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PROGRAMA NOMBRE DEL CURSO

TQI/TRF MICROBIOLOGÍA

PRACTICA No NOMBRE DE LA PRACTICA DURACIÓN EN HORAS

2 MEDIOS DE CULTIVO Y TIPOS DE SIEMBRA 4/7

1. INTRODUCCIÓN:

Para poder cultivar microorganismos en el laboratorio, es decir, para permitir el

desarrollo y/o crecimiento de un microorganismo bajo condiciones In Vitro, es
necesario conocer los requerimientos nutricionales del microorganismo, su
temperatura optima de crecimiento, su tipo de respiración, el pH óptimo de
desarrollo, entre otras cosas. Sin embargo, conocer todos los factores y variables
involucradas en el crecimiento microbiano resulta bastante complejo. Por ejemplo,
hasta la fecha solamente entre el 0.1 al 10% de las bacterias en el ambiente han
podido ser cultivadas (Rondon et al.,1999; Watts et al., 1999; Tiedje y Stein, 1999;
Handelsman et al., 2002; Torsviky Øvreås, 2002; Torsvik et al., 2002).

Los nutrientes necesarios para el desarrollo y/o crecimiento de los microorganismos

pueden variar ampliamente dependiendo del tipo de microorganismo, y no todos los
nutrientes son requeridos en las mismas cantidades. Algunos nutrientes se
denominan macronutrientes y son requeridos por la célula en grandes cantidades,
mientras que otros llamados micronutrientes solamente se necesitan en bajas
proporciones (Madigan et al., 2015).

Los nutrientes requeridos por las células microbianas están todos constituidos por
elementos químicos, sin embargo, solo un puñado de elementos dominan los
sistemas biológicos y son esenciales. Dentro de este selecto grupo se encuentra el
hidrogeno (H), el oxígeno (O), el carbono (C), el nitrógeno (N), el fosforo (P), el
sulfuro (S) y el selenio (Se). La Figura 1 muestra los porcentajes aproximados en
peso seco de estos elementos dentro de una célula microbiana.
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Figura 1. Porcentajes de los elementos químicos esenciales en la célula microbiana

dados en peso seco. Tomado de Madigan et al., (2015).

2. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA:

Un medio de cultivo es una solución de nutrientes que permite el crecimiento y

desarrollo de uno o varios microorganismos. Existen diferentes tipos de medios de
cultivo y pueden ser clasificados con base en distintos criterios (Madigan et al.,
2015).

Los medios de cultivo definidos son aquellos en los cuales se conoce con exactitud
la composición de elementos químicos inorgánicos y orgánicos a nivel cuantitativo y
cualitativo. En contraparte, los medios de cultivo complejos o indefinidos son
aquellos en los cuales se desconoce la composición química exacta (Madigan et al.,
2015).

Según su estado físico podemos clasificar a los medios de cultivo en sólidos si

contienen de 12 a 15 gramos de agar por litro, semisólidos si contienen 3 gramos de
agar por litro o líquidos si no contienen agar (Universidad de Salamanca, 2018).

Dependiendo de la función del medio de cultivo se pueden clasificar en generales

(permiten el crecimiento de una amplia gama de microorganismos y no contienen
agentes selectivos), enriquecidos (medios complejos adicionados con sustancias
altamente nutritivas como el suero o la sangre que permiten el crecimiento de
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microorganismos exigentes), selectivos (contienen componentes que inhiben el

crecimiento de algunos microorganismos pero no de otros), diferenciales (medios en
los cuales usualmente se agrega un indicador, generalmente un tinte, que revela,
mediante un cambio de color, si se ha producido una reacción metabólica particular
durante el crecimiento del microorganismo), y de almacenamiento y transporte
(Madigan et al., 2015).

3. OBJETIVOS:

General:
Desarrollar las habilidades y destrezas básicas para la elaboración y uso de
medios de cultivo microbianos.

Específicos:

- Reconocer los diferentes tipos de medios de cultivo y comprender su fundamento.

- Identificar las variables fisicoquímicas que afectan el crecimiento y desarrollo

microbiano.
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4. MATERIALES Y REACTIVOS:

Material suministrado Reactivos suministrados Material que deben traer

por el laboratorio por el laboratorio los estudiantes
Bacteria en medio de cultivo
Microscopio (Gr) Láminas (Gr)
sólido (Gr)
Mechero (Gr) Azul de lactofenol (Gr) Laminillas/cubre objetos (Gr)
2 Erlenmeyer de 250 mL 250 mL de solución salina al Marcador delgado Sharpie
(Gr) 0,9% (Cu) (indeleble) (Gr)
Asa redonda/curva (Gr) 450 mL de Agar Nutritivo Guantes (Es)
Asa recta (Gr) Gorro/cofia (Es)
Probeta 100 mL (Gr) Tapabocas (Es)
2 cajas de Petri estériles
Toallas desechables (Gr)
(Es)
2 cajas de Petri estériles
Bandas de caucho (Gr)
(Gr)
Espátula (Gr) Encendedor (Gr)
Balanza (Cu) Vinipel (Gr)
Incubadora (Cu) Alcohol antiséptico (Gr)
Autoclave (Cu) Cámara fotográfica (Gr)
Malla de Asbesto (Gr) Papel aluminio (Gr)
Trípode (Gr) Papel Kraft (Gr)
Hisopos (Gr)
Es: Por estudiante Gr: Por grupo Cu: Por curso

5. PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:

• Utilice en todo momento los elementos de protección personal.

• Trabaje cerca al mechero para evitar la contaminación de los medios
de cultivo y la diseminación no controlada de microorganismos.
• Evite el uso de celulares y tablets.
• En ninguna circunstancia consuma alimentos o bebidas.
• Rotule los Erlenmeyer y las cajas de Petri.
• Al finalizar la practica todos los reactivos utilizados deben ser
desechados como riesgo biológico.

6. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
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Preparación de medios de cultivo

En la primera parte de la práctica usted y su grupo deberán realizar los

cálculos necesarios para preparar 2 cajas de Petri con agar Sabouraud por
grupo y 2 cajas de Petri con agar Nutritivo por cada integrante del grupo.

1. Observe y anote la concentración a la cual debe prepararse cada uno de

los medios de cultivo (Sabouraud y Nutritivo) de acuerdo con el fabricante (se
encuentra en la etiqueta del frasco que contiene el medio de cultivo).

2. Calcule la cantidad que debe pesar de cada uno de los medios de cultivo
(Sabouraud y Nutritivo) y el volumen de agua destilada que debe adicionar
para obtener la concentración indicada por el fabricante, de acuerdo con los
requerimientos de su grupo. Tenga en cuenta que el volumen de medio de
cultivo que debe tener una caja de Petri es entre 20 y 25 mL.

3. Rotule cada uno de los Erlenmeyer con el grupo y el tipo de medio de

cultivo (Sabouraud o Nutritivo). Pese la cantidad total de cada uno de los
medios de cultivo (la cantidad que requerirá para servir todas las cajas de
Petri con ese medio de cultivo) que calculo anteriormente y luego adiciónela
en el Erlenmeyer de 250 mL marcado con el grupo y el nombre del medio de
cultivo (Sabouraud o Nutritivo).

4. Adicione el volumen de agua destilada que calculó con anterioridad a cada

Erlenmeyer que contiene el medio de cultivo, para obtener la concentración
requerida por el fabricante con ayuda de la probeta de 100 mL. Caliente a
fuego lento usando el trípode y la malla de Asbesto, hasta el inicio de la
ebullición.

5. Coloque un tapón de aluminio sobre cada uno de los Erlenmeyer (Figura 2).
Sobre el tapón de aluminio coloque un tapón de papel Kraft y asegúrelo
usando una banda de caucho alrededor de este.
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Figura 2. Medio de cultivo en Erlenmeyer con tapón de aluminio.

6. Lleve a esterilizar los Erlenmeyer que contienen los medios de cultivo

(Sabouraud y Nutritivo) en el autoclave por 15 a 20 minutos, a 121°C y 15
libras de presión. Rotule las cajas de Petri con el grupo y el tipo de medio de
cultivo (Sabouraud o Nutritivo).

7. Sirva el medio de cultivo en cada una de las cajas de Petri mientras aún se
encuentre caliente (evite que se solidifique en el Erlenmeyer). Adicione el
medio de cultivo por encima de la mitad de la caja (Figura 3), hágalo siempre
cerca al mechero y una sola caja a la vez. Cada vez que termine de servir una
caja ciérrela inmediatamente y colóquela en un lugar plano (tenga cuidado de
no regar el medio de cultivo) hasta que se solidifique el agar.
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Figura 3. Medio de cultivo servido en una caja de Petri.

Siembra

En la segunda parte usted y su grupo deberán aislar al menos un hongo

filamentoso empleando las cajas de Petri con agar Sabouraud previamente
preparadas. Posteriormente, deberán realizar la caracterización macroscópica
y microscópica de dicho hongo a partir de los criterios vistos en clase (Esto
corresponderá a un quiz de laboratorio).

1. Sumerja la punta de 2 hisopos en solución salina al 0,85% (p/v).

2. Pase los 2 hisopos sobre superficies o lugares donde se podrían encontrar

hongos filamentosos (hojas de las plantas, tierra, lugares húmedos, etc.)
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3. Junto al mechero abra una de las cajas de Petri que contiene el agar
Sabouraud y pase uno de los hisopos sobre su superficie asegurándose de
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cubrir toda la caja (siembra masiva). Repita el procedimiento con el otro

hisopo en la caja de Petri restante con agar Sabouraud.

4. Envuelva el borde de las 2 cajas de Petri con vinipel y llévelas a incubación

entre 5 y 7 días a 25°C.

5. Seleccione uno de los hongos filamentosos que crecieron y se

desarrollaron en el agar Sabouraud y describa sus características
macroscópicas (color del anverso y reverso, presencia o ausencia de
pigmentos difusibles al medio, y tipo de textura) y microscópicas (hifas y
conidios hialinos o dematiáceos, hifas septadas o cenocíticas, y si se
observan o no cuerpos fructíferos). No olvide el registro fotográfico tanto de
las características macroscópicas como microscópicas.

6. Para la observación de características microscópicas tome una pequeña

muestra del hongo filamentoso con una aguja de disección recta o con el asa
recta y colóquela sobre una lámina (abra la caja de Petri siempre junto al
mechero). Luego agregue una gota de azul de lactofenol y coloque una
laminilla/cubre objetos encima y observe en el microscopio óptico con los
objetivos 10X y 40X.

7. El quiz lo deberán entregar por grupos de laboratorio, en un archivo digital

que contenga la descripción macroscópica y microscópica, junto con las fotos
que lo soporten vía correo electrónico.
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Aislamiento

En la tercera parte cada integrante del grupo deberá realizar el aislamiento de la

bacteria problema en dos cajas de Petri con agar Nutritivo, la cual seguirán usando
en las siguientes prácticas de laboratorio. Para esto deberán realizar el
procedimiento que se ilustra en la Figura 4.

Figura 4. Procedimiento para aislar una bacteria. Tomado de Madigan et al., (2015).

En las siguientes prácticas de laboratorio se realizarán aislamientos de la bacteria

problema y en la última práctica se evaluará la capacidad del estudiante para aislar
la bacteria. Se espera que el estudiante logre un aislamiento similar al de la Figura 5,
con al menos 10 colonias aisladas y un cultivo axénico.

1. Envuelva el borde de las cajas de Petri con vinipel y llévelas a incubación entre 24
a 48 horas a 37°C.

2. Observe si logró aislar la bacteria problema y obtener un cultivo axénico.

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Figura 5. Aislamiento bacteriano. Tomado de Madigan et al., (2015).

7. PRELABORATORIO:

1. ¿Cuál es el fundamento del caldo nutritivo y para que se utiliza?

2. ¿Cómo observo el crecimiento de las bacterias cuando son cultivadas en caldos?

3. ¿Por qué se deben esterilizar los medios de cultivo antes de inocular uno o varios
microorganismos?

* Fundamento de un medio de cultivo: se refiere a cuál es la función de cada uno

de los componentes que integran el medio de cultivo.
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8. REFERENCIAS

Handelsman J, Liles M, Mann D, Riesenfeld C, Goodman R (2002) Cloning the

metagenome: culture-independent access to the diversity and functions of the
uncultivable microbial world. In: Methods in Microbiology, vol. 33. Functional
Genomics. Wren B and Dorrel N, (eds). Academic Press. Amsterdam, The
Netherlands. pp: 241-255

Madigan M, Martinko T, Bender J, Buckley K, Stahl D, David A (2015) Brock Biology

of Microorganisms. Thirteenth Edition. Boston: Pearson.

Rondon M, Goodman M, Handelsman J (1999) The earth’s bounty: assessing and

accessing the soil microbial diversity. Trends in Biotechnology 17: 403-409

Tiedje J, Stein J (1999) Microbial diversity: strategies for its recovery. In: Manual of
Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain A and Davies J(eds). ASM Press.
Washington, D.C. USA. pp: 682-692

Torsvik V, Øvreås L (2002) Microbial diversity and function in soil: from genes to
ecosystems. Current Opinion in Microbiology 5: 240-245

Torsvik, V, Øvreås L, Thingstad T (2002) Prokaryotic diversity- Magnitude, dynamics,

and controlling factors. Science 296: 1064-1066

Universidad de Salamanca (2018) Capítulo 2: Medios de cultivo, Sección 2: Tipos de

medios de cultivo. Disponible en
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c
2s2.htm

Watts J, Huddleston-Anderson A, Wellington E (1999) Bioprospecting. In: Manual of

Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain A, Davies J (eds). ASM Press.
Washington, D.C. USA. pp: 631-641