Facultad de Medicina, UdelaR

Informe Caso 2 BCM

Estudio de Caso: Biología Celular y Molecular

Integrantes: Sofía Beltran, Nicolás Martínez, Carolina Lantean y Paulina Fregeiro

Docente: Paola Froster

18 de agosto de 2024

Montevideo, Uruguay
Objetivos

● Estudiar tecnicas de analisis de ADN: PCR y electroforesis

● Investigar el método secuenciación de ADN de Sanger
● Interpretar los resultados de la electroforesis

Marco Teórico

Para comenzar se definirá la mutación que se estudia en el caso. El síndrome

de X frágil es un síndrome genético hereditario causante de deficiencia mental.
Como se menciona en el caso, es causado por una expansión anómala en el gen
FMR1 en una zona no codificante del cromosoma X. En los individuos sin mutación
el número de repetidos está entre 6 y 45, en los individuos con un tipo de alelo
incierto entre 45 y 54. En los individuos con mutación el número es mayor a 200, lo
que genera una inactivación del gen. La inactivación de este gen provoca la
ausencia de proteína FMPR (Fragile X Mental Retardation Protein), muy abundante
en neuronas. Los individuos con un número de repeticiones entre 55 y 200 se
denominan premutados, estos siguen produciendo proteína FMPR suficiente para
un desarrollo normal de las neuronas. La prevalencia del síndrome es baja y
mayoritaria en hombres. La cifra de prevalencia para hombres es de 1:4.000 y en
mujeres 1:8.000 aproximadamente (Molina, Justo y Fuentes, 2010).
Para estudiar la presencia de este síndrome se puede amplificar la región del
ADN de interés gracias a un estudio, PCR (Polymerase Chain Reaction) o reacción
en cadena de la polimerasa la cual es un procedimiento en el cual se busca obtener
muchas veces una secuencia específica de ADN o ARN partiendo de una o muy
pocas secuencias en un proceso en el que varía la temperatura y son agregados
ciertos componentes, por un lado se necesitan los cuatro tipos de
desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP) quienes formarán las diferentes copias de
secuencias, luego se necesitan cebadores específicos para la región que deseamos
amplificar, esto significa que son complementarios a la hebra en la que se encuentra
la secuencia que buscamos. Los cebadores son secuencias cortas que permiten
que la ADN polimerasa se una para poder seguir la replicación, pero no sirve
cualquier enzima ADN polimerasa, necesitamos una que soporte altos cambios de
temperatura, por lo cual la que nosotros tenemos en nuestro organismo no nos
servirá y por eso la Taq polimerasa es la más usada ya que se ubica en la
proximidad de manantiales de agua caliente. Se necesitará también una solución
buffer para que mantenga el PH apropiado para la enzima y por último se utilizaran
iones divalentes, el más común es el Mg2+ ya que su carácter positivo ayuda a
estabilizar el carácter negativo del ADN (Facultad de Medicina del Uruguay - Udelar,
2023).
El procedimiento del método comienza por la desnaturalización. Como su nombre lo
indica aquí buscaremos separar las hebras del ADN molde, por medio del
calentamiento a una temperatura alrededor de 94°C, aun así la temperatura
depende de la proporción de G+C (estos dos nucleótidos generan un enlace un
poco más fuerte que el que tienen A + T), como también el largo de la cadena que
buscamos desnaturalizar La segunda etapa es el ligamiento. Aquí es donde entran
en juego los cebadores, se baja la temperatura a una en la que los cebadores
puedan actuar (alrededor de 50 o 60 °C) y unirse por enlaces de hidrógeno (o
puentes de hidrógeno)
La última etapa es la extensión. Aquí la mezcla se vuelve a calentar, alrededor de
los 72 °C, pero esta vez en presencia de la Taq ADN polimerasa (una temperatura
óptima para esta enzima en específico pero no para la de nuestro organismo), la
solución buffer, los dNTP´s y el Mg2+. y aquí se produce la replicación.
Debemos recordar que este es solo un ciclo, esto se tiene que hacer muchas veces
para obtener la cantidad necesaria, unos 25 ciclos sería óptimo (Cheriyedath, 2018).
Pero este no fue el único método de análisis del ADN visto en el caso,
también vimos una imagen de una electroforesis, el cual es un procedimiento que
busca separar ADN, ARN o proteínas (depende del método que usemos) según su
tamaño y carga eléctrica, tiene múltiples usos desde forenses hasta para
diagnosticar enfermedades y para la investigación médica, y si bien existen muchos
tipos de electroforesis, la presentada en el caso es la electroforesis en el gen de
agarosa, se utiliza como soporte sólido un gel preparado con agarosa, este tipo de
electroforesis se usa comúnmente para separar moléculas de gran tamaño como
ácidos nucleicos, como es el caso (NIH, 2019).
El proceso es relativamente simple. El primer paso inicia con la extraccion y
preparacion de la muestra de ADN, seguiremos esa misma muestra se amplifica por
PCR la muestra específica que buscamos y le aplicamos la tinción, que dependerá
de lo que deseamos ver, en su momento se usaron tinciones radioactivas, ahora
usamos una menos dañina y que es más simple, pero siempre la tinción depende
del tipo de electroforesis que hagamos y lo que deseemos ver, pero ¿que veríamos?
En un pocillo (cualquiera) debemos poner los marcadores de peso molecular, que
son secuencias que sabemos exactamente su peso y que usaremos para poder
controlar el peso del resto de bandas, aquí veremos múltiples bandas. Luego
dependiendo de cuantas muestras tengamos será la cantidad de pocillos que
veremos. Usaremos el control positivo que es una muestra que contiene el
fragmento que nos interesa corroborar que se haya producido completamente y por
último usaremos un control negativo, una muestra que contiene todos los reactivos
utilizados en la PCR pero no ADN aquí esperamos no ver ninguna banda, si la
vemos es que la muestra está contaminado, pero, ¿qué significa que las bandas
están a diferentes alturas del gel de agarosa? Aquí es donde entra en juego el
tamaño, la carga de las moléculas de ADN y los polos de donde se corre la
electroforesis. Como sabemos, el ADN tiene carga negativa entonces, será atraída
por el lado positivo hacia el polo negativo, (Catodo y Anodo respectivamente) pero
esto es en un tiempo determinado ya que si lo dejamos un tiempo indefinido todas
las muestras llegan al final aunque con tiempos distintos, gracias a la porosidad del
gel agarosa (Gonzalez, 2022).
Cuando una electroforesis nos da un resultado incierto, como ocurrió en este
caso podríamos usar el Método de Sanger (Khan Academy, s.f.), un método que es
utilizado para determinar la secuencia de nucleótidos en el ADN e identificar
mutaciones. Desarrollado por Frederick Sanger en 1977, este método comienza por
separar una cadena de ADN de la cadena complementaria, la cuál sera sintetizada
por la enzima polimerasa (proteína aislada o de restricción que corta secuencias de
ADN en sitios específicos), utilizando también didesoxinucleótidos (ddNTP)
marcados con tintes fluorescentes o radiactivos que actúan como "terminadores de
cadena". Estos marcan los extremos de los fragmentos y permiten la determinación
de la secuencia. Durante la replicación, estos ddNTP se insertan en la cadena de
ADN en lugar de nucleótidos normales, lo que interrumpe la síntesis y crea
fragmentos de ADN de diferentes longitudes (Merck, 2024). Estos fragmentos se
pueden separar y analizar para determinar la secuencia exacta de bases en la
cadena de ADN original (TG Test Genéticos, 2021)

Discusión

El caso de esta semana trata sobre las técnicas de análisis genético que
permiten identificar la presencia de mutaciones. En esta ocasión, se quiere
investigar si Florencia y Pedro tienen el Síndrome de X frágil ya que están
evaluando la posibilidad de realizar una fecundación in vitro y tienen antecedentes
familiares con mutaciones. Para ello se realiza un PCR con cebadores específicos
que amplifica la región de repetidos donde se encontraría la mutación. Para
observar los resultados, se corren los segmentos de ADN amplificados por un gel. Si
se observa el gel, se puede ver que tiene bandas de control, marcadores de peso
molecular y otras dos que muestran diferentes cantidades de repetidos, lo que sirve
para poder leer los resultados de Pedro y Florencia.
A partir de lo trabajado en clase y planteado en los objetivos, se puede decir
que el caso de Florencia es incierto, esto se pudo ir deduciendo a medida que se
fueron analizando los temas más relevantes. En un principio se sabe que la técnica
de electroforesis tiene ciertas limitaciones dado que solo se pueden observar hasta
70 repetidos CGG y una persona enferma es aquella que tiene más de 200, por lo
que no se pueden identificar individuos enfermos con esta técnica y se debe
secuenciar su ADN para tener un diagnóstico preciso. Con estos conceptos
abordados y sabiendo que el síndrome a tratar en este caso está ligado al
cromosoma X nos anticipa que es hereditario tanto del padre como de la madre. Por
ende, si analizamos la electroforesis del caso teniendo como referencia la tabla,
podemos confirmar que Pedro es sano y no sería portador de este síndrome, en
cambio en el caso de Florencia solo podemos observar una X, la cual refleja que es
sana, pero al no ver su otra X en dicha técnica damos por hecho que es un caso
incierto. Ya que no podemos visualizar su localización para afirmar si es portadora
de este síndrome. Se debe aplicar el método Sanger para descubrir si Florencia
tiene dos X con la misma cantidad de repetidos o que tiene el alelo mutado.

Conclusión

En relación con el caso tratado llegamos a la conclusión que es

imprescindible conocer las diferentes técnicas que emplea la biología molecular,
específicamente la técnica de PCR y de la electroforesis, así como sus pasos para
la realización y el correspondiente análisis para la interpretación de los resultados.
Gracias a la discusión generada en clase, nos permitió conceptualizar qué el
síndrome X frágil (SXF) es un trastorno hereditario genético, el cual provoca
discapacidad intelectual.
El antecedente de esta enfermedad en una pareja (Pedro y Florencia) es lo
que lleva a una ginecóloga a solicitar un test de diagnóstico para dicho síndrome, al
obtener los resultados e interpretar la electroforesis presentada en el caso, llegamos
a la conclusión que Pedro es sano, ya que según la tabla de referencias por
repetidos presentadas, así nos lo indica. Así mismo, no podemos afirmar lo mismo
para Florencia, puesto que observamos expresado una sola X o en su defecto la X
faltante puede estar expresada con la misma cantidad de repeticiones o por encima
de 70 repeticiones, lo cual no lo podemos ver en la electroforesis presentada, por
ende no podemos confirmar con exactitud el resultado para Florencia. Esto lleva a el
cuestionamiento sobre otras técnicas de análisis genético más específicas como el
Método Sanger.

Referencias Bibliográficas

Cheriyedath, S. (2018). History of Polymerase Chain Reaction (PCR).

News-Medical.net.
https://www.news-medical.net/life-sciences/History-of-Polymerase-Chain-Rea
ction-(PCR).aspx

Facultad de Medicina del Uruguay - Udelar (2023). Técnicas de Biología Molecular.

[Video]. Disponible en:
https://youtu.be/ZWl3MmnXREM?si=rORh3HJtmGXmpWeo

González, R.M (2022). Electroforesis: ¿Qué es y para qué sirve? - Genotipia.

Genotipia. https://genotipia.com/electroforesis

Khan Academy (s.f.). Secuenciación del ADN (artículo). Disponible en:

https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulati
on/biotechnology/a/dna-sequencing

Merck. (2024). Pasos y método de secuenciación de Sanger. Merck, 1(1).

Disponible en:
https://www.sigmaaldrich.com/UY/es/technical-documents/protocol/genomics/
sequencing/sanger-sequencing

Molina, M. R., Juste, J. P., & Fuentes, F. R. (2010). Síndrome de X frágil. Protoc
diagn ter pediatr, 1, 85-90.

NIH. (2019). Electroforesis | National Human Genome Research Institute.

Genome.gov. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis

Secuenciación por Sanger — TG Test Genéticos. (2021). TG Test Genéticos.

Disponible en:
https://testgeneticos.es/servicios/secuenciacion-por-sanger/#:~:text=Es%20u
n%20m%C3%A9todo%20enzim%C3%A1tico%20que
Aportes de autores al trabajo

Diseño del documento Paulina Fregeiro

Búsqueda bibliográfica Nicolas Martinez, Carolina Lantean,

Paulina Fregeiro y Sofia Beltrán

Organización de los aportes realizados Carolina Lantean, Paulina Fregeiro,

en el foro de EVA Sofia Beltrán y Nicolás Martínez

Organización de los aportes efectuados Carolina Lantean, Paulina Fregeiro,

en los distintos subgrupos e instancia Sofia Beltrán y Nicolás Martínez
plenaria

Redacción de alguna o todas las Paulina Fregeiro (Marco teórico-

secciones (especificar cual/es) Síndrome de X frágil, Discusión), Sofía
Beltrán (Marco teórico-Método de
Sanger) Carolina Lantean (Conclusión),
Nicolas Martinez (PCR y Electroforesis)

Revisión y corrección del informe Carolina Lantean, Paulina Fregeiro,

Sofia Beltrán y Nicolás Martínez