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MACROPROCESO MISIONAL Fecha: 15/12/2017

PROCESO FORMACIÓN
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PROGRAMA NOMBRE DEL CURSO

Tecnología en Química Industrial
Bioquímica
Tecnología en Regencia de Farmacia

PRACTICA No NOMBRE DE LA PRACTICA DURACIÓN EN HORAS

2 Actividad enzimática de la amilasa (VIRTUAL) 4

1. INTRODUCCIÓN:

Las enzimas son proteínas con actividad catalítica que aceleran reacciones bioquímicas. La
mayoría de las enzimas sigue una cinética de Michaelis-Menten (figura 1). Esta curva se obtiene
mediante la determinación de las velocidades iniciales (Vo) de reacción en función de la
concentración de sustrato [S]. Se observa al principio una cinética de orden 1, donde la velocidad
Vo tiene una dependencia directamente proporcional con la concentración. A concentraciones
mayores de sustrato, la velocidad Vo tiene una dependencia de orden 0 con la concentración
(región de saturación de la enzima).

Figura 1. Cinética de Michaelis-Menten. La variación de la velocidad inicial con la concentración

describe una curva hiperbólica rectangular de 2 parámetros, Vmax y Km.

La actividad de las enzimas depende de varios factores fisicoquímicos: la temperatura, el pH, la

fuerza iónica, la presencia de inhibidores o activadores, la presencia o ausencia de cofactores
(iones y coenzimas), la concentración de sustrato, etc.

Para estudiar la actividad de una enzima en distintas condiciones se determinan las constantes
cinéticas Km y Vmax a partir de los datos cinéticos. Para ello se pueden aplicar varios métodos de
linealización de la ecuación de Michaelis-Menten. Uno de estos es el método de Lineweaver-
Burk, donde se grafica el inverso de las velocidades en función del inverso de las concentraciones

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(figura 2). Km es la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de la

velocidad máxima Vmax.

Figura 2. Gráfico de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk. Al hacer la regresión lineal, la

pendiente de la recta es igual a Km/Vmax y el intercepto es igual a 1/Vmax.

En una reacción enzimática general, la enzima E se une específicamente a un sustrato S y forma

un complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente, el producto P se disocia de la enzima. La
constante de Michaelis Km comprende las constantes cinéticas de formación (k1) y disociación
(k-1) del complejo ES, y la constante de formación del producto (k2), figura 3. Valores pequeños
de Km implican valores grandes de k1 y pequeños de k-1, es decir, una mayor tendencia a la
formación del complejo enzima-sustrato ES. Así pues, valores pequeños de Km se interpretan
como una mayor afinidad de la enzima por el sustrato.

k−1 +k 2
Km=
k1

Figura 3. Reacción enzimática general y significado cinético de la Km.

2. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA:

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Consulte y resuelva las siguientes preguntas como parte de la preparación de la práctica.

 ¿Qué es una enzima? ¿Cuáles son los factores que pueden afectar la actividad enzimática?
 ¿Qué es la amilasa? Consulte para esa enzima las condiciones óptimas de actividad, clases,
codificación y nombre sistemático, activadores e inhibidores.
 ¿Qué es la invertasa o sacarasa? Consulte para esa enzima las condiciones óptimas de
actividad, clases, codificación y nombre sistemático, activadores e inhibidores.
 Consulte sobre las reacciones de identificación de carbohidratos de Lugol y Benedict.
¿Cuándo se consideran resultados positivos o negativos?

3. OBJETIVOS:

Para la práctica cada estudiante debe plantear un objetivo general y al menos dos específicos.

4. MATERIALES Y REACTIVOS:

MATERIALES
AGITADOR DE VIDRIO PIPETA GRADUADA 1 mL VASO DE PRECIPITADO DE 500 mL
CHURRUSCO PIPETA GRADUADA 10 mL VASO DE PRECIPITADO DE 250 mL
EMBUDO ANALITICO DE VIDRIO PIPETA GRADUADA DE 5 mL VASO DE PRECIPITADO DE 100 mL
FRASCO LAVADOR PIPETA PASTEUR VIDRIO VASO PRECIPITADO 50 mL
GRADILLA PIPETEADOR VIDRIO DE RELOJ
MALLA DE CERAMICA TERMOMETRO
TETINA DE CAUCHO PARA PIPETA
MECHERO
PASTEUR
MICROESPATULA TRIANGULO DE PORCELANA
MICROPIPETA 1000 µl TRIPODE
PINZA PARA TUBO DE ENSAYO TUBOS DE ENSAYO GRANDES
REACTIVOS
SOLUCIÓN BUFFER DE FOSFATOS SOLUCIÓN DE ALMIDÓN AL 0.1% EN
SOLUCIÓN DE SACAROSA AL 2%
0.2 M PH 6.8 NaCl al 0.9%
SOLUCIÓN BUFFER DE CITRATO SOLUCIÓN DE CLORURO DE PLATA
REACTIVO DE LUGOL
0.2 M PH 3.5 (AgCl) al 1%
SOLUCION BUFFER DE
REACTIVO DE BENEDICT HIELO
BICARBONATO 0.2 M PH 8.0 (3)

5. PRECAUCIONES:

Para el preinforme el estudiante debe realizar las fichas técnicas de cada uno de los reactivos,
teniendo en cuenta riesgos, precauciones y colector de desecho.

Cada grupo debe traer a la práctica los siguientes materiales: 3 Vasos desechables, 1 sobre (al
menos 10 g) de levadura para panadería, solución salina estéril o suero fisiológico, marcador
indeleble (Sharpie), papel absorbente, y los materiales básicos de laboratorio.

6. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA AMILASA

6.1 Apertura del laboratorio virtual:

1. Para este laboratorio virtual, se trabajará con una herramienta digital que trabaja con
extensión flas player, la cual normalmente ya no tiene soporte con el uso de navegadores
convencionales. Para poder utilizar la herramienta desde su navegador, debe instalar en su
navegador una extensión que le permita abrir ese tipo de archivos en la web. Se recomienda
instalar la aplicación “flash player for web 2021” desde el buscador de extensiones de Google
Chrome.
https://chrome.google.com/webstore/detail/flash-player-for-web-
2021/kajnfloacekelnfgckmnnkeeaajfkeja

2. Una vez instalado el complemento, o asegurándose que su navegador es capaz de reproducir

contenido flash player, ingrese en la siguiente dirección web y seleccione la opción Amylase
dentro de las tres opciones disponibles de <PhysioEx™ Lab Experiments>.
https://wps.pearsoned.com/bc_physioex_8_ap_lms/112/28698/7346880.cw/index.html

En esa misma página podrá encontrar documentación relacionada con el laboratorio en formato
PDF.

3. Si su navegador es compatible, podrá visualizar el espacio virtual para iniciar el laboratorio

(Figura 1.)

Figura 1. Interfaz inicial del laboratorio virtual

6.2 Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimática:

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1. Tome 3 tubos de ensayo y ubíquelos sobre las posiciones 1, 2 y 3 del área de incubación. En
cada tubo agregue buffer pH 7.0, solución de amilasa y solución de almidón. Basta con arrastrar
cada tubo, y cada gotero al espacio correspondiente.

2. Caliente el tubo 1 hasta ebullición. Para eso, de clic sobre la base del tubo para que ingrese en
el baño térmico y seleccione la opción boil. El tubo se llevará a ebullición unos segundos y
regresará a su posición inicial, en donde regresará a temperatura ambiente.

3. Enfríe el tubo 2. Siga el mismo procedimiento que con el tubo 1, pero seleccionando la opción
freeze.

4. El tubo 3 no tendrá ningún tratamiento térmico, por lo que todo el tiempo se mantendrá a
temperatura ambiente.

5. Someta los tres tubos a incubación a 37 °C durante 60 minutos. Para ello, debe seleccionar la
temperatura y el tiempo correspondientes, y seleccionar la opción incubate. Para la simulación
del proceso, cada segundo equivale a 1 minuto completo.

6. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, vierta la mitad del contenido de cada tubo en
tres tubos de ensayo disponibles ahora en el gabinete de reactivos. Basta con que arrastre cada
tubo hacia otro limpio en el gabinete.

7. A los tubos del gabinete, agregue reactivo de Lugol (IKI). Observe los resultados, analice y
saque sus conclusiones.

8. A los tubos que están sobre el área de incubación, agregue reactivo de Benedict y llévelos a
ebullición. Observe los resultados, analice y saque sus conclusiones.

9. Para concluir el experimento, de clic sobre el botón Record data en la parte inferior en donde
se almacenarán los resultados. Lleve cada tubo a la zona de lavado test tuve washer, para
reiniciar el aplicativo.

6.3 Influencia del pH sobre la actividad enzimática:

1. Tome 4 tubos de ensayo y ubíquelos en las posiciones 1, 2, 3 y 4 del área de incubación. En

cada tubo agregue solución de amilasa y solución de almidón.

2. En el tubo 1 agregue agua desionizada, en el tubo 2 agregue buffer pH 2.0, en el tubo 3

agregue buffer pH 7.0 y en el tubo 4 agregue buffer pH 9.0.

3. Someta los cuatro tubos a incubación a 37 °C durante 60 minutos.

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4. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, vierta la mitad del contenido de cada tubo en
cuatro tubos de ensayo disponibles ahora en el gabinete de reactivos.

5. A los tubos del gabinete, agregue reactivo de Lugol (IKI). Observe los resultados, analice y
saque sus conclusiones.

6. A los tubos que están sobre el área de incubación, agregue reactivo de Benedict y llévelos a
ebullición. Observe los resultados, analice y saque sus conclusiones.

7. Para concluir el experimento, de clic sobre el botón Record data en la parte inferior en donde
se almacenarán los resultados. Lleve cada tubo a la zona de lavado test tuve washer, para
reiniciar el aplicativo.

6.4 Especificidad enzimática:

1. Tome 7 tubos de ensayo y ubíquelos en las posiciones disponibles en el área de incubación. En

cada tubo agregue los siguientes reactivos:

Tubo Reactivo 1 Reactivo 2 Reactivo 3

1 Amilasa Almidón Buffer pH 7
2 Amilasa Maltosa Buffer pH 7
3 Amilasa Celulosa Buffer pH 7
4 Amilasa Glucosa Buffer pH 7
5 Peptidasa Almidón Buffer pH 7
6 Bacteria Almidón Buffer pH 7
7 Bacteria Celulosa Buffer pH 7

2. Someta los tubos a incubación a 37 °C durante 60 minutos.

3. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, vierta la mitad del contenido de cada tubo en
los tubos de ensayo disponibles ahora en el gabinete de reactivos.

5. A los tubos del gabinete, agregue reactivo de Lugol (IKI). Observe los resultados, analice y
saque sus conclusiones.

6. A los tubos que están sobre el área de incubación, agregue reactivo de Benedict y llévelos a
ebullición. Observe los resultados, analice y saque sus conclusiones.

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7. Para concluir el experimento, de clic sobre el botón Record data en la parte inferior en donde
se almacenarán los resultados. Lleve cada tubo a la zona de lavado test tuve washer, para
reiniciar el aplicativo.

6.5 Inhibición de la actividad enzimática:

La inhibición enzimática de la amilasa no se puede trabajar utilizando el simulador, debido a que

en los reactivos disponibles no se incluye un inhibidor.

Para esta parte de la práctica. Consulte sobre la inhibición de la amilasa, e indique desde el
punto de vista teórico, lo que ha debido ocurrir con la metodología que se propone a
continuación, analizando los resultados y el fundamento y análisis de dichos resultados.

1. En dos tubos de ensayos marcados como 1A y 2A, agregue 2 mL de solución de amilasa

(saliva). Únicamente en el tubo 1A, adicione 0.5 mL de solución de AgCl al 1% y agite.

2. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego adicione a cada uno 2
mL de buffer de fosfatos pH 6.8, y 4 mL de solución de almidón. Mezcle e incube durante 20
minutos en baño maría a 37 °C.

3. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, vierta la mitad del contenido de cada tubo en
dos tubos de ensayo limpios y marcados respectivamente como 1B y 2B.

4. A los dos tubos A, agregue 0.5 mL del reactivo de Lugol. A los dos tubos B agregue 1 mL del
reactivo de Benedict calentando a baño maría durante 3-5 minutos a temperatura de ebullición
del agua.
5. Observe y registre los resultados, analice y saque sus conclusiones. Los desechos de esta
prueba deben descartarse en el colector de soluciones inorgánicas sin metales pesados.

7. SEGÚN EL DESARROLLO EXPERIMENTAL REALICE LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES:

 Analice para cada reacción los resultados obtenidos, a la luz de los factores que afectan la
actividad enzimática: Concentración, temperatura, pH, etc.
 ¿Qué es la especificidad enzimática? Y ¿Cómo se evidencia en la práctica?
 ¿Qué es la inhibición enzimática? ¿Cómo se evidencia en la práctica? ¿Quién es y cómo actúa
el inhibidor utilizado?

8. BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA:

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Nelson, David L., Michael M. Cox., Lehninger. Principios de bioquímica. Omega. Séptima edición,
2017.

Horton, Moran, Scrimgeour, Perry, Rawn. Principios de Bioquímica. 4ta o 5ta edición.

FIRMA ELABORÓ GUÍA FIRMA REVISO GUÍA

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