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Carta de motivación
Ayush profundo

Una de mis experiencias más impactantes durante la universidad ocurrió durante mi tercer año de curso
de biología molecular. En casi todas las conferencias, quedé cautivado por los diferentes complejos
macromoleculares que eran el foco de la clase. Lo que más me intrigaba eran las formas simples que el
profesor había utilizado como representaciones en sus powerpoints. “¿Cuán precisos podrían ser estos
simples dibujos con respecto a las estructuras reales de estos complejos?” Pensaría.
Esta curiosidad eventualmente resultó en el desarrollo de mi rutina diaria; Tomaría nota de los complejos
que me parecieron particularmente interesantes, encontraría sus estructuras en el Banco de datos de
proteínas y luego los examinaría en PyMOL.

Me fascinó lo diversas que parecían muchas de estas macromoléculas, tanto en tamaño como en forma.
Algo aún más fascinante para mí fue cómo su estructura afectaba su función. De vez en cuando, terminaba
realizando búsquedas aparentemente interminables de la estructura de una proteína o de un complejo
macromolecular. Mi incapacidad para encontrar una estructura me llevaría a concluir que esta biomolécula
aún no había sido visualizada. Lo que más me sorprendió fue que muchas de estas biomoléculas misteriosas
estaban involucradas en vías críticas para la salud y las enfermedades humanas. Un ejemplo particular que
me llamó la atención fue la proteína reparadora de daños en el ADN, BRCA2, para la cual encontré varias
estructuras parciales, pero ninguna estructura completa. Como esta proteína desempeñaba un papel
importante en la supresión de tumores, me llamó la atención que su estructura completa aún no se hubiera
resuelto. Al darme cuenta de que aún quedan por visualizar muchos complejos biológicos importantes,
como el BRCA2, me motivé a seguir investigando en el campo de la biología estructural. Tuve la suerte de
tener la oportunidad de realizar la investigación de mi tesis de licenciatura en un laboratorio de biología
estructural y aprendí mucho en el camino.
Ahora me gustaría continuar mi educación para explorar el tema más en profundidad. Por lo tanto, estoy
postulando al programa de Maestría en Biología en ETH Zurich, con el objetivo de realizar investigaciones
en biología estructural para obtener una mejor comprensión del mundo molecular.

Tres años de experiencia trabajando en el laboratorio de Agrawal me han preparado para los desafíos
que enfrenta el campo de la biología estructural. Durante mis primeros dos años en el laboratorio me
encargaron la sobreexpresión y purificación de un factor de traducción en un sistema de sobreexpresión bacteriana.
En el transcurso de este proyecto, aprendí mucho sobre bioquímica de proteínas, principalmente métodos
de purificación por afinidad de proteínas, junto con técnicas básicas de laboratorio de biología molecular,
como cultivo de bacterias, transferencia Western, SDS­PAGE y PCR. Desde que me gradué, he trabajado
a tiempo completo como asistente de investigación en el mismo laboratorio y he tenido más oportunidades
de explorar una amplia gama de proyectos. En uno de los proyectos, estandaricé un ensayo de GTPasa
para medir las diferencias en la susceptibilidad de diferentes tipos de ribosomas a una variedad de
antibióticos. También analicé estas estructuras y pude determinar las bases moleculares de la susceptibilidad
o resistencia. En otro proyecto procesé datos crio­EM de la pequeña subunidad ribosomal de M. smegmatis
cultivada en condiciones limitantes de nutrientes. Interpreté las diferentes clases de mapas de densidad
obtenidos de este conjunto de datos e identifiqué la presencia de múltiples factores traslacionales unidos a
la subunidad. He aprendido una serie de habilidades computacionales clave importantes para la biología
estructural a través de cada proyecto. Estos incluyen secuencias de comandos en la línea de comandos de
Unix, procesamiento de datos crio­EM con cryoSPARC, uso de Chimera y ChimeraX para la visualización
de mapas y PDB, y uso de Coot y

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PHENIX para la construcción y refinamiento de modelos. Además, también he estado aprendiendo a

vitrificar y preparar grillas para la toma de datos.

Aunque hay muchos grupos excelentes de investigación en biología estructural presentes en ETH
Zurich, tengo muchas ganas de trabajar en el laboratorio del Dr. Nenad Ban. Mi interés surge del trabajo
del laboratorio en la determinación de la estructura de grandes conjuntos biomoleculares, con especial
atención a la maquinaria traslacional. Mi experiencia previa en biología de ribosomas y crio­EM me
ayudaría a adaptarme rápidamente a las necesidades de investigación del laboratorio. La historia del
trabajo del grupo con el complejo mTOR, que es un importante regulador de la traducción, también es de
gran interés para mí, ya que tengo especial curiosidad por los cambios en el panorama de la síntesis de
proteínas durante las condiciones limitantes de nutrientes.

En conclusión, espero ampliar mi formación académica con el objetivo de comprender con mayor
detalle el mundo molecular. Mi fascinación por la biología estructural no ha hecho más que crecer después
de realizar investigaciones de primera mano. Si tengo la oportunidad de inscribirme en ETH Zurich como
estudiante de maestría, la aprovecharé al máximo trabajando duro para contribuir a nuestra comprensión
de cómo los mecanismos biológicos básicos gobiernan la salud y las enfermedades humanas.

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Conocimientos estructurales sobre la falta de nutrientes y la ribofagia

impulsada por la inhibición de mTOR
Ayush profundo

Fondo
Las condiciones limitantes de nutrientes y la inhibición de mTOR dan como resultado la autofagia selectiva de la
maquinaria de traducción en eucariotas a través de un proceso conocido como ribofagia1­3. Se requieren proteínas
adaptadoras específicas, NUFIP1 y ZNHIT3, para la degradación de la subunidad 60S, pero aún no está claro
dónde se unen estos factores en la 60S1 . Los datos también han demostrado que los ribosomas pueden
remodelarse durante condiciones limitantes de nutrientes para permitir que los receptores de ribofagia se unan1,
,
pero aún no se ha dilucidado la base estructural exacta de esta remodelación.
Dado que la regulación traslacional y la autofagia se ven alteradas en una serie de patologías, el conocimiento
estructural de estos procesos es de gran importancia para comprender las bases biológicas de enfermedades como
las ribosomopatías, los trastornos metabólicos, la neurodegeneración y el cáncer4, 5 . .

Objetivos y metas
El objetivo principal de este proyecto será determinar la estructura del complejo pre­ribofagia 60S (60S­NUFIP1­
ZNHIT3), junto con posibles estados intermedios utilizando dos técnicas de biología estructural complementarias,
microscopía electrónica criogénica (crio­EM) y espectrometría de masas de reticulación (CLMS)6 . Este estudio
ayudará a comprender los cambios estructurales exactos que ocurren en el ribosoma para permitir la unión de estos
receptores de ribofagia particulares. Se utilizará una muestra heterogénea de subunidades 60S purificadas
directamente de células de mamíferos cultivadas en condiciones inhibidas por mTOR y/o privadas de nutrientes.

Este conjunto de datos también se analizará más a fondo para determinar la formación de nuevos complejos que
pueden estar presentes solo durante la inhibición de mTOR o la falta de nutrientes.

Métodos de investigación
Las células HEK293 se cultivarán y luego se incubarán en medios privados de aminoácidos o tratados con Torin­1
durante 60 minutos1 . Los ribosomas se purificarán utilizando un gradiente de cojín de sacarosa y se fraccionarán
como se describe en ref7 . La reticulación química con disuccinimidil urea diacética (DSDU) reticulante reactiva
amina se puede realizar según sea necesario para mantener la integridad de los complejos nativos durante la
preparación de la rejilla crio­EM8 . La fracción 60S se utilizará para preparar rejillas y se recogerán micrografías.
Durante el procesamiento de datos crio­EM, una clasificación heterogénea extensa permitirá dilucidar complejos
que incluyen NUFIP1 y ZNHIT3, junto con otros factores potenciales.

Luego, la muestra 60S se analizará con espectrometría de masas de reticulación (CLMS) para determinar qué
proteínas están unidas a la subunidad grande9 . Estos datos se utilizarán posteriormente para la colocación y
modelado de proteínas unidas. Software como cryoID10 ayudará en la identificación de proteínas con mapas de
densidad crio­EM.

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El paso final implicará el modelado y la interpretación de los mapas de densidad crio­EM.

También se pueden utilizar programas como cryoDRGN11 junto con un software de modelado de biología estructural
estándar para determinar la dinámica de varias clases. Se propondrá un mecanismo de ensamblaje y relevancia
biológica basado en interpretaciones de los conjuntos estructurales.

Calendario e hitos

Hito Tiempo
Cultivo celular y purificación de ribosomas 2 a 4 semanas Preparación, detección
y recopilación de datos de la rejilla crio­EM 1 a 2 semanas
Recopilación y procesamiento de datos CLMS 2 semanas

Procesamiento de datos, interpretación de mapas y construcción de modelos 3 a 4 meses

Tabla 1: Cronograma aproximado del proyecto de 6 meses.

Nota: Si queda tiempo adicional, otras fracciones de la purificación de ribosomas (40S,

80S, 110S y polisomas) se pueden obtener imágenes y analizar.

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Referencias
1. Wyant, GA y cols. NUFIP1 es un receptor de ribosomas para la ribofagia inducida por el hambre.
Ciencia 360, 751–758 (2018).
2. An, H. & Harper, JW El análisis sistemático de la ribofagia en células humanas revela el flujo de
espectadores durante la autofagia selectiva. Nat. Biol celular. 20, 135­143 (2018).
3. Liu, GY y Sabatini, DM mTOR en el nexo entre nutrición, crecimiento, envejecimiento y
enfermedad. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 21, 183­203 (2020).
4. Yang, Y. & Klionsky, DJ Autofagia y enfermedad: preguntas sin respuesta. Celúla. Muerte
Diferir de. 27, 858–871 (2020).
5. Mills, EW & Green, R. Ribosomopatías: La unión hace la fuerza. Ciencia. 358
(2017).
6. Schmidt, C. & Urlaub, H. Combinación de microscopía crioelectrónica (crio­EM) y espectrometría de
masas de reticulación (CX­MS) para la elucidación estructural de grandes conjuntos de proteínas.
actual. Opinión. Estructura. Biol. 46, 157­168 (2017).
7. Weisser, M. et al. Conocimientos estructurales y funcionales de los complejos de reiniciación
humana. Mol. Celda 67, 447–456 (2017).
8. Muller, MQ, Dreiocker, F., Ihling, CH, Schafer, M. y Sinz, A. Reticulante escindible para análisis de
estructura de proteínas: identificación confiable de productos de reticulación
por MS en tándem. Anal. Química. 82, 6958–6968 (2010).
9. O'Reilly, FJ & Rappsilber, J. Espectrometría de masas de reticulación: métodos y aplicaciones en
biología estructural, molecular y de sistemas. Nat. Estructura. Mol. Biol. 25,
1000­1008 (2018).
10. Ho, CM, Li, X., Lai, M., Terwilliger, TC, Beck, JR, Wohlschege,l JA, Goldberg,
DE, Fitzpatrick, AWP y Zhou, ZH Proteómica estructural ascendente: crioEM
de complejos proteicos enriquecidos del medio celular. Métodos de la naturaleza 17, 79­85
(2020).
11. Zhong, ED, Bepler, T., Berger, B. y Davis, JH CryoDRGN: reconstrucción de estructuras
heterogéneas a partir de micrografías crioelectrónicas utilizando redes neuronales. Preimpresión
En bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.03.27.003871 (2020).