada

C1= concentración de la solución concentrada
V2 =Volumen de la solución diluída
C2 = concentración de la solución diluída

C1 y C2 pueden ser unidades de concentración de cualquier sistema referido a

volumen.

Ejemplo: En un matraz aforado de 100 mL se colocaron 10 mL de una solución

2 M de cloruro de sodio y se aforó con agua.

¿ Cuál será la concentración de la solución resultante?

Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0.2 M, ya que la solución
se diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dada sería:

V1 x C1 = V2 x C2
C 2 = V1 x C 1 / V 2
= 10 mL x 2M / 100 mL
10 mL x 2 M = XM
100 mL
donde X = 0,2 M

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pH Y TAMPONES

ÁCIDOS Y BASES

De acuerdo a la definición de Bronsted:

1. ÁCIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio.

2. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio.

En medio acuoso, la reacción correspondiente de un ácido HA es:

HA + H2O # H3O+ + A-

y obviando la participación del agua:

HA # H+ + A- (1)
Considerando esta reacción en el sentido inverso, la especie A- puede captar
protones. A- es la base conjugada de HA. De igual forma para una base B:

B + H+ # BH+ (2)
BH+ es el ácido conjugado de B.

FUERZA DE ÁCIDOS Y BASES

Un ácido o una base fuerte es el que está completamente disociado en solución.

En cambio, en ácido débil esta solamente parcialmente disociado y la base
parcialmente protonada.

Ácidos fuertes: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente
el primer protón que se disocia).

Bases fuertes: NaOH, KOH, etc.

Ácidos y bases débiles: prácticamente todos los ácidos y bases orgánicos

pertenecen a este grupo.

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ÁCIDOS Y BASES DÉBILES

a. ÁCIDOS DÉBILES

Consideramos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAc.

Fórmula estructural: CH3-COOH

Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten en
equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión acetato
(OAc-) y protones.
La relación entre la concentración de las especies nombradas a una temperatura
determinada, está dada por la constante de equilibrio de la reacción de
disociación, llamada constante de acidez, Ka:

HOAc #" OAc- + H+ (3)

Ka = [ OAc-] [ H+ ] / [HOAc ] (4)

Ka del ácido acético a 25° C: 1.78 x 10-5

Se suele expresar la acidez a través del pKa en lugar de usar Ka:

pKa = - log Ka
Ka de HOAc (25° C) es = 4.75

Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez,

calcularemos la concentración de las especies presentes en una solución 0.1 M
de HOAc.

Según la ecuación 3

[H+] = [OAc] = x
[HOAc] = 0.1 - x

6
El valor numérico de Ka indica que HOAc estará poco disociado, por lo tanto, es
lícito efectuar la siguiente aproximación:

[HOAc ] = 0.1

reemplazando en la expresión de Ka (4)

Ka = x2 / 0.1 = 1.78 x 10-5

X = 1.33 x 10-3 M

Es decir, en nuestra solución: la [HOAc ] es virtualmente 0,1 M, en tanto que la

concentración de [OAc- ] y de [ H+ ] es 1,33 mM.

Una vez conocida la concentración de H+ se puede calcular el pH de una

solución de ácido acético 0.1 M empleando la siguiente fórmula:
pH = - log [H+]

Por consiguiente, el pH de esta solución será igual a – log (1.33 x 10-3), vale
decir pH = 2.88.

b. BASES DÉBILES

Para una base débil B se puede definir también una constante. En este caso, la
llamada constante de basicidad Kb

Kb = [ BH+] / [ B ] [ H+] (5)

Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases débiles a través de la constante

de acidez de su ácido conjugado BH+ (invirtiendo la reacción 2).

Para un par ácido/base conjugada se cumple:

Ka x Kb = Kw

Siendo Kw = constante de disociación del agua

Kw = [H+ ] [OH- ] = 10-14 ( 25° C)

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ECUACIÓN DE HENDERSON – HASSELBACH

En forma análoga a lo visto para el ácido acético (HOAc), se puede generalizar

para un ácido débil que denominaremos HA:

Ka = [A- ] [H+ ] / [HA ]

Despejando H+ y aplicando log se obtiene la ecuación de Henderson –

Hasselbach

pH = pKa + log [ A- ] / [ HA ] (6)

Esta ecuación establece la relación entre pH, el pKa y la proporción de la especie

protonada (HA) y la desprotonada (A-). Se usa para calcular el pH de la mezcla
de un ácido débil con un ácido fuerte, o una base fuerte de un ácido débil con su
sal, mezclas tampón, etc.

SOLUCIONES TAMPÓN

Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base fuerte
(NaOH), midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente gráfico,
llamado curva de titulación:

Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4.75 (pka) el pH varía muy poco

durante la adición de base, se trata de la zona tamponante del par HOAc / OAc-

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Las 3 reacciones involucradas son:
1. NaOH !" Na++ OH-
2. OH- + H+ !" H2O
3. HOAc !" OAc- + H+

La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentración de

protones en la solución. Sin embargo, la tercera reacción simultáneamente
repone parte de los protones neutralizados. El equilibrio de disociación de HOAc
se desplaza hacia la formación de acetato.

Para:

pH = pKa ocurre que HOAc = OAc-

A medida que la concentración de la especie protonada HOAc en la solución se

hace pequeña, el pH comienza a aumentar más fuertemente, hasta que la
solución pierde su característica de tampón.

Al titular una solución básica, que contiene el anión acetato con un ácido fuerte
se observa el mismo fenómeno. Estaríamos recorriendo nuestra curva de
derecha a izquierda.

Solución tampón (solución amortiguadora o buffer): es una solución cuyo pH se

mantiene prácticamente constante cuando se le agregan pequeñas cantidades
de ácido o base. Las soluciones tampón son sistemas formados por un ácido
débil y su base conjugada o por una base débil con un ácido conjugado.

Rango de un sistema tampón: es el rango de pH en el cual el sistema posee

propiedades de tampón, esta dado por el pKa de la especie protonada. Un
tampón es “bueno” aproximadamente 0,5 unidades de pH alrededor del pKa. Los
valores de pKa para algunos tampones de uso común en bioquímica están
contenidos en la tabla 1. También se usan mezclas de dos diferentes sistemas
tampón, ejemplos: tampón tris/fosfato, trienolamina/dietilamina, etc.

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Capacidad de una solución tampón: la capacidad de una solución tampón indica
la cantidad de ácido o de base que es capaz de absorber sin cambiar
fuertemente su pH y depende de:

1. pH: es máxima para pH = pKa

2. Concentración: a mayor concentración, mayor capacidad tamponante.

TABLA 1
COMPUESTO pKa (20° C)
Ácido fosfórico (pKa 1) 1.96
Glicina 2.45
Ácido cítrico (pKa 1) 3.1
Ácido fórmico 3.75
Ácido acético 4.75
Ácido cítrico (pKa 2) 4.75
Ácido cítrico (pKa 3) 5.40
MES (ácido conjugado) 6.15
Imidazol (ácido conjugado) 7.00
Ácido fosfórico (pKa 2) 7.21
HEPES (ácido conjugado) 7.55
Trietanolamina (ácido conjugado) 7.77
TRIS (ácido conjugado) 8.08
Ácido fosfórico (pKa 3) 12.30

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SELECCIÓN DE UN TAMPÓN

Para la selección de un sistema buffer adecuado se deben considerar las

siguientes variables:

a. El pH al cual deseamos trabajar

b. La capacidad tamponante requerida
c. Solubilidad de los compuestos

Ejemplo: una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de

sus sales.

d. Variación del pH con la temperatura

Ejemplo: una desventaja de los tampones de Tris es que su pH varía
notoriamente con la temperatura.

e. Volatilidad: algunos sistemas tampón presentan la desventaja de ser volátiles.

Ejemplo: acetato de amonio, bicarbonato de amonio.

f. Transparencia a la luz UV. Cuando se desea detectar un compuesto por

absorciometría, es necesario usar un buffer que sea suficientemente
transparente (que no absorba) a la longitud de onda de la determinación.

g. Interacciones: entre el sistema tampón y la actividad de determinada enzima.

Observación: la concentración de un buffer es la suma de las concentraciones

de la especie protonada y de la especie desprotonada.

Ejemplo: se desea preparar un litro de buffer acetato 0,1 M de pH = 4,60 a partir

de ácido acético 2 M y acetato de sodio. La ecuación de Henderson –
Hasselbach permite calcular la razón de las concentraciones de HOAc y OAc-
necesaria para que el pH de la solución sea igual a 4.60:

pH = pKa + log [ OAc-] / [ HOAc ]

Reemplazando el pka de HOAc y el pH:

4.60 = 4.75 + log [ OAc- ] / [ HOAc ]

log [ OAc-] / [ HOAc ] = - 0.15 lo que implica : [ OAc- ] / [ HOAc ] = 0,708

Por otra parte: [ HOAc ] + [ OAc- ] = 0,1

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(todas las concentraciones en concentración molar, M)

[HOAc] = 0.1 - [OAc-]

Remplazando [HOAc] = 0.1 – 0.708 x [HOAc]

Resolviendo [HOAc] = 0.0585 M y, por consiguiente,

[OAc-] = 0.0415 M

En consideración a que se desea preparar un volumen igual a un litro, se

necesitan 0.0415 moles de acetato de sodio.

NaOAc: PM = 82 lo que implica que 0,0415 moles = 3,4 g.

HOAc: Se aplica la relación de las diluciones

V1 = 1 L x 0,0585 M / 2 M = 0,0293 L = 29,3 mL

Preparación de la solución: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3,4 g. de

acetato de sodio más 29,3 mL de HOAc (2M) y se afora con agua destilada.

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FOTOMETRÍA: ABSORCIOMETRÍA

MONTAJE DE UNA TÉCNICA FOTOCOLORIMÉTRICA

Principios de absorciometría de UV / visible.

La absorciometría aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber
radiación electromagnética.
Los diferentes tipos de radiación electromagnética: rayos X, luz ultravioleta (UV),
luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, se propagan a la misma velocidad, pero
difieren en longitud de onda y frecuencia. Para estas radiaciones se cumple la
siguiente expresión matemática.

c= λxν
c = velocidad de la luz en el vacío
λ = longitud de onda
ν = frecuencia

El ojo humano detecta la radiación en un rango de longitud de onda de 400 a

800 nm, llamada luz visible (1 nm = 10-9 m).

La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energía
necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de
menor energía a otro de mayor energía de ciertos compuestos, llamados
cromóforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color
corresponde a la radiación no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene
radiación de todo el espectro visible, además de otras radiaciones.

LEY DE LAMBERT - BEER

La ley de Lambert – Beer es la ley fundamental de la absorciometría, ya que

relaciona la absorción de la luz con la concentración de las soluciones.

Consideremos un haz de luz monocromática (luz de una sola longitud de onda)

que atraviesa una solución de un compuesto contenido en un recipiente de
vidrio.

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El siguiente esquema ilustra la situación:

I0.: intensidad de haz incidente

I: intensidad de haz transmitido
b: camino óptico

Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I es menor que I0 . Cuanto

mayor es el número de moléculas de este cromóforo encontradas por el haz de
luz en su camino, menor será la intensidad de la luz transmitida. Dicho número
de moléculas depende de la distancia recorrida a través de la solución (camino
óptico) y de la concentración. La relación entre estos parámetros está dada por
la ley de Lambert – Beer :

I = I0 x 10-εbc (1)

La forma de esta ley que se usa en la práctica es más sencilla y se obtiene

aplicando logaritmos y reordenando:

Log I0 / I = ε bc

Se define como absorbancia (A) de la solución:

A = Log I0 / I (2)
Luego:
A = εbc (3)
Ley de Lambert - Beer

Por conveniencia se usa el siguiente sistema de unidades: b = camino óptico

en cm.
c = concentración en M
ε = coeficiente de extinción molar, en cm-1 x M-1

El coeficiente de extinción molar, ε, a una longitud de onda dada es una

característica propia del cromóforo y representa la probabilidad de que el

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cromóforo absorba la radiación. Para explicar el significado de ε se suele señalar
que es igual al valor numérico de la absorbancia que tendría una solución 1 M
del cromóforo si el camino óptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el
carácter hipotético de esta afirmación, ya que normalmente no es posible
preparar soluciones de concentración 1 M de los cromóforos (si el PM es alto, 1
M es una concentración extremadamente alta), y por otra parte el orden de la
magnitud de los ε corresponde a valores muy superiores al rango de
absorbancias medibles en la práctica. Los coeficientes de extinción pueden
tomar valores hasta 1000.000 cm-1 M-1 e incluso mayores.

La ley de Lambert – Beer indica que si consideramos a b como constante, la

absorbancia a una λ dada aumenta en forma lineal con la concentración (Figura
1), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial (Figura 2):

El gráfico de la absorbancia de un cromóforo en solución en función de la

longitud de onda se denomina espectro de absorción o espectrograma de
absorción. Un espectro de absorción se obtiene variando λ para b y c constantes,
y por lo tanto representa la variación de A con ε.

Figura N° 3: Espectro de absorción de riboflavina.

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El espectro de absorción de UV/ visible es característico para un cromóforo
determinado, por lo tanto, se puede usar para su identificación. Las
características espectroscópicas se pueden resumir indicando la posición de los
máximos de las bandas de absorción ( λmáx ) con los correspondientes ε.

Por ejemplo, para riboflavinas a pH 7.0 (Figura 3):

ε ( M-1 cm –
λ máx. 1
)
266 31.800
373 10.400
445 12.500

La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su única banda en la región del
visible es a 450 nm.

INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN

Los componentes básicos de todos los instrumentos que se usan en

absorciometría de UV / visible son:

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Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos:

a. Fotómetros de filtro: la selección de la longitud de onda se realiza

mediante filtros intercambiables.
b. Espectrofotómetros: poseen un monocromador; son más sofisticados que
los fotómetros de filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en
el rango visible solamente y otros que abarcan el UV y el visible (tiene 2 fuentes
de luz).

LA FUENTE DE LUZ

No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral
UV / visible de suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes
diferentes:

16
Fuente de luz visible: lámpara de tungsteno. Sirve para 340 – 850 nm
aproximadamente.

SELECCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA

FILTROS

No proporcionan luz realmente monocromática, sino que permiten el paso de un

cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda máxima,
transmitancia del filtro.

MONOCROMADORES

Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de

distracción. El elemento dispersor separa los haces de luz de diferente longitud
de onda. Un sistema de espejo permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda
deseada hacia la ranura de salida.

Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz, pero siempre

pasará un cierto rango de longitud de onda.
En la práctica se considera que un espectrofotómetro opera con luz
prácticamente monocromática. La calidad de un espectrofotómetro depende en
parte importante de esta característica.

Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua,

condición necesaria para obtener espectros de absorción. Con un fotómetro de
filtro no es posible obtener espectros de absorción.

PORTADOR DE MUESTRA

Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia. Las
cubetas son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV).

DETECTOR

Los detectores son del tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente
eléctrica, de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen
celdas de capa barrera (solamente para fotómetros de filtro), fototubos y tubos
fotomultiplicadores.

LECTURA O REGISTRO

La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia.

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Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (3).
La absorbancia se mide en 3 cifras después de la coma. El rango de A medible
es de 0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000 (dependiendo del instrumento).

APLICACIÓN DE LA ABSORCIOMETRÍA EN EL ANÁLISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UN CROMÓFORO

PURO

Midiendo la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y

conociendo el correspondiente ε se puede calcular la concentración.
Normalmente, se usa la longitud de onda del máximo de una banda, cuyo valor
se encuentra en la literatura.

Un método alternativo es construir una curva de calibración de Abs en función

de [c], que será una recta si se cumple la ley de Lambert – Beer (ver Fig. 1).
Interpolando en la recta con la absorbancia de la solución problema se puede
determinar su concentración.

2. DETERMINACIONES A TRAVÉS DE UNA REACCIÓN QUÍMICA O

“TEST”

Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no

absorben convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo específico
formándose un cromóforo.

Se realiza en paralelo el test con la muestra problema y con una o varias

soluciones del compuesto a determinar, de concentración conocida (soluciones
patrón). Posteriormente, se mide la absorbancia.

Esta absorbancia será proporcional a la concentración del compuesto que se va

a determinar dentro de cierto rango de concentraciones. Si se usó solamente
una solución, se calcula la concentración por proporción directa:

C (problema) = A (problema)
C (estándar) A (estándar)

Si se usaron varias soluciones estándar, se construye la curva de calibración del

test, y se interpola en ésta. Este gráfico será una recta cuya pendiente se ha
llamado factor de calibración, k:

A=kxC

En forma alternativa a interpolar en la recta se puede calcular C a partir de la

absorbancia medida dividiendo por el factor de calibración.

18
CASOS EN LOS CUALES SE REALIZA UN TEST

1. El compuesto no absorbe en todo el UV – visible:

se realiza el test, generándose un cromóforo, el cual generalmente absorbe en
el visible (se genera un color) o excepcionalmente solamente en el UV.
Ejemplo: determinaciones de azúcares.

2. El compuesto absorbe en una región espectral (generalmente UV) en la cual

no se puede efectuar la determinación porque la solución problema es una
mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma región que el
compuesto a determinar, y/o el instrumento de la medida permite medir
solamente en el rango visible.
Ejemplo: determinación de proteínas.

Cuando se monta un método fotocolorimétrico, pueden existir tres posibilidades:

a. Que la sustancia sea coloreada y que presente un máximo de absorción

característico solo para ella y, por lo tanto, esta podría usarse para su
determinación fotocolorimétrica.

b. La sustancia en solución es incolora, y por lo tanto, se aprovecha alguna

propiedad química de ella (poder reductor, oxidante, de sustitución de grupos,
etc.) para desarrollar una reacción coloreada que sirve entonces para determinar
su concentración.

c. La sustancia en solución, a pesar de ser incolora, presenta un máximo de

absorción característico, generalmente a longitudes de onda cortas (UV) que
puede ser usada para su determinación.

BIBLIOGRAFÍA

● H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN “INSTRUMENTAL METHODS OF

ANÁLYSIS”
● G. EWING “INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANLYSIS”
● STROBEL “INSTRUMENTACIÓN QUÍMICA”
● S.B. BROWN, ED, “AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR
BIOCHEMISTS”

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 LABORATORIO Nº1
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN

Se han descrito un gran número de métodos para la cuantificación de proteínas.

Todos presentan ventajas y desventajas, y la selección de uno en particular va
a depender de la proteína que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada,
posibles interferencias y la sencillez del método.

En general, los métodos están basados en reacciones químicas, absorción

ultravioleta, reacciones de fluorescencia y determinación del nitrógeno.

MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

Las proteínas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de ácido

tricloroacético, sulfosalicílico o ferricianuro de potasio en ácido acético. Este
método tiene desventajas ya que no todas las proteínas precipitan en la misma
cantidad e interfieren con otras sustancias precipitables como ácidos nucleicos.
La ventaja que presenta es la rapidez de la determinación. El rango útil de trabajo
es entre 0.1 y 0.3 mg de proteínas agregadas.

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

El método colorimétrico más difundido es el método de Löwry, en que el color

final de la reacción, es el resultado de la reacción de Biuret de la proteína con el
ión cobre en medio alcalino y la reducción del reactivo fosfomolíbdico –
fosfotúngstico por la serina y triptófano presentes en las proteínas.

Los métodos de Biuret y Bradford se discutirán más adelante en esta guía y son
los que se realizarán en el trabajo práctico.

MÉTODOS DE ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA

La mayoría de las proteínas tiene un máximo de absorción a 280 nm, debido

primariamente a la presencia de tirosina y triptófano, y secundariamente, a
fenilalanina y cisteína. Por consiguiente, el coeficiente de extinción molar a 280
nm varía de una proteína a otra debido a su composición aminoacídica. Más
aún, los ácidos nucleicos que muchas veces están como contaminantes en las
preparaciones de proteínas, aunque tienen un máximo de absorción a 260,
también lo hacen a 280 nm, falseando la lectura de las proteínas. La razón de
absorbancia a 280/260 nm ha sido usada por Wargurg y Christian para eliminar
la interferencia de ácidos nucleicos en la determinación de proteínas. El rango
útil de trabajo es entre 0,1 y 0,6 mg/mL.

20
Por debajo de 230 nm, la extinción de una solución de proteínas sube
precipitadamente alcanzando un máximo a 190 nm, debido principalmente al
enlace peptídico. En la práctica, es más conveniente medir la extinción a 210
nm, ya que el coeficiente de extinción molar a esta longitud de onda es de cerca
de 200 para la mayoría de las proteínas.
Todas tienen una absorción específica similar, pues el contenido de enlaces
peptídicos es semejante.

Se han descrito una serie de métodos que utilizan absorbancias menores a 240
nm, sin embargo, se obtienen mejores resultados con el método de Scopes, en
el cual se efectúan lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm, pudiéndose calcular
el coeficiente de extinción molar de una proteína a 205 nm con bastante
precisión.

EXPERIENCIA A:
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino) reacciona con un

compuesto que contiene dos o más enlaces peptídicos dando una coloración
violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinación entre el Cu
y cuatro átomos de nitrógeno que provienen de dos cadenas peptídicas
adyacentes. Los dipéptidos y los aminoácidos (excepto la serina y treonina) no
dan esta reacción. La reacción no es absolutamente específica para los enlaces
peptídicos, interfiriendo una serie de compuestos en la determinación de
proteínas como, por ejemplo, sales de amonio.

Mediante este método se pueden valorar proteínas en un rango de 1 a 10 mg.

MATERIALES

● El Reactivo de Biuret se le entregará listo en esta experiencia de

laboratorio. Su preparación consiste en: colocar 1,5 g, de CuSO4 x H2O
y 6 g. de tartrato de sodio y potasio (NAKC4H4O6 x 4 H2O). Agregar
alrededor de 500 mL de agua destilada y agitar hasta disolución. Agregar
lentamente y agitando en forma constante 300 mL de NaOH 2.5N. Las
dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0 g, de
yoduro de potasio y agitar hasta que esté totalmente disuelto. Llevar a un
volumen final de 1000 mL y guardar en un frasco de polietileno. Este
reactivo es estable indefinidamente.

● Espectrofotómetro Spectronic 20 (540 nm)

● Solución estándar de proteína de concentración conocida (10 mg/mL).

21
A.1 CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
MEDIANTE REACTIVO DE BIURET.

Para la confección de la curva de calibración se utilizará una solución de

proteína stock de concentración 10 mg/mL.

1. Disponga de 7 tubos y vierta en ellos los sgtes volúmenes de solución

estándar de proteína, según se indica en la Tabla 1: 0, 200; 400; 600; 800
y 1000 mL.
- El tubo Nº 1 úselo como blanco, ya que contendrá 1 mL de agua destilada
en lugar de proteína.
- El tubo Nº 7 contendrá su muestra problema, por lo que deberá vaciar en
él la muestra tal como se la entregue el profesor.
2. Enrase los 7 tubos a 1 mL de volumen final con agua destilada.
3. A cada tubo agregue 4 mL del reactivo de Biuret.
Tendrá todos sus tubos con 5 mL totales de solución.
4. Deje desarrollar color durante 30 min, y luego mida Absorbancia en
un espectrofotómetro a 540 nm.

Tabla 1. Curva de calibración para cuantificar proteínas mediante método de

Biuret.
Tubo Proteína (μL) Agua (μL) Reactivo de Biuret (mL)
1 0 1000 4
2 200 800 4
3 400 600 4
4 600 400 4
5 800 200 4
6 1000 0 4
7 x x 4

● Actividad: Realice la gráfica de la curva de calibración (Abs vs

Concentración) y determine la concentración de su muestra problema.

22
EXPERIENCIA B.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G – 250 de

unirse a las proteínas. El colorante sólo presenta un máximo de absorción a 465
nm, mientras que cuando está unido a proteínas, el máximo es de 595 nm.
La coloración en presencia de proteínas es lineal en el rango de 0-30 μg, pero
interfieren en la determinación de proteínas los detergentes y las álcalis. Se
recomienda leer a los 10 min. de iniciada la reacción, debido a que el color no
es estable en el tiempo, puesto que la proteína comienza a precipitar debido al
medio ácido. Este efecto es especialmente significativo a altas concentraciones
de proteínas.

MATERIALES

● El Reactivo de Bradford se le entregará listo para ser usado. Su

preparación consiste en: disolver 100 mg. de azul de Coomasie G –250
(sigma) en 50 mL de etanol 95% (siempre queda un ligero residuo
insoluble). Agregar lentamente 100 mL de ácido fosfórico 85% p/v y luego
completar a 100 mL con agua destilada. Dejar el reactivo en reposo todo
un día y luego filtrar. El reactivo debe filtrarse toda vez que presente
residuo, o que el blanco de reactivo leído contra agua presente una
absorbancia mayor a 0,5.
● Solución estándar de proteína 50 μg/mL

● Espectrofotómetro Spectronic 20 (595 nm)

B.1 CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA CUANTIFICACIÓN DE

PROTEÍNAS MEDIANTE REACTIVO DE BRADFORD

Para la confección de la curva de calibración se utilizará una solución de

proteína stock de concentración 50 µg/mL.

1. Disponga de 8 tubos y vierta en ellos los sgtes volúmenes de solución

estándar de proteína, según se indica en la Tabla 2: 0, 50, 100, 150, 200,
250 y 300 μL de proteína.
- El tubo Nº1 úselo como blanco, ya que contendrá agua destilada en lugar
de proteína.
- El tubo Nº 8 contendrá su muestra problema, por lo que deberá vaciar en
él la muestra tal como se la entregue el profesor.
2. Complete todos los tubos a 500 μL con agua destilada.
3. A cada tubo agregue 500 μL del reactivo de Bradford
Tendrá todos los tubos con 1 mL final.
23
4. Deje desarrollar color durante 10 min, y luego mida Absorbancia en
un espectrofotómetro a 595 nm.

Tabla 2. Curva de calibración para cuantificar proteínas mediante método de

Bradford.

Tubo Proteína (µL) Agua (µL) Reactivo de Bradford (µL)

1 0 500 500
2 50 450 500
3 100 400 500
4 150 350 500
5 200 300 500
6 250 250 500
7 300 200 500
8 x x 500

● Actividad: Realice la gráfica de la curva de calibración (Abs vs

Concentración) y determine la concentración de su muestra problema.

BIBLIOGRAFÍA

− Skoog & West. Análisis Instrumental

− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company
2° Edición Pág. 75 – 77.
− Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pág. 248 – 254.

24
 LABORATORIO Nº2
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA
ÁCIDA DE GERMEN DE TRIGO

INTRODUCCIÓN

Reacción Enzimática

Una enzima es una proteína que cataliza una reacción química específica, es
decir, aumenta su velocidad de reacción. La figura Nº 1 muestra la variación de
la concentración de producto de una reacción enzimática en el tiempo (cinética),
así como también la desaparición de sustrato.
La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad de reacción. Se aprecia
que durante cierto tiempo (inicio) la velocidad se mantiene constante (la curva
es una recta) y posteriormente decae.

Figura N° 1. Curva de progreso de la reacción

Es importante tener en cuenta que para el estudio de reacciones enzimáticas

siempre se determinan velocidades iniciales (V0), es decir, se utiliza únicamente
aquel intervalo de tiempo en el cual la velocidad se mantiene constante. La
velocidad inicial se define como:

V0 = cantidad de sustrato consumido (μmoles)

Tiempo (min.)

V0 = cantidad de producto formado (μmoles)

Tiempo (min.)

25
Existen dos tipos diferentes de ensayos enzimáticos:

1. Ensayo de tiempo fijo: se detiene después de un tiempo determinado y se

mide la concentración de producto formado o sustrato consumido.

2. Ensayo cinético: se determina la concentración de sustrato o producto en

forma continua o a una serie de tiempos muy próximos entre sí, obteniéndose
una curva como la figura 1.

Una reacción catalizada por una enzima aumenta su velocidad con el incremento
de la concentración de sustrato hasta un nivel en que por más sustrato que se
adicione, no aumentará la velocidad de la misma. Este fenómeno se denomina
saturación y alcanza la velocidad inicial máxima Vmax.

Figura N° 2: Variación de la velocidad inicial ( V0 ) con la concentración de sustrato (S).

En el siguiente trabajo práctico se determinará la actividad enzimática de una

fosfatasa. En general, las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de
fosfatos monoésteres con la consecuente liberación de fosfato inorgánico. Este
tipo de reacciones está muy distribuido en la naturaleza.

La reacción descrita es la siguiente:

Las fosfatasas en general presentan un amplio rango de especificidad de

sustrato y se clasifican como ácidas o alcalinas, basándose en su pH óptimo de
reacción. Las hojas de las plantas son particularmente ricas en fosfatasas ácidas
26
y su actividad comúnmente aumenta con la germinación, aunque su rol
fisiológico no se conoce bien.

La enzima a utilizar en el presente trabajo práctico, proviene de una fracción

cruda de germen de trigo, la cual será empleada para realizar un ensayo
enzimático, y luego estudiar las propiedades cinéticas de ésta.

El ensayo consiste en determinar la actividad enzimática mediante un sustrato

artificial, el p–nitrofenil fosfato (NPP). El grado de hidrólisis de éste se
determinará fotométricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, según se
ilustra el la sgte ecuación. En solución alcalina el ión p–nitrofenolato absorbe la
luz fuertemente en la región de los 405 nm.

27
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Materiales

$ Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0

$ Sustrato p–nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
$ Solución de p–nitrofenol 60 μM en NaOH 0.02 M $ Solución de 0.02 M NaOH
$ Solución stock de enzima 100 μg/mL
$ Baño termoregulado a 37° C

EXPERIENCIA A

Curva de calibración para la formación de p–nitrofenol

1. Prepare 6 tubos que contengan 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mL de una solución stock

de p–nitrofenol 60 μM. Enrase cada uno de los tubos con NaOH 20 mM
hasta un volumen final de 6 mL (ver tabla anexa).

2. Mezcle cada tubo y luego transfiera 1 mL de solución a una cubeta de

espectrofotometría, para leer su absorbancia a 405 nm.

- Como tubo blanco utilice el tubo Nº1, ya que no contiene p–nitrofenol y

además le permite calibrar el equipo.

- Actividad: calcule los μmoles de p–nitrofenol para cada uno de los tubos,

28
 - Actividad: grafique A405 versus los μmoles de p–nitrofenol.

- A continuación se ilustra una curva estándar como ejemplo. Use su curva

estándar para analizar sus datos cinéticos.

EXPERIENCIA B

Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de Germen de trigo

Ya que el ensayo de la fosfatasa se realiza a tiempo fijo, es necesario determinar

la dilución correcta de enzima a usar ó el tiempo de ensayo a realizar con una
misma dilución de enzima.

1. Prepare 5 tubos con 2 mL de una solución de NaOH 20mM, cuya función

será detener la reacción enzimática. Mantenga estos tubos a temperatura
ambiente en el mesón.

2. Prepare 1 tubo que contenga 10 mL de amortiguador citrato de sodio (0.1

M; EDTA 0,15 M, pH 5,0), y agregue 1 mL de sustrato NPP 10 mM. Mezcle
e incube este tubo en un baño termoregulado a 37 °C por 5 minutos.

3. Al completar los 5 minutos de incubación agregue al tubo 350 μL de

enzima fosfatasa ácida (100 μg/mL). Considere que al momento de añadir
la enzima comienza la reacción enzimática.

4. Mezcle la solución del tubo para asegurar que la enzima entre en contacto
con el sustrato. Inmediatamente saque una alícuota de 2 mL de solución

29
 y adiciónela sobre uno de los tubos preparados anteriormente y dejados
en el mesón con solución de NaOH 20mM.

- Este es un control denominado tiempo cero de reacción, ya que al entrar

en contacto con el NaOH no se le dio tiempo a la enzima para generar el
producto. Este tubo además le permite calibrar el equipo.

5. Repita secuencialmente el paso anterior con los siguientes 4 tubos, pero

esperando los siguientes tiempos: 5-10-15 y 30 minutos.

6. Finalmente, lea absorbancia a 405nm de cada uno de los tubos utilizando

como blanco el tiempo cero.

- Actividad: Grafique sus datos Abs vs tiempo, según el sgte ejemplo-

- Actividad: Calcule los µmoles de p-nitrofenol formados a cada uno de

los tiempos y grafique. según el sgte ejemplo.

30
Según las actividades anteriores, ya cuenta con los gráficos de curva de
calibración de p-nitrofenol y la determinación del rango lineal de la enzima.

- Actividad: Una vez realizadas las medidas correspondientes complete la

siguiente tabla:

N° tubo Abs 405 nm μmoles Pi Velocidad (μmoles /min.)

1 0.0 0.0 0.0
2
3
4

Nota: los μmoles de producto catalizados por la enzima se calculan utilizando

la curva de calibración para el producto p–nitrofenol.

BIBLIOGRAFÍA

- Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &

Company, NY. 2° Edición Pág. 77 – 85; 105 – 108.
! Lehninger, A y col. Principios de Bioquímica.
! Stryer, A. Bioquímica.

31
 LABORATORIO Nº3
PROPIEDADES CINÉTICAS DE LA FOSFATASA ÁCIDA DEL GERMEN DE
TRIGO

EXPERIENCIA C:

Determinación de la constante de Michaelis-Menten para p-nitrofenilfosfato

y Vmax

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIALES

- Amortiguador citrato de sodio 0.1 M, EDTA 0.15 M, pH 5.0

- Sustrato p – nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
- Solución de 0.1 M NaOH
- Solución stock de enzima 100 μg/mL
- Baño termoregulado a 37 ºC

- Siguiendo la linealidad de la curva determinada en el práctico anterior,

se trabajará a 10 minutos.

1. Prepare 7 tubos que contengan 2 mL de NaOH 20mM. Deje en el

mesón a temperatura ambiente.

32
 2. Prepare 7 tubos con p-NPP y amotiguador citrato, según lo indica la sgte
tabla, e incube los 7 tubos a 37 ºC por 5 minutos.

3. Una vez terminados los 5 minutos de incubación, adicione 70 μL de la de

enzima a cada uno de los tubos. Mezcle bien e incube el tiempo indicado
en la tabla (10 minutos), a excepción del tubo Nº 2 que corresponderá a
su tiempo cero, por ello deberá detener la reacción vertiendo el NaOH (del
tuno Nº2 que tiene reservado a temperatura ambiente) inmediatamente
después de haber agregado la enzima, para no darle tiempo de
reaccionar con el sustrato.

- Recuerde que al momento de añadir la enzima comienza la reacción

enzimática.

4. Detenga la reacción en cada tubo secuencialmente. Para ello tome los

tubos de NaOH que tiene a temperatura ambiente y voltée cada uno sobre
cada uno de los tubos que tiene en incubación.

5. Para finalizar lea absorbancia a 405 nm de los 7 tubos.

Actividad: A partir de la curva de calibración, calcule la cantidad de µmoles

generados y construya el gráfico de Michaellis-Menten. Luego a partir de este
gráfico calcule los parámetros cinéticos (Vmax y Km) a partir del gráfico de
Lineweaver-Burk o dobles recíprocos. Ejemplos de sus gráficos en el inicio de la
experiencia C.

BIBLIOGRAFÍA
! Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 77 – 85; 105 – 108.
! Lehninger, A y col. Principios de Bioquímica.
! Stryer, A. Bioquímica.

33
 LABORATORIO Nº4
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Es una técnica utilizada para separar compuestos de diferente peso molecular.

La base de la separación del método es la propiedad del gel o matriz (Sephadex),
de fraccionar solutos de acuerdo a su tamaño molecular.

Cuando se coloca una solución acuosa con macromoléculas que difieren en

tamaño y se pasa a través de una columna empacada con gel de dextrano
(Sephadex), las moléculas más grandes son incapaces de penetrar los poros del
gel (se excluyen), y se mueven más rápido a través de la columna, es decir,
tienen menos trayecto que recorrer que las moléculas pequeñas. Estas últimas,
difunden a través de los poros según su tamaño. Las diferentes moléculas
eluyen de la columna en una secuencia decreciente en tamaño molecular.

MATERIALES

$ Columna de plástico 1.3 x 15 cm. (jeringa de 5 mL)

$ Sephadex G – 75
$" Buffer fosfato 20 mM pH 7
$ Muestra: mezcla de azul dextrano 0.5% y dicromato de potasio (K2Cr2O7) al
0.5%. Proporción dada por el profesor.

MONTAJE DE LA COLUMNA

Ponga un trozo de papel filtro en el fondo de la columna con la ayuda de una

bagueta. Mediante una pinza, cierre la salida de la columna y llénela con agua
destilada. Soltando la pinza deje escurrir el agua hasta la mitad de la columna.
Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si
hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento nuevamente.

Proceda a rellenar la columna hasta la mitad con una solución acuosa de

Sephadex, y espere unos minutos hasta que comience a sedimentar. Abra la
pinza de salida suavemente hasta obtener un flujo de 1 mL/min como máximo.
Continúe agregando el Sephadex hasta completar una altura de entre 5 y 8 cm
en la columna. Equilibre la columna haciéndole pasar 2 volúmenes de tampón
pH 7.

SEMBRADO DE LA MUESTRA

Una vez equilibrada la columna, con ayuda de la pipeta pasteur retire el agua de
ella, o bien deje gotear para bajar el nivel de líquido desde la superficie. Cuando
34
está a punto de empezar a secarse la superficie del gel, agregue la muestra con
una pipeta Pasteur. Una vez que la muestra ha entrado al gel, agregue un poco
de tampón lavando las paredes y espere que penetre. Luego agregue más
tampón.

Consideraciones

1) Nunca deje secar la superficie del lecho de la columna.

2) El buffer debe agregarse lentamente de manera que no altere la superficie
del lecho de la columna, idealmente agregue las soluciones en forma
circular.
3) Cada vez que cambia de solución deje que la última solución entre
completamente para agregar la siguiente, de manera que no se mezclen
en la superficie.

ELUCIÓN DE LA MUESTRA

Eluya la muestra haciendo pasar buffer fosfato pH 7 por la columna, de igual

manera que en el paso de equilibración. Colecte fracciones de aproximadamente
1 mL y tome imágenes (fotografías) de la separación.

Actividad: El resultado será visual, aprovechando la diferencia de colores de los

reactivos utilizados.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado?

Describa a qué moléculas corresponderían los colores de inicio, mezcla y colores
de separación. Apoye esta información con datos bibliográficos
2. De acuerdo al resultado que Ud. obtuvo ¿Qué podría decir, en forma
comparativa, del peso molecular de los compuestos? Busque en bibliografía el
peso de los compuestos para responder la pregunta.
3. Diseñe un método experimental que le permita cuantificar la muestra
eluída.

BIBLIOGRAFÍA

! Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &

Company, NY. 2° Edición Pág. 20 – 27.

! Lehninger, A (1982). Principles Biochemistry. Capítulo 6. Pág. 127 – 129.

35
 LABORATORIO Nº5
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La absorción de las proteínas a intercambiadores iónicos de celulosa, involucra

principalmente, la formación de uniones iónicas múltiples entre los grupos
cargados de la proteína y los grupos disponibles de carga opuesta del
absorbente.

La separación cromatográfica depende, por lo tanto, de la elución diferencial de

las proteínas absorbidas por una variedad de técnicas, basadas ya sea, en la
alteración de la carga de la proteína (pH), o en el uso de agentes capaces de
competir con la proteína absorbida por los sitios cargados en el absorbente.

Materiales

$ Columna de plástico de 10 mL
$ DEAE – celulosa (Dietilaminoetil celulosa)
$ Muestra de proteína de concentración a determinar.
$ Tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7.0
$ Soluciones NaCl 0.05 M; 0.1 M; 0.5 M; 1 M en tampón fosfato de sodio
20 mM pH 7.0

MONTAJE DE LA COLUMNA

Ponga una trozo de papel filtro en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza cierre la salida de la columna y llene ésta con
tampón fosfato 20 mM pH 7.0. Soltando la pinza, deje escurrir el tampón hasta
la mitad de la columna.

Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si

hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo.

A la columna llena hasta la mitad con tampón, comience a agregar DEAE,

previamente equilibrada en el tampón fosfato. Abra la pinza dejando escurrir
tampón, sin dejar que se seque el lecho de celulosa que va formando. Continúe
agregando celulosa hasta completar un lecho de aproximadamente 5 y 8 mL.
Haga pasar 5 mL de tampón por la columna con el fin de equilibrarla.

SEMBRADO DE LA MUESTRA

Una vez equilibrada la columna, deje escurrir el tampón. Cuando esté a punto
de empezar a secarse la superficie del lecho de la columna, agregue la muestra.
Una vez que la muestra ha entrado al lecho de la columna, agregue 5 mL de

36
tampón lavando las paredes y espere a que penetre, recolectando fracciones de
aproximadamente 1 mL.

Consideraciones

1. Nunca deje secar la superficie del lecho de la columna.

2. El buffer debe agregarse lentamente de manera que no altere la superficie
del lecho de la columna, idealmente agregue las soluciones en forma
circular.
3. Cada vez que cambia de solución deje que la última solución entre
completamente para agregar la siguiente, de manera que no se mezclen en
la superficie.

ELUCIÓN DE LA MUESTRA

Con el fin de eluir la muestra, agregue sucesivamente 5 mL de las soluciones de

NaCl en concentraciones crecientes. Colecte el eluído de la columna en
fracciones de 1 mL cada una. Se recomienda marcar el tubo de recolección
cuando cambie de concentración de cada nueva solución, de manera que
después pueda identificar claramente qué tubos corresponden a cada
concentración salina.

CUANTIFICACIÓN DE LA MUESTRA EN EL ELUATO

1. Según lo visto en laboratorios anteriores, la cuantificación de la proteína

en las distintas fracciones se puede realizar mediante el método de Biuret,
Braford o midiendo la absorbancia a 280 nm. Para ello tome 1 mL de las
fracciones y elija alguno de estos métodos para identificar en qué tubos
tiene la proteína separada. Prepare el blanco correspondiente y un par de
estándares apropiados.

2. Actividad: Con los resultados de concentración de proteínas, puede

construir un gráfico en que en la ordenada se señale el número de
fracción y en la abscisa la concentración de proteínas por fracción.
Además, indique con una flecha los cambios de solución salina.

37
CUESTIONARIO

1. ¿Qué puede Ud. concluir del experimento realizado?

2. ¿Qué resultado esperaría, si la columna se equilibrara con tampón fosfato
20 mM pH 7.0 y NaCl 500 mM ? (la muestra aplicada está disuelta en el mismo
tampón).
3. ¿Qué resultado esperaría Ud. si la columna se equilibrara con tampón
pH 5.0? [pI (pto isoeléctrico) de albúmina es 5].
4. Si se realiza el mismo experimento utilizando leche como muestra, Qué
resultados esperaría? ¿Podría identificar las fracciones que contienen lacto
albúmina? Discuta.
5. Se tiene una solución que contiene una enzima más lacto albúmina. Si a
Ud. le interesa sólo la enzima y debe remover la lacto albúmina, ¿cómo realizaría
el experimento si no posee columna?

BIBLIOGRAFÍA
! Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman & Company,
NY. 2° Edición Pág. 16 – 20.

! Lehninger, A (1982). Biochemistry. 2° edición. Editores Word. Capitulo 6. Pág. 127 –

129.
! Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman &
Company.

38
 LABORATORIO Nº6
ELECTROFORESIS

El término electroforesis describió originalmente la migración de partículas

cargadas a través de un medio líquido o semisólido bajo la influencia de un
potencial o campo eléctrico. En la actualidad, el término se refiere a cualquier
técnica por la cual las macromoléculas se separan unas de otras en gradientes
de potencial eléctrico, en base a diferencias en sus cargas netas, sin importar el
medio de conducción.

Las proteínas son polielectrolitos y por lo tanto, son susceptibles de ser

analizadas electroforeticamente. Normalmente, las cadenas laterales de ciertos
aminoácidos son los sitios ionizables en las proteínas (arginina, pKa = 12; lisina;
pKa = 9,7 – 10,7; cisteína, pKa = 8,5 – 9,5; tirosina, pKa = 8,5 – 10,0; histidina,
pKa = 6,0 – 7,0; ácido aspártico y glutámico, pKa = 3,9 – 5,0) y contribuyen a la
carga neta de las proteínas, como también algunos grupos prostéticos (ejemplo:
NAD+). Otras moléculas, además de proteínas, también pueden ser separadas
por electroforesis, después de formar complejos con iones inorgánicos u otros
grupos cargados.

Los principios de la electroforesis son simples: si dos electrodos se sumergen

en una solución que contiene un electrolito y una suspensión de macromoléculas
cargadas, éstas se movilizarán hacia el electrodo de signo opuesto con una
fuerza proporcional a la magnitud de la carga en la macromolécula, y a la
diferencia del potencial eléctrico aplicado. Debido a que cada una de las
partículas que migran van a enfrentar una resistencia friccional a su movimiento,
cada una alcanzará rápidamente una velocidad máxima de migración. Por lo
tanto, si una mezcla de estas macromoléculas se expone a un campo eléctrico
constante, se alcanzarán distintas velocidades máximas para partículas de
distintas cargas netas.

Además de la carga neta y el campo eléctrico, hay muchos otros factores que
influencian la rapidez de la migración electroforética de proteínas, incluyendo
tamaño, pH y la naturaleza del medio a través del cual ocurre la migración.

La velocidad a la cual la proteína migra hacia uno u otro electrodo durante la

electroforesis se llama movilidad electroforética (usualmente expresada en cm2
seg.-1 volt-1 ), y es dependiente del número relativo de cadenas laterales de
aminoácidos cargados positiva y negativamente.

El hecho que una cadena lateral de un aminoácido tenga o no carga, es a su vez

determinado en parte por el pH de la solución de proteínas. A medida que el pH
baja, grupos secundarios cargados negativamente como COO- del ácido
aspártico o glutámico, y el O- de la tirosina, se protonan y, por lo tanto, las cargas
negativas se neutralizan. Al mismo tiempo, algunos grupos amino secundarios
de la lisina y arginina pueden aceptar protones adicionales, aumentando así, el
39
número de cargas positivas asociadas a la proteína. Por el contrario, si el pH
aumenta, los protones se disocian de las cadenas laterales y la proteína se hace
más negativa.

Según lo anterior, el número y tipo de cargas asociadas a las cadenas laterales

de los aminoácidos de una proteína, estarán determinados por el pH de la
solución que las contenga.

A bajo pH, las proteínas tienden a llevar más cadenas laterales positivas que
negativas, por lo tanto la carga neta será positiva y la migración en una
electroforesis será hacia el ánodo (electrodo negativo). A pH alto, las cadenas
laterales negativas predominan y la proteína migra hacia el cátodo (electrodo
positivo). De lo anterior, se deduce que para cada proteína existirá un pH en el
cual el número de cargas positiva y negativas sea igual. Si la electroforesis se
realiza a este pH no habrá migración, debido a que la proteína tendrá una carga
neta igual a cero. Valores de pH del solvente por encima del pI (punto
isoeléctrico) hacen que la carga neta de la proteína sea más negativa y su
movilidad electroforética hacia el cátodo aumenta. En cambio, valores de pH
más bajos que el pI hacen que la proteína sea más positiva, por ende, la
movilidad electroforética aumenta hacia el ánodo. Debido a que el pH influencia
marcadamente la movilidad electroforética, es importante mantener el pH
constante durante la electroforesis. Esto se lleva a cabo incluyendo tampones
en las soluciones electrolíticas.

La electroforesis en geles de poliacrilamida es quizás el sistema electroforético

más útil y versátil en el análisis y separación de proteínas, moléculas pequeñas
de RNA y fragmentos de DNA.

El soporte poliacrilamida ha reemplazado otros medios debido a que el tamaño

del poro del gel se puede controlar variando la concentración de poliacrilamida
y, además, la absorción de proteínas es despreciable. El gel de poliacrilamida
se prepara entrecruzando acrilamida en N,N-metilenbisacrilamida, y el resultado
es una matriz inerte, ósea un gel continuo a través del cual migran las
macromoléculas de interés. Básicamente hay dos formas de realizar
experimentalmente una electroforesis en geles de poliacrilamida: en un tubo
cilíndrico de vidrio o bien entre placas planas de vidrio. Los geles en placas han
reemplazado casi totalmente a los geles en tubos, debido al gran número de
muestras que pueden correrse en forma simultánea.

Para una buena resolución, Ornstein y Davis implementaron la electroforesis

discontinua, desarrollada alrededor de 1960. El término discontinuo se refiere a
que el sistema usa pH discontinuo. El gel se prepara en un tubo de vidrio
cilíndrico o bien entre dos placas planas de vidrio. En ambos casos, existen dos
regiones: gel espaciador y gel separador. El gel espaciador tiene una
concentración de poliacrilamida menor, por lo que el tamaño del poro es mayor
y está preparado, además, en un tampón de menor fuerza iónica y a distinto pH
en comparación con el gel separador. El tamaño de poro más grande significa
40
que las moléculas se moverán más rápido en el gel espaciador. Similarmente, la
fuerza iónica menor significa una mayor resistencia eléctrica, de manera que el
campo eléctrico (V/cm) es mayor en este gel y eso permite a las moléculas
desplazarse con mayor velocidad. Este movimiento rápido en el gel espaciador
resulta en la acumulación de material entre el gel espaciador y el separador. A
medida que las moléculas migran a través del gel separador, las diferentes
proteínas se separan en bandas discretas de acuerdo a su movilidad. Al término
de la corrida electroforética, las bandas se pueden identificar de varias formas:

1. El gel se puede teñir por inmersión en colorante seguido de lavado

exhaustivo para remover colorante no unido. Si es necesaria información
cuantitativa, se puede medir la cantidad de colorante unido a cada una de las
bandas en un densitómetro.
2. Cuando la proteína en estudio es una enzima, se puede practicar tinción
de la actividad enzimática.
3. Si la mezcla de proteínas es radioactiva, las bandas se pueden detectar
por autorradiografía o fluorografía.

Los principales usos de la electroforesis discontinua son: por una parte,

determinar la pureza de una proteína y en segundo término para analizar los
componentes de una mezcla compleja. La pureza, es por supuesto, un término
relativo, ya que se puede obtener una sola banda en el gel, debido a que las
impurezas están a concentraciones muy bajas para ser detectadas.

GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DENATURANTES

En 1967, A. Shapiro, E. Viñuela y J. Maizel mostraron que los pesos moleculares

para la mayor parte de la proteínas se podían determinar midiendo la movilidad
electroforética en geles de poliacrilamida que contiene un poderoso detergente
de carga negativa, dodecil sulfato de sodio (SDS). Esta técnica fue
perfeccionada dos años después por K. Weber y M. Osborn.

A pH cercano al neutro, en 1% SDS y 0,1 M β-mercaptoetanol, la mayoría de las

proteínas, son cadenas que unen SDS, los puentes S–S se rompen por el βMSH
y la estructura secundaria se pierde. Los complejos resultantes que consisten en
subunidades proteicas y SDS asumen una configuración en espiral al azar. Las
proteínas, así tratadas, se comportan como si tuvieran forma uniforme y razón
idéntica carga / masa. Esto es debido a que la cantidad de SDS unido por unidad
de peso de proteína es constante: 1,4 g SDS/g de proteínas.

La carga es entonces determinada por SDS unido y no por la carga intrínseca

de los aminoácidos. Debido a que los espirales al azar de la proteína recubierto
con SDS, tiene igual razón carga a masa, uno puede esperar que la movilidad
de cada molécula proteica sea proporcional al número de enlaces peptídicos por
moléculas, esto es, la movilidad sería proporcional al peso molecular. El gel se
comporta como un “cedazo molecular” a través del cual deben pasar las
moléculas. En cuanto más pequeñas sean, la molécula migrará más
41
rápidamente a través del gel; por lo tanto, la movilidad aumenta con pesos
moleculares decrecientes.

Weber y Osborn demostraron que si una serie de proteínas de peso molecular

conocido son sometidas a electroforesis en un gel, ésta se separa en bandas
(ver figura 1 a), y que el gráfico: distancia de migración v / s log peso molecular
corresponde a una línea recta (Figura 1b). Por lo tanto, si se somete a
electroforesis una proteína de peso molecular de peso desconocido con varias
proteínas con PM conocido o estándar, el PM desconocido puede ser calculado
con una exactitud que varía entre 5 al 10%.

El procedimiento de electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS es una

herramienta poderosa para el análisis de proteínas debido a que se usa para
separar cualquier proteína sin importar su solubilidad en solución acuosa.

Proteína de membrana, componentes proteicos del citoesqueleto y proteínas

que forman parte de agregados macromoleculares grandes pueden resolverse
en especies separadas.

Finalmente, debido a que el método separa polipéptidos de acuerdo al tamaño,

provee también información acerca de PM y la composición de las unidades de
cualquier complejo proteico.

BIBLIOGRAFÍA

! Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman &

Company.
! Chrambach, A. & Robbard, D. (1971) Science, 172, 440.
! LaemmLi, UK (1970) Nature (London) 277, 680 – 685.
! Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. I, T.S. Work + E:
Work Editors A:H: Gordon, Pág. 1 –145 (parte I).

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ELECTROFORESIS DISCONTINUA DE PROTEÍNAS SÉRICAS EN GELES
DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DENATURANTES

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

● La experiencia de este laboratorio consiste en realizar y conocer las

distintas etapas de una electroforesis SDS-page, bajo la guía y material
facilitado por el profesor.

A.- SOLUCIONES: a continuación se listan las soluciones que nos permiten

armar los geles y luego realizar la corrida electroforética. Se detalla la
composición de cada una y las condiciones de preparación y almacenaje. Se
recomienda revisar la función de cada una en el proceso, y las consideraciones
de cuidado que se deben tener en su manipulación.
En su mayoría las soluciones estarán preparadas para realizar este laboratorio
de manera guiada y se puedan optimizar los tiempos de trabajo experimental.

A) Acrilamida – bisacrilamida: 45% - 1.2% (46.2% T – 2.6% C).

Precaución: la acrilamida es neurotóxica. EVITE EL CONTACTO DIRECTO.
Agregar a la solución una punta de espátula de carbón activado agitar durante 2
horas, filtrar por papel Whatman. Guardar a 4 °C.

B) Tampón gel separador 1.5 M Tris – HCl pH 8.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C).

C) Tampón gel espaciador 0.5 M Tris – HCl pH 6.8, 0.4 % SDS (guardar a
4°C).0.5 M

D) Persulfato de amonio 1% Preparar solución fresca; duración una semana

(guardar a 4°C)

E) TEMED ( N; N; N’; N’ – tetrametiletilendiamina)

F) Tampón de corrida 4X 0.1 M Tris, 0.768 M glicina, 0.4 % SDS. Diluir con agua
antes de usar, no es necesario ajustar el pH. (guardar a 4°C).

G) SDS 20% (p/v) (guardar a temperatura ambiente)

H) Azul de Bromofenol: 0.2% azul de Bromofenol en 0.1 M Tris – HCl pH 6.8

I) Tampón de muestra (5X) 0.125 M Tris – HCl pH 6.8, 5 % SDS, 25%

glicerol, 0.05% azul de Bromofenol (guardar a -20°C).

J) Fijador: 30% etanol, 10% ácido acético

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K) Solución de teñido 0.3% azul de Coomasie R – 250 en 50% metanol y 10%
ácido acético. Se disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas), se
filtra, se agrega ácido acético y el agua.

L) Solución de desteñido: 7% ácido acético – 30% metanol

B.- PREPARACIÓN DE GELES

Gel separador (lower)
Acrilamida – Bisacrilamida 45 – 1.2%
Tris – HCl 1.5 M pH 8.8, 1.2% SDS Persulfato 1%
Agua
TEMED

Gel espaciador (upper)

Acril – Bis 45 – 1.2%
Tris – HCl 0,5 M pH 6.8, 0.8 % SDS persulfato 1%
Agua
TEMED

C.- SISTEMA DE MONTAJE

A continuación se ilustra el sistema de electroforesis que se utiliza con el detalle
de sus partes y piezas. Se recomienda revisar la información en su página
comercial de Biorad.

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PROCEDIMIENTO

A) Limpiar las placas de vidrio con acetona y etanol.

B) Armar el sistema según instrucciones del profesor. Fijar los vidrios con las
pinzas y los espaciadores en el sistema de montaje.
C) Agregar el volumen necesario de la mezcla del gel separador hasta una altura
de 5 cm. aprox.
D) Borrar el menisco agregando alcohol para eliminar las burbujas y dejar el gel
derecho y sin imperfecciones. Dejar gelificar (polimerizar) por 20 min
aproximadamente.
E) Preparar el gel espaciador
F) Agregar el volumen del gen espaciador sobre el gel separador hasta que se
rebalse. Insertar la peineta de 8 ó 10 pocillos. Agregar alcohol para evitar que
queden burbujas de aire. Dejar gelificar por 20 min.
G) Una vez gelificado el gel espaciador, retirar la peineta. Realizar un lavado de
los pocillos para evitar que queden restos de acrilamida en ellos.
H) Armar el sistema con las placas que contienen el gel polimerizado dentro de
la cámara electroforética.
I) Agregar el tampón de corrida en el depósito inferior y en el depósito exterior
para asegurar el paso de la corriente.

C.- PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA

A) La cantidad de proteínas séricas a aplicar es de 10 a 20 μg por pocillo.

B) Diluir las muestras con buffer muestra 1:5. Agregar β - mercaptoetanol 5%
final y hervir por 2 min.
C) Los volúmenes recomendables a aplicar por pocillo son de 10–20 μL
D) Aplicar las muestras con micro pipeta adecuada y agregar nuevamente
tampón de corrida sobre las muestras y el depósito superior.

D.- CORRIDA ELECTROFORÉTICA

A) Conectar los electrodos ( polo +, abajo)

B) Aplicar 10 – 15 mA observando la generación de burbujas en la base de
la cámara.
C) Correr el gel hasta que el indicador del frente iónico llegue a 1 cm del
borde del gel (más o menos 2 horas)

E.- FIJACIÓN Y TINCIÓN

A) Transcurrido el tiempo de corrida, retirar los espaciadores y placas de vidrio

y sumergir el gel en solución fijadora y de tinción por una hora.
B) Cambiar a la solución decolorante hasta que las bandas se observen sobre
un fondo claro.
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F.- CÁLCULO DEL PESO MOLECULAR DE LA ALBÚMINA

Una vez terminada su electroforesis usted tendrá en su gel una serie de bandas
correspondientes a las distintas proteínas que ha separado (observar imagen).
Junto a ellas en el primer carril tendrá un estándar de peso molecular que
corresponde a una serie de proteínas de distinto peso molecular conocido,
ordenadas según tamaño decreciente, y que le permiten comparar el tamaño de
sus bandas desconocidas con el tamaño de proteínas de peso conocido.
También podrá observar bandas gruesas y otras más delgadas que indican la
cantidad de proteína que hay en cada banda.

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Actividad: En el gel que se le entregará, mida las distancias de migración en cm
o en mm, de cada una de las bandas del estándar de peso molecular. Grafique
el log de peso molecular versus distancia, según se ilustra en la figura a
continuación.
Luego mida las distancias de migración en cm o en mm, de cada una de las
bandas que necesite identificar.
Por interpolación determine el peso molecular de las bandas que requiera
conocer su peso molecular.

La gráfica entre el log del peso molecular (PM) y la migración relativa durante la
electroforesis es lineal, lo cual permite conocer el PM de una proteína
desconocida.

Fin de semestre.

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