Validación Interna del Método de Digestibilidad In Vitro de la Materia

Orgánica (DIVMO) y Control Interno de la Calidad *

Ing. Agr. Marcelo F. Prand 1
Ing. Agr. Liliana R. Zimmermann 1
Ing. Agr. Claudia A. Scorciapino 1
Ing. Agr. Marcela Cian 1
1
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Entre Ríos. CC 24 (3100) Paraná, Entre Ríos. Tel: 0343 -
4975075. E-mail: marcelofp@ciudad.com.ar; gutzimm@arnet.com.ar
Resumen
Se presenta el desarrollo de la metodología para la implementación del Sistema de Calidad del
Laboratorio de Nutrición Animal (LNA) - FCA - UNER, referido a requisitos técnicos de la norma IRAM
301/ ISO 17025:2000, para la Validación, Trazabilidad, Incertidumbre y Control Interno de Calidad, del
Método de Digestibilidad in Vitro de la Materia Orgánica (DIVMO).
La Validación del método, se llevó a cabo mediante la evaluación de Exactitud, Precisión e
Incertidumbre. El estudio se realizó con “Alfalfa”, patrón de alta digestibilidad y ”Pasto llorón”, patrón
de baja digestibilidad, suministrados, junto con su valor de referencia por el Laboratorio de Nutrición
Animal de la EEA Concepción del Uruguay.
Se realizó un análisis de validación retrospectivo basado en registros del Laboratorio de Nutrición
Animal, correspondiente a valores obtenidos en ensayos de rutina durante un período de dos años.
Para demostrar Trazabilidad se usó un test de hipótesis acerca de un parámetro - test “t de Student”.
Esta prueba permitió comparar la media del patrón (O) obtenida en el laboratorio con el valor del patrón
de referencia (E).
El control de calidad interno, se realizó, a través de Gráficos de Control de los patrones y Análisis
Cruzado entre los analistas, mediante Análisis de Variancia y Componentes de Variancia.
El estudio retrospectivo mostró falta de precisión y niveles de exactitud en el límite de aceptación
establecidos por el LNA. No ha podido verificarse la Trazabilidad del método.
La incertidumbre del resultado final de una muestra de rutina no pudo ser estimada ya que el LNA no
cuenta con el valor de incertidumbre del patrón de referencia.
El control interno de la calidad - mediante el uso de gráficos de control del rango y promedio - mostró
para el período evaluado, para ambos patrones, evidencias de falta de precisión entre repeticiones de una
misma muestra y entre muestras en el tiempo.
El control interno de la calidad mediante análisis cruzado entre analistas, mostró que los laboratoristas no
han trabajado con el mismo nivel de precisión.
El procedimiento de análisis es susceptible de mejorarse detectando errores sistemáticos siendo
importante la implementación de acciones correctivas. Del mismo modo resulta necesario aumentar el
número de repeticiones del patrón de alta digestibilidad, a por lo menos 4 repeticiones y del patrón de
baja digestibilidad, a por lo menos 5 repeticiones a fin de demostrar de manera conveniente la trazabilidad
de los resultados.
Palabras claves: Validación, Trazabilidad, Incertidumbre, Control interno de calidad.

1.- Introducción a la Calidad.

La calidad puede definirse desde diferentes puntos de vista, que a la vez son complementarios.
Una definición universalmente aceptada, es considerar a la calidad como el conjunto de propiedades de un
producto, sistema o servicio, que lo hacen adecuado para su uso. Desde un punto de vista más aplicado, la
calidad implica satisfacción de las necesidades del cliente.
Finalmente, desde un enfoque práctico, implica que la calidad debe poder cuantificarse a través de
indicadores cuantitativos y cualitativos.
Hablar de calidad implica el análisis de una organización estructurada, que se encadena en diversas acciones
y decisiones que se materializan en una secuencia política - gestión - sistema de calidad - garantía de calidad.
Alcanzar la calidad, interna como externa, de una entidad, un proceso, un producto o un servicio, comprende
la existencia de una Política de Calidad, a través de un documento (Manual de Calidad), que debe ser
aprobado por el máximo órgano de discusión. Esta política, llevada a la práctica, se traduce en elementos de
Gestión y Sistemas de Calidad, que se materializan en la denominada “Garantía de Calidad”, la cual se
encamina a asegurar la calidad planificada.[19]
La Garantía de Calidad comprende tres grupos de actividades: Control de Calidad (Quality Control),
Evaluación de la Calidad (Quality Assessment), y Acciones Correctivas Internas.

*
Versión adptada del Trabajo Final de Graduación: Validación Interna del Método de Digestibilidad In Vitro
de la Materia Orgánica (DIVMO) y Control Interno de Calidad. Marcelo F. Prand. Septiembre 2002

Prand, M.; Zimmermann, L. "y col." Validación y Control Interna de la Calidad 1

Las actividades de Garantía de Calidad tienen un carácter cíclico y a la vez tres momentos: El Control de
Calidad se realiza antes y durante la realización del proceso analítico, mientras que la Evaluación de la
Calidad se desarrolla durante y después. Las Actividades de Corrección son a posteriori e inciden en la
revisión / cambio de las actividades de control.

1.1 Sistema de Calidad en Laboratorios Analíticos

Un Laboratorio Analítico se considera un ente productivo al recibir materias primas (muestras, reactivos,
patrones, etc.) y generar productos (informe de ensayo).
La Calidad analítica resulta de: la calidad de los resultados obtenidos, la que depende de la calidad del
proceso analítico implicado, de la calidad de las herramientas empleadas y de la calidad del trabajo y la
organización / dirección del laboratorio.
Los Sistemas de Calidad aplicados a los Laboratorios Analíticos, consisten en el seguimiento de normas y
cumplimiento de la legislación. En este sentido, la norma internacional de mayor difusión es la ISO / IEC
17025:1999[19]
Esta norma, contiene los requisitos que deben cumplir los Laboratorios de Ensayo y Calibración para
demostrar que: gestionan un sistema de Calidad; son técnicamente competentes y son capaces de producir
resultados técnicamente válidos.

1.2 Metrología en Medidas Químicas y Biológicas.

Las Medidas Químicas y Biológicas (MQB) dependen decisivamente de las muestras; siendo el
procedimiento de toma de muestra un factor decisivo para garantizar la representatividad de los resultados.
Sin embargo, la calidad de las determinaciones analíticas dependen además, del proceso de medición que
involucra patrones, equipos de medida y procedimientos de ensayo.
Cualquier proceso de medida esta sujeto a diferentes fuentes de variabilidad. Cuanto más largo y complejo
sea el proceso mayor será la variabilidad en el resultado.[19 ]
La Estadística proporciona herramientas básicas para aplicar en Metrología y evaluar la calidad de los
resultados obtenidos en laboratorios analíticos. Tanto en el ámbito de la Investigación y desarrollo, como en
análisis de rutina, su contribución es decisiva. La validación de los métodos analíticos, la trazabilidad, la
incertidumbre y el aseguramiento de la calidad de los resultados, aspectos contemplados en la Norma ISO
/ IEC 17025:1999, apartados 5.4, 5.6 y 5.9, requieren el uso de un número importante de técnicas estadísticas.
Pueden citarse análisis de regresión, análisis de Variancia, pruebas de hipótesis, intervalos de confianza,
gráficos de control, etc.[17,19, 20, 21]
Se entiende por Validación el proceso de evaluación de las características de un procedimiento de medida y
comprobación de que dichas características cumplen una serie de requisitos preestablecidos. La validación
establece y suministra evidencias documentales de que el proceso de medida es útil para el uso previsto. [13,15]
La validación, ya sea de carácter prospectivo, retrospectivo o de revalidación, permite obtener conocimiento
de las características de funcionamiento del Proceso Analítico, proporcionando un alto grado de confianza y
seguridad en el mismo y en los resultados obtenidos.
Trazabilidad, es la propiedad de un resultado de una medición, la que consiste en poder relacionarlo con
patrones adecuados, en general patrones internacionales o nacionales, a través de una cadena ininterrumpida
de comparaciones.[14]
No se puede demostrar Trazabilidad, si no determinamos el grado de incertidumbre de los resultados
analíticos. La norma ISO 8402[15] define la incertidumbre como el intervalo de valores dentro del cual se
espera encontrar, con una alta probabilidad, el verdadero valor de aquello que se mide.
El aseguramiento de la calidad se refiere a todas aquellas acciones planificadas y sistemáticas, necesarias
para garantizar una adecuada confianza de que un producto o servicio satisfacerá los requisitos definidos de
calidad. (ISO 8402:1994)
El aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayos y calibraciones, esta referido al control de
calidad, tanto interno como externo, a través de procedimientos de control de calidad, tales como gráficos de
control, análisis cruzados, ensayos de aptitud, etc.

2.- Objetivos
2.1.- General
Presentar un conjunto de técnicas estadísticas para evaluar la calidad de un procedimiento analítico y de los
resultados, según requisitos técnicos de la norma ISO / IEC 17025:1999
2.2.- Específicos
• Presentar un procedimiento normativo operacional general para la validación de métodos analíticos.
• Demostrar que el Método (DIVMO) ha cumplido con los requisitos -Validación- para el uso específico
previsto, mediante un Análisis Retrospectivo.

2 XVII Jornadas IRAM - Universidades UNLM, Octubre 2002

• Demostrar la Trazabilidad del Método (DIVMO)
• Proponer la metodología para el Cálculo de Incertidumbre.
• Aplicar herramientas para la realización del Control Interno de Calidad.

3.- Procedimiento de validación

Para asegurar la confiabilidad de los resultados los métodos analíticos deben someterse a un proceso de
validación. Este proceso incluye como requisitos previos, el control de materias primas; material de
referencia; verificación, calibración y control del equipamiento y entrenamiento del personal.

3.1. Parámetros a determinar.[6,7,8,9,16]

Validar un método de Análisis supone demostrar formalmente que posee un determinado nivel de parámetros
analíticos básicos [ISO 8042][15]: Exactitud, Precisión, Linealidad / Función respuesta, Selectividad /
Especificidad, Límite de Detección, Límite de Determinación, Robustez, Intervalo de trabajo,
Incertidumbre, además de cumplir su idoneidad para el fin previsto en el contexto analítico. Sin embargo,
los parámetros difieren según el objetivo del método de ensayo a validar, tal como se muestra en la tabla 1:

Tabla 1: Parámetros a determinar en la Validación de Métodos Analíticos según el objetivo de mismos.

Cualitativo Determinación de Análisis de trazas Parámetro físico-
contenidos químico
Exactitud



Precisión



Linealidad/ f. Respuesta



Selectividad / Especificidad



Límite Detección


Límite Determinación

Robustez




Incertidumbre

Exactitud
Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al valor verdadero
o de referencia (E).
La evaluación de este parámetro, en un laboratorio de ensayos, requiere del valor de referencia, el cual debe
ser suministrado junto con los materiales de referencia (patrones) adquiridos.
Mediante pruebas estadísticas, se compara el valor obtenido de los patrones analizados por el laboratorio
(O), con respecto al valor verdadero o de referencia (E).
Las diferencias (Sesgo) entre los valores obtenidos (O) y el patrón (E), se deben fundamentalmente a errores
sistemáticos. Si el valor del sesgo excede los requisitos legales o criterios técnicos del laboratorio, se deberán
tomar acciones correctivas necesarias evaluando nuevamente la calidad del proceso analítico.

Precisión
La precisión cuantifica la dispersión de una serie repetida de ensayos analíticos obtenidos sobre una muestra
en el mismo laboratorio, con el método a validar. Depende de errores aleatorios.
Se puede evaluar en dos condiciones diferentes: Repetibilidad, según que los resultados que integran la serie
se obtengan consecutivamente uno tras otro, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista,
con los mismos equipos y reactivos, o de Reproducibilidad, en sesiones diferentes tales como distintos días,
diferentes analistas, etc.
La cuantificación del parámetro que caracteriza a este estudio, es la desviación estándar, (S) o
preferiblemente su expresión relativa, el coeficiente de variación. Si bien algunos autores utilizan el término
coeficiente de variación, IUPAC - Unión Internacional de Física Pura y Aplicada - recomienda el uso de
Desviación Estándar Relativa, (DER). [19]Para la mayoría de los métodos analíticos el coeficiente DER de la
reproducibilidad debe ser menor que un 2,0 %.[4,10]

Robustez
Es el grado de reproducibilidad de los resultados obtenidos mediante la ejecución del método sobre una
misma muestra variando algunas condiciones operacionales, como por ejemplo diferentes días, analistas,
concentraciones, temperaturas, etc.
La comprobación de este parámetro resulta relevante en métodos de análisis complejos y de rutina, dado que
las muestras pueden estar sometidas a diferentes etapas de tratamiento (digestión, filtrado, extracción, etc.),
que tienden a romper la cadena de Trazabilidad.

Prand, M.; Zimmermann, L. "y col." Validación y Control Interna de la Calidad 3

Incertidumbre
Se refiere a la variabilidad asociada al proceso analítico, involucrando todas las etapas del mismo (muestreo,
submuestreo, tratamiento de la muestra).

3.2.- Cálculo de parámetros

El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Nutrición Animal (LNA), dependiente de la Facultad
de Ciencias Agropecuarias – UNER.
Uno de los ensayos que realiza es la determinación del Porcentaje de Digestibilidad In Vitro de la Materia
Orgánica (DIVMO) de alimentos, método desarrollado por Tilley y Terry y publicado y modificado por
Alexandar R. H. [1]
La Técnica de Tilley y Terry, consta de dos etapas. En la primer etapa, se simula la fermentación que sufriría
el alimento en el rumen del animal. Consiste en incubar en un tubo de 100 ml y 3 cm de diámetro, y por 48
horas una muestra de alimento seco (0,5 gramos) y molido (tamiz de diámetro 1 mm) en licor ruminal en
condiciones anaerobias, en un medio tamponado (pH = 6,9) y a una temperatura de 38 ºC. El licor ruminal es
extraído de un animal donante (corderos) fistulado en el rumen.
En la segunda etapa se simula la digestión post ruminal. Consiste en una digestión durante 48 horas con
pepsina y ácido clorhídrico. El residuo en el tubo es la fracción no digestible del alimento.
El análisis de muestras de rutina, incluye el uso de patrones de alta y baja digestibilidad estableciendo dos
momentos para la aceptación de resultados del ensayo. Los criterios utilizados por LNA, son:

a) La diferencia entre 2 repeticiones del patrón:

• Para el patrón de alta digestibilidad debe ser menor a 3 unidades porcentuales de digestibilidad.
• Para el patrón de baja digestibilidad debe ser menor a 6 unidades porcentuales de digestibilidad.

b) La diferencia entre el valor de referencia (E) y el promedio de las 2 replicas del patrón (O):
• Para el patrón de alta digestibilidad debe ser menor a 3 unidades porcentuales de digestibilidad.
• Para el patrón de baja digestibilidad debe ser menor a 6 unidades porcentuales de digestibilidad.

De acuerdo a los objetivos del Método (DIVMO), el mismo pertenece a la categoría de determinación de
contenidos, por lo que para la validación del mismo, se deben demostrar por lo menos los siguientes
parámetros: Exactitud, Precisión, Robustez e Incertidumbre.
La validación del método, se llevó a cabo mediante la evaluación de Exactitud, Precisión (Reproducibilidad)
e Incertidumbre.
El estudio se realizó con “Alfalfa”, patrón de alta digestibilidad y ”Pasto llorón”, patrón de baja
digestibilidad, suministrados, junto con su valor de referencia por el Laboratorio de Nutrición Animal de la
EEA Concepción del Uruguay de INTA.
Se realizó un análisis de validación retrospectivo[3] basado en registros del Laboratorio de Nutrición Animal
(LNA) de FCA - UNER, correspondiente a valores obtenidos en ensayos de rutina durante un período de dos
años.
Se asume que el laboratorio ha cumplido con requisitos tales como materiales de referencia, materias primas,
equipamiento, personal.
En la Tabla 2, se muestran los valores de referencia y los datos de los patrones analizados en el LNA.

Tabla 2.- Valores de Digestibilidad in Vitro de la M.O. de los patrones en unidades porcentuales.
PATRONES
Alfalfa Pasto Llorón
Número de Datos (muestras) 11 12
Valor de referencia (E) 59,85 21,9
Media en Laboratorio (O) 63,32 28,20
Desvío Estándar (S) 1,90 4,63

Analizando las medidas obtenidas, la exactitud del patrón “alfalfa”, 5,80%, supera el límite de aceptación de
5% en valor relativo. En unidades porcentuales de digestibilidad, el sesgo fue de 3,47 siendo levemente
superior al valor de aceptación de 3 del LNA. (Tabla 3.)

4 XVII Jornadas IRAM - Universidades UNLM, Octubre 2002

Tabla 3. Resultados de los parámetros evaluados del Método de Digestibilidad in Vitro de la Materia Orgánica
Parámetros Método Patrón Patrón Criterios de aceptación
Estadístico alfalfa p. llorón
alfalfa p. llorón
Exactitud Sesgo 5,80 % 28,77 % 5%a 27,4%a
[(O – E) /E] 100

(O - E) (3,47) (6,13) (3)a (6)a

Precisión C de Variación 3,01 % 16,42 % 2%b 2%b

[Sp / X ] 100
Incertidumbre del proceso = [t(n-1; α) * sp / √n] (1,28 ) (2,94)
Up
a
Criterio del Laboratorio de Nutrición Animal FCA - UNER
b
DeSain, Martin-Smith y Rudd.1997
Los valores entre paréntesis representan unidades porcentuales de digestibilidad

El valor hallado de precisión (DER) del patrón alfalfa, 3,01 %, mostró una baja reproducibilidad de los datos
a través del período analizado, de acuerdo a De Sain, Martin-Smith y Rudd [4,10] quienes plantean para la
mayoría de los métodos analíticos, que el coeficiente de variación de la reproducibilidad, debe ser menor del
2%. (Tabla 3). No obstante, dado que se trata de un método complejo que utiliza material biológico, podría
considerarse como razonable, el valor de precisión hallado.
La exactitud del patrón “pasto llorón”, 28,78%, supera el límite de aceptación de 27,4% en valor relativo. En
unidades porcentuales de digestibilidad, el sesgo fue de 6,13 siendo levemente superior al valor de aceptación
de 6. (Tabla 3.)
El valor de precisión de 16,42 % mostró baja reproducibilidad a través del tiempo.
Si bien los datos utilizados para el estudio correspondían a valores de digestibilidad de los patrones utilizados
en ensayos de rutina, cuyos resultados fueron considerados como válidos de acuerdo a los criterios de
aceptación (LNA), se observó en el estudio de validación una variabilidad en el tiempo (falta de
reproducibilidad), que no permitió demostrar la exactitud y fundamentalmente, la precisión del método.
La falta de exactitud, en cada ensayo está vinculada con la presencia de errores sistemáticos, originados por
errores incorporados en las sucesivas pesadas, hasta llegar al resultado final; a la falta de control en los pesos
de los platillos, sometidos a mufla; falta de control en el calibrado del pH-metro y / o balanzas y a la
complejidad del método analítico en sí. Sin embargo, la variabilidad observada en el tiempo pudo deberse a
problemas con los corderos donantes de licor ruminal tales como cambio de dietas, distintos corderos,
cambio de hábitat; falta de estabilidad del patrón, entre otras.
La incertidumbre del conjunto del proceso analítico, en unidades porcentuales de digestibilidad, fue de 1,28
para alfalfa y 2,94 para pasto llorón.

4.- Trazabilidad de las mediciones.

Demostrar la Trazabilidad es un requisito metrológico básico para los resultados de un laboratorio. Significa
comparar los resultados promedios de muestras de patrones realizadas en el laboratorio (O) con respecto a
los valores de referencia suministrado (E).
Para demostrar Trazabilidad se uso un test de hipótesis acerca de un parámetro - test “t de Student”.
Los resultados obtenidos indican que no existe Trazabilidad de los resultados respecto al valor de referencia
provisto por el Laboratorio de Nutrición Animal de EEA de Concepción del Uruguay, en ambos patrones
estudiados. Tabla 4

Tabla 4. Trazabilidad
Método Estadístico t experimental t critico Media (O) a Media crítica a
Alfalfa t=O–E 6,06 * 2,23 63,32 * 59,85± 1,28
Pasto llorón S/√n 4,71 * 2,2 28,20 * 21,9 ± 2,94
(*) Significativo (p - sig. < 0.05)
a
Medidas en unidades porcentuales de digestibilidad (1 - α = 0.95)

Los valores obtenidos por el LNA no son comparables con el valor del material de referencia (E). En Alfalfa
la media (O) superó el intervalo de medias críticas de 59,85 ± 1,28 unidades de digestibilidad; en Pasto llorón
la media (O) fue mayor que el intervalo de 21,9 ± 2,94 % de digestibilidad.

Prand, M.; Zimmermann, L. "y col." Validación y Control Interna de la Calidad 5

 Resulta importante destacar el significado de los valores obtenidos de 1,28 % y 2,94 %, para los patrones de
alta y baja digestibilidad, respectivamente. Los mismos, representan el valor de aceptación de resultados que
son comparables teniendo en cuenta un nivel de confianza en términos de probabilidad.
Si el criterio de aceptación utilizado por el LNA en análisis de rutina, del 3 y 6 unidades porcentuales de
digestibilidad, se mantiene, se sugiere repetir la experiencia para demostrar Trazabilidad con tamaños
muestrales ade: no menos de 4 repeticiones del material de referencia para alfalfa y no menos de 5
repeticiones del material de referencia para pasto llorón.

5.- Incertidumbre asociada a los resultados analíticos

La incertidumbre es el intervalo dentro del cual se espera encontrar el valor real de aquello que se mide[15]
Cualquier proceso de medición está sujeto a diferentes fuentes de variación, producto de errores aleatorios y
errores sistemáticos.
En procesos analíticos largos y/o complejos puede resultar realmente difícil hacer estimaciones parciales o
por etapas. El procedimiento global para estimar incertidumbre, considera al proceso analítico como una
“caja negra” en la que se introducen muestras y salen resultados asociados a las mismas. De ese modo la
incertidumbre se estima agrupando todas las etapas del proceso analítico en una sola. combinando según [1]:

U = 2
U MR + U Pr2 oceso + U Muestra
2
[1]
Donde:
U MRC: Incertidumbre del Material de Referencia. = k u MR (donde k = 2, para un nivel de 95 % de confianza)
U PROCESO: Incertidumbre del proceso obtenida en el análisis de Validación. = (t n * s n / √n: expresa la incertidumbre
expandida para el proceso)
U MUESTRA: Incertidumbre de las muestras = (t m * s m) / √m: expresa la incertidumbre expandida para las muestras
consideradas.)
t = valor de la distribución "t" de Student. Depende del número de repeticiones y del nivel de confianza (1 - α)

5.1.- Cálculo de Incertidumbre

El Laboratorio de Nutrición Animal - FCA no cuenta con datos acerca de la incertidumbre del patrón (U
MRC) que provee el Laboratorio de Nutrición Animal EEA Concepción del Uruguay, por lo que el cálculo de
incertidumbre del resultado final, no ha sido posible.
A modo de ejemplo se calcularon sólo dos componentes de incertidumbre expandida, la asociada al proceso
(U PROCESO) y la de muestras (U MUESTRA) reales de rutina.
La incertidumbre de las muestras se evaluó teniendo en cuenta un ensayo de rutina realizado en el LNA para
una muestra aleatoria, de alfalfa y pasto llorón. Los resultados del análisis se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5. Resultados obtenidos en un análisis de rutina en unidades porcentuales de Digestibilidad.

Muestra 1 = Alfalfa Muestra 2 = Pasto llorón
Promedio 65,81 28,86
Desvió Estándar 0,93 0,78
Replicas 2 2

En la Tabla 6, se presentan los valores de dispersión en términos de desvío estándar y la incertidumbre

expandida del proceso y de las muestras. Los resultados muestran que la incertidumbre debida a las muestras
resultó mayor a la del proceso, debido a la variabilidad que aporta el muestreo, submuestreo y al número
reducido de réplicas para el análisis de rutina.

Tabla 6: Valores de Desvío Estándar e Incertidumbre parcial expandida en unidades de porcentuales de Digestibilidad
Desvío estándar Incertidumbre
Material de Referencia Desconocido Desconocido
Proceso (alfalfa) 1,90 2,228 * 1,90 / √11 = 1,28
Proceso (pasto llorón) 4,63 2,201 * 4,64 / √ 12 = 2,94
Muestra 1 (alfalfa) 0,93 12,706 * 0,93 / √ 2 = 8,35
Muestra 2 (pasto llorón) 0,78 12,706 * 0,78 / √ 2 = 6,99
Incertidumbre expandida (alfalfa) U = √u MRC + (1.28) + (8.35)2
2 2

Incertidumbre expandida (pasto llorón) U = √u2 MRC + (2,94)2 + (6,99)2

a
n = (Z 2 * S 2) / e2 ; para un nivel de confianza de 1- α = 0.95

6 XVII Jornadas IRAM - Universidades UNLM, Octubre 2002

 6.- Aseguramiento de la calidad de los resultados de Ensayos
Como parte de su Sistema de Calidad, los laboratorios deben tener un programa sistemático de control
interno y participar, siempre que sea posible, en ensayos de aptitud. El control de calidad interno en un
laboratorio, se puede implementar, entre otros, a través de Gráficos de Control y Análisis Cruzados entre los
analistas. Los datos resultantes deben ser registrados de forma tal que se puedan detectar las tendencias
debiéndose aplicar técnicas estadísticas para la revisión de los resultados.[9,13]

6.1.- Gráficos de Control

Los gráficos de control, diseñados por Shewhart, proporcionan una representación visual de los datos
permitiendo detectar y separar las causas especiales o asignables de la variación del proceso de las causas
comunes o debidas al azar. [12,18,19]
Dos de los gráficos más utilizados son, el Gráfico del Promedio y el Gráfico del Rango. El primero permite
obtener información acerca de causas que llevan a que el proceso de medida esté fuera de control estadístico,
y el segundo es importante para evaluar la precisión del proceso. Otro de los gráficos es el de Control de
Observaciones individuales.
Un diagrama de control puede indicar una condición fuera de control cuando uno o más puntos se hallan
fuera de los límites de actuación de 3 σ, o bien cuando los puntos representados exhiben algún patrón de
comportamiento no aleatorio.

6.1.1 Construcción de gráficos de control

Para la construcción de los gráficos se usaron 11 muestras (m) del patrón alfalfa y 12 del patrón pasto llorón,
cada uno con dos repeticiones (n), utilizados en la demostración de la Validación.
Analizando el gráfico del Rango (Fig. 1) para el patrón alfalfa no se observan puntos fuera de los límites de
actuación. Sin embargo, se observan una alta concentración de puntos por debajo de la línea central
(comportamiento no aleatorio). La variabilidad entre las repeticiones de una misma muestra, es significativa
(muestra 5, 8 y 11) lo que estaría indicando falta de precisión.

Gráfico del Rango Patrón Alfalfa

3 LSC = 2,95

2,5 2σ
% DIVMO

2
1σ
1,5

1 L Central = 0,90

0,5 1σ
LIC = 0,00
0
0 2 4 6 8 10 12
Muestras

Fig. 1 Gráfico de control para el Rango para Patrón Alfalfa

La gráfica del promedio (Fig. 2) muestra que el proceso analítico durante el período evaluado estuvo fuera de
control por diferentes causas. La muestra nº 11 cae fuera de los límites de actuación. Se observa, además,
una fuerte tendencia descendente en los promedios de las muestras (comportamiento no aleatorio).

Gráfico del Promedio Patrón Alfalfa

66
LSC = 2,95
2σ
64 1σ
% DIVMO

L Central = 63,32
1σ
62 2σ
LIC = 61,63

60

58
0 2 4 6 8 10 12
Muestras

Fig. 2 Gráfico de control del Promedio para Patrón Alfalfa

Para el patrón pasto llorón (Fig. 3), el gráfico para Rango no presenta puntos fuera de los límites de control.
Sin embargo, existe una distribución no aleatoria de los puntos y se observa variabilidad en las muestras 2 y
6. Esto esta indicando que el proceso no estuvo bajo control.

Prand, M.; Zimmermann, L. "y col." Validación y Control Interna de la Calidad 7

 Gráfico del Rango Patrón Pasto llorón
3 LSC = 2,72
2,5
2σ

% DIVMO
2

1,5 1σ

1 L Central = 0,83

0,5 1σ

0 LIC = 0,00
0 2 4 6 8 10 12
Muestras

Fig. 3 Gráfico de control para el Rango para Patrón Pasto llorón

El gráfico del promedio (Fig. 4) muestra una elevada cantidad de muestras fuera de los límites de actuación,
evidencia una alta variabilidad entre las distintos muestras.

Gráfico del Promedio Patrón Pasto llorón

36

32 LSC = 29,77
2σ
% DIVMO

1σ
28 L Central = 28,20
1σ
2σ
LIC = 26,64
24

20
0 2 4 6 8 10 12
Muestras

Fig. 4 Gráfico de control para el Promedio para Patrón Pasto llorón

6.2.- Análisis cruzado entre analistas.[13,19]

El objetivo de este tipo de control, es el de asegurarse que dos o más analistas que realizan análisis de rutina,
trabajan con el mismo nivel de precisión.
La técnica estadística para el análisis de los datos, es el Análisis de Variancia (ANVA) Dicho método permite
trabajar sobre cualquier diseño experimental, comparando en forma simultánea diversos factores y
determinando, qué porcentaje de la variación total de los resultados obtenidos, le corresponde a cada
fuente.[2,5,11, 21]

6.2.1.- Método de Análisis de Variancia . Cálculo de componentes de variancias

El modelo de ANVA utilizado es el Modelo de Efectos Aleatorios o Modelo de componentes de Varianza.
Para demostrar el efecto de diferentes analistas se condujo un ensayo en LNA en el mes de octubre del año
2000. Participaron dos laboratoristas, realizando el análisis de digestibilidad DIVMO, sobre dos muestras de
alimentos (muestra 1 = Silo de grano de maíz entero; y muestra 2 = Afrechillo.) Cada analista realizó 9
determinaciones de cada forraje.
La prueba de F del Análisis de Variancia permite comprobar si las estimaciones de la variancia de cada
fuente, difieren significativamente de la variación aleatoria debida al error experimental de la medición
(repetibilidad). Los resultados (tabla 7) muestran efectos significativos de los analistas, indicando que no
han trabajado con el mismo nivel de precisión. Se observó diferencias entre muestras, mientras que la
interacción entre operadores y muestras no mostró diferencias (p < 0,05)

Tabla 7. Tabla de análisis de Variancia

Tabla de Análisis de Variancia

Fuentes de Suma de G. l. Cuadrados F-obs. F 0.05

Variación Cuadrados Medios
--------------------------------------------------------------------------
Analistas 26,4882 1 26,4882 9,635 4,17
Muestras 3622,43 1 3622,43 1317,6 4,17
Analistas*Muestras 2,4649 1 2,4649 0,90 4,17
Residual (Error) 87,9763 32 2,74926
--------------------------------------------------------------------------
Total 3739,36 35

8 XVII Jornadas IRAM - Universidades UNLM, Octubre 2002

El efecto de los analistas, puede observarse en los gráficos de control de observaciones individuales. El
analista A obtuvo valores promedios de digestibilidad mayores, tanto en silo de grano de maíz como en
afrechillo. En cuanto a la precisión, el analista A fue mas preciso en silo de grano de maíz, pero resulto
menos preciso en afrechillo. Fig. 5.

ANALISTA A ANALISTA B
92 92
LSC = 90,52
90 LSC = 88,99 90
2σ
88 2σ 88

% DIVMO
% DIVMO

86 86
L Central = 84,70
84 84 L Central = 83,51
2σ 82
82
80 LIC = 84,41 80
78 78 2σ
76 76
LIC = 76,50
74 74
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Repeticiones Repeticiones

a) Silo grano maíz entero b) Silo grano maíz entero

ANALISTA A ANALISTA B
72 72
LSC = 71,57
70 2σ 70
68 68 LSC = 68,03
% DIVMO

% DIVMO
66 66 2σ
L Central = 65,16
64 64
L Central = 62,92
62 2σ 62
60 60 2σ
LIC = 58, 75
58 58 LIC = 57,81
56 56
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
Repeticiones Repeticiones

c) Afrechillo d) Afrechillo

Fig. 5 Gráficos de Control de Observaciones Individuales

Los Componentes de Variancia se estiman a partir de los cuadrados medios de cada fuente obtenidos del
Análisis de Variancia. Su uso permite determinar cuáles son los factores y su contribución porcentual en la
variación total del proceso, como así también, evaluar la precisión del método en términos de repetibilidad y
reproducibilidad.
La estimación de los componentes de variancia se presentan en la tabla 7.
Los resultados indican que del 100 % de la variación total del método analítico -repetibilidad y
reproducibilidad - (R y R), el 67,32 % se debe a la repetibilidad, es decir a la variabilidad que existe entre las
repeticiones realizadas por el mismo operador dentro de cada muestra. La reproducibilidad, que cuantifica la
variabilidad entre operadores, contribuyó con un 32,58 % de variación, esto significa que los resultados
obtenidos por ambos operadores son comparativamente menos variables que los obtenidos en cada muestra.
La interacción no aporta variabilidad debido a que en el análisis de variancia resultó no significativo.
Tabla N º 7: Estimación de las Componentes de Variancia
Estimación de las componentes de Variancia.
Variable Medida: % de Digestibilidad in Vitro de la Materia Orgánica.

2 Analistas 2 Muestras 9 Repeticiones

Estimación Estimación Porcentaje

Desvío Estándar Variancia Variación Total
--------------------------------------------------------------------------------------
Repetibilidad 1,65809 2,74926 67,32
Reproducibilidad 1,15526 1,33463 32,68
Interacción 0,0 0,0 0,00
--------------------------------------------------------------------------------------
R y R 2,02086 4,08389 100,00

Prand, M.; Zimmermann, L. "y col." Validación y Control Interna de la Calidad 9

 Conclusiones
Del análisis de aspectos técnicos vinculados con la evaluación y control de calidad, exigidos por la Norma
IRAM 301 - ISO / IEC 17025:1999, desarrollados en el presente trabajo, se concluye:

• Respecto de la validación del método de Digestibilidad in Vitro de la Materia Orgánica, el estudio

retrospectivo mostró falta de precisión y niveles de exactitud en el límite de aceptación establecidos por
el LNA.
• No ha podido verificarse la Trazabilidad del método. El procedimiento de análisis es susceptible de
mejorarse detectando errores sistemáticos y al mismo tiempo aumentando el número de repeticiones del
patrón de alta digestibilidad, a no menos de 4 repeticiones y del patrón de baja digestibilidad, a no menos
de 5 repeticiones.
• La incertidumbre del resultado final de una muestra de rutina no pudo ser estimada ya que el LNA no
cuenta con el valor de incertidumbre del patrón de referencia.
• El control interno de la calidad - mediante el uso de gráficos de control del rango y promedio - mostró
para el período evaluado, para ambos patrones, evidencias de falta precisión entre repeticiones de una
misma muestra y entre muestras en el tiempo.
• El control interno de la calidad - análisis cruzado entre analistas - mostró que los laboratoristas no han
trabajado con el mismo nivel de precisión.
Por lo expuesto se sugiere que el Laboratorio de Nutrición Animal de la FCA - UNER realice, a través de una
adecuada planificación, una validación prospectiva del método de Digestibilidad In Vitro de la Materia
Orgánica.
Solicite el valor de incertidumbre de los patrones de referencia, al proveedor, con el objeto de poder efectuar
el cálculo de la incertidumbre global de los resultados de los ensayos de rutina.
Adecue el número de réplicas de muestras incógnitas usados en ensayos de rutina, a fin de lograr una mejor
estimación de la variabilidad y mejorar la precisión de los análisis.

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