Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas Grado en Químicas

Técnicas y Métodos en Bioquímica

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos

Hemos visto como la absorción de radiación UV-Vis puede ayudar a obtener

información sobre una muestra. Ya sabemos que esa energía absorbida por la muestra
la lleva a un estado electrónico excitado desde el que, tras un determinado tiempo,
volverá a su estado fundamental, esto es, se desactivará. Como resulta obvio, en esta
vuelta al punto inicial, el sistema deberá liberar esa energía absorbida, lo que en las
moléculas sucede mediante diferentes mecanismos. En muchas ocasiones esta vuelta
al estado fundamental no es espectroscópicamente interesante, disipándose la energía
en forma de calor en el medio, pero en algunos sistemas, parte de la energía emitida lo
hace en forma de fluorescencia, siendo este fenómeno la base de una técnica
espectroscópica muy utilizada en el estudio de sistemas biológicos.
A continuación, revisaremos brevemente los distintos mecanismos que permiten a una
molécula desactivarse. Algunos de estos mecanismos implicarán la emisión
espontánea de radiación electromagnética, procesos a los que denominamos
desactivación radiativa. En general, a la energía radiante emitida por átomos o
moléculas cuando pasan de un estado excitado a uno de menor energía la
denominamos luminiscencia, más en concreto, hablamos de fotoluminiscencia
(diferenciándola de la quimiluminiscencia o la electroluminiscencia) para referirnos a
esa emisión cuando la excitación de la muestra se ha producido a consecuencia de la
absorción de radiación electromagnética. A su vez, dentro de la fotoluminiscencia
podemos diferenciar entre fosforescencia o fluorescencia, según que la emisión vaya
acompañada o no de un cambio en la multiplicidad del sistema.
La detección y registro de la radiación fluorescente emitida por una muestra
constituye su espectro de emisión fluorescente, que nos aportará información
complementaria a la de los espectros de absorción, y que diferenciamos del
denominado espectro de excitación en el que se registra la intensidad de fluorescencia
en función de la longitud de onda de la radiación de excitación.
La fluorescencia está presente en algunas de sustancias biológicas, pero además,
cuando no existe fluorescencia natural, se puede trabajar con compuestos externos
que se incorporan al sistema y le aportan la fluorescencia.
En general, se trata de una técnica más sensible que la espectroscopía de absorción, lo
que permite detectar cantidades de sustancias muy pequeñas, siendo este uno de los
principales motivos por los que se ha venido aplicando a la visualización de sustancias
con fines cuantitativos (no todos los fotones absorbidos producen fluorescencia, pero
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 2

la cantidad de fluorescencia de una muestra es proporcional a la cantidad de

moléculas fluorescentes presentes).
Por otra parte, la emisión de fluorescencia se produce en nanosegundos, rango de
tiempo en el que tienen lugar numerosos procesos moleculares que pueden inducir
modificaciones en algunas de las propiedades de los compuestos fluorescentes. Esta y
otras propiedades de la fluorescencia (quenching, polarización y anisotropía,…) hacen
que, además de su utilidad en la detección y cuantificación de biomoléculas, se hayan
encontrando en gran número de aplicaciones en relación con el estudio de los
procesos dinámicos de estados excitados, la localización de aminoácidos en las
proteínas, la medición de distancias en estructuras biológicas y en el seguimiento de
procesos de interacción y asociación.

FUNDAMENTOS DE LA ESPECTROSCOPÍA MOLECULAR DE FLUORESCENCIA:

Desactivación del estado excitado
La absorción es rápida, se produce en unos 10-15 s, y va seguida de una serie de
procesos de desactivación más lentos mediante los cuales la molécula se relaja y
vuelve al estado electrónico fundamental. Normalmente, el tiempo de vida media de
una especie excitada es breve, ya que son diversos los mecanismos mediante los que
un átomo o una molécula excitada pueden liberar su exceso de energía: junto con la
desactivación mediante la emisión de fotones, existen otros procesos que hacen que la
molécula disipe la energía necesaria para poder volver al estado fundamental, unos de
ellos de desactivación interna en el sistema, y otros de gran aplicación en los estudios
sobre sistemas biológicos, como por ejemplo, la desactivación por colisiones con las
moléculas circundantes y, si la molécula es lo suficientemente grande, las
interacciones intramoleculares. En la Figura 1 se esquematizan estos procesos de
desactivación (diagrama de Jablonski).
La molécula, a temperatura ambiente, podemos considerar que estará,
fundamentalmente, en el nivel de vibración más bajo de su estado electrónico
fundamental. En la mayoría de los casos las moléculas en estado fundamental están en
estado singlete (S0), con orbitales doblemente ocupados. Por excitación electrónica se
puede pasar a niveles electrónicos superiores, conservándose la multiplicidad (S1,
S2,…). Las transiciones electrónicas con cambios de multiplicidad, en general, son muy
débiles (prohibidas, no están permitidas). No obstante, existen otros niveles
energéticos correspondientes a distintas multiplicidades, como por ejemplo diferentes
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 3

estados triplete (T1, T2,…), considerando dos electrones desapareados, por los que
podrá pasar la molécula en su proceso de desactivación. Las energías de los niveles
para cada estado triplete son inferiores a las de su correspondiente estado singlete
(Figura 1). Cada uno de estos niveles electrónicos contiene los diferentes niveles
vibracionales (y a su vez rotacionales que, para simplificar, no representamos). Tras la
absorción, la molécula estará en uno de los niveles vibracionales excitados de un
estado electrónico superior, en el que la molécula estará vibrando con las frecuencias
características del mismo. Esta energía vibracional se irá rápidamente disipando, o
bien mediante colisiones con otras moléculas, que se llevan de este modo el exceso de
energía vibracional de la primera1, o redistribuyéndose internamente entre el resto de
posibles modos de vibración propios. La eficacia de la redistribución de energía
vibracional intramolecularmente aumenta con el tamaño de la molécula (el mayor
número de modos posibles y más densidad de estados vibracionales, favorece la
transferencia entre los distintos modos). Estos procesos de relajación y redistribución
vibracional dejan a la molécula en el nivel vibracional más bajo del estado electrónico
singlete excitado.
En ese punto, pueden tener lugar diferentes procesos de desactivación, que podemos
agrupar en dos categorías, los que se producen con emisión de radiación y los no
radiativos.
Entre estos últimos están:
 Las colisiones con otras moléculas pueden seguir afectando, llevando a la
molécula al estado electrónico fundamental2. Esta desactivación colisional se
denomina conversión externa.
 La molécula en el estado singlete excitado (S1) podría desactivarse también sin
necesidad de colisionar con otras, mediante la transferencia isoenergética de
su energía electrónica a un nivel vibracional muy fuertemente excitado del
estado electrónico fundamental S0. A este proceso se le denomina conversión
interna, término que se aplica, en general, a las transiciones no radiativas
entre estados electrónicos de la misma multiplicidad. La conversión interna va
seguida de la relajación y redistribución vibracional hasta el nivel vibracional
más bajo del estado electrónico fundamental.

1
La ganancia de energía vibracional por las moléculas del disolvente, a través de las colisiones se refleja en
un ligero incremento de la temperatura del medio
2
Las colisiones entre moléculas pueden dar lugar también a una reacción química, lo que entra dentro del
campo de trabajo de la fotoquímica, que se ocupa del estudio de los procesos químicos inducidos por la
radiación.
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 4

 Puede tener lugar también una transición no radiativa a un nivel vibracional

excitado de un estado electrónico con distinta multiplicidad, por ejemplo, el
estado electrónico triplete T1 (Figura 1). Este proceso se denomina cruce entre
sistemas. También puede ir seguido de la correspondiente relajación y
redistribución vibracional.

Tanto la conversión interna, como el cruce entre sistemas son procesos

isoenergéticos, por lo que necesitan de la existencia de una gran densidad de
niveles de energía vibracionales en los estados electrónicos que están en juego.

Figura 1. Diagrama de niveles de energía para la absorción, fluorescencia y fosforescencia. La absorción

de radiación da lugar a las transiciones vibrónicas desde un estado fundamental singlete (S 0), con todos
los electrones apareados, hasta otro estado excitado singlete, S1 o S2. La transición desde un singlete
excitado a un singlete en estado fundamental produce fluorescencia. Una transición no radiativa puede
tener lugar desde el estado singlete excitado, S1, al estado triplete excitado, T1, con dos electrones
desapareados. Las transiciones vibrónicas desde un triplete excitado al singlete en estado fundamental
provocan la fosforescencia.

Todos los mecanismos de desactivación en los que no se produce emisión de fotones

compiten con la desactivación radiativa espontánea de la molécula, que es la que da
lugar a su correspondiente espectro de emisión de fluorescencia. Los fotones emitidos
tendrán o la misma energía que los absorbidos inicialmente o, lo que es más frecuente,
menos energía, es decir, esa radiación emitida estará situada más hacia la zona visible
del espectro (desplazamiento Stokes). Si la luminiscencia procede del paso de un
estado electrónico a otro con la misma multiplicidad (desde singletes excitados al
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 5

singlete fundamental) se denomina fluorescencia. Si la emisión se debe a una

transición entre estados electrónicos con diferente multiplicidad (desde estados
triplete a singlete fundamental) se denomina fosforescencia. Podremos diferenciar la
fluorescencia y la fosforescencia por los tiempos de emisión. Ya hemos mencionado
que la emisión fluorescente tiene lugar en el orden de los nanosegundos (transición
entre estados energéticos permitidos, rápida), mientras que la fosforescencia ocurre
en milisegundos o incluso tiempos mayores (interconversión de estado singlete a
triplete no permitida, no ocurre fácilmente). Más allá de esta diferencia cualitativa,
que normalmente es suficiente para poder distinguir un fenómeno de otro, una prueba
real necesita de la determinación de las propiedades magnéticas del estado excitado
(estado triplete tiene espines electrónicos desapareados).
El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo
de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es
rápida, con respecto a los procesos sin radiación, se observará esta emisión, mientras
que si un camino sin radiación tiene una constante de velocidad alta, la fluorescencia
no se observará o será menos intensa.

LOS ESPECTROS DE FLUORESCENCIA

El espectro de emisión de fluorescencia nos va a permitir poder caracterizar la
presencia un fluoróforo concreto, a la vez que cuantificarlo. La emisión fluorescente,
en general, está muy influenciada por las propiedades físicas y el entorno químico en el
que se encuentre la molécula, por tanto, su estudio y el análisis de las variaciones que
experimenta, bajo distintas condiciones, nos puede aportar mucha información sobre
la estructura y funcionalidad de los sistemas en estudio. El efecto que sobre el
espectro de emisión tiene el medio en el que se encuentre el fluoróforo será una
prueba directa de las interacciones entre ambos y de los procesos de asociación en los
que el fluoróforo participa. Uno de los parámetros medibles más interesantes es la
intensidad de la fluorescencia (proporcional al rendimiento cuántico). Existen
diferentes factores externos al fluoróforo que producen una disminución de la
intensidad de la fluorescencia, que se denomina desactivación o quenching. En los
sistemas biológicos, la reducción de la fluorescencia es normalmente el resultado de
procesos de colisión (tanto por reacción química como únicamente colisión con
intercambio de energía) o de procesos radiativos por transferencia de energía, que
dan lugar a los métodos denominados transferencia de energía de resonancia de
Föster (Förster’s Resonance Energy Transfer, FRET). Algunas de las aplicaciones más
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 6

importantes de la fluorescencia a sistemas bioquímicos están basadas en esta

posibilidad de transferencia de energía.
La detección de la intensidad de la fluorescencia en función del tiempo nos va a
permitir determinar otra característica muy útil de los fluoróforos: su tiempo de vida
medio en el estado excitado, que además de permitirnos diferenciar entre fluoróforos
cuyos espectros se solapen, vamos a poder utilizar para obtener información
estructural y dinámica sobre las moléculas.
Por último, la excitación de los fluoróforos con luz polarizada tiene gran interés y
aplicación en estudios conformacionales, en el análisis de procesos de autoasociación
o en el seguimiento de los procesos de interacción macromolécula-ligando, debido a la
relación directa entre la libertad de movimiento del fluorórofo y el grado de
despolarización de la fluorescencia.
A continuación presentaremos todos estos conceptos.

Espectros de emisión y de excitación

El tiempo de vida media de la radiación emitida por los estados electrónicos excitados
varía entre 10-10 y 10-7 s. En condiciones normales y fases condensadas, la relajación
vibracional es mucho más rápida (10-14-10-12 s), lo que implica que la emisión
fluorescente se realizará, principalmente, desde el nivel vibracional más bajo del
estado electrónico excitado (fluorescencia normal). El espectro de fluorescencia que se
observa habitualmente es el correspondiente a las transiciones desde el primer estado
excitado singlete (S1), al estado singlete fundamental, S0, incluso aunque la absorción
de radiación pueble los estados (S2, S3, …) ya que los procesos de conversión interna y
de relajación vibracional son mucho más rápidos que los de emisión de radiación3.
Una molécula en el estado electrónico excitado tendrá un electrón en un orbital de no-
enlace o en un orbital antienlazante, por lo que los átomos enlazados están más
separados que en el estado electrónico fundamental. El mínimo de la curva de energía
potencial para el estado electrónico excitado estará desplazado a distancias mayores
con respecto al del estado fundamental (Figura 2). Como hemos visto, la molécula
excitada pierde rápidamente parte de su energía de forma no radiativa y una vez que
la molécula se encuentra en el nivel vibracional fundamental del estado electrónico
excitado, podrá emitir radiación en forma de fluorescencia. Lógicamente, esta
radiación emitida, en forma de fotones, tendrá una frecuencia más baja (mayor

3
Existen raras excepciones, como por ejemplo la molécula azuleno, en la que la fluorescencia viene
predominantemente desde el segundo estado singlete excitado.
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 7

longitud de onda, desplazamiento Stokes) que la absorbida para la transición inicial en

la excitación (Figura 2). Habrá un solapamiento entre las bandas de absorción y
fluorescencia, ya que la transición entre los niveles 0 y 0’ es común a ambos. De esta
forma, si tras irradiar nuestra muestra con fotones de una determinada longitud de
onda (la del máximo de absorción, por ejemplo) vamos registrando los distintos
fotones emitidos, obtendremos lo que denominamos espectro de emisión, que será,
en muchos casos, una imagen especular del espectro de absorción ya que los estados
vibracionales de S0 y S1 serán similares. La forma de los espectros de emisión será
independiente de la longitud de onda de excitación (una vez en el estado excitado, el
retorno al estado fundamental implicará las mismas transiciones, cada una con sus
probabilidades relativas). Lo que sí cambia si se excita con una longitud de onda
diferente a la del máximo es la intensidad global del espectro (el rendimiento cuántico,
que definiremos a continuación, es diferente para cada longitud de onda de
excitación).

Figura 2. En la izquierda: estados electrónicos singlete fundamental y primer excitado. Las flechas muestras
las transiciones más probables de absorción y fluorescencia. En la parte inferior se muestran las bandas
vibrónicas para la absorción (líneas continuas) y fluorescencia (líneas discontinuas). Figura adaptada van
Holde y col [3]. En la derecha: otra representación de la relación entre absorción y fluorescencia. Figura
adaptada de Chang [6].

En la Figura 3 se muestran los espectros de absorción y fluorescencia de la

bacterioclorofila. Se representan en vertical para hacerlos corresponder con los
diagramas de niveles energéticos.
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 8

Figura 3. Absorción y fluorescencia de la bacterioclorofila. En ambos casos, las bandas están ensanchadas
por efecto de las transiciones vibrónicas no resueltas en los espectros en disolución. Figura adaptada de
Tinoco y col [1], tomada de K. Sauer (1975), Bioenergetics of Photosynthesis, Ed. Govindjee, Academic Press
115-181.

Si en lugar de registrar las longitudes de onda de los distintos fotones emitidos por la
muestra, después de excitarla en su máximo de absorción UV, lo que hacemos es
observar como varía la intensidad de la emisión fluorescente según la vamos
irradiando con distintas longitudes de onda, lo que obtenemos es lo que denominamos
espectro de excitación, que reflejará, por tanto, la dependencia de la intensidad de
fluorescencia con la longitud de onda de la radiación de excitación. Si la molécula
posee un único fluoróforo, el espectro de excitación coincide en forma con el de
absorción, ya que la intensidad de fluorescencia cambiará proporcionalmente con la
cantidad de radiación absorbida a cada longitud de onda. Estos espectros nos permiten
conocer qué fluoróforo es el responsable de la emisión fluorescente a una
determinada longitud de onda en una molécula con varios cromóforos, cuyos
espectros de absorción se solapan.
Los espectroscopios usados en fluorescencia son similares a los utilizados en absorción,
utilizan una luz para excitar la muestra y recogen la fluorescencia, que es emitida en
todas las direcciones. Para evitar las posibles interferencias causadas por la
transmisión de la radiación incidente sobre la muestra, el sistema de detección se
coloca en una posición de 900 con respecto a esta luz incidente. Un monocromador
situado delante de la muestra selecciona la longitud de onda de la luz de excitación, y
un monocromador situado después de la muestra barre las diferentes longitudes de
onda de la luz emitida. Al tener estos dos monocromadores se pueden registrar los dos
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 9

tipos de espectros mencionados: si se fija el monocromador de emisión (longitud de

onda de emisión constante) y se barre el de excitación obtendremos el espectros de
excitación; si se fija el monocromador de excitación (longitud de onda de excitación
constante) y se barre el de emisión obtendremos el espectro de emisión.

Rendimiento cuántico de la fluorescencia,

No todas las moléculas en el primer estado electrónico excitado singlete vuelven al
fundamental emitiendo un fotón. El número de las que lo hacen lo refleja el concepto
de rendimiento cuántico de la fluorescencia, , que se define como la relación entre
el número de fotones emitidos mediante fluorescencia (IF) y el número de fotones
absorbidos (Iab); y refleja cómo de fluorescente es una molécula.

El rendimiento cuántico puede estar bastante próximo a la unidad pero, para la

mayoría de las moléculas que emiten fluorescencia, está normalmente entre 0,3 y 0,7.
Para poder tener una magnitud absoluta necesitaríamos conocer el número de fotones
absorbidos y el número de fotones emitidos, lo que resulta muy complicado; en la
práctica la intensidad de la fluorescencia, proporcional al rendimiento cuántico, se
suele expresar de forma relativa o en comparación con la de una disolución estándar
de la que se conoce el rendimiento cuántico.
La mayoría de las moléculas que absorben radiación UV/Vis no producen fluorescencia
medible, en lugar de ello la desactivación al estado fundamental es no radiativa y el
rendimiento cuántico es cero. De los aminoácidos, presentan fluorescencia los tres
aromáticos, pero de ellos el que aporta más utilidad al estudio de proteínas es el
triptófano. Ninguno de los ácidos nucleicos muestra una fluorescencia significativa.
Existen diferentes factores que pueden hacer variar el rendimiento cuántico, entre
ellos podemos citar la temperatura, la presencia de oxígeno, la interacción del
fluoróforo con otras moléculas, y las variaciones en el pH o en la polaridad del
disolvente o del entorno en el que se encuentre el fluoróforo (en general, los
fluoróforos son más fluorescentes en solventes no polares que en solventes polares).

Como se han mencionada arriba, en la mayoría de las investigaciones biológicas no

será importante conocer los rendimientos cuánticos absolutos, sino que realizaremos
comparaciones entre rendimientos cuánticos de un sistema en diferentes situaciones,
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 10

que a su vez, para cuantificar, compararemos con los rendimientos cuánticos de

sistemas referencia. Por ejemplo, en la Figura 4 se muestran los espectros de
fluorescencia para la tirosina en la proteína calmodulina, cuando esta está saturada de
Ca2+ y en ausencia del metal. Este ejemplo muestra como la fluorescencia de la tirosina
en la calmodulina, cuando se va retirando el Ca2+, va perdiendo intensidad (lo que
constituye un ejemplo de desactivación de la fluorescencia por la presencia de otras
sustancias, en este caso, iones, a lo que nos referiremos más adelante). Comparando
las áreas bajo las curvas podemos tener una relación de los rendimientos cuánticos en
cada situación (proteína con Ca2+ y sin Ca2+). Es recomendable la comparación con
determinadas referencias, que en este caso es el espectro de emisión de la tirosina
libre.

Figura 4. Espectros de fluorescencia de Tyr libre (línea

2+
continúa), de Tyr en calmodulina con Ca (-------) y la Tyr en
2+
calmodulina sin Ca (.........). Figura adaptada van Holde y
col [3].

Decaimiento de la fluorescencia, vida media y probabilidad de transición

Tras excitar una muestra de moléculas simples fluorescente, en disolución diluida, con
un pulso breve de radiación, si registramos la emisión de esta muestra en función del
tiempo normalmente encontraremos un espectro del tipo del mostrado en la Figura 5.
En esta Figura podemos ver como decae la fluorescencia para el antraceno en
ciclohexano, tras haber excitado con un pulso de 1,4 ns a 360 nm. La emisión es
medida a 450 nm. Como se observa se trata de una curva con decaimiento logarítmico.
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 11

-3
Figura 5. Decaimiento de la fluorescencia del antraceno en ciclohexano (1,7 x 10 M) excitado con un pulso
de 360 nm y 1,4 ns. Emisión a 450 nm. Figura adaptada de Tinoco y col [1].

Es decir, la excitación del sistema decae exponencialmente en el tiempo. A la

constante de velocidad de este proceso se le denomina constante de decaimiento.
La inversa de la constante de decaimiento (constante de velocidad de emisión de
fluorescencia) es el tiempo de vida medio radiativo del estado electrónico (), que es
un parámetro medible ya que la intensidad de la luz emitida en un determinado
tiempo es proporcional al número de moléculas en el estado excitado en ese
momento. Así, la detección de la intensidad de radiación emitida en función del
tiempo (Figura 5) nos permitirá conocer este tiempo, , que refleja el tiempo promedio
que una molécula pasa en el estado excitado, antes de volver al fundamental.
Todo esto es aplicable si consideramos que el único efecto que debemos tener en
cuenta durante la desactivación de la molécula es la fluorescencia, pero, en la mayoría
de los casos, esto no es así, ya que van a existir determinados procesos que van a
contribuir a que tengamos menos fluorescencia de la “natural”. Así, la fluorescencia
compite con mecanismos no radiantes, es decir, además de la tasa de decaimiento de
fluorescencia, deberemos tener en cuenta, durante el proceso de desactivación del
sistema: los mecanismos de desactivación térmica, las posibles reacciones químicas
(fotoquímica) y la desactivación debida a la presencia de otras moléculas o iones, que
denominamos desactivador o quencher (Q), que interactúan con el fluoróforo. De esta
forma, la tasa de decaimiento real de moléculas en el estado excitado será el resultado
de sumar las contribuciones de cada uno de estos procesos.
La medida de los tiempos de vida media puede ser utilizada para obtener información
estructural y dinámica sobre las moléculas.
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 12

Efectos del medio sobre la fluorescencia (posición de las bandas, el

rendimiento cuántico y tiempo de vida media)
Como hemos visto, el perfil del espectro de emisión fluorescente a menudo recuerda
al de absorción, desplazado a longitudes de ondas mayores (en muchos casos es una
imagen especular del espectro de absorbancia). Por otra parte, y como sucedía con los
cromóforos y la absorción, el ambiente en el que se encuentra el fluoróforo también
afecta a la posición de las bandas en el espectro de fluorescencia, por lo estos
espectros pueden ser utilizados como sonda de los ambientes moleculares. Los
desplazamientos de la posición no son necesariamente los mismos que en
absorbancia, ya que están relacionados con las interacciones entre el medio y el
estado excitado. También el rendimiento cuántico es muy sensible a los alrededores
del fluoróforo. Las variaciones en el rendimiento cuántico van acompañadas por
cambios en la intensidad de la fluorescencia. Como veremos, un gran número de
aplicaciones bioquímicas están relacionadas con el seguimiento de los cambios en la
intensidad de fluorescencia.
Un indicador más sensible del ambiente local es el tiempo de vida media del estado
excitado y la constante de decaimiento, o tasa de la pérdida de energía desde el
estado excitado.
Existen efectos que denominados generales del disolvente, que dependen de la
polarizabilidad del medio (un aumento de la constante dieléctrica generalmente
desplaza la fluorescencia hacia mayores longitudes de onda), y también efectos
específicos, que son el resultado de reacciones e interacciones entre el estado excitado
y las moléculas del solvente (formación de enlaces de hidrógeno, reacciones ácido-
base y formación de complejos de transferencia de carga mayores). En estos últimos
casos, las nuevas especies frecuentemente tienen nuevas bandas fluorescentes.
Podemos citar, como ejemplo, los estudios sobre proteínas, en las que el espectro de
fluorescencia está dominado por la emisión del triptófano. Se ha comprobado que la
fluorescencia del triptófano es muy sensible a la polaridad del ambiente. Las
propiedades espectroscópicas de este aminoácido, junto con que se trata de un
aminoácido muy poco frecuente (muchas proteínas pueden tener incluso un único
residuo de este aminoácido) hacen que sea una buena sonda para llevar a cabo
investigación estructural. La dependencia de la longitud de onda, max, de la
fluorescencia y del rendimiento cuántico en los espectros de este aminoácido respecto
a las distintas condiciones del medio ha sido ampliamente estudiada. Como
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 13

consecuencia, se conocen bastante bien los efectos del ambiente sobre la max a la que
aparece la emisión del triptófano en proteínas, que varía en el rango de 310-350 nm.
Se ha comprobado que, en general, la max del espectro de emisión del triptófano se
desplaza a longitudes de onda más bajas y la intensidad de la banda a max aumenta
según disminuye la polaridad del disolvente. Por ello, cuando max se desplaza a
longitudes de onda más bajas estando la proteína en un medio polar, el triptófano
debe estar ubicado en el interior de la proteína, y en un ambiente apolar. Si max
aparece a longitudes de onda cuando la proteína está en un ambiente apolar, o bien el
triptófano está en la superficie de la proteína o bien el solvente induce en cambio
conformacional que sitúa a ese aminoácido en el exterior.

Desactivación o quenching de la fluorescencia

Existen diferentes mecanismos que producen una disminución de la intensidad de la
fluorescencia o del rendimiento cuántico. Entre ellos están los procesos de colisión con
moléculas específicas para esta desactivación (a las que denominados desactivadores o
quenchers), la transferencia de excitación a especies no fluorescentes y la formación
de complejos o agregados que dan lugar a especies no fluorescentes (quenching por
concentración). Existen importantes aplicaciones biológicas o consecuencias de cada
uno de esos mecanismos de quenching, entre las que podemos citar el conseguir
información sobre las interacciones moleculares, sobre la accesibilidad del fluoróforo o
sobre la presencia de estados intermedios, tales como estados tripletes o radicales
libres.
Los quenching que se producen por contacto entre el fluoróforo y el quencher
dependen directamente de la accesibilidad del fluoróforo. Entre estos mecanismos
diferenciamos:
 la desactivación dinámica, aquella que es consecuencia de la colisión entre las
moléculas quencher y el fluoróforo (disipación de la energía en forma de
energía cinética en el desactivador), que dependerá de la concentración de
ambas especies, de la temperatura y de la viscosidad del medio,y
 la desactivación estática, en la que la molécula quencher forma un complejo
con el fluoróforo, que estará en equilibrio químico con las especies separadas.
Un ejemplo de quenching por formación de complejos es el de la “clorofila a” y
quinonas o carotenoides. La clorofila a es una molécula bastante fluorescente
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 14

en disoluciones diluidas (  0.3), pero en presencia de estos quenchers la

fluorescencia se hace prácticamente nula.

Obviamente, cuanto mayor es el tiempo de vida del estado excitado, mayor será la
probabilidad de quenching. En los estudios de fluorescencia, es importante tener
especial cuidado con la presencia de especies extrañas en el medio, no controladas,
que puedan tener este tipo de efectos.
En los quenching relacionados con la concentración del fluoróforo, la desactivación
estará relacionada con procesos de agregación, disociación u otros cambios en el
fluoróforo mismo. La clorofila a también presenta desactivación por efecto de la
concentración (a concentraciones de aproximadamente 10-2M) en la mayoría de los
disolventes.

Transferencia de excitación, FRET (Föster’s Resonance Energy Transfer)

Algunas de las aplicaciones más importantes de la fluorescencia a sistemas
bioquímicos están basadas en la desactivación del fluoróforo mediante la transferencia
de la energía de excitación desde un cromóforo a otro, como consecuencia de las
interacciones dipolo-dipolo inducido entre un fluoróforo y un cromóforo vecino, que
absorba en las mismas longitudes de onda en las que el fluoróforo emite. Del primero
(donador) se produce una transferencia de energía al segundo (aceptor), que pasa así a
un estado excitado. Este mecanismo de transferencia de la excitación, propuesto por
Föster en 1948 (del que recibe el nombre: Föster’s Resonance Energy Transfer, FRET)
adicionales para la desactivación de la fluorescencia.
Un ejemplo de FRET tiene lugar entre los aminoácidos aromáticos de una proteína y
aporta una explicación a las características de la fluorescencia de estas: se acepta que
el aminoácido fenilalanina (Ex/Em: 260 nm/282 nm) es fácilmente desactivado por la
tirosina (Tyr; Ex/Em: 280nm/303 nm) mediante mecanismos de transferencia de
energía, y a su vez, la tirosina también parece sufrir desactivación de este tipo por el
triptófano(Ex/Em: 280, 295 nm/305-350 nm), lo que es una de las causas de que el
espectro de fluorescencia de las proteínas esté dominado por este último aminoácido.
Para que tenga lugar FRET deben cumplirse tres condiciones importantes:
 el espectro de emisión del fluoróforo donador debe solapar con el espectro de
excitación de la molécula aceptora,
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 15

 la orientación física de los dipolos de transición de los donadores y aceptores

debe ser favorable, y no perpendiculares entre sí, y
 donadores y aceptores deben estar en proximidad física, entre 1-10 nm.

Por tanto, el proceso de transferencia depende, en gran medida, de la distancia física

entre donador y aceptor y de sus orientaciones relativas: la eficiencia de FRET varía
con la sexta potencia de la distancia que separa ambos grupos. Basándose en esto, se
han diseñado diferentes experimentos que permiten obtener información cuantitativa
sobre la geometría de macromoléculas, de forma que es posible cuantificar la distancia
entre determinados grupos y la orientación relativa de sus dipolos de transición.

Polarización de la fluorescencia
Si un cromóforo es excitado con radiación linealmente polarizada, esta sólo será
absorbida por las moléculas que presenten sus dipolos de transición paralelos al plano
de polarización. Antes de emitir la fluorescencia, el fluoróforo estará un determinado
tiempo en el estado excitado (relacionado con su vida media). Durante ese tiempo, la
molécula podrá rotar, y los fotones emitidos tras esa rotación tendrán planos de
oscilación diferentes a los de la radiación incidente. Si analizamos la luz emitida por la
muestra con un polarizador, podremos detectar sólo la luz emitida con el mismo plano
de polarización que la incidente. Así, la radiación detectada será máxima si la molécula
no ha cambiado de posición, mientras que decrecerá según el grado de movimiento de
esas moléculas: a mayor movilidad, menor polarización de la fluorescencia. Este
fenómeno, denominado despolarización de la fluorescencia, refleja la relativa
inmovilización del fluoróforo, la extensión con la que la excitación es transferida a
otras moléculas, y los cambios conformacionales relativos entre las diferentes partes
de un fluoróforo complejo. Por ello, el trabajo con fluorescencia polarizada ha
encontrado interesantes aplicaciones en el estudio de los procesos de unión
ligando-macromoléculas, en el análisis de cambios conformacionales y en el estudio de
procesos de autoasociación de péptidos y proteínas.

FLUORÓFOROS DE INTERÉS BIOLÓGICO

No todos los cromóforos van a ser fluorescentes. En general, podemos decir que las
transiciones *, la conjugación de enlaces (aromaticidad), la rigidez estructural y
determinados sustituyentes en los anillos aromáticos son todos factores que favorecen
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 16

la fluorescencia. En otras transiciones, como, por ejemplo las n*, está favorecida la
conversión interna.
Podemos diferenciar dos tipos de fluoróforos de interés en los estudios con
biomoléculas, por un lado (1) los denominados fluoróforos intrínsecos o naturales y
por otro (2) los extrínsecos, que deben ser añadidos al sistema y normalmente se unen
a alguno de sus componentes.
Entre las moléculas biológicas con fluorescencia intrínseca podemos destacar los
aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina) y algunas moléculas que
pueden actuar como cofactores proteicos: el dinucleótido de nicotinamida y adenina
en su forma reducida, NADH (la forma oxidada, NAD+, no fluoresce), los nucleótidos
con flavina, FMN y FAD, y los derivados porfirínicos.
En proteínas y péptidos la fluorescencia está originada principalmente por los
aminoácidos aromáticos, que como ya sabemos presentan fuertes bandas de
absorción hacia 220 nm (ex <230 nm), que se corresponden con transiciones S0S1.
No obstante, para los estudios de fluorescencia normalmente se excitan con
longitudes de onda de 260-280 nm, con objeto de minimizar la fotorreacción y
aumentar el rendimiento cuántico de la fluorescencia (F). En estas últimas longitudes
de onda, el triptófano (Trp; Ex/Em: 280, 295 nm/305-350 nm) tiene el mayor
coeficiente de absortividad molar y el mayor rendimiento cuántico de los tres
aminoácidos aromáticos. En el caso de la fenilalanina (Phe; Ex/Em: 260 nm/282 nm),
tanto la absortividad molar como el rendimiento cuántico son tan bajos que raramente
se utiliza este aminoácido en estudios de fluorescencia. Por otra parte, como
mencionábamos antes, la emisión de la tirosina (Tyr; Ex/Em: 280nm/303 nm) y la
fenilalanina es fácilmente desactivada mediante mecanismos de transferencia de
energía (de fenilalanina a tirosina, y transferencia de tirosina a triptófano; ver
longitudes de onda de excitación/emisión). La fluorescencia de la tirosina además de
ser muy débil por FRET, también estará prácticamente desactivada si está ionizada, o si
se encuentra cerca de un grupo amino o un grupo carboxilo. Por todo ello, el espectro
de fluorescencia de proteínas, aunque que contengan estos tres aminoácidos, está
dominado por la emisión del triptófano.

Tabla 1. Datos de absorbancia y fluorescencia de los tres aminoácidos aromáticos

Absorbancia Fluorescencia Sensibilidad Abundancia
max  (max) max F max F (%)
/nm /cm2mol-1 /nm
Triptófano 280 5600 348 0.20 1100 1.4
Tirosina 274 1400 303 0.14 200 3.2
Fenilalanina 257 200 282 0.04 8 3.9
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 17

Los estudios de la fluorescencia intrínseca se han aplicado fundamentalmente al

análisis estructural y conformacional de las proteínas, gracias a la dependencia directa
entre la fluorescencia del triptófano y la tirosina, y su entorno: disolvente, pH,
presencia de quenchers, o la proximidad de determinados grupos funcionales dentro
de la misma proteína. Los numerosos estudios de la fluorescencia intrínseca en
proteínas y compuestos modelos han conducido a poder contar con una serie de
conclusiones que Freifelder [9] tiene recopiladas a modo de reglas empíricas de
utilidad para el análisis estructural de proteínas (Figura 7).

Figura 7. Reglas empíricas para interpretación de espectros de fluorescencia de proteínas. Tomado de D.

Freifelder, 1982 [9]
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 18

Existen algunos ejemplos en los que la fluorescencia de la proteína no deriva

directamente de los aminoácidos aromáticos. De estos, la proteína más conocida
posiblemente sea la GFP (green fluorescent protein), de gran utilidad y aplicación. La
fluorescencia intensa de la GFP se debe a un cromóforo que se origina por oxidación
de la secuencia de aminoácidos Serina-Tirosina-Glicina. En torno a la fluorescencia de
la GFP se ha desarrollado una nueva técnica de marcaje, en la que esta proteína se
utiliza como agente fluorescente externo que se incorpora a la proteína en estudio. En
general, los marcajes con moléculas fluorescentes (fluoróforos extrínsecos) suelen
conseguirse mediante uniones covalentes de los colorantes fluorescentes a las
moléculas de interés, lo que resulta muy complicado en los estudios in vivo. La
metodología desarrollada en torno a la proteína GFP ha supuesto toda una revolución
en los estudios con fluorescencia en sistemas biológicos, ya que se utiliza esta proteína
como proteína de fusión: el gen de la GFP se fusiona con el gen de la proteína en
estudio, y ambos se expresan en el organismo de interés. La proteína fusionada actúa y
se sitúa igual que la proteína natural pero lleva “adherida” la fluorescencia de la GFP.
Dentro del resto de fluoróforos extrísecos diferenciamos entre sondas fluorescentes,
que interacción de forma no covalente con la molécula biológica, y los marcadores
fluorescentes, en los que se producente una unión covalente con las moléculas de la
muestra. Entre estos fluoróforos extrínsecos encontramos una gran variedad de
compuestos con aplicaciones también variadas como, por ejemplo, marcadores
característicos de proteínas (por ej. fluoresceína, rodamina y cloruro de dansilo),
sondas de ADN (por ej. bromuro de etidio y naranja de acridina), sondas de
membranas biológicas (por ej. Laurdan, DHP y t-PnA), sondas sensibles a la
concentración de iones Ca2+, etc.
 Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas

Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos 19

Referencias utilizadas

[1] Tinoco, I., Jr., Sauer, K, Wang, J.C. y Puglisi, J. D. (2003) Physical Chemistry. Principles
and Applications in Biological Sciences. Prentice Hall International, Inc. 4ª Ed.

[2] I. D. Campbell & R. A. Dwek, Biological Spectroscopy, 1984. Chapter 4, Ultraviolet and
Visible Absorption Spectroscopy. The Benjamin/Cummings Publishing Company,
Inc. Advanced Book Program, California.

[3] Van Holde, K.E., Jonson, W.C. y Ho, P.S. (1ª ed. 1998, 2ª ed. 2006) Principles of Physical
Biochemistry, Prentice Hall, Upper Saddle River, Nueva Jersey.

[4] Requena, A. Zúñiga, J. (2004) Espectroscopia, Pearson Prentice Hall, Madrid.

[5] G.G. Hammes (2005). Spectroscopy for the Biological Sciences, John Wiley & Sons, Inc.
Nueva Jersey. Capítulo 6.

[6] Chang, R. (2000) Physical Chemistry for the Chemical and Biological Sciences, 3ª ed.,
University Science Books.

[7] J. B. Shear (1999) Biochemical Applications of Fluorescence Spectroscopy. Encyclopedia

of Spectroscopy and Spectrometry, J. C. Lindon, G. E. Trante y J. L. Holmes, Academic
Press.

[8] S. Weiss (1999) Fluorescence Spectroscopy of Single Biomolecules, Science 283, 1676-
1683.
http://www.sciencemag.org/content/283/5408/1676.full.pdf

[9] D. Freifelder (1982) Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and

Molecular Biology, Segunda Edición, W.H Freeman and Co.
http://books.google.es/books?id=iW0yHGmE-
JwC&printsec=frontcover&hl=es&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepag
e&q&f=false

[10] S. Mayor y S. Bilgrami (2008) Fretting about FRET in Cell and Structural Biology, Cell
Press,43-49.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006349507712195
 Grado en Químicas
Técnicas y Métodos en Bioquímica
Tema 5. Fluorescencia: aplicaciones y ejemplos pág. 20

Lecturas complementarias:

Green Fluorescent Protein

El Premio Nobel de Química en el 2008 fue otorgado a Osamu Shimomura, Martin Chalfie y Roger Y. Tsien
por el descubrimiento y desarrollo de la metodología en torna a la proteína fluorescente verde (GFP). Una
buena forma de conocer detalles sobre su descubrimiento y aplicaciones son las conferencias que los tres
galardonados impartieron con motivo de la entrega de los premios, especialmente la de R. Y. Tsien:

Roger Y. Tsien, 2008

Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox, Nobel Lecture.
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/tsien_lecture.pdf

Más información en:

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/shimomura_lecture.pdf
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/chalfie_lecture.pdf

Fluoróforos extrínsecos
La revista Molecules ha editado un número especial dedicado a los fluoróforos como herramientas
esenciales actualmente en la investigación de sistemas biológicos y biomédica. El objetivo principal ha sido
el abordar la síntesis y modificación de fluoróforos, sus propiedades fisicoquímicas y fluorescentes y sus
aplicaciones. Puede conocer detalles actuales sobre estos aspectos consultando los trabajos publicados en
esta edición, en la que destacan varios artículos de revisión (Reviews)

Fluorophores - The Fluorescent Toolbox in Biological and Biomedical Research.

http://www.mdpi.com/journal/molecules/special_issues/fluorophores-toolbox

Sobre Förster’s Resonance Energy Transfer, FRET

Instructivo artículo
S. Mayor y S. Bilgrami, 2008
Fretting about FRET in cell and Structural Biology, Cell Press,43-49.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006349507712195