ES2955062T3

19 OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAÑA
11 Número de publicación: 2 955 062
51Int. CI.:
A61K 9/00 (2006.01)
A61K 39/00 (2006.01)
A61K 47/18 (2007.01)
A61K 47/26 (2006.01)
C07K 16/28 (2006.01)
12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86 Fecha de presentación y número de la solicitud internacional: 23.03.2018 PCT/US2018/024032

87 Fecha y número de publicación internacional: 11.10.2018 WO18187057
96 Fecha de presentación y número de la solicitud europea: 23.03.2018 E 18719338 (8)
97 Fecha y número de publicación de la concesión europea: 19.07.2023 EP 3606504
54 Título: Formulación estable de anticuerpos
30 Prioridad: 73 Titular/es:
06.04.2017 US 201762482270 P REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
(100.0%)
45 Fecha de publicación y mención en BOPI de la 777 Old Saw Mill River Road
traducción de la patente: Tarrytown, NY 10591-6707, US
28.11.2023 72 Inventor/es:
HU, QINGYAN y
LIU, DINGJIANG
74 Agente/Representante:
PONS ARIÑO, Ángel
Observaciones:
Véase nota informativa (Remarks, Remarques o
Bemerkungen) en el folleto original publicado por
la Oficina Europea de Patentes
ES 2 955 062 T3
Aviso:En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín Europeo de Patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre Concesión de Patentes Europeas).
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DESCRIPCIÓN
Formulación estable de anticuerpos
5 La presente solicitud se presentó el 23 de marzo de 2018 como una Solicitud de patente internacional PCT y reclama
el beneficio de la prioridad de la Solicitud de patente provisional de EE. UU. n.º 62/482.270, presentada el 6 de abril
de 2017.
Campo de la invención
10
La presente invención se refiere al campo de las formulaciones de anticuerpos terapéuticos. Más específicamente, la
presente invención se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humano
que se une específicamente a la proteína muerte programada -1 (PD-1) humana.
15 Antecedentes de la invención
Las macromoléculas terapéuticas (por ejemplo, los anticuerpos) deben formularse de una manera que no solamente
haga que las moléculas sean adecuadas para su administración a pacientes, sino que también mantengan su
estabilidad durante el almacenamiento y el uso posterior. Por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos en solución líquida
20 son propensos a la degradación, la agregación o a modificaciones químicas indeseadas, salvo que la solución se
formule apropiadamente. La estabilidad de un anticuerpo en una formulación líquida depende no solamente de los
tipos de excipientes usados en la formulación, sino también de las cantidad y proporciones de los excipientes unos
respecto a otros. Adicionalmente, cuando se prepara una formulación líquida de anticuerpos deben tenerse en cuenta
otras consideraciones aparte de la estabilidad. Los ejemplos de tales consideraciones adicionales incluyen la
25 viscosidad de la solución y la concentración de anticuerpo que puede adaptarse a una formulación dada, y la calidad
visual o el aspecto de la formulación. Por tanto, cuando se formula un anticuerpo terapéutico, debe tenerse gran
cuidado en llegar a una formulación que permanezca estable, contenga una concentración adecuada de anticuerpo y
posea una viscosidad adecuada, así como otras propiedades que posibiliten que la formulación se administre
convenientemente a los pacientes.
30
Los anticuerpos contra la proteína muerte programada -1 (PD-1) humana son un ejemplo de una macromolécula
terapéuticamente de interés que precisa una formulación adecuada. Los anticuerpos anti-PD-1 son clínicamente útiles
para el tratamiento del cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, melanoma y cáncer cerebral) e infecciones virales y
enfermedades autoinmunes. Se describen ejemplos de anticuerpos anti-PD-1, entre otros, en los números de
35 publicación/patente de 7101550, 7595048, 7488802, 7563869, 8008449, 8168757, 8216996, 20110008369,
20130017199, 20130022595, y en los documentos WO2006121168, WO2009114335, WO2012145493,
WO2013014668, WO2009101611, EP2262837 y EP2504028. El documento US20140234296 describe formulaciones
liofilizadas de un anticuerpo anti-PD-1.
40 Aunque se conocen los anticuerpos anti-PD-1, sigue existiendo una necesidad en la técnica de formulaciones
farmacéuticas novedosas que comprendan anticuerpos anti-PD-1 que sean suficientemente estables y adecuadas
para la administración a pacientes.
Breve sumario de la invención

45
La presente invención satisface la necesidad mencionada anteriormente al proporcionar formulaciones farmacéuticas
estables, según se define mediante las reivindicaciones, comprendiendo dichas formulaciones un anticuerpo humano
que se une específicamente a la proteína muerte programada 1 (PD-1) humana.
50 En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica líquida estable de baja viscosidad, que comprende: (i)
un anticuerpo humano que se une específicamente a la proteína muerte programada (PD-1) humana; (ii) un tampón;
(iii) un codisolvente orgánico; (iv) un estabilizante; y (v) un modificador de la viscosidad, como se define mediante las
reivindicaciones.
55 En diversas realizaciones, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 5 ± 0,75 mg/ml a

aproximadamente 250 ± 37,5 mg/ml. En una realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de
12,5 mg/ml ± 1,85 mg/ml, o de aproximadamente 12,5 mg/ml. En una realización, el anticuerpo se proporciona a una
concentración de 25 mg/ml ± 3,75 mg/ml, o de aproximadamente 25 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se
proporciona a una concentración de 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml, o de aproximadamente 50 mg/ml. En otra realización, el
60 anticuerpo se proporciona a una concentración de 100 mg/ml ± 15 mg/ml, o de aproximadamente 100 mg/ml. En una
realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml, o de aproximadamente
150 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml, o de
aproximadamente 175 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de 200 mg/ml ±
30 mg/ml, o de aproximadamente 200 mg/ml.
65
En determinadas realizaciones, la formulación comprende uno cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en
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la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º: 20150203579. El anticuerpo anti-PD-1 comprende (a) una región
variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las regiones determinantes de complementariedad de cadena
pesada 1, 2 y 3 (HCDR1-HCDR2-HCDR3), cada una de las cuales comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 3, la
SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5, respectivamente; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende
5 las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera 1, 2 y 3 (LCDR1-LCDR2-LCDR3), cada una de
las cuales comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. En
una realización, el anticuerpo comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
1 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, el anticuerpo
comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera
10 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En una realización, el anticuerpo comprende una
cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En una realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada
que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9 y 11; y una
cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En una realización, el anticuerpo
15 comprende una HCVR que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 1. En una realización, el
anticuerpo comprende una LCVR que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 2. En una
realización, el anticuerpo comprende una HCVR que tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 1
y una LCVR que tiene un identidad de secuencia del 90 % con la SEQ ID NO: 2.
20 El pH de la formulación líquida es de aproximadamente pH 6,0 ± 0,3.
El tampón comprende histidina. En determinadas realizaciones, el tampón de histidina está a una concentración de
desde 5 mM ± 1 mM a 50 mM ± 10 mM, preferentemente de 5 mM ± 1 mM a 25 mM ± 5 mM. En una realización, el
tampón de histidina está a una concentración de 10 mM ± 2 mM o aproximadamente 10 mM. En una realización, el
25 tampón de histidina está a una concentración de 20 mM ± 4 mM o aproximadamente 20 mM. En una realización, el
tampón de histidina está a una concentración de 40 mM ± 8 mM o aproximadamente 40 nM. En determinadas
realizaciones, el tampón de histidina comprende L-histidina y monoclorhidrato de L-histidina monohidrato. En una
realización, La L-histidina está a una concentración de desde 2 mM ± 0,4 mM a 25 mM ± 5 mM, preferentemente de 4
mM ± 0,8 mM a 20 mM ± 4 mM. En una realización, el monoclorhidrato de L-histidina monohidrato está en una
30 concentración de 2 mM ± 0,4 mM a 25 mM ± 5 mM, preferentemente de 4 mM ± 0,8 mM a 20 mM ± 4 mM. En una
realización, el tampón comprende L-histidina a una concentración de 4,8 mM ± 0,96 mM y monoclorhidrato de L-
histidina a una concentración de 5,2 mM ± 1,04 mM. En una realización, el tampón comprende histidina a una
concentración de 10 mM ± 2 mM, en donde la histidina comprende L-histidina a una concentración de 4,8 mM ± 0,96
mM y monoclorhidrato de L-histidina a una concentración de 5,2 mM ± 1,04 mM.
35
En determinadas realizaciones, el codisolvente orgánico es un polímero no iónico que contiene un resto de
polioxietileno. En una realización, el disolvente orgánico es un tensioactivo. En algunas realizaciones, el codisolvente
orgánico es uno cualquiera o más de polisorbato, poloxámero 188 y polietilenglicol 3350. En una realización, el
codisolvente orgánico es polisorbato 80. En una realización, el codisolvente orgánico es polisorbato 20.
40
En una realización, el codisolvente orgánico está a una concentración de aproximadamente el 0,01 % ± 0,005 % a
aproximadamente el 1 % ± 0,5 % "en peso sobre volumen" o "p/v", en donde, por ejemplo, 0,1 g/ml = el 10 % y 0,01
g/ml = el 1 %. En determinadas realizaciones, el disolvente orgánico es polisorbato a una concentración de desde el
0,05 % ± 0,025 % al 0,5 % ± 0,25 % (p/v). En una realización, el codisolvente orgánico es polisorbato 80, que está en
45 una concentración del 0,2 % ± 0,1 % p/v, o de aproximadamente el 0,2 %. En otra realización, el codisolvente orgánico
es polisorbato 80, que está a una concentración del 0,1 % ± 0,05 % p/v o de aproximadamente el 0,1 % p/v. En una
realización, el codisolvente orgánico es polisorbato 20, que está en una concentración del 0,2 % ± 0,1 % p/v, o de
aproximadamente el 0,2 %. En otra realización, el codisolvente orgánico es polisorbato 20, que está a una
concentración del 0,1 % ± 0,05 % p/v o de aproximadamente el 0,1 % p/v.
50
El estabilizante es un azúcar que es sacarosa. En diversas realizaciones, el estabilizante está en una concentración
de desde el 1 % ± 0,2 % p/v al 20 % ± 4 % p/v, de desde el 5 % ± 1 % p/v al 15 % ± 3 % p/v, o de desde el 1 % ± 0,2 %
al 10 % ± 2 % p/v. En una realización, el estabilizante es sacarosa a una concentración del 5 % ± 1 % p/v o de
aproximadamente el 5 % p/v. En otra realización, el estabilizante es sacarosa a una concentración del 9 % ± 1,8 % p/v
55 o de aproximadamente el 9 % p/v. En otra realización, el estabilizante es sacarosa a una concentración del 10 % ±
2 % p/v o de aproximadamente el 10 % p/v.
En una realización, el modificador de la viscosidad es L-prolina. En determinadas realizaciones, el modificador de la

viscosidad está en una concentración de desde el 1 % ± 0,2 % al 5 % ± 1 % p/v. En una realización, el modificador de
60 la viscosidad es prolina a una concentración del 1,5 % ± 0,3 % o de aproximadamente el 1,5 %. En una realización, el
modificador de la viscosidad es prolina a una concentración del 3 % ± 0,6 % o de aproximadamente el 3 %.
En determinadas realizaciones, la viscosidad de la formulación farmacéutica líquida a 25 °C es de menos o igual a

aproximadamente 15 cPoise ± 10 %, en donde 1 cP se refiere a 1 mPas. En determinadas realizaciones, la viscosidad
65 a 25 °C está entre 1,0 cPoise ± 10 % y 20 cPoise ± 10 %. En determinadas realizaciones, la viscosidad de la
formulación farmacéutica líquida es ≤ 15 cPoise. En determinadas realizaciones, la viscosidad de la formulación
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farmacéutica líquida es ≤ 20 cPoise. En determinadas realizaciones, la viscosidad de la formulación farmacéutica

líquida es ≤ 10 cPoise. En determinadas realizaciones, la viscosidad a 25 °C es de 5 cPoise ± 10 %, 6,0 cPoise ±
10 %, 7,0 cPoise ± 10 %, 7,1 cPoise ± 10 %, 7,2 cPoise ± 10 %, 7,9 cPoise ± 10 %, 8,3 cPoise ± 10 %, 9,0 cPoise ±
10 %, 9,6 cPoise ± 10 %, 10,0 cPoise ± 10 %, 10,6 cPoise ± 10 %, 11,4 cPoise ± 10 %, 11,6 cPoise ± 10 %, 11,8
5 cPoise ± 10 %, 12,0 cPoise ± 10 %, 13,0 cPoise ± 10 %, 14,0 cPoise ± 10 %, 15,0 cPoise ± 10 % o 16 cPoise ± 10 %.
Además se divulga, pero no de acuerdo con la invención, que se proporciona una formulación farmacéutica líquida
estable de baja viscosidad, que comprende: (i) de 5 ± 0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de un anticuerpo humano que
se une específicamente a PD-1 humana; (ii) tampón de histidina de desde 0 mM a 40 ± 8 mM; (iii) polisorbato 80 de
10 desde el 0 % al 0,5 % ± 0,25 % (p/v); (iv) sacarosa de desde el 0 % al 15 % ± 3 % (p/v) de sacarosa; y (v) prolina de
desde el 0 al 5 % ± 1 %, a un pH de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,7; en donde el anticuerpo anti-PD-1
comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) de modo
que la combinación HCVR/LCVR comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y
ligera (HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3), que comprenden las secuencias de aminoácidos de las
15 SEQ ID NO: 3 - 4 - 5 / las SEQ ID NO: 6 - 7 - 8, respectivamente. En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 comprende
una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. En determinadas realizaciones,
el anticuerpo anti-PD1 comprende una región Fc elegida del grupo que consiste en los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4 humanos. En una realización, el anticuerpo comprende un isotipo IgG4 humano. En una realización, el anticuerpo
20 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
las SEQ ID NO: 9 y 11; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En
una realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ
ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En una realización,
el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y
25 una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En una realización, el anticuerpo
tiene un peso molecular de 143 kDa ± 5 kDa.
Además se divulga, pero no de acuerdo con la invención, que se proporciona una formulación farmacéutica líquida de
baja viscosidad, que comprende: (i) de 5 ± 0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de un anticuerpo humano que se une
30 específicamente a PD-1 humana; (ii) tampón de histidina de desde 0 mM a 40 ± 8 mM; (iii) polisorbato 80 de desde el
0 % al 0,5 % ± 0,25 % (p/v); (iv) sacarosa de desde el 0 % al 15 % ± 3 % (p/v) de sacarosa; y (v) prolina de desde el
0 al 5 % ± 1 %, a un pH de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,7; en donde el anticuerpo anti-PD-1 comprende
una HCVR y una LCVR, en donde el HCVR tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEC ID NO: 1 y/o la
LCVR tiene una identidad de secuencia del 90 % con la SEC ID NO: 2. En una realización, el anticuerpo anti-PD-1
35 comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una LCVR que comprende
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena
pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9 y 11;
y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
40 Además se divulga, pero no de acuerdo con la invención, que se proporciona una formulación farmacéutica líquida de
baja viscosidad estable, que comprende: (i) de 5 ± 0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de un anticuerpo humano que se
une específicamente a PD-1 humana; (ii) tampón de histidina de desde 0 mM a 40 ± 8 mM; (iii) polisorbato 80 de desde
el 0 % al 0,5 % ± 0,25 % (p/v); (iv) sacarosa de desde el 0 % al 15 % ± 3 % (p/v) de sacarosa; y (v) prolina de desde
el 0 al 5 % ± 1 %, a un pH de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,7; en donde el anticuerpo anti-PD-1
45 comprende una HCVR y una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
1 que no tiene más de cinco sustituciones de aminoácidos, y en donde la LCVR comprende una secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que no tiene más de dos sustituciones de aminoácidos. En una realización, el
anticuerpo anti-PD-1 comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una
LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, el anticuerpo anti-PD-1
50 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
la SEQ ID NO: 9 y 11; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En determinadas realizaciones, la formulación de cualquiera de los aspectos anteriores tiene un atributo seleccionado
del grupo que consiste en: (i) la formulación es estable en el almacenamiento a largo plazo a 25 °C, 5 °C, -20 °C, -
55 30 °C y -80 °C, como se describe en el presente documento; (ii) la formulación es estable al estrés por agitación como
se describe en el presente documento; (iii) la formulación es de baja viscosidad (viscosidad de menos de 20 cPoise,
preferentemente de menos de 15 cPoise); (iii) la formulación es estable incluso con una variación de hasta ± 50 % en
las concentraciones de los excipientes de la formulación, como se describe en el presente documento; (iv) la
formulación es isoosmolar a las condiciones fisiológicas; (v) la formulación es estable y compatible con dispositivos y
60 procedimientos de suministro intravenoso; y (vi) la formulación es estable en el almacenamiento a largo plazo en un
vial de vidrio o en una jeringa precargada.
En determinadas realizaciones de este aspecto, se proporciona una formulación líquida estable, que comprende: (i)
de 5 ± 0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de un anticuerpo humano que se une específicamente a PD-1 humana; (ii)
65 tampón de histidina de desde 5 mM ± 1 mM a 20 ± 4 mM; (iii) polisorbato 80 de desde el 0,05 % ± 0,025 % al 0,3 % ±
0,15 % (p/v); (iv) sacarosa de desde el 1 % ± 0,2 % al 10 % ± 2 % (p/v); y (v) prolina de desde el 1 % ± 0,2 % al 5 %
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± 1 %, a un pH de aproximadamente 6,0, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que comprende una
pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2. En una realización, la formulación líquida estable de este
aspecto tiene una viscosidad de menos de 15 cP. En una realización, ≥ 90 % de los anticuerpos tienen un peso
molecular de 143 kDa ± 1 kDa. En una realización, la formulación farmacéutica tiene una viscosidad de menos de 20
5 cP, menos de 15 cP, o menos de 10 cP. En una realización, más del 96 % de los anticuerpos tienen una conformación
nativa tras el almacenamiento durante 12 meses a 5 °C. En una realización, al menos el 97 % o más de los anticuerpos
tienen una conformación nativa tras el almacenamiento a -80 °C, -30 °C y/o -20 °C durante 6 meses.
En una realización de este aspecto, la formulación líquida estable comprende (i) 25 ± 3,75 mg/ml de un anticuerpo
10 anti-PD-1; (ii) tampón de histidina 10 ± 2 mM; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (iv) prolina al 1,5 % ± 0,3 %
(p/v); y (v) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v), a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que
comprende una pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2.
15 anti-PD-1; (ii) L-histidina 4,8 mM ± 0,96 mM; (iii) monoclorhidrato de L-histidina monohidrato 5,2 mM ± 1,04 mM; (iv)
polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (v) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v); y (vi) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v), a un pH de
6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que comprende una pareja de secuencias de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2.
20 En una realización de este aspecto, la formulación líquida estable comprende (i) 50 ± 7,5 mg/ml de un anticuerpo anti-
PD-1; (ii) tampón de histidina 10 ± 2 mM; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (iv) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v);
y (v) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v), a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que
comprende una pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2. En una realización de esta formulación
particular, la viscosidad es de menos de 10 cPoise.
25
En una realización de este aspecto, la formulación líquida estable comprende (i) 50 ± 7,5 mg/ml de un anticuerpo anti-
PD-1; (ii) L-histidina 4,8 mM ± 0,96 mM; (iii) monoclorhidrato de L-histidina monohidrato 5,2 mM ± 1,04 mM; (iv)
30 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2.
En una realización, la formulación líquida estable comprende (i) 100 ± 15 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1; (ii) tampón
de histidina 10 ± 2 mM; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v) (p/v); (iv) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v); y (v) sacarosa
al 5 % ± 1 % (p/v), a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que comprende una
35 pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2. En una realización de esta formulación particular, la
viscosidad es de menos de 10 cPoise.
En una realización de este aspecto, la formulación líquida estable comprende (i) 100 ± 15 mg/ml de un anticuerpo anti-
PD-1; (ii) L-histidina 4,8 mM ± 0,96 mM; (iii) monoclorhidrato de L-histidina monohidrato 5,2 mM ± 1,04 mM; (iv)
40 polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (v) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v); y (vi) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v), a un pH de
En una realización, la formulación líquida estable comprende (i) 150 ± 22,5 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1; (ii)
45 tampón de histidina 10 ± 2 mM; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (iv) sacarosa al 10 % ± 2 % (p/v); y (v) prolina
al 1,5 % ± 0,3 % (p/v), a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que comprende una
pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2. En una realización de esta formulación particular, la
viscosidad es de menos de 20 cPoise, preferentemente de menos de 15 cPoise.
50 En una realización de este aspecto, la formulación líquida estable comprende (i) 150 ± 22,5 mg/ml de un anticuerpo
anti-PD-1; (ii) L-histidina 4,8 mM ± 0,96 mM; (iii) monoclorhidrato de L-histidina monohidrato 5,2 mM ± 1,04 mM; (iv)
55
anti-PD-1; (ii) tampón de histidina 10 ± 2 mM; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (iv) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v);
y (v) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v), a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que
comprende una pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2. En una realización de esta formulación
60 particular, la viscosidad es de menos de 20 cPoise, preferentemente de menos de 15 cPoise.
65 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que comprende una pareja de secuencias de
5
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anti-PD-1; (ii) tampón de histidina 10 ± 2 mM; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (iv) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v);
y (v) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v), a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una HCVR/LCVR que
5 comprende una pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2. En una realización de esta formulación
particular, la viscosidad es de menos de 20 cPoise.
10 polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % (p/v); (v) prolina al 1,5 % ± 0,3 % (p/v); y (vi) sacarosa al 5 % ± 1 % (p/v), a un pH de
En una realización, después del almacenamiento de la formulación a 45 ° durante 28 días, ≥ 90 % del anticuerpo es
15 nativo y ≥ 35 % del anticuerpo es de la forma de carga principal. En una realización, después del almacenamiento de
la formulación a 25° durante tres meses, > 94 % del anticuerpo es nativo y ≥ 44 % del anticuerpo es de la forma de
carga principal. En una realización, después del almacenamiento de la formulación a 5 ° durante 12 meses, > 96 %
del anticuerpo es nativo y > 50 % del anticuerpo es de la forma de carga principal. En una realización, después del
almacenamiento de la formulación a -20 ° durante 12 meses, > 96 % del anticuerpo es nativo y > 40 % del anticuerpo
20 es de la forma de carga principal. En una realización, después del almacenamiento de la formulación a -30 ° durante
12 meses, > 96 % del anticuerpo es nativo y > 40 % del anticuerpo es de la forma de carga principal. En una realización,
después del almacenamiento de la formulación a -80 ° durante 12 meses, > 96 % del anticuerpo es nativo y > 40 %
del anticuerpo es de la forma de carga principal. En una realización, más del 96 % de los anticuerpos tienen una
conformación nativa tras el almacenamiento durante 12 meses a 5 °C. En una realización, al menos el 97 % o más de
25 los anticuerpos tienen una conformación nativa tras el almacenamiento a -80 °C, -30 °C y/o -20 °C durante 6 meses.
Además se divulga, pero no de acuerdo con la invención, es una formulación líquida estable que comprende: (i) hasta
100 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1; (ii) tampón de histidina de desde 2 mM ± 0,4 mM a 20 mM ± 4 mM; (iii) sacarosa
hasta el 20 % ± 4 % (p/v); y (iv) polisorbato hasta el 0,2 % ± 0,1 % p/v, a pH 6,0 ± 0,3. En una realización, la formulación
30 líquida estable comprende 25 mg/ml de anticuerpo anti-PD-1. En una realización, la formulación líquida estable
comprende 50 mg/ml de anticuerpo anti-PD-1. En una realización, la formulación líquida estable comprende 75 mg/ml
de anticuerpo anti-PD-1. En una realización, la formulación líquida estable comprende tampón de histidina 10 mM ± 2
mM. En una realización, la formulación líquida estable comprende sacarosa al 5 %. En una realización, la formulación
líquida estable comprende sacarosa al 6 %. En una realización, la formulación líquida estable comprende sacarosa al
35 9 %. En una realización, la formulación líquida estable comprende sacarosa al 10 %. En una realización, la formulación
líquida estable comprende polisorbato al 0,1 %. En una realización, el polisorbato es polisorbato 80 o polisorbato 20.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 1/2.
En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica líquida estable de cualquiera de los aspectos anteriores
40 en un recipiente. En una realización, el recipiente es un vial de policarbonato. En una realización, el recipiente es un
vial de vidrio. En una realización, el vial de vidrio es un vial de vidrio de borosilicato tipo 1 con un tapón de goma de
butilo recubierto con fluorocarbono. En una realización, el recipiente es un microinfusor. En una realización, el
recipiente es una jeringa. En una realización, el recipiente es una jeringa precargada. En una realización, la jeringa
comprende un émbolo recubierto con fluorocarbono. En determinadas realizaciones, la jeringa es una jeringa de vidrio
45 larga de 1 ml o 2,25 ml que contiene menos de aproximadamente 500 partes por mil millones de tungsteno equipada
con una aguja de calibre 27, un tapón de caucho de butilo recubierto de fluorocarbono, y un tapón de punta de goma
no citotóxico y sin látex. En una realización, la jeringa es una jeringa de vidrio de 1 ml de largo equipada con una aguja
de pared fina de calibre 27, un tapón de goma 4023/50 revestido con FLUROTEC y una tapa de punta de goma FM
27. En una realización, la jeringa es una jeringa de plástico de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 5 ml o 10 ml provista de una aguja.
50
En un aspecto, se proporciona un kit que comprende una composición farmacéutica estable de uno cualquiera de los
aspectos anteriores, un recipiente e instrucciones. En una realización, el recipiente es un vial de vidrio. En una
realización, el recipiente es una jeringa precargada. En una realización, la jeringa es una jeringa de vidrio de 1 ml o
2,25 ml de largo equipada con una aguja de pared fina de calibre 27, un tapón de goma 4023/50 revestido con
55 FLUROTEC y una tapa de punta de goma FM 27. En una realización, la jeringa es una jeringa de plástico de 1 ml, 2
ml, 3 ml, 5 ml o 10 ml provista de una aguja.
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona una jeringa precargada que comprende una
formulación farmacéutica líquida estable que comprende: (i) de 5 ± 0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de un anticuerpo
60 humano que se une específicamente a PD-1 humana; (ii) tampón de histidina de desde 5 mM ± 1 mM a 20 ± 4 mM;
(iii) polisorbato 80 de desde el 0,05 % ± 0,025 % al 0,3 % ± 0,15 % (p/v); (iv) sacarosa de desde el 1 % ± 0,2 % al
10 % ± 2 % (p/v); y (v) prolina de desde el 1 % ± 0,2 % al 5 % ± 1 %, a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo
comprende una HCVR/LCVR que comprende una pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2; en
donde la formulación tiene un atributo seleccionado del grupo que consiste en: (i) ≥ 98 % del anticuerpo está en forma
65 nativa después del almacenamiento a 5 °C durante 12 meses; (ii) ≥ 53 % del anticuerpo es la variante de carga
principal después del almacenamiento a 5 °C durante 12 meses; (iii) ≥ 97 % del anticuerpo está en forma nativa
6
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después del almacenamiento a 25 °C durante 6 meses; (iv) la formulación es estable en el estrés por agitación en
donde ≥ 98 % del anticuerpo está en forma nativa después de 120 minutos de estrés por agitación en la jeringa
precargada; (v) más del 90 % de los anticuerpos tienen un peso molecular de 143 kDa ± 1 kDa; (vi) la formulación
farmacéutica tiene una viscosidad de menos de 20 cP, menos de 15 cP, o menos de 10 cP; (vii) más del 96 % de los
5 anticuerpos tienen una conformación nativa tras el almacenamiento durante 12 meses a 5 °C; y (viii) al menos el 97 %
o más de los anticuerpos tienen una conformación nativa tras el almacenamiento a -80 °C, -30 °C y/o -20 °C durante
6 meses.
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un vial de vidrio que comprende una formulación
10 farmacéutica líquida estable que comprende: (i) de 5 ± 0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de un anticuerpo humano que
se une específicamente a PD-1 humana; (ii) tampón de histidina de desde 5 mM ± 1 mM a 20 ± 4 mM; (iii) polisorbato
80 de desde el 0,05 % ± 0,025 % al 0,3 % ± 0,15 % (p/v); (iv) sacarosa de desde el 1 % ± 0,2 % al 10 % ± 2 % (p/v);
y (v) prolina de desde el 1 % ± 0,2 % al 5 % 1 %, a un pH de 6,0 ± 0,3, en donde el anticuerpo comprende una
HCVR/LCVR que comprende una pareja de secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1/2; en donde la formulación
15 tiene un atributo seleccionado del grupo que consiste en: (i) la formulación es estable al almacenamiento y al estrés
en un vial de vidrio; (ii) la formulación es estable y compatible para su uso en dispositivos de suministro i.v.; (iii) la
formulación es química y físicamente estable en la dilución con diluyentes convencionales conocidos en la técnica (por
ejemplo, cloruro de sodio al 0,9 % o dextrosa al 5 %); (iv) la formulación es estable en las bolsas i.v. de vidrio o
polímeros plásticos (por ejemplo, cloruro de polivinilo, ftalatos, poliolefinas o polipropileno); (v) la formulación es
20 compatible con las bombas de infusión convencionales (por ejemplo, un bomba peristáltica, una bomba de
desplazamiento de líquidos); (vi) ≥ 90 % de los anticuerpos tienen un peso molecular de 143 kDa ± 1 kDa; (vii) la
formulación farmacéutica tiene una viscosidad de menos de 20 cP, menos de 15 cP, o menos de 10 cP; (viii) más del
96 % de los anticuerpos tienen una conformación nativa tras el almacenamiento durante 12 meses a 5 °C; y (ix) al
menos el 97 % o más de los anticuerpos tienen una conformación nativa tras el almacenamiento a -80 °C, -30 °C y/o
25 -20 °C durante 6 meses.
Otras realizaciones serán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras

30
La Figura 1 es una tabla que muestra el efecto del pH sobre la estabilidad de mAb1 150 mg/ml incubado a 45 °C
durante 28 días. aLos resultados de 'Material de partida' de SE-UPLC, del inglés size exclusion-ultra performance
liquid chromatography, exclusión por tamaño-cromatografía líquida de ultrarrendimiento" y CEX-UPLC (del inglés
cation exchange ultra performance liquid chromatography, intercambio catiónico-cromatografía líquida de
35 ultrarrendimiento) son los valores promedio del material de partida para todas las formulaciones.
La Figura 2 muestra la estabilidad en el almacenamiento de tres formulaciones F1, F2 y F3, en donde F1
comprende mAb1 210 mg/ml, histidina 10 mM y prolina al 3 %, a pH 6,0; F2 comprende mAb1 210 mg/ml, histidina
10 mM y sacarosa al 3 %, a pH 6,0; y F3 comprende mAb1 210 mg/ml, histidina 10 mM y sacarosa al 5 %, a pH
6,0. La estabilidad en el almacenamiento se mide por el % de especies de alto peso molecular (HMW) generadas
40 durante el almacenamiento a -80 °C (A), -30 °C (B) y -20 °C (C) durante hasta 9 meses y analizado por
cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, del inglés size-exclusion chromatography).
La Figura 3 muestra la estabilidad en el almacenamiento de tres formulaciones F1, F2 y F3, en donde F1
comprende mAb1 150 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 9 % y polisorbato 80 (PS80) al 0,2 %, a pH 6,0; F2
comprende mAb1 175 mg/ml, histidina 10 mM, prolina al 3 % y PS80 al 0,2 %, a pH 6,0; y F3 comprende mAb1
45 175 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, prolina al 1,5 % y PS80 al 0,2 %, a pH 6,0. La estabilidad en el
almacenamiento se mide por el % de especies de alto peso molecular (HMW) generadas durante el
almacenamiento a -80 °C (A), -30 °C (B) y -20 °C (C) durante hasta 6 meses y analizado por cromatografía de
exclusión por tamaño (SEC).
La Figura 4 es una tabla que muestra la viscosidad de mAb1 150 mg/ml con la adición de excipientes y
50 modificadores de la viscosidad.
La Figura 5 es una tabla que muestra el efecto de los modificadores de la viscosidad sobre la estabilidad de mAb1
175 mg/ml incubado a 45 °C durante 14 días. aLos resultados de 'Material de partida' de pH, SE-UPLC y CEX-
UPLC son los valores promedio del material de partida para todas las formulaciones.
55 Descripción detallada
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni
a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. Además,
debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente
60 realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado
solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento
tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente
65 invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un
valor numérico o intervalo de valores indicado particular, significa que el valor puede variar del valor indicado en no
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más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99
y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.). Aunque pueden utilizarse en la práctica
o el ensayo de la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen
en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
5
Como se usa en el presente documento, la expresión "formulación farmacéutica" significa una combinación de al
menos un principio activo (por ejemplo, una molécula pequeña, macromolécula, compuesto, etc. que es capaz de
ejercer un efecto biológico en un ser humano o animal no humano) y al menos un excipiente que, cuando se combina
con el principio activo o uno o más excipientes adicionales, es adecuada para la administración terapéutica a un ser
10 humano o animal no humano. El término "formulación", como se usa en el presente documento, significa "formulación
farmacéutica" a menos que se indique específicamente otra cosa. La presente invención proporciona formulaciones
farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido terapéutico. De acuerdo con determinadas realizaciones de
la presente invención, el polipéptido terapéutico es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que
se une específicamente a la proteína muerte programada -1 (PD-1) humana. Más específicamente, la presente
15 invención incluye formulaciones farmacéuticas que comprenden: (i) un anticuerpo humano que se une específicamente
a PD-1 humana; (ii) un tampón de histidina; (iii) un codisolvente orgánico que es un tensioactivo no iónico; (iv) un
estabilizante que es un hidrato de carbono; y, opcionalmente, (v) un modificador de la viscosidad que es un
aminoácido. Los componentes y formulaciones ilustrativos específicos incluidos dentro de la presente invención se
describen en detalle a continuación.
20
ANTICUERPOS QUE SE UNEN ESPECÍFICAMENTE A PD-1
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender un anticuerpo humano, o un fragmento
de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 humana. Como se usa en el presente documento,
25 el término "PD-1" significa proteína humana de muerte programada 1. Los anticuerpos contra PD-1 humana se
describen en, por ejemplo, las patentes de EE. UU./N.º de publicación 8008449, 8168757, 20110008369,
20130017199, 20130022595, 20150203579 y en los documentos WO2006121168, WO2009114335, WO2012145493,
WO2013014668, WO2009101611, WO2015112800, EP2262837 y EP2504028.
30 El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia en líneas generales a
moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos
cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM); sin
embargo, las moléculas de inmunoglobulina que consisten en únicamente cadenas pesadas (es decir, carecen de
cadenas ligeras) también están abarcadas dentro de la definición del término "anticuerpo". Cada cadena pesada
35 comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V H) y una
región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y
CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como
LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio
(CL1). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones
40 determinantes de complementariedad (las CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas
regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y de cuatro FR, dispuestas desde el
extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Salvo que se indique específicamente otra cosa, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, debe
45 entenderse abarcando moléculas de anticuerpo completas, así como fragmentos de unión a antígeno de las mismas.
La expresión "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente
"porción de anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más
fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a PD-1 humana o un epítopo del
mismo.
50
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a un anticuerpo que
está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen distintas especificidades antigénicas (por ejemplo, un
anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-1 humana está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen
específicamente a antígenos distintos de PD-1 humana).
55
La expresión "se une específicamente" o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del
mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión
específica puede caracterizarse por una constante de disociación de al menos aproximadamente 1 x 10-8 M o mayor.
Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen,
60 por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Un anticuerpo aislado que se une de
manera específica a PD-1 humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como
moléculas PD-1 de otras especies (ortólogos). En el contexto de la presente invención, se considera que los
anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que se unen a la PD-1 humana así como a uno o más
antígenos adicionales "se unen específicamente" a PD-1 humana. Además, un anticuerpo aislado puede estar
65 sustancialmente exento de otro material celular o productos químicos.
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En las publicaciones de solicitud de patente US20150203579 y WO2015112800 se exponen anticuerpos anti-PD-1

human ilustrativos que pueden incluirse en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención.
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo anti-PD-1 humana, o fragmento
5 de unión a antígeno del mismo, comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada
(HCDR) 1 de la SEQ ID NO: 3, una HCDR2 de la SEQ ID NO: 4 y una HCDR3 de la SEQ ID NO: 5. En determinadas
realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 humana, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una HCVR de
la SEQ ID NO: 1.
10 De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el anti-PD-1 humana, o fragmento de unión a
antígeno del mismo, comprende una región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1 de la
SEQ ID NO: 6, una LCDR2 de la SEQ ID NO: 7 y una LCDR3 de la SEQ ID NO: 8. En determinadas realizaciones, el
anticuerpo anti-PD-1 humana, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una LCVR de la SEQ ID NO:
2.
15
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el anti-PD-1 humana, o fragmento de unión a
antígeno del mismo, comprende una HCVR que tiene una identidad de secuencia del 90 %, 95 %, 98 % o 99 % con
la SEQ ID NO: 1.
20 De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, el anti-PD-1 humana, o fragmento de unión a
antígeno del mismo, comprende una LCVR que tiene una identidad de secuencia del 90 %, 95 %, 98 % o 99 % con la
SEQ ID NO: 2.
25 antígeno del mismo, comprende una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que
no tiene más de 5 sustituciones de aminoácidos.
antígeno del mismo, comprende una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que
30 no tiene más de 2 sustituciones de aminoácidos.
La identidad de secuencia puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, GAP,
BESTFIT y BLAST).
35 La presente invención también incluye formulaciones que comprenden anticuerpos anti-PD-1, en donde los
anticuerpos anti-PD-1 comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o
CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por
ejemplo, la presente invención incluye formulaciones que comprenden anticuerpos anti-PD-1 que tienen secuencias
de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc.
40 sustituciones conservadoras de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR,
LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD1 comprende una región Fc elegida del grupo que consiste en
los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos.
45
El anticuerpo ilustrativo no limitante usado en los Ejemplos en el presente documento se denomina "mAb1". Este
anticuerpo también se denomina en el documento US 20150203579 H2M7798N o H4H7798N, y también se conoce
como "REGN2810" o "cemiplimab". mAb1 (H4H7798N) comprende una pareja de secuencias de aminoácidos
HCVR/LCVR que tienen la SEQ ID NO: 1/2, y los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3
50 representados por las SEQ ID NO: 3 - 4 - 5 / las SEQ ID NO: 6 - 7 - 8.
antígeno del mismo, comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 10.
55 Es bien sabido en la técnica que la escisión terminal de aminoácidos puede producirse durante la producción de
anticuerpos (véase, por ejemplo, Wang et al. 2007, J. Pharma. Sci. 96: 1-26). Por consiguiente, en determinadas
realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena pesada y una cadena ligera, la cadena pesada del
anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. La SEQ ID NO: 11 comprende la secuencia
de aminoácidos de la cadena pesada en donde la lisina carboxiterminal está ausente de la secuencia de aminoácidos
60 de la SEQ ID NO: 9. En determinadas realizaciones, las formulaciones de la presente divulgación contienen
aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %,
aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 98 % o más del anticuerpo anti-PD-1 en
donde la lisina carboxiterminal está ausente.
65 La cantidad de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, contenida dentro de las formulaciones
farmacéuticas de la presente invención puede variar dependiendo de las propiedades específicas deseadas de las
9
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formulaciones, así como las circunstancias particulares y fines para los que se pretenden a usar las formulaciones. En
determinadas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas son formulaciones líquidas que pueden contener de 5 ±
0,75 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml de anticuerpo; 10 ± 1,5 mg/ml a 240 ± 36 mg/ml de anticuerpo; 20 ± 3,0 mg/ml a 230
± 34,5 mg/ml de anticuerpo; 25 ± 3,75 mg/ml a 240 ± 36 mg/ml de anticuerpo; 50 ± 7,5 mg/ml a 230 ± 34,5 mg/ml de
5 anticuerpo; 60 ± 9 mg/ml a 240 ± 36 mg/ml de anticuerpo; 70 ± 10,5 mg/ml a 230 ± 34,5 mg/ml de anticuerpo; 80 ±
12 mg/ml a 220 ± 33 mg/ml de anticuerpo; 90 ± 13,5 mg/ml a 210 ± 31,5 mg/ml de anticuerpo; 100 ± 15 mg/ml a 200
± 30 mg/ml de anticuerpo; 110 ± 16,5 mg/ml a 190 ± 28,5 mg/ml de anticuerpo; 120 ± 18 mg/ml a 180 ± 27 mg/ml de
anticuerpo; 130 ± 19,5 mg/ml a 170 ± 25,5 mg/ml de anticuerpo; 140 ± 21 mg/ml a 160 ± 24 mg/ml de anticuerpo; 150
± 22,5 mg/ml de anticuerpo; o 175 ± 26,25 mg/ml. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden
10 comprender aproximadamente 5 mg/ml; aproximadamente 10 mg/ml; aproximadamente 15 mg/ml; aproximadamente
20 mg/ml; aproximadamente 25 mg/ml; aproximadamente 30 mg/ml; aproximadamente 35 mg/ml; aproximadamente
15 100 mg/ml; aproximadamente 105 mg/ml; aproximadamente 110 mg/ml; aproximadamente 115 mg/ml;
aproximadamente 120 mg/ml; aproximadamente 125 mg/ml; aproximadamente 130 mg/ml; aproximadamente
135 mg/ml; aproximadamente 140 mg/ml; aproximadamente 145 mg/ml; aproximadamente 150 mg/ml;
20 aproximadamente 190 mg/ml; aproximadamente 195 mg/ml; aproximadamente 200 mg/ml; aproximadamente
240 mg/ml; aproximadamente 245 mg/ml; o aproximadamente 250 mg/ml de un anticuerpo o un fragmento de unión a
antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 humana.
25
EXCIPIENTES Y pH
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más excipientes. El término "excipiente",
como se usa en el presente documento, significa cualquier agente no terapéutico añadido a la formulación para
30 proporcionar una consistencia, viscosidad o efecto estabilizante deseado.
En determinadas realizaciones, la formulación farmacéutica de la invención comprende al menos un codisolvente

orgánico en un tipo y en una cantidad que estabiliza el anticuerpo para PD-1 humana en condiciones de manipulación
brusca o agitación, tal como, por ejemplo, agitación vorticial. En algunas realizaciones, lo que se entiende por
35 "estabiliza" es la prevención de la formación de más del 3 % de anticuerpos agregados de la cantidad total de
anticuerpos (sobre una base molar) en el transcurso de una manipulación brusca. En algunas realizaciones, una
manipulación brusca consiste en agitar vorticialmente una solución que contiene el anticuerpo y el codisolvente
orgánico durante aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 120 minutos.
40 En determinadas realizaciones, el codisolvente orgánico es un tensioactivo no iónico, tal como un poli(óxido de etileno)
de alquilo. Los tensioactivos no iónicos específicos de acuerdo con la invención son tales como polisorbato 20,
polisorbato 28, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81 y polisorbato 85;
poloxámeros tales como poloxámero 181, poloxámero 188, poloxámero 407; o polietilenglicol (PEG). El polisorbato 20
también se conoce como TWEEN 20, monolaurato de sorbitán y monolaurato de polioxietilensorbitán. El poloxámero
45 188 también es conocido como PLURONIC F68.
La cantidad de tensioactivo no iónico contenida dentro de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención
puede variar dependiendo de las propiedades específicas deseadas de las formulaciones, así como las circunstancias
particulares y fines para los que se pretenden a usar las formulaciones. En determinadas realizaciones, las
50 formulaciones pueden contener tensoactivo del 0,01 % ± 0,005 % al 0,5 % ± 0,25 %. Por ejemplo, las formulaciones
de la presente invención pueden comprender polisorbato 20 o polisorbato 80 aproximadamente al 0,005 %;
aproximadamente al 0,01 %; aproximadamente al 0,02 %; aproximadamente al 0,03 %; aproximadamente al 0,04 %;
55 aproximadamente al 0,13 %; aproximadamente al 0,14 %; aproximadamente al 0,15 %; aproximadamente al 0,16 %;
60 aproximadamente al 0,45 %; aproximadamente al 0,46 %; aproximadamente al 0,47 %; aproximadamente al 0,48 %;
aproximadamente al 0,49 %; aproximadamente al 0,50 %; aproximadamente al 0,55 % o aproximadamente al
0,575 %.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más estabilizantes de un tipo y en una
65 cantidad que estabiliza el anticuerpo PD-1 humano en condiciones de estrés térmico. En algunas realizaciones, lo que
se entiende por "estabiliza" es el mantenimiento de más de aproximadamente el 91 % del anticuerpo en una
10
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conformación nativa cuando la solución que contiene el anticuerpo y el estabilizante térmico se mantienen a
aproximadamente 45 °C durante un máximo de aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, lo que se
entiende por "estabiliza" es en donde menos de aproximadamente el 6 % del anticuerpo se agrega cuando la solución
que contiene el anticuerpo y el estabilizante térmico se mantienen a aproximadamente 45 °C durante un máximo de
5 aproximadamente 28 días. Como se usa en el presente documento, "nativo" significa la forma principal del anticuerpo
por exclusión de tamaño, que generalmente es un monómero intacto del anticuerpo. El término "nativo" también se
refiere a la forma no agregada y no degradada del anticuerpo.
El estabilizante térmico es la sacarosa, cuya cantidad contenida dentro de la formulación puede variar dependiendo
10 de las circunstancias específicas y los fines pretendidos para los que se usa la formulación. En determinadas
realizaciones, las formulaciones pueden contener azúcar de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 15 %;
azúcar de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 14 %; azúcar de aproximadamente el 3 % a
aproximadamente el 13 %; azúcar de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 12 %; azúcar de
aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 12 %; azúcar de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el
15 11 %; azúcar de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 10 %; azúcar de aproximadamente el 8 % a
aproximadamente el 11 %; o azúcar de aproximadamente el 9 % a aproximadamente el 11 %. Por ejemplo, las
formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender azúcar al 4 % ± 0,8 %; 5 % ± 1 %; 6 % ±
1,2 %; 7 % ± 1,4 %; 8 % ± 1,6 %; 9 % ± 1,8 %; 10 % ± 2 %; 11 % ± 2,2 %; 12 % ± 2,4 %; 13 % ± 2,6 %; o de
aproximadamente el 14 % ± 2,8 % (por ejemplo, sacarosa).
20
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también comprenden un tampón o sistema tampón, que
sirve para mantener un pH estable y para ayudar a estabilizar el anticuerpo para PD-1 humana. El término "tampón",
como se usa en el presente documento, indica un tampón farmacéuticamente aceptable que mantiene un pH estable
o resiste los cambios de pH de la solución. De acuerdo con la invención, el tampón comprende histidina. En el contexto
25 de la presente divulgación, "tampón de histidina" o "tampón que comprende histidina" es un tampón que comprende
el aminoácido histidina. Los ejemplos de tampones de histidina incluyen cloruro de histidina, acetato de histidina,
fosfato de histidina y sulfato de histidina. En una realización preferida, el tampón de histidina se prepara disolviendo
L-histidina y clorhidrato de L-histidina (por ejemplo, como monohidrato) en una cantidad y proporción definidas. En
una realización, el tampón de histidina se prepara titulando L-histidina (base libre, sólida) con ácido clorhídrico diluido.
30 El término "histidina" se usa indistintamente con "tampón de histidina" a lo largo de la presente divulgación. En algunas
realizaciones, lo que se entiende por "estabiliza" es en donde menos del 4,5 % ± 0,5 % del anticuerpo se agrega
cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a aproximadamente 45 °C durante un máximo
de aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, lo que se entiende por "estabiliza" es en donde menos del
3 % ± 0,5 % o menos del 2,5 % ± 0,5 % del anticuerpo se agrega cuando la solución que contiene el anticuerpo y el
35 tampón se mantienen a aproximadamente 37 °C durante un máximo de aproximadamente 28 días. En algunas
realizaciones, lo que se entiende por "estabiliza" es cuando al menos el 93 % ± 0,5 % o al menos el 94 % ± 0,5 % del
anticuerpo está en su conformación nativa como se determina por cromatografía por exclusión de tamaño cuando la
solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a aproximadamente 45 °C durante hasta
aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, lo que se entiende por "estabiliza" es cuando al menos el 94 %
40 ± 0,5 % o al menos el 95 % ± 0,5 % del anticuerpo está en su conformación nativa como se determina por
cromatografía por exclusión de tamaño cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a
aproximadamente 37 °C durante hasta aproximadamente 28 días. Por "nativo" o "conformación nativa", lo que se
entiende es la fracción de anticuerpo que no se agrega o degrada. Esto se determina generalmente por un ensayo
que mide el tamaño relativo de la entidad de anticuerpo, tal como un ensayo cromatográfico de exclusión de tamaño.
45 El anticuerpo no agregado y no degradado eluye en una fracción que equivale al anticuerpo nativo y generalmente es
la fracción de elución principal. El anticuerpo agregado eluye en una fracción que indica un tamaño mayor que el
anticuerpo nativo. El anticuerpo degradado eluye en una fracción que indica un tamaño menor que el anticuerpo nativo.
En algunas realizaciones, lo que se entiende por "estabiliza" es en donde al menos el 35 % ± 0,5 % del anticuerpo
50 está en su forma de carga principal determinada por cromatografía de intercambio catiónico cuando la solución que
contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a aproximadamente 45 °C durante un máximo de aproximadamente
28 días. En algunas realizaciones, lo que se entiende por "estabiliza" es en donde al menos el 46 % ± 0,5 % o al
menos el 39 % ± 0,5 % del anticuerpo está en su forma de carga principal determinada por cromatografía de
intercambio catiónico cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a aproximadamente
55 37 °C durante hasta aproximadamente 28 días. Por "carga principal" o "forma de carga principal", lo que se entiende
es la fracción de anticuerpo que eluye de una resina de intercambio iónico en el pico principal, que generalmente está
flanqueado por picos más "básicos" en un lado y picos más "ácidos" en el otro lado.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención tienen un pH de 6.0 + 0.3.

60
El tampón comprende un tampón de histidina. En determinadas realizaciones, el tampón de histidina está presente a
una concentración de 5 mM ± 1 mM a 15 mM ± 3 mM; 6 mM ± 1,2 mM a 14 mM ± 2,8 mM; 7 mM ± 1,4 mM a 13 mM
± 2,6 mM; 8 mM ± 1,6 mM a 12 mM ± 2,4 mM; 9 mM ± 1,8 mM a 11 mM ± 2,2 mM; 10 mM ± 2 mM; o es
aproximadamente 10 mM. En determinadas realizaciones, el sistema de tampón comprende histidina 10 mM ± 2 mM,
65 a un pH de 6,0 ± 0,3. En realizaciones preferidas, el tampón de histidina comprende L-histidina y monoclorhidrato de
L-histidina monohidrato. En una realización, el tampón de histidina comprende L-histidina a una concentración de 4,8
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mM ± 0,96 mM. En una realización, el tampón de histidina comprende monoclorhidrato de L-histidina monohidrato a
una concentración de 5,2 mM ± 1,04 mM. En una realización, el tampón de histidina comprende L-histidina a una
concentración de 4,8 mM ± 0,96 mM y monoclorhidrato de L-histidina monohidrato a una concentración de 5,2 mM ±
1,04 mM.
5
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también comprenden uno o más excipientes que sirven
para mantener una viscosidad reducida o para disminuir la viscosidad de las formulaciones que contienen una alta
concentración de sustancia farmacológica de anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, generalmente ≥ 150 mg/ml de
anticuerpo). El modificador de la viscosidad es prolina. En una realización, la formulación farmacéutica de la presente
10 invención contiene L-prolina, a una concentración del 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 % o 5 %. El término
"prolina" se usa indistintamente con "L-prolina" a lo largo de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la
formulación comprende prolina en una cantidad suficiente para mantener la viscosidad de la formulación líquida a
menos de 20 ± 3 cPoise, menos de 15 ± 2,25 cPoise o menos de 11 ± 1,65 cPoise. En algunas realizaciones, la
formulación comprende prolina en una cantidad suficiente para mantener la viscosidad en o por debajo de 15 ± 2,25
15 cPoise. En determinadas realizaciones, las formulaciones pueden contener prolina de aproximadamente el 1 % a
aproximadamente el 5 %; prolina de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 4 %; o prolina a
aproximadamente el 3 %. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender
prolina al 1 %± 0,2 %; 1,5 % ± 0,3 %; 2 % ± 0,4 %; 2,5 % ± 0,5 %; 3 % ± 0,6 %; 3,5 % ± 0,7 %; 4 % ± 0,8 %; 4,5 % ±
0,9 %; o de aproximadamente al 5 % ± 1 %.
20
Durante el procedimiento de purificación de anticuerpos, puede ser conveniente o necesario cambiar un tampón por
otro para lograr concentraciones de excipientes, una concentración de anticuerpos, un pH, etc., apropiados. El cambio
de tampón se puede lograr, por ejemplo, por ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) usando, por ejemplo, una membrana
de filtración de flujo tangencial semipermeable. El uso de tales técnicas, sin embargo, tiene el potencial de provocar
25 el efecto Gibbs-Donnan [Bolton et al., 2011, Biotechnol. Prog. 27(1):140-152]. La acumulación de carga positiva en el
lado del producto de la membrana durante la concentración de proteína se contrarresta eléctricamente por el
movimiento preferencial de iones positivos hacia el lado opuesto de la membrana. La posible consecuencia de este
fenómeno es que las concentraciones finales de determinados componentes (por ejemplo, histidina, L-prolina, etc.)
pueden ser menores que las concentraciones diana pretendidas de estos componentes debido a la repulsión
30 electrostática de los excipientes del tampón de diafiltración con carga positiva con la proteína de anticuerpo con carga
positiva durante la etapa de UF/DF. Por tanto, la presente invención incluye formulaciones en las que la concentración
de, por ejemplo, la histidina y/o la L-prolina varían de las cantidades o intervalos mencionados en el presente
documento debido al efecto Gibbs-Donnan.
35 La exclusión por volumen describe el comportamiento de muestras altamente concentradas en las que una parte
significativa del volumen total de la solución es ocupada por el soluto, especialmente moléculas grandes como las
proteínas, excluyendo al disolvente de este espacio. Esto disminuye el volumen total de disolvente disponible para
que se disuelvan otros solutos, lo que puede dar lugar a una partición desigual a través de la membrana de
ultrafiltración. Por tanto, la presente invención incluye formulaciones en las que la concentración de, por ejemplo, la
40 histidina y/o la L-prolina pueden variar de las cantidades o intervalos mencionados en el presente documento debido
al efecto de exclusión por volumen.
Durante la fabricación de las formulaciones de la presente invención, pueden producirse variaciones en la composición
de la formulación. Estas variaciones pueden incluir la concentración del principio activo, la concentración de los
45 excipientes y/o el pH de la formulación. Debido a que los cambios en cualquiera de estos parámetros podrían
posiblemente afectar la estabilidad o la potencia de la especialidad farmacéutica, se realizaron estudios de intervalo
aceptable probado (PAR, del inglés proven acceptable range) para evaluar si las variaciones de la composición, dentro
de los intervalos definidos, afectaría la estabilidad o la potencia del anticuerpo. Por consiguiente, la presente invención
incluye formulaciones que comprenden anticuerpos anti-PD-1 que son estables y conservan su potencia con una
50 variación de hasta el 50 % en la concentración del excipiente. Por ejemplo, en el presente documento hay
formulaciones de anticuerpo anti-PD-1, en donde la estabilidad y la potencia de dichas formulaciones no están
afectadas por una variación de ± el 10 %, ± 20 %, ±30 %, ± 40 % o ± 50 % en la concentración de anticuerpo, la
sacarosa, el tampón de histidina y/o el polisorbato.
55 ESTABILIDAD Y VISCOSIDAD DE LAS FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención normalmente presentan altos niveles de estabilidad. El
término "estable", como se usa en el presente documento en referencia a las formulaciones farmacéuticas, significa
que los anticuerpos dentro de las formulaciones farmacéuticas conservan un grado aceptable de estructura química o
60 función biológica después del almacenamiento en condiciones definidas. Una formulación puede ser estable aunque
el anticuerpo contenido en la misma no mantenga un 100 % de su estructura química o función biológica después del
almacenamiento durante una cantidad definida de tiempo. En determinadas circunstancias, el mantenimiento de
aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %,
aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % de una estructura o función del anticuerpo después del
65 almacenamiento durante una cantidad definida de tiempo puede considerarse como "estable".
12
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La estabilidad puede medirse, entre otros, determinando el porcentaje de anticuerpo nativo que permanece en la
formulación después del almacenamiento durante una cantidad de tiempo definida a una temperatura definida. El
porcentaje de anticuerpo nativo puede determinarse por, entre otros, cromatografía de exclusión por tamaño (por
ejemplo, cromatografía de líquidos de ultrarrendimiento por exclusión de tamaño [SE-UPLC]), de modo que nativo
5 significa no agregado y no degradado. Un "grado aceptable de estabilidad", como se usa la expresión en el presente
documento, significa que al menos el 90 % de la forma nativa del anticuerpo puede detectarse en la formulación
después del almacenamiento durante una cantidad de tiempo definida a una temperatura dada. En determinadas
realizaciones, al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %
de la forma nativa del anticuerpo puede detectarse en la formulación después del almacenamiento durante una
10 cantidad definida de tiempo a una temperatura definida. La cantidad definida de tiempo después de la que se mide la
estabilidad puede ser de al menos 14 días, al menos 28 días, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses,
al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses,
al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o más. La
temperatura definida a la que la formulación farmacéutica puede almacenarse cuando se valúa la estabilidad puede
15 ser cualquier temperatura de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 45 °C, por ejemplo, almacenamiento a
aproximadamente -80 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente 0 °C,
aproximadamente 4°-8 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 35 °C,
aproximadamente 37 °C o aproximadamente 45 °C. Por ejemplo, una formulación farmacéutica puede considerarse
estable si después de 6 meses de almacenamiento a 5 °C, se detecta por SE-UPLC más de aproximadamente el
20 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de anticuerpo nativo. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si
después de 6 meses de almacenamiento a 25 °C, se detecta por SE-UPLC más de aproximadamente el 95 %, 96 %,
97 % o 98 % de anticuerpo nativo. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de
28 días de almacenamiento a 45 °C, se detecta por SE-UPLC más de aproximadamente el 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,
93 %, 94 %, 95 % o 96 % del anticuerpo nativo. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si
25 después de 12 meses de almacenamiento a -20 °C, se detecta por SE-UPLC más de aproximadamente el 96 %, 97 %
o 98 % del anticuerpo nativo. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de 12
meses de almacenamiento a -30 °C, se detecta por SE-UPLC más de aproximadamente el 96 %, 97 % o 98 % de
anticuerpo nativo. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de 12 meses de
almacenamiento a -80 °C, se detecta por SE-UPLC más de aproximadamente el 96 %, 97 % o 98 % de anticuerpo
30 nativo.
La estabilidad puede medirse, entre otros, determinando el porcentaje de anticuerpo que se forma en un agregado
dentro de la formulación después del almacenamiento durante un período de tiempo definido a una temperatura
definida, en donde la estabilidad es inversamente proporcional al porcentaje de agregado que se forma. El porcentaje
35 de anticuerpo agregado puede determinarse por, entre otros, cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo,
cromatografía de líquidos de ultrarrendimiento por exclusión de tamaño [SE-UPLC]). Un "grado aceptable de
estabilidad", como se usa la expresión en el presente documento, significa que como máximo el 5 % del anticuerpo se
encuentra en una forma agregada (también conocida como forma de alto peso molecular, HMW) detectada en la
formulación después del almacenamiento durante un período de tiempo definido a una temperatura determinada. En
40 determinadas realizaciones, un grado aceptable de estabilidad significa que, como máximo, puede detectarse
aproximadamente el 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo en un agregado en la formulación después
del almacenamiento durante una cantidad definida de tiempo a una temperatura dada. La cantidad definida de tiempo
después de la que se mide la estabilidad puede ser de al menos 2 semanas, al menos 28 días, al menos 1 mes, al
menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al
45 menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses,
al menos 24 meses o más. La temperatura a la que la formulación farmacéutica puede almacenarse cuando se valúa
la estabilidad puede ser cualquier temperatura de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 45 °C, por ejemplo,
almacenamiento a aproximadamente -80 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente
0 °C, aproximadamente 4°-8 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 35 °C,
50 aproximadamente 37 °C, o aproximadamente 45 °C. Por ejemplo, una formulación farmacéutica puede considerarse
estable si después de 12 meses de almacenamiento a 5 °C, menos de aproximadamente el 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 %
del anticuerpo se detecta en forma agregada. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si
después de tres meses de almacenamiento a 25 °C, menos de aproximadamente el 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 %
del anticuerpo se detecta en forma agregada. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si
55 después de 28 días de almacenamiento a 45 °C, menos de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %,
3 %, 2 %, 1 % o 0,5 %, del anticuerpo se detecta en forma agregada. Una formulación farmacéutica también puede
considerarse estable si después de tres meses de almacenamiento a 20 °C, -30 °C o -80 °C, menos de
aproximadamente el 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo se detecta en forma agregada.
60 La estabilidad puede medirse, entre otros, determinando el porcentaje de anticuerpo que migra en una fracción más
ácida durante el intercambio iónico ("forma ácida") que en la fracción principal del anticuerpo ("forma de carga
principal"), en donde la estabilidad es inversamente proporcional a la fracción de anticuerpo en forma ácida. Sin
pretender quedar ligados a teoría alguna, la desamidación del anticuerpo puede provocar que el anticuerpo adquiera
una carga más negativa y, por tanto, más ácido con respecto al anticuerpo no desamidado (véase, por ejemplo,
65 Robinson, N., Protein Deamidation, PNAS, 16 de abril de 2002, 99(8):5283-5288). El porcentaje de anticuerpo
"acidificado" puede determinarse por, entre otros, cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía
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líquida de ultrarrendimiento intercambio catiónico [CEX-UPLC]). Un "grado aceptable de estabilidad", como se usa la
expresión en el presente documento, significa que como máximo el 45 % del anticuerpo se detecta en una forma más
ácida en la formulación después del almacenamiento durante un período de tiempo definido a una temperatura
definida. En determinadas realizaciones, un grado aceptable de estabilidad significa que, como máximo, puede
5 detectarse aproximadamente el 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 %
del anticuerpo en una forma ácida en la formulación después del almacenamiento durante una cantidad definida de
tiempo a una temperatura dada. En una realización, un grado aceptable de estabilidad significa que puede detectarse
menos del 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo en una forma ácida
en la formulación después del almacenamiento durante una cantidad definida de tiempo a una temperatura dada. La
10 cantidad definida de tiempo después de la que se mide la estabilidad puede ser de al menos 2 semanas, al menos 28
días, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses,
al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12
meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o más. La temperatura a la que la formulación farmacéutica puede
almacenarse cuando se valúa la estabilidad puede ser cualquier temperatura de aproximadamente -80 °C a
15 aproximadamente 45 °C, por ejemplo, almacenamiento a aproximadamente -80 °C, aproximadamente -30 °C,
aproximadamente -20 °C, aproximadamente 0 °C, aproximadamente 4°-8 °C, aproximadamente 5 °C,
aproximadamente 25 °C o aproximadamente 45 °C. Por ejemplo, una formulación farmacéutica puede considerarse
estable si después de tres meses de almacenamiento a -80 °C, -30 °C o -20 °C, menos de aproximadamente el 30 %,
29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %,
20 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo se encuentra en una forma más
ácida. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de seis meses de
almacenamiento a 5 °C, menos de aproximadamente el 32 %, 31 %, 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %,
23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %,
2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo se encuentra en una forma más ácida. Una formulación farmacéutica también
25 puede considerarse estable si después de seis meses de almacenamiento a 25 °C, menos de aproximadamente el
43 %, 42 %, 41 %, 40 %, 39 %, 38 %, 37 %, 36 %, 35 %, 34 %, 33 %, 32 %, 31 %, 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %,
25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %,
5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo se encuentra en una forma más ácida. Una formulación
farmacéutica también puede considerarse estable si después de 28 días de almacenamiento a 45 °C, menos de
30 aproximadamente el 49 %, 48 %, 47 %, 46 %, 45 %, 44 %, 43 %, 42 %, 41 %, 40 %, 39 %, 38 %, 37 %, 36 %, 35 %,
34 %, 33 %, 32 %, 31 %, 30 %, 29 %, 28 %, 27 %, 26 %, 25 %, 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %,
16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del anticuerpo
puede detectarse en una forma más ácida.
35 Pueden usarse otros métodos para evaluar la estabilidad de las formulaciones de la presente invención, tales como,
por ejemplo, calorimetría diferencial de barrido (DSC, del inglés differential scanning calorimetry) para determinar la
estabilidad térmica, agitación controlada para determinar la estabilidad mecánica y la absorbancia a aproximadamente
350 nm o a aproximadamente 405 nm para determinar la turbidez de la solución. Por ejemplo, una formulación de la
presente invención puede considerarse estable si, después de 6 o más meses de almacenamiento a aproximadamente
40 5 °C a aproximadamente 25 °C, el cambio en la DO405 de la formulación es de menos de aproximadamente 0,05 (por
ejemplo, de 0,04, 0,03, 0,02, 0,01 o menos) de la DO405 de la formulación a tiempo cero.
Medir la actividad biológica o la afinidad de unión del anticuerpo por su diana también puede usarse para evaluar la
estabilidad. Por ejemplo, una formulación de la presente invención puede considerarse como estable si, después del
45 almacenamiento a, por ejemplo, 5 °C, 25 °C, 45 °C, etc. durante un período de tiempo definido (por ejemplo, 1 a 12
meses), el anticuerpo anti-PD-1 contenido en la formulación se une a PD-1 con una afinidad de al menos el 90 %, el
95 % o más de la afinidad de unión del anticuerpo antes de dicho almacenamiento. La afinidad de unión puede
determinarse mediante, por ejemplo, ELISA o resonancia de plasmón superficial. La actividad biológica puede
determinarse por un ensayo de actividad de PD-1, tal como, por ejemplo, poniendo en contacto una célula que expresa
50 PD-1 con la formulación que comprende el anticuerpo anti-PD-1. La unión del anticuerpo a dicha célula puede medirse
directamente, tal como, por ejemplo, mediante análisis por FACS. Alternativamente, puede medirse la actividad aguas
abajo del sistema PD-1 en presencia del anticuerpo, y compararse con la actividad del sistema PD-1 en ausencia del
anticuerpo. En algunas realizaciones, la PD-1 puede ser endógena para la célula. En otras realizaciones, la PD-1
puede expresarse de forma ectópica en la célula.
55
En los Ejemplos que se presentan a continuación se muestran métodos adicionales para evaluar la estabilidad de un
anticuerpo en una formulación.
Las formulaciones farmacéuticas líquidas de la presente invención pueden, en determinadas realizaciones, presentar
60 niveles de viscosidad de bajos a moderados. "Viscosidad", como se usa en el presente documento, puede ser
"viscosidad cinemática" o "viscosidad absoluta". La "viscosidad cinemática" es una medida del flujo de resistencia de
un líquido bajo la influencia de la gravedad. Cuando dos líquidos de volumen igual se colocan en viscosímetros
capilares idénticos y se deja que fluyan por gravedad, un líquido viscoso tarda más que un líquido menos viscoso en
fluir a través del capilar. Por ejemplo, si un líquido tarda 200 segundos en completar su flujo y otro líquido tarda 400
65 segundos, el segundo líquido es dos veces más viscoso que el primero en una escala de viscosidad cinemática.
"Viscosidad absoluta", a veces llamada viscosidad dinámica o simple, es el producto de la viscosidad cinemática y la
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densidad del fluido (viscosidad absoluta = viscosidad cinemática x densidad). La dimensión de la viscosidad cinemática
es L2/T donde L es una longitud y T es un tiempo. Comúnmente, la viscosidad cinemática se expresa en centistokes
(cSt). La unidad del SI de la viscosidad cinemática es mm2/s, que es 1 cSt. La viscosidad absoluta se expresa en
unidades de centipoise (cP). La unidad del SI de la viscosidad absoluta es el miliPascal-segundo (mPa-s), donde 1 cP
5 = 1 mPa-s.
Como se usa en el presente documento, un nivel bajo de viscosidad, en referencia a una formulación líquida de la
presente invención, mostrará una viscosidad absoluta de menos de aproximadamente 20 cPoise (cP). Por ejemplo,
una formulación líquida de la invención se considerará que tiene "baja viscosidad", si, cuando se mide usando técnicas
10 de medición de viscosidad convencionales, la formulación presenta una viscosidad absoluta de aproximadamente
20 cP, aproximadamente 19 cP, aproximadamente 18 cP, aproximadamente 15 cP, aproximadamente 12 cP,
aproximadamente 10 cP, aproximadamente 9 cP, aproximadamente 8 cP o menos. Como se usa en el presente
documento, un nivel moderado de viscosidad, en referencia a una formulación líquida de la presente invención,
presentará una viscosidad absoluta de entre aproximadamente 35 cP y aproximadamente 20 cP. Por ejemplo, una
15 formulación líquida de la invención se considerará que tiene "viscosidad moderada", si cuando se mide usando
técnicas de medición de viscosidad convencionales, la formulación presenta una viscosidad absoluta de
aproximadamente 34 cP, aproximadamente 33 cP, aproximadamente 32 cP, aproximadamente 31 cP,
20 aproximadamente 22 cP, aproximadamente 21 cP, aproximadamente 20 cP, aproximadamente 19 cP, 18 cP,
aproximadamente 17 cP, aproximadamente 16 cP o aproximadamente 15,1 cP.
Como se ilustra en los ejemplos siguientes, los presentes inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de
que se pueden obtener formulaciones líquidas de baja viscosidad que comprenden altas concentraciones de un
25 anticuerpo anti-PD-1 humana (por ejemplo, desde aproximadamente 50 mg/ml hasta 250 mg/ml) formulando el
anticuerpo con prolina de desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 % y sacarosa a aproximadamente
el 5 %. Dichas formulaciones son estables en estrés durante la manipulación y el almacenamiento a temperaturas que
varían de 45 °C a -80 °C (mostrado en el presente documento) y tienen una viscosidad baja (tienen una viscosidad
que varía de 7 a 15 cP).
30
FORMULACIONES ILUSTRATIVAS
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la formulación farmacéutica es una formulación líquida estable,
de baja viscosidad y generalmente fisiológicamente isotónica, que comprende: (i) un anticuerpo humano que se une
35 específicamente a PD-1 humana (por ejemplo, H4H7798N), a una concentración de hasta 250 mg/ml ± 45 mg/ml; (ii)
un sistema de tampón de histidina que proporciona suficiente tamponamiento a un pH de aproximadamente 6,0 ± 0,3;
(iii) un codisolvente orgánico, que protege la integridad estructural del anticuerpo; (iv) un estabilizante térmico que es
un azúcar; y (iv) un modificador de la viscosidad que es un aminoácido, que sirve para mantener la viscosidad
manejable para la inyección en un volumen conveniente para la administración subcutánea.
40
De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica de baja viscosidad estable comprende: (i) un anticuerpo
IgG4 humano que se une específicamente a PD-1 humana, y que comprende una HCDR1 de la SEQ ID NO: 3, una
HCDR2 de la SEQ ID NO: 4, una HCDR3 de la SEQ ID NO: 5, una LCDR1 de la SEQ ID NO: 6, una LCDR2 de la SEQ
ID NO: 7 y una LCDR3 de la SEQ ID NO: 8, a una concentración de hasta 200 mg/ml ± 30 mg/ml; (ii) tampón de
45 histidina 10 mM ± 2 mM, que tampona a pH 6,0 ± 0,3; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % p/v ± 0,1 % p/v; (iv) sacarosa al 5 %
± 1 % p/v; y (v) L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.
De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica de baja viscosidad y estable comprende: (i) un anticuerpo
50 HCDR2 de la SEQ ID NO: 4, una HCDR3 de la SEQ ID NO: 5, una LCDR1 de la SEQ ID NO: 6, una LCDR2 de la SEQ
ID NO: 7 y una LCDR3 de la SEQ ID NO: 8, a una concentración de 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (ii) tampón de histidina
10 mM ± 2 mM, que tampona a pH 6,0 ± 0,3; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % p/v ± 0,1 % p/v; (iv) sacarosa al 5 % ± 1 %
p/v; y (v) L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.
55 De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica de baja viscosidad y estable comprende: (i) un anticuerpo
10 mM ± 2 mM, que tampona a pH 6,0 ± 0,3; (iii) polisorbato 80 al 0,2 % p/v ± 0,1 % p/v; (iv) sacarosa al 5 % ± 1 %
60 p/v; y (v) L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.
65 ID NO: 7 y una LCDR3 de la SEQ ID NO: 8, a una concentración de 100 mg/ml ± 15 mg/ml; (ii) tampón de histidina 10
mM ± 2 mM, que tampona a pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 5 % p/v ± 1 % p/v; (iv) polisorbato 80 al 0,2 % p/v ± 0,1 %;
15
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y L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.
5 HCDR2 de la SEQ ID NO: 4, una HCDR3 de la SEQ ID NO: 5, una LCDR1 de la SEQ ID NO: 6, una LCDR2 de la SEQ
ID NO: 7 y una LCDR3 de la SEQ ID NO: 8, a una concentración de 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml; (ii) tampón de histidina 10
mM ± 2 mM, que tampona a pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 5 % p/v ± 1 % p/v; (iv) polisorbato 80 al 0,2 % p/v ± 0,1 %;
y L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.
10 De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica de baja viscosidad y estable comprende: (i) un anticuerpo
10 mM ± 2 mM, que tampona a pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 5 % p/v ± 1 % p/v; (iv) polisorbato 80 al 0,2 % p/v ± 0,1 %;
15 y L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.
Los ejemplos no limitantes adicionales de formulaciones farmacéuticas abarcadas por la presente invención se
exponen en otra parte en el presente documento, incluyendo los Ejemplos de trabajo presentados a continuación.
20 RECIPIENTES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar contenidas dentro de un recipiente adecuado
para almacenamiento de medicinas u otras composiciones terapéuticas. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas
pueden estar contenidas dentro de un recipiente de plástico o de vidrio precintado y esterilizado que tenga un volumen
25 definido tal como un vial, ampolla, jeringa, cartucho o frasco. Pueden usarse distintos tipos de viales para contener las
formulaciones de la presente invención incluyendo, por ejemplo, viales de vidrio o plástico transparentes y opacos (por
ejemplo, ámbar). Asimismo, para contener o administrar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención
puede usarse cualquier tipo de jeringa.
30 Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar contenidas dentro de jeringas "de tungsteno
normal" o jeringas de "bajo contenido en tungsteno". Como apreciarán los expertos en la materia, el procedimiento de
fabricación de las jeringas de vidrio generalmente implica el uso de una varilla de tungsteno caliente que actúa
perforando el vidrio creando de ese modo un orificio desde el que puede extraerse líquidos y expulsarse desde la
jeringa. Este procedimiento da como resultado que se depositen cantidades mínimas de tungsteno sobre la superficie
35 interior de la jeringa. Pueden usarse el lavado posterior y otras etapas de procesamiento para reducir la cantidad de
tungsteno en la jeringa. Como se usa en el presente documento, la expresión "tungsteno normal" significa que la
jeringa contiene más de o igual a 500 partes por mil millones (ppmm) de tungsteno. La expresión "bajo contenido en
tungsteno" significa que la jeringa contiene menos de 500 ppmm de tungsteno. Por ejemplo, una jeringa de bajo
contenido en tungsteno, de acuerdo con la presente invención, puede contener menos de aproximadamente 490, 480,
40 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o menos ppmm
de tungsteno.
Los émbolos de goma usados en las jeringas, y los tapones de caucho usados para cerrar las aberturas de los viales,
pueden recubrirse para prevenir la contaminación de los contenidos medicinales de la jeringa o el vial, o para conservar
45 su estabilidad. Por tanto, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, de acuerdo con determinadas
realizaciones, pueden estar contenidas dentro de una jeringa que comprende un émbolo recubierto o dentro de un vial
que está sellado con un tapón de goma recubierto. Por ejemplo, el émbolo o tapón puede recubrirse con una película
de fluorocarbono. Los ejemplos de tapones o émbolos recubiertos adecuados para su uso con viales y jeringas que
contienen las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se mencionan en, por ejemplo, las patentes de
50 Estados Unidos n.º 4.997.423; 5.908.686; 6.286.699; 6.645.635; y 7.226.554, cuyo contenido se incorpora por
referencia en el presente documento en su totalidad. Los tapones y émbolos de goma recubiertos ilustrativos
particulares que pueden usarse en el contexto de la presente invención están disponibles en el mercado con la marca
comercial "FluroTec®", disponible en West Pharmaceutical Services, Inc. (Lionville, PA). FluroTec® es un ejemplo de
un recubrimiento de fluorocarbono usado para minimizar o evitar que la especialidad farmacéutica se adhiera a las
55 superficies de goma.
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, las formulaciones farmacéuticas pueden estar
contenidas dentro de una jeringa de bajo contenido en tungsteno que comprende un émbolo recubierto con
fluorocarbono.
60
Las formulaciones farmacéuticas pueden administrarse a un paciente por vías parenterales tales como inyección (por
ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, etc.) o administración percutánea, mucosa, nasal,
pulmonar u oral. Para suministrar por vía subcutánea las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden
usarse numerosos dispositivos de suministro de tipo pluma o autoinyector reutilizable. Los ejemplos incluyen, pero sin
65 limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems,
Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co.,
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Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo
Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN
PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania). Los ejemplos de dispositivos de
suministro de tipo pluma o autoinyector desechable que tienen aplicaciones en suministro subcutáneo de una
5 composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLO-STAR™ (sanofi-
aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand
Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs,
Abbott Park, IL).
10 El uso de un microinfusor para suministrar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también se
contempla en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "microinfusor" significa un
dispositivo de suministro subcutáneo diseñado para administrar lentamente volúmenes grandes (por ejemplo, hasta
aproximadamente 2,5 ml o más) de una formulación terapéutica durante un periodo prolongado de tiempo (por
ejemplo, aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30 o más minutos). Véase, por ejemplo, los documentos US 6.629.949; US
15 6.659.982; y Meehan et al., J. Controlled Release 46:107-116 (1996). Los microinfusores son particularmente útiles
para el suministro de grandes dosis de proteínas terapéuticas contenidas dentro de soluciones de alta concentración
(por ejemplo, aproximadamente 100, 125, 150, 175, 200 o más mg/ml) o viscosas.
En determinadas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida estable de cualquiera de los aspectos anteriores
20 está contenida en un vial de vidrio estéril y se administra como una infusión i.v.
En una realización, el recipiente es un vial de vidrio de borosilicato transparente tipo 1 de 20 ml. En determinadas
realizaciones, el recipiente es un vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml, 5 ml o 10 ml con un tapón de clorobutilo,
con un revestimiento de FluroTec®.
25
En una realización, la formulación farmacéutica líquida de la presente invención que comprende aproximadamente 25
mg/ml o 50 mg/ml de mAb1 se administra por vía intravenosa y puede estar contenida en un vial de vidrio.
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un autoinyector que comprende cualquiera de las
30 formulaciones líquidas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente invención
proporciona un autoinyector que comprende una formulación líquida estable que comprende aproximadamente 50
mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml o aproximadamente 175 mg/ml de mAb1,
aproximadamente 10 mM de histidina, a pH de aproximadamente 6,0, sacarosa aproximadamente al 5 %, prolina
aproximadamente al 1,5 % y polisorbato 80 aproximadamente al 0,2 %.
35
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona una jeringa precargada que comprende cualquiera
de las formulaciones líquidas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente invención
proporciona una jeringa precargada que comprende una formulación líquida estable que comprende aproximadamente
50 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml o aproximadamente 175 mg/ml de mAb1,
40 aproximadamente 10 mM de histidina, a pH de aproximadamente 6,0, sacarosa aproximadamente al 5 %, prolina
aproximadamente al 1,5 % y polisorbato 80 aproximadamente al 0,2 %. En determinadas realizaciones, la jeringa es
una jeringa de vidrio de 1 ml o 2,25 ml de largo rellena con una aguja de pared fina de calibre 27, un émbolo de goma
recubierto de fluorocarbono y un protector de aguja de goma.
45 En una realización, la formulación farmacéutica líquida que contiene mAb1 a aproximadamente 175 mg/ml ± 26,25
mg/ml se administra en un volumen de aproximadamente hasta 2 ml en una jeringa precargada. En determinadas
realizaciones, la jeringa es una jeringa de vidrio de 1 ml o 2,25 ml de largo rellena con una aguja de pared fina de
calibre 27, un émbolo de goma recubierto de fluorocarbono y un protector de aguja de goma. En una realización, la
jeringa es una jeringa de vidrio larga OMPI de 1 ml equipada con una aguja de calibre 27, un protector de aguja de
50 goma FM27 y un émbolo de goma 4023/50 revestido con FLUROTEC®.
En una realización, la formulación farmacéutica líquida que contiene anticuerpo anti-PD-1 aproximadamente 150
mg/ml ± 22,5 mg/ml se administra en un volumen de aproximadamente hasta 2 ml en una jeringa precargada. En una
realización, la jeringa es una jeringa de vidrio de 1 ml o 2,25 ml de largo rellena con una aguja de pared fina de calibre
55 27, un émbolo de goma recubierto de fluorocarbono y un protector de aguja de goma. En una realización, la jeringa es
una jeringa de vidrio larga OMPI de 1 ml equipada con una aguja de calibre 27, un protector de aguja de goma FM27
y un émbolo de goma 4023/50 revestido con FLUROTEC®.
USOS TERAPÉUTICOS DE LAS FORMULACIONES FARMACÉUTICAS

60
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención son útiles, entre otros, para el tratamiento, prevención o
mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de PD-1, incluyendo enfermedades o trastornos
mediados por PD-1. Las enfermedades y trastornos ilustrativos y no limitantes que pueden tratarse o prevenirse
mediante la administración de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen las infecciones
65 víricas, enfermedades autoinmunitarias y diversos tipos de cánceres tales como, por ejemplo, cáncer de cerebro,
cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, diversos cánceres
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hemáticos y cánceres de endometrio.
Ejemplos
5 Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción
completas de cómo fabricar y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance
de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto
a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y
desviaciones experimentales.
10
A menos que se indique otra cosa, las partes son partes por mol, el peso molecular es peso molecular promedio, la
temperatura es en grados Celsius y la presión es a o cerca de la presión atmosférica.
Ejemplo 1: Desarrollo de una formulación de anticuerpo anti-PD-1

15
Los objetivos de las actividades de formulación eran desarrollar una formulación con los siguientes atributos:
• Una formulación líquida con una concentración de anticuerpo anti-PD-1 suficiente para suministrar una dosis de
250 mg o más por infusión intravenosa;
20 • Una formulación casi isoosmolar que es estable tras la dilución con diluyentes de uso común, por ejemplo,
inyección de cloruro de sodio al 0,9 % o inyección de dextrosa al 5 %, para infusión intravenosa;
• Una formulación que sea compatible y estable en el vial de vidrio transparente tipo 1 y el tapón de suero
convencional como envase; y
• Una solución de especialidad farmacéutica (EF) estéril que sustenta la estabilidad a largo plazo;
25
◦ Una formulación que minimiza las especies de anticuerpos de alto peso molecular (HMW) cuando se someten
a manipulación y estrés térmico;
◦ Una formulación que minimiza los cambios en la distribución relativa de las especies cargadas de anticuerpos
cuando se someten a estrés térmico; y
30 ◦ Una formulación que mantiene la actividad biológica cuando se somete a manipulación y estrés térmico.
A lo largo del desarrollo de la formulación, se emplearon tres condiciones principales de estrés proteico (que
representan condiciones extremas de manipulación más allá de las cuales el medicamento de anticuerpo no estaría
sometido durante la manipulación, fabricación, envío, almacenamiento y etiquetado) para desarrollar y optimizar las
35 formulaciones de anticuerpos y evaluar los efectos de los posibles estreses del mundo real sobre la estabilidad del
medicamento. Estas condiciones de estrés incluyen:
• Agitación (agitación vorticial) de la solución de proteína a temperatura ambiente. La agitación vorticial en viales de
vidrio supera la agitación que se produce durante la manipulación y fabricación de la proteína.
40 • Incubación de la solución de proteína a temperatura elevada (37 °C, 40 °C o 45 °C) con respecto a la condición de
almacenamiento de la EF propuesta (2 °C-8 °C).
• Sometimiento de la proteína a múltiples ciclos de congelación y descongelación. Dado que la proteína se someterá
al menos a un ciclo de congelación y descongelación durante la fabricación de la EF, múltiples ciclos de
congelación y descongelación simulan y superan el estrés real que se espera que experimente la proteína.
45
Había cuatro objetivos principales del trabajo inicial de desarrollo de la formulación:
1. Selección de tampón y pH: La elección del tampón y el pH puede tener un gran efecto en la estabilidad de las
proteínas, por lo que decidir sobre la especie de tampón y el pH óptimos es un procedimiento importante. En estos
50 apartados se presentan estudios que demuestran la justificación de la elección del tampón y el pH óptimos para el
anticuerpo.
2. Selección de tensioactivo o codisolvente orgánico: Normalmente se precisa un tensioactivo o cosolvente
orgánico, tal como polisorbato, para evitar la precipitación o agregación de proteínas cuando se agita. La proteína
soluble puede experimentar agitación cuando se manipula, filtra, mezcla, fabrica, envía y administra. La sustancia
55 farmacéutica de anticuerpo en una solución tamponada individual puede volverse visiblemente turbia con una
agitación excesiva. Por lo tanto, se determinó que era importante estabilizar la proteína frente a la manipulación y
agitación.
3. Identificación/selección de excipientes estabilizantes/tonificantes: Se examinó la adición de azúcares, sales y
aminoácidos en cuanto a su capacidad para mejorar la estabilidad del anticuerpo frente al estrés térmico y
60 aumentar la vida útil de la EF. La justificación para la inclusión de estos estabilizantes térmicos, así como los
estudios que identifican las concentraciones óptimas en la formulación final, se presentan en el presente
documento.
4. Selección de la concentración de anticuerpo: Se examinó el efecto de la concentración del anticuerpo sobre la
estabilidad de la especialidad farmacéutica con los excipientes seleccionados.
65
Las actividades iniciales de desarrollo de la formulación se realizaron utilizando 5-50 mg/ml del anticuerpo anti-PD-1
18
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e incluyeron la selección de codisolventes orgánicos, de estabilizantes térmicos y de tampones en formulaciones

líquidas de anticuerpos anti-PD-1 para identificar excipientes que sean compatibles con la proteína y potencien su
estabilidad, manteniendo al mismo tiempo una osmolalidad casi fisiológica y una baja viscosidad para inyección
intravenosa y subcutánea. También se examinaron las condiciones del tampón para determinar el pH óptimo para la
5 máxima estabilidad de la proteína (descrito en los Ejemplos 4, 6 y 7 en el presente documento).
Los resultados de este trabajo de desarrollo de formulación inicial se utilizaron para desarrollar una formulación inicial
que fuera adecuada para los estudios clínicos de fase 1. La formulación de fase 1 también proporcionó una referencia
para optimizar las formulaciones clínicas y comerciales de las últimas fases.
10
Con el conocimiento obtenido del desarrollo de la formulación inicial, las actividades de desarrollo de la formulación
de las últimas fases implicaron la optimización del pH, de la concentración de tensioactivo y estabilizantes para
identificar excipientes que potencien la estabilidad de la proteína a concentraciones de proteína altas y bajas (mAb1
hasta 175 mg/ml) (descrito en los Ejemplos 5, 8, 9 y 10).
15
A lo largo del desarrollo de la formulación, se evaluaron las formulaciones en cuanto a la estabilidad en el
almacenamiento y en estrés. Los métodos utilizados para evaluar la estabilidad en los estudios de desarrollo de la
formulación se describen en el Ejemplo 3 del presente documento. Los Ejemplos 11 y 12 describen la estabilidad en
el almacenamiento y en estrés de las formulaciones.
20
El Ejemplo 13 describe la estabilidad de las formulaciones cuando los excipientes se variaron dentro de intervalos
específicos.
Los resultados generados a partir de estos estudios se utilizaron para desarrollar formulaciones líquidas estables
25 adecuadas para el uso clínico, para administración intravenosa (i.v.) o subcutánea (s.c.). El Ejemplo 14 describe
recipientes usados para las formulaciones en el presente documento. Los Ejemplos 15, 16 y 17 describen la
compatibilidad y estabilidad de las formulaciones en viales de vidrio, jeringas precargadas y dispositivos de
administración intravenosa. Dichas formulaciones cumplieron con los objetivos definidos para el desarrollo de
formulaciones:
30
• Las formulaciones desarrolladas son adecuadas para las dosis desarrolladas;
• Una tonicidad que es isoosmolar en las condiciones fisiológicas;
◦ La osmolalidad de la formulación de 50 mg/ml es de aproximadamente 318 mOsm/kg;

35
• Solución estéril de EF que sustenta la estabilidad a largo plazo en estado líquido;
◦ Se produce una formación mínima de especies de anticuerpos de HMW tras el almacenamiento a largo plazo
a 2-8 °C;
40 ◦ Se produce poco o ningún cambio en la distribución relativa de las especies cargadas de anticuerpos tras el
almacenamiento a largo plazo a 2-8 °C; y
◦ Se observó una formación mínima de partículas subvisibles en el anticuerpo de EF en condiciones aceleradas
de almacenamiento y estrés, y tras el almacenamiento a 5 °C durante 12 meses.
45 Otros atributos de las formulaciones serán evidentes a partir de la descripción en el presente documento. Anticuerpos
anti-PD-1: Los anticuerpos anti-PD-1 se describen en el documento US20150203579. El anticuerpo ilustrativo utilizado
en los Ejemplos a continuación es un anticuerpo anti-PD-1 completamente humano H4H7798N (como se divulga en
el documento US20150203579, conocido como "REGN2810" o "cemiplimab") que comprende una cadena pesada que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de
50 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; una pareja de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que comprende las
SEQ ID NO: 1/2; y secuencias de CDR de cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 3 - 8; y denominado
en el presente documento como "mAb1".
Ejemplo 2: Formulaciones ilustrativas

55
En determinadas realizaciones, mAb1 se formula como una formulación tamponada acuosa que contiene mAb1 desde
5 mg/ml ± 0,75 mg/ml a 250 mg/ml ± 45,0 mg/ml, tampón de histidina 10 mM ± 2 mM, polisorbato al 0,2 % ± 0,1 % p/v,
sacarosa al 1 % ± 0,2 % al 10 % ± 2 % p/v y prolina al 1 % ± 0,02 % al 5 % ± 1 % p/v, a pH 6,0 ± 0,3.
60 Las formulaciones ilustrativas incluyen:
• Una formulación farmacéutica estable de baja viscosidad que comprende: mAb1 25 mg/ml ± 3,75 mg/ml, tampón
de histidina 10 ± 2 mM, polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % p/v, sacarosa al 5 % ± 1 % p/v y L-prolina al 1,5 % ± 0,3 %
p/v, a pH 6,0 ± 0,3.
65 • Una formulación farmacéutica estable de baja viscosidad que comprende: mAb1 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml, tampón de
histidina 10 ± 2 mM, polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % p/v, sacarosa al 5 % ± 1 % p/v y L-prolina al 1,5 % ± 0,3 %
19
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p/v, a pH 6,0 ± 0,3.

• Una formulación farmacéutica estable de baja viscosidad que comprende: mAb1 150 ± 23 mg/ml, tampón de
histidina 10 ± 2 mM, polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % p/v, sacarosa al 5 % ± 1 % p/v y L-prolina al 1,5 % ± 0,3 %
p/v, a pH 6,0 ± 0,3.
5 • Una formulación farmacéutica estable de baja viscosidad que comprende: mAb1 175 ± 27 mg/ml, tampón de
histidina 10±2 mM, polisorbato 80 al 0,2 % ± 0,1 % p/v, sacarosa al 5 % ± 1 % p/v y L-prolina al 1,5 % ± 0,3 % p/v,
a pH 6,0 ± 0,3.
Ejemplo 3: Métodos utilizados para evaluar la estabilidad de la formulación

10
Para evaluar la estabilidad de la formulación se aplicaron los siguientes ensayos:
• Color y aspecto por inspección visual

• pH
15 • Turbidez medida por aumento de la DO a 405 nm, o por nefelometría
• Análisis de material particulado realizado por obtención de imágenes de microflujo (MFI, del inglés microflow
imaging) (informado como recuentos de partículas obtenidos tal cual) y oscurecimiento de la luz (HIAC)
• Concentración de proteínas por cromatografía líquida de ultrarrendimiento de fase inversa (RP-UPLC, del inglés
reverse phase-ultra performance liquid chromatography)
20
• Pureza por cromatografía líquida de ultrarrendimiento-exclusión por tamaño (SE-UPLC), o por PAGE de
electroforesis capilar de microchip reducida y no reducida, dodecilsulfato de sodio (MCE-SDS)
• Análisis de variantes de carga mediante cromatografía de intercambio catiónico-cromatografía líquida de
ultrarrendimiento (CEX-UPLC) o mediante isoelectroenfoque capilar con obtención de imágenes (iCIEF, del inglés
25 imaged capillary isoelectric focusing)
• Potencia por bioensayo: La potencia relativa de cada muestra se determina mediante un bioensayo y se define
como: (CI50 de la muestra de referencia/CI50 de la muestra)*100 %. La potencia medida de las muestras de
estabilidad en el almacenamiento debe estar entre el 50 % y el 150 % de la potencia medida del patrón de
30 referencia.
La estabilidad física de una formulación se refiere a propiedades tales como color, aspecto, al pH, turbidez y
concentración de proteínas. La presencia de partículas visibles en solución puede detectarse mediante inspección
visual. Una solución aprueba la inspección visual si es transparente a ligeramente opalescente, está esencialmente
35 exenta de partículas visibles y es de incolora a amarilla pálida. Además, la turbidez, medida por DO a 405 nm, también
se puede utilizar para detectar partículas en solución. Un aumento de la DO a 405 nm puede indicar la presencia de
partículas, un aumento en la opalescencia o cambio de color de los artículos de prueba. La MFI se utiliza para medir
partículas subvisibles que son de un tamaño de ≥ 2 µm. La concentración de proteína de mAb1 se mide mediante un
ensayo RP-UPLC y se informa como porcentaje de recuperación de proteína con respecto al material de partida. En
40 el ensayo RP-UPLC, mAb1 se eluye de la columna de RP como un solo pico. La concentración de proteínas se
determina a partir del área del pico total de mAb1 comparándola con una curva de calibración generada usando
patrones de mAb1. El porcentaje de recuperación se calcula basándose en la concentración de proteína medida con
respecto a la concentración de proteínas inicial.
45 Estabilidad química se refiere a la formación de formas covalentemente modificadas (por ejemplo, agregados
covalentes, productos de escisión o formas de variantes de carga) y formas modificadas no covalentemente (por
ejemplo, agregados no covalentes) de proteína. Los productos de degradación de mayor y menor peso molecular se
pueden separar del mAb1 nativo mediante los métodos de SE-UPLC y MCE-SDS. El porcentaje de mAb1 degradado
en los métodos SE-UPLC y MCE-SDS se calcula a partir de la relación entre la superficie de todos los picos no nativos
50 la superficie total de todos los picos de mAb1. Las formas de variantes de carga de mAb1 se resuelven mediante CEX-
UPLC e iCIEF. En el método de CEX-UPLC, los picos con tiempos de retención anteriores al del pico principal se
etiquetan como picos "ácidos"; los picos con tiempos de retención posteriores al del pico principal se etiquetan como
picos "básicos". En el método iCIEF, los picos que están centrados en un pI más bajo que el del pico principal se
etiquetan como picos "ácidos", mientras que los centrados en un pI más alto que el del pico principal se etiquetan
55 como picos "básicos".
Ejemplo 4: Efecto de distintos tampones y pH
Se examinó el efecto del tampón y el pH en la estabilidad térmica de mAb1 en formulaciones líquidas mediante la
60 incubación de mAb1 5 mg/ml a 45 °C durante 28 días en una serie de sistemas de tampón a distintos intervalos de
pH. Se estudiaron los siguientes sistemas de tampón y de pH: acetato (pH 4,5, 5,0, 5,5), histidina (pH 5,5, 6,0, 6,5) y
fosfato (pH 6,0, 6,5, 7,0). Basándose en los resultados del análisis de SE-UPLC, se observó la máxima estabilidad de
la proteína cuando se formuló mAb 1 entre pH 6,0 y 6,5 en tampón de histidina (Tabla 1).
65 Tabla 1: Efecto del tampón y el pH sobre la estabilidad de mAb1 5 mg/ml a 45 °C durante 28 días
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Formulación mAb1 5 mg/ml, tampón 10 mM

Volumen de
0,4 ml
llenado
Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50,
Recipiente
recubierto con FluroTec®
Color y aspecto
recuperada por
(aumento de la
DO a 405 nm)
% de proteína
Cambio en la pureza por Cambio de variantes de
RP-UPLC
Turbidez
SE-UPLCa) carga por CEX-UPLCa)
% de
% de % de % de % de % de
princip
HMW nativo LMW ácida básica
pH/tampón al
pH 4,5,
Aprobado 0,00 87 5,2 -7,2 2,0 11,1 -15,4 4,3
Acetato
pH 5,0,
Aprobado 0,00 82 5,0 -5,9 0,9 7,5 -10,9 3,4
Acetato
pH 5,5,
Aprobado 0,00 90 4,7 -5,4 0,7 12,8 -13,7 0,9
Acetato
pH 5,5,
Aprobado 0,00 97 5,6 -6,4 0,8 10,8 -12,4 1,6
Histidina
pH 6,0,
Aprobado 0,00 86 1,9 -2,4 0,6 13,4 -12,6 -0,7
Histidina
pH 6,5,
Aprobado 0,00 84 1,2 -1,8 0,7 25,4 -21,3 -4,1
Histidina
pH 6,0,
Aprobado 0,01 92 3,7 -4,3 0,6 24,8 -21,8 -3,0
Fosfato
pH 6,5,
Aprobado 0,03 91 4,9 -5,8 0,9 49,6 -40,3 -9,3
Fosfato
pH 7,0,
Aprobado 0,03 95 10,4 -11,6 1,2 56,5 -42,2 -14,3
Fosfato
aInformado como un cambio relativo en la pureza con respecto al material de partida. El material de partida (sin
incubación) contiene ≥ el 97,2 % del pico nativo por SE-UPLC y ≥49,0 % del pico principal por CEX-UPLC en
todas las formulaciones.
CEX = intercambio catiónico; SF = Sustancia farmacéutica; HMW = alto peso molecular;
5 LMW = bajo peso molecular; DO = Densidad óptica; RP = fase inversa; SE = exclusión por tamaño; UPLC =
cromatografía líquida de ultrarrendimiento
Basándose en los resultados del análisis de CEX-UPLC, se observó la máxima estabilidad de la proteína cuando se
formuló mAb1 entre pH 5,5 y 6,0 en tampón de histidina o entre pH 5,0 y 5,5 en tampón de acetato. Estos análisis
10 también revelaron que la agregación (es decir, la formación de especies de HMW), la fragmentación (es decir, la
formación de especies de LMW) y la formación de variantes de carga fueron las principales vías de degradación. El
tampón de histidina se seleccionó como tampón de formulación debido a que proporcionó el mejor nivel global de
estabilización de proteínas con respecto a la formación de especies de HMW y LMW y la formación de variantes de
carga. Se eligió un pH de 6,0 para la formulación debido a la formación de especies de HMW y variantes de carga,
15 que son las principales vías de degradación, se minimizaron a este pH. Basándose en estos resultados, se eligió
tampón de histidina 10 mM a pH 6,0 para la formulación de mAb1.
Ejemplo 5: Selección del pH en tampones de histidina
20 Se examinó el efecto del tampón y el pH sobre la estabilidad térmica de mAb1 en formulaciones líquidas de alta
concentración. Se incubó mAb1 150 mg/ml a 45 °C durante 28 días en una serie de tampones de histidina con un
intervalo de pH de 5,3, 5,5, 5,8, 6,0 y 6,3 con y sin estabilizantes térmicos. Con sacarosa al 9 %, basándose en los
resultados del análisis de SE-UPLC, se observó la máxima estabilidad de la proteína cuando se formuló mAb1 entre
pH 5,8 y 6,3 en tampón de histidina (Figura 1). Basándose en los resultados del análisis de CEX-UPLC, se observó la
25 máxima estabilidad de la proteína cuando se formuló mAb1 entre pH 5,3 y 6,0 en tampón de histidina (Tabla 2).
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Tabla 2: Efecto del pH sobre la estabilidad de mAb1 150 mg/ml incubado a 45 °C durante 28 días
Formulación mAb1 150 mg/ml, histidina 10 mM
Volumen de
0,4 ml
llenado
Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50 recubierto con
Recipiente/ cierre
FluroTec®
pH/estabilizante Color y aspecto
recuperada por
(aumento de la
% de proteína
DO a 405 nm)
Cambio en la pureza por Cambio de variantes de
RP-UPLC
Turbidez
SE-UPLC3 carga por CEX-UPLCa)
% de
princip
al
Desaprobado
pH 5.3/ninguno b) NA NA NA NA NA NA NA NA
Desaprobado
pH 5.5/ninguno b) NA NA NA NA NA NA NA NA
pH 5.8/ninguno Desaprobado 0,40 95 46,2 -46,4 0,3 6,4 -10,2 3,9

pH 6.0/ninguno Desaprobado 0,51 99 41,2 -41,5 0,3 10,6 -7,3 -3,3
pH 6.3/ninguno Desaprobado 0,65 98 35,0 -35,4 0,4 19,6 -14,3 -5,3
pH 5,3 / sacarosa
Aprobado 0,14 95 41,9 -42,1 0,3 7,9 -11,1 3,2
al 9 % (p/v)
pH 5,5 / sacarosa
Aprobado 0,16 99 30,8 -31,2 0,4 9,5 -12,5 2,9
al 9 % (p/v)
pH 5,8/ sacarosa al
Aprobado 0,13 100 22,8 -23,3 0,5 9,7 -11,8 2,1
9 % (p/v)
pH 6,0 / sacarosa
Aprobado 0,14 99 19,4 -19,9 0,5 13,5 -14,5 1,0
al 9 % (p/v)
pH 6,3 / sacarosa
Aprobado 0,15 98 16,9 -17,4 0,5 22,4 -22,1 -0,4
al 9 % (p/v)
a Informado como un cambio relativo en la pureza con respecto al material de partida. El material de partida
(sin incubación) contiene ≥ el 94,0 % del pico nativo por SE-UPLC y ≥48,7 % del pico principal por CEX-UPLC
en todas las formulaciones
b Muestra gelificada. No se realizaron análisis adicionales. NA = no aplicable
5
CEX, intercambio catiónico; HMW, alto peso molecular; LMW, bajo peso molecular;
DO, densidad óptica; RP, fase inversa; SE, exclusión por tamaño; UPLC, cromatografía líquida de
ultrarrendimiento
10 Estos análisis también revelaron que la agregación (es decir, la formación de especies de HMW) y la formación de
variantes de carga eran las principales vías de degradación. Se eligió un pH de 6,0 para la formulación de la EF debido
a la formación de especies de HMW y variantes de carga, que son las principales vías de degradación, se minimizaron
a este pH. Basándose en estos resultados, se eligió tampón de histidina 10 mM a pH 6,0 para la formulación de EF
de alta concentración de mAb1.
15
Ejemplo 6: Selección de protectores frente a la sobrecarga por agitación
Los estabilizantes, tales como los tensioactivos y los codisolventes orgánicos, a menudo se añaden a las formulaciones
de anticuerpos para proteger a la proteína de la agregación inducida por la agitación. Se examinó el efecto de los
20 codisolventes y los tensioactivos orgánicos sobre la estabilidad en estrés por agitación y la estabilidad térmica de
mAb1 5 mg/ml en formulaciones líquidas. Se evaluaron los siguientes codisolvente y tensioactivos:
polisorbato 20 al 0,1 %, polisorbato 80 al 0,1 % y PEG3350 al 1,0 %. Los resultados de los estudios de estabilidad en
estrés por agitación se resumen en la Tabla 3.
25
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Tabla 3: Efecto de los codisolventes orgánicos y tensioactivos sobre la estabilidad de mAb1 5 mg/ml
después de agitación (120 min de agitación vorticial)
Formulación mAb1 5 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0
Volumen de
0,4 ml
llenado
Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50 recubierto con
Recipiente
FluorTec®Color y aspecto
recuperada por
(aumento de la
DO a 405 nm)
% de proteína
Cambio en la pureza por SE- Cambio de variantes de
RP-UPLC
Turbidez UPLCa" carga por CEX-UPLC 3
Codisolvente/
pH
Tensoactivo
% de
princip
al
Sin
codisolvente/ Desaprobado 1,69 6,0 76 15,3 -23,7 -8,4 -2,3 -1,7 3,9
tensioactivo
sacarosa al
Desaprobado 1,75 6,0 64 9,4 -12,8 3,4 -1,7 -0,1 1,8
5 % (p/v)
polisorbato 20
Aprobado 0,00 6,0 102 -0,1 -0,8 0,8 0,2 0,2 -0,3
al 0,1 % (p/v)b)
polisorbato 80
Aprobado 0,00 6,0 100 -0,2 -0,5 0,4 0,2 -0,1 -0,1
al 0,1 % (p/v)b)
PEG3350 al
Desaprobado 0,20 6,0 93 0,3 -0,5 0,2 -0,2 -0,3 0,4
1 % (p/v)b)
5 las 5 formulaciones.
b La formulación también contiene sacarosa al 5 %.
CEX = intercambio catiónico; HMW = alto peso molecular; LMW = bajo peso molecular; DO = Densidad óptica;
RP = fase inversa; SE = exclusión por tamaño; UPLC = Cromatografía líquida de ultrarrendimiento
10
mAb1 era inestable cuando se agitaba vorticialmente durante 120 min en ausencia de un codisolvente orgánico o
tensioactivo. Después de la agitación vorticial en ausencia de un codisolvente o tensioactivo, la solución se volvió
turbia, presentó un aumento sustancial de la turbidez y tuvo un aumento del 15,3 % en los agregados según lo
determinado por SE-UPLC, así como una pérdida del 24 % en la recuperación de proteínas por RP-UPLC (Tabla 3).
15 PEG3350 al 1 % no proporcionó suficiente estabilización de mAb1 después de 120 min de agitación vorticial. En
presencia de PEG3350 al 1 %, la solución se volvió turbia y presentó un aumento de la turbidez (Tabla 3). Por el
contrario, tanto el polisorbato 20 al 0,1 % como el polisorbato 80 al 0,1 % protegieron al mAb1 de la inestabilidad
inducida por agitación en la misma medida (Tabla 3).
20 Sin embargo, la formulación que contenía polisorbato 80 al 0,1 % presentó una cantidad disminuida de agregados en
comparación con la formulación que contenía polisorbato 20 al 0,1 % cuando se incubó a 45 °C (Tabla 4). Se eligió
polisorbato 80 al 0,1 % como tensioactivo para la formulación de EF de mAb1 debido a que estabilizó la proteína frente
al estrés por agitación, tuvo un efecto menos negativo sobre la estabilidad térmica de la proteína que el polisorbato 20
(según lo determinado por los análisis de SE-UPLC y CEX-UPLC) y tiene un historial de uso seguro en formulaciones
25 de anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 7: Selección de protectores frente a la sobrecarga térmica
A menudo se añaden estabilizantes tales como la sacarosa a las formulaciones de anticuerpos para aumentar la
30 estabilidad térmica de la proteína en las formulaciones líquidas. mAb1 cinco (5) mg/ml en una formulación líquida
presentó una estabilidad mejorada cuando se formuló con sacarosa al 5 % y se incubó en condiciones aceleradas
(Tabla 4).
Tabla 4: Efecto de los codisolventes orgánicos y tensioactivos sobre la estabilidad de mAb1 5 mg/ml
35 incubado a 45 °C durante 29 días
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Formulación mAb1 5 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0

Volumen de
0,4 ml.
llenado
Recipiente/ Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50
Cierre recubierto con FluorTec®
Cambio en la pureza por Cambio de variantes
recuperada por RP-

de la DO a 405 nm)
Turbidez (aumento
SE-UPLCa) de carga por CEX-
Color y aspecto
% de proteína
UPLCa)
UPLC
% de % de % de % de % de % de
HMW nativo LMW ácida princi básic
Codisolvente pal a
/
Tensioactivo pH
Sin
codisolvente/ Aprobado 0,00 6,1 96 2,8 -3,2 0,5 10,8 -10,7 -0,2
tensioactivo
Sacarosa al
Aprobado 0,01 6,1 99 1,6 -2,0 0,3 12,6 -11,7 -0,9
5 % (p/v)
polisorbato 20
Aprobado 0,00 6,0 92 27,6 -28,4 0,7 0,1 -24,0 23,9
al 0,1 % (p/v)
polisorbato 80
Aprobado 0,00 6,1 96 12,8 -14,1 0,9 4,4 -20,4 15,9
al 0,1 % (p/v)
PEG3350 al
Aprobado 0,00 6,1 90 8,4 -8,0 -0,4 0,4 -25,0 24,5
1 % (p/v)
las 5 formulaciones
b La formulación también contiene sacarosa al 5 %
5 CEX = intercambio catiónico; HMW = alto peso molecular; LMW = bajo peso molecular; DO = Densidad óptica;
RP = fase inversa; SE = exclusión por tamaño; UPLC = Cromatografía líquida de ultrarrendimiento
Después de la incubación a 45 °C durante 29 días, la cantidad relativa de especies de HMW aumentó el 1,7 % en la
formulación que contenía sacarosa al 5 % en comparación con un aumento del 2,8 % en la formulación de control sin
10 sacarosa. Por este motivo, se eligió sacarosa como estabilizante térmico. Para hacer la formulación isotónica y
maximizar la estabilidad térmica, la concentración de sacarosa se aumentó al 10 % para la formulación de mAb1.
Ejemplo 8: Optimización de los estabilizantes
15 El objetivo de optimizar los estabilizantes térmicos era identificar los componentes estabilizantes que podrían usarse
para desarrollar una formulación de EF compatible con una concentración de anticuerpo de hasta 200 mg/ml. Se
seleccionó sacarosa al 10 % en la formulación inicial. Se descubrió que con sacarosa al 10 %, la viscosidad de mAb1
era de aproximadamente 20 cP a 20 °C y se consideró demasiado alta para un producto comercial y de última fase
sólido. Por lo tanto, se necesitaba una formulación de mAb1 modificada que presentara una estabilidad favorable y
20 una viscosidad más baja.
Se eligió la sacarosa como estabilizante térmico para mAb1 durante el desarrollo de la formulación de baja
concentración. Para el desarrollo de formulaciones de alta concentración, se evaluaron distintas concentraciones de
sacarosa y L-prolina sobre la estabilidad y viscosidad del mAb1 a concentraciones de 150 y 175 mg/ml a 25 °C (Tabla
25 5) y a 40 °C durante 1 mes. La formación de especies de HMW disminuyó con el aumento de las concentraciones de
sacarosa cuando las formulaciones se incubaron a 40 °C durante 28 días. L-prolina al 3 % proporcionó una
estabilización similar a la de sacarosa al 5 %, y la estabilización máxima se observó con sacarosa al 9 %.
Aunque la sacarosa al 9 % proporcionó una estabilización ligeramente mejor en comparación con L-prolina al 3 %,
30 también aumentó la viscosidad de la formulación. A 175 mg/ml, la formulación de mAb1 con sacarosa al 9 % tiene una
viscosidad de 27 centipoises, lo que plantea desafíos de fabricación y administración. La formulación de mAb1 175
mg/ml con prolina al 3 % tiene una viscosidad de aproximadamente 20 centipoises, lo que es manejable con el
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procedimiento de fabricación actual.
Tabla 5: Estabilidad acelerada de mAb1 de alta concentración con estabilizantes térmicos a 25 °C durante 1
mes
Formulación mAb1 210 mg/ml, histidina 10 mM pH 6,0
Volumen de
0,8 ml
llenado
Recipiente/ cierre Vial de policarbonato de 5 ml con tapón de rosca de polipropileno revestido de silicona
Variantes cargadas por

Pureza por SE-UPLC
Color y aspecto
recuperado por
(aumento de la CEX-UPLC
DO a 405 nm)
% de mAb1
Excipientes
RP-UPLC
pH % de
Turbidez
princip
al
Material de
Aprobado 0,00 6,0 100 2,9 96,6 0,5 25,3 47,4 27,3
partidaa)
Prolina al
Aprobado 0,01 6,0 106 4,1 95,3 0,6 25,2 47,1 27,8
3%
5
Sacarosa
Aprobado 0,00 6,0 107 4,7 94,8 0,6 25,2 46,5 28,3
al 3 %
Sacarosa
Aprobado 0,00 6,0 104 4,7 94,8 0,6 25,1 46,1 28,8
al 5 %
Formulación SFF/EF: mAb1 150 mg/ml o 175 mg/ml, histidina 10 mM pH 6,0, PS 80 al 0,1 %
Volumen de
0,4 ml
llenado
Recipiente/ Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50,
cierre recubierto con FluroTec®
Material
de Aprobado 0,00 6,1 100 2,3 97,4 0,4 24,9 50,2 24,9
partidaa)
Sacarosa
al 9 %, PS
Aprobado 0,00 6,1 101 3,7 95,7 0,7 28,4 47,7 23,9
80 al
0,1 %
Prolina
3 % PS 80 Aprobado 0,00 6,1 101 3,7 95,7 0,7 26,5 47,7 25,8
al 0,1 %
a pH, Los resultados de "Material de partida" de SE-UPLC y CEX-UPLC son los valores promedio de las
formulaciones de partida
Sin embargo, basándose en la estabilidad en el almacenamiento a -20 °C, -30 °C y -80 °C, se encontró que la
10 formulación con prolina al 3 % no era tan estable como las formulaciones con sacarosa (Figura 2). Como se muestra
en la Figura 2, la formulación F3 (con sacarosa al 5 %) fue estable a -20 °C, -30 °C y -80 °C con el ≤3 % de especies
de HMW.
El efecto de la L-prolina en la estabilización de mAb1 se examinó con la formulación de 50 mg/ml. Después de la

15 incubación a 45 °C durante 28 días,
la formulación con L-prolina mostró niveles más bajos de especies de HMW con respecto a la formulación sin L-
prolina, mostrando que la L-prolina estabiliza el anticuerpo a una concentración de 50 mg/ml (Tabla 6). Además, el
impacto de la L-prolina sobre la estructura de la proteína del anticuerpo se examinó mediante técnicas biofísicas
20 (espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier, espectroscopia de DC, espectroscopía de emisión de
fluorescencia y calorimetría diferencial de barrido). Los resultados mostraron que la L-prolina no perturbó la estructura
secundaria y terciaria del anticuerpo.
Tabla 6: Efecto de los estabilizantes sobre la estabilidad de mAb1 50 mg/ml después de la incubación a 45 °C
25 durante 28 días
25
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Formulación mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, pH 6,0, polisorbato 80 al 0,2 %

Volumen de
0,6 ml
llenado
Recipiente/
Vial de vidrio tipo 1 de 2 ml con tapón de clorobutilo 4432/50 recubierto con FluorTec®
Cierre
Estabilizante Cambio de pureza por SE- Cambio de variantes de
Turbidez (aumento de la
(% p/v) UPLC3 carga por CEX-UPLC 3
recuperada por RP-

Color y aspecto
% de proteína
DO a 405 nm)
pH HMW monómero LMW ácida princip básic
al a
UPLC
- Aprobado 0,02 6,0 96 12,1 -12,7 0,6 10,8 -11,9 1,0
L-prolina al
Aprobado 0,02 6,1 96 11,3 -11,9 0,6 11,0 -11,8 0,8
1,5 %
L-prolina al
Aprobado 0,01 6,0 96 10,9 -11,5 0,6 12,8 -12,9 0,1
3,0 %
a) Informado como un cambio en la pureza con respecto al material de partida. El material de partida (sin
incubación) contiene ≥ el 98,5 % del pico de monómero por SE-UPLC y ≥52,8 % del pico principal por CEX-
UPLC en las tres formulaciones.
CEX, intercambio catiónico; SF, sustancia farmacéutica; HMW, alto peso molecular; LMW, bajo peso molecular;
5 DO, densidad óptica; RP, fase inversa; SE, exclusión por tamaño; UPLC, cromatografía líquida de
ultrarrendimiento
El efecto de distintos estabilizantes sobre la estabilidad térmica de mAb1 a concentraciones altas (150 y 175 mg/ml)
se examinó más a fondo en formulaciones líquidas. Los estabilizantes evaluados fueron sacarosa al 9 % (p/v), L-
10 prolina al 3 % (p/v) y sacarosa al 5 % (p/v) con L-prolina al 1,5 % (p/v). Los resultados del estudio de estabilidad
acelerada se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7: Efecto de los estabilizantes sobre la estabilidad de mAb1 después de la incubación a 25 °C y 40 °C

Formulación mAb1 150 o 175 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 80 al 0,1 %
Volumen de llenado 0,5 ml
Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50, recubierto con
Recipiente/ cierre
FluorTec®
Incubación 25 °C durante 3 meses
pH Cambio de pureza por SE- Cambio de variantes de

(aumento de DO
UPLC carga por CEX-UPLCa

Estabilizante (%
Color y aspecto
Conc. de mAb1
recuperada por
% de proteína
a 405 nm)
RP-UPLC
Turbidez
(mg/ml)
HMW nativo LMW ácida princip básica
p/v)
al
Sacarosa al 150 Aprobado 0,02 6,2 110 2,6 -2,8 0,2 6,0 -4,2 -1,9
9%
L-prolina al 175 Aprobado 0,00 6,2 112 2,4 -2,5 0,2 6,5 -4,1 -2,4
3%
5 %,
L-prolina al
1,5 %
Incubación 40 °C durante 28 días
26
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(continuación)
pH Cambio de pureza por SE- Cambio de variantes de
Estabilizante (% p/v)
recuperada por RP-

Turbidez (aumento
UPLCa) carga por CEX-UPLCa
de DO a 405 nm)
Color y aspecto
Conc. de mAb1
% de proteína
(mg/ml)
UPLC
HMW nativo LMW ácida princip básica
al
Sacarosa al 150 Aprobado 0,04 6,1 102 6,9 -7,5 0,5 9,4 -9,7 0,3
9%
L-prolina al 175 Aprobado 0,03 6,2 103 11,7 -12,3 0,6 12,1 -10,7 -1,4
3%
5 %, L-
prolina al
1,5 %
aInformado como un cambio en la pureza con respecto al material de partida. El material de partida (sin
las tres formulaciones.
5 CEX, intercambio catiónico; HMW, alto peso molecular; LMW, bajo peso molecular;
DO, densidad óptica; RP, fase inversa; SE, exclusión por tamaño; UPLC, cromatografía líquida de
ultrarrendimiento
Después de la incubación a 40 °C durante 28 días, la sacarosa al 9 % proporcionó la mejor estabilización y tuvo la

10 mayor viscosidad entre las formulaciones de alta concentración. La formulación de sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 %
ocupó el segundo lugar en cuanto a estabilidad después de 28 días a 40 °C. Después de la incubación a 25 °C durante
tres meses, la estabilidad de mAb1 fue casi la misma en todas las formulaciones examinadas; sin embargo, la
formulación con sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % fue ligeramente mejor que las otras dos formulaciones. Sin
embargo, tras la incubación a -20 °C, -30 °C y -80 °C, la sacarosa al 5 % y al 9 % proporcionó una mejor estabilidad
15 que la prolina al 3 % (Figura 3). La viscosidad de mAb1 175 mg/ml con sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % tiene una
viscosidad de 14 cP a 20 °C. Para proporcionar una formulación que produzca una solución isotónica y logre el mejor
equilibrio entre estabilidad y viscosidad, se seleccionó sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % para el desarrollo de una
formulación de EF de anticuerpo de últimas fases.
20 Ejemplo 9: Selección de modificadores de viscosidad
La viscosidad de las formulaciones de proteína aumenta exponencialmente a medida que aumenta la concentración
de proteína. Cuando la viscosidad comienza a exceder aproximadamente de 10 a 15 cP a 20 °C, la viscosidad de la
formulación debe tenerse en cuenta al desarrollar una formulación: esto se debe simplemente a que la viscosidad se
25 correlaciona con la facilidad de inyección a través de una jeringa precargada (JPC) u otro dispositivo de administración
con aguja; lo que es más importante, mantener una viscosidad razonablemente baja es fundamental para el desarrollo
de un dispositivo de suministro, tal como un autoinyector. El efecto de los excipientes sobre la viscosidad de la
formulación se examinó en una formulación líquida con los siguientes posibles modificadores de la viscosidad, prolina,
argininaHCl, histidinaHCl, acetato de magnesio y NaCl. La Figura 4 resume la viscosidad de mAb1 150 mg/ml con los
30 modificadores de la viscosidad. ArgininaHCl, histidinaHCl, acetato de magnesio y NaCl a 25 - 100 mM reducen la
viscosidad de las formulaciones de mAb1 150 mg/ml.
También se examinó el impacto de los modificadores de la viscosidad sobre la estabilidad de la formulación de mAb1.
Se prepararon e incubaron a 45 °C durante 28 días formulaciones de mAb1 150 mg/ml con modificadores de la
35 viscosidad tales como argininaHCl, histidinaHCl, acetato de magnesio y NaCl. Los resultados se muestran en la Figura
5. Se descubrió que se observó la máxima estabilidad de la proteína cuando se formuló mAb1 sin los modificadores
de la viscosidad; todas estas sales modificadoras de la viscosidad afectan negativamente a la estabilidad de mAb1.
Por lo tanto, las sales no se incluyeron en la formulación final.
40 L-prolina, como estabilizante, minimizó la viscosidad de la solución para las concentraciones de anticuerpo iguales o
superiores a 50 mg/ml. Los resultados de los estudios de estabilidad acelerada para anticuerpos de alta concentración
con cantidades variables de L-prolina, con y sin sacarosa, se resumen en la Tabla 7. Después de la incubación a 25 °C
durante tres meses, la formulación con sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % proporcionó una estabilidad ligeramente
mejorada en relación con las otras dos formulaciones con respecto a la formación de especies de HMW. Después de
45 la incubación a 40 °C durante 28 días, la formulación que contenía sacarosa al 9 % proporcionó la mejor estabilización,
y la formulación con sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % ocupó el segundo lugar. La formulación con sacarosa al 9 %
tiene una viscosidad de 20 cP a anticuerpo 175 mg/ml, mientras que la viscosidad de la formulación a 175 mg/ml con
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sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % tiene una viscosidad de 14 cP a 20 °C. La adición de L-prolina a la formulación fue
importante para reducir la viscosidad a concentraciones elevadas de proteína, así como para estabilizar el anticuerpo.
Resumiendo, se seleccionó sacarosa al 5 %/L-prolina al 1,5 % para las formulaciones de anticuerpos de 50 mg/ml y
5 de alta concentración. Esta combinación de excipientes logró una formulación isotónica con una estabilidad y
viscosidad aceptables en todas las concentraciones de anticuerpo probadas (hasta 175 mg/ml).
Ejemplo 10: Optimización de la concentración de polisorbato (PS)
10 Durante el desarrollo de la formulación, se observó la formación de especies de peso molecular de orden superior y
un aumento de la turbidez cuando la formulación de mAb1 se agitó sin tensioactivo. La proteína se estabilizó con
agitación mediante la adición de polisorbato 80 (PS 80). Durante el desarrollo de formulaciones líquidas de mAb1 de
alta concentración, la inestabilidad en la agitación se observó como un aumento en las especies de peso molecular
de orden superior. Se llevó a cabo un estudio para determinar la cantidad mínima de polisorbato 80 necesaria para
15 proteger mAb1 hasta 175 mg/ml frente a la inestabilidad inducida por la agitación. Las formulaciones de este estudio
contenían sacarosa al 5 % y L-prolina al 1,5 %, por lo que el efecto del polisorbato 80 se pudo estudiar con una
composición de formulación que fuera más representativa de la formulación final. Las concentraciones nominales de
polisorbato 80 incluidas en el estudio fueron el 0 %, 0,02 %, 0,04 %, 0,06 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,15 % y 0,2 % (p/v). En
ausencia de polisorbato 80, la solución se volvió turbia y presentó un aumento sustancial de la turbidez después de la
20 agitación vorticial. Se observó una reducción dependiente de la concentración de polisorbato 80 en la cantidad de %
de HMW después de 120 minutos de agitación. Se descubrió que una concentración de polisorbato 80 del 0,15 - 0,2 %
era suficiente para estabilizar a mAb1 150 mg/ml y 175 mg/ml en la agregación inducida por agitación (Tabla 8). La
adición de polisorbato 80 al 0,2 % (p/v) (valor nominal) impidió por completo la formación de especies de HMW
después de agitar durante 120 minutos.
25
Tabla 8: Estabilidad de mAb1 150 mg/ml y 175 mg/ml con PS 80 después de 120 min de agitación
Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma
Recipiente/cierre
de butilo 4432/50, recubierto con FluroTec®
(aumento de
% de
la DO a 405
Aumento
Turbidez
aspecto
Color y
mAb1,
en % de
nm)
Formulación [PS 80] pH recuperado

HMW por
por RP-
SE-UPLC
UPLC
0,00 Desaprobado 0,38 6,0 No aplicable

0,02 Aprobado 0,00 6,0 97 4,7
0,04 Aprobado 0,00 6,0 100 0,3
mAb1 150 mg/ml
histidina 10 mM, 0,06 Aprobado 0,00 6,0 102 0,3
pH 6,0, sacarosa 0,08 Aprobado 0,04 6,0 99 0,0
al 9 %
0,10 Aprobado 0,01 6,0 101 0,1
0,15 Aprobado 0,00 6,0 98 0,1
0,20 Aprobado 0,00 6,0 106 0,1
0,02 Aprobado 0,06 6,1 100 7,0
0,04 Aprobado 0,00 6,0 97 2,4
mAb1 175 mg/ml
pH 6,0, prolina al 0,08 Aprobado 0,03 6,1 98 0,9
3%
0,10 Aprobado 0,00 6,1 102 0,4
0,15 Aprobado 0,00 6,1 102 0,1
0,20 Aprobado 0,00 6,1 101 0,1
mAb1 175 mg/ml 0,02 Aprobado 0,01 6,1 97 3,5
pH 6,0, sacarosa
al 5 %, prolina al 0,06 Aprobado 0,01 6,1 100 1,3
1,5 % 0,08 Aprobado 0,01 6,1 99 1,0
0,10 Aprobado 0,01 6,0 102 0,3
28
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(continuación)
0,15 Aprobado 0,00 6,1 101 0,2
0,20 Aprobado 0,00 6,1 98 0,0
La Tabla 9 detalla el efecto de la concentración de polisorbato 80 sobre la estabilidad de mAb1 175 mg/ml después
de la agitación (120 minutos de agitación vorticial).
5
Tabla 9: Efecto de la concentración de polisorbato 80 sobre la estabilidad de mAb1 175 mg/ml después de
agitación (120 minutos de agitación vorticial)
Formulac
mAb1 175 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 % (p/v)
ión
Volumen
de 0,4 ml
llenado
Recipient Vial de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapón de goma de butilo 4432/50,
e/ Cierre recubierto con FluorTec®
Color y aspecto
recuperada por
(aumento de la
Cambio de variantes
% de proteína
DO a 405 nm)
Conc. Cambio en la pureza por de carga por CEX-

nominal SE-UPLCa) UPLCa)
RP-UPLC
pH
Turbidez
de PS 80.
(% en p/v) % de % de
% de % de % de % de princi básic
HMW nativo LMW ácida pal a
0,00 % Desaprobado 0,36 6,0 ND ND ND ND ND ND ND
0,02 % Aprobado 0,01 6,0 97 3,5 -3,5 0,0 -0,6 0,8 -0,1
0,04 % Aprobado 0,01 6,0 98 2,0 -2,0 0,0 0,1 -0,2 -0,2
0,06 % Aprobado 0,01 6,0 100 1,3 -1,3 0,0 -0,2 0,3 -0,1
0,08 % Aprobado 0,01 6,0 99 1,0 -1,0 0,0 -0,2 0,0 0,0
0,10 % Aprobado 0,02 6,0 102 0,3 -0,3 0,0 0,2 0,0 0,0
0,15 % Aprobado 0,00 6,1 101 0,2 -0,2 0,0 0,2 -0,3 0,1
0,20 % Aprobado 0,00 6,1 98 0,0 0,0 0,0 0,0 -0,1 0,2
incubación) contiene ≥ el 97,4 % del pico nativo por SE-UPLC y ≥48,2 % del pico principal por CEX UPLC en
10 todas las formulaciones.
CEX, intercambio catiónico; HMW, alto peso molecular; LMW, bajo peso molecular;
ND, no disponible; DO, densidad óptica; RP, fase inversa; SE, exclusión por tamaño;
UPLC, cromatografía líquida de ultrarrendimiento
15 La capacidad del polisorbato 80 al 0,2 % (p/v) para proteger el mAb1 de la inestabilidad inducida por la agitación se
confirmó mediante otro estudio con la formulación final a 50 mg/ml (Tabla 10).
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Tabla 10: Efecto de la concentración de PS80 sobre la estabilidad de mAb1 50 mg/ml después de agitación
(120 minutos de agitación vorticial)
Formulac
mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 % (p/v)
ión
Volumen
de 0,6 ml
llenado
Recipient
Vial de vidrio tipo 1 de 2 ml con tapón de clorobutilo 4432/50 recubierto con FluorTec®
e/ Cierre
Turbidez (aumento de
Conc. de Polisorbato
Cambio de variantes
recuperada por RP-

Cambio en la pureza por SE- de carga por CEX-
UPLCa UPLCa
Color y aspecto
la DO a 405 nm)
% de proteína
80. (% en p/v)
pH
% de % de
UPLC
% de % de % de % de princi básic
HMW monómero LMW ácida pal a
0,0 % Aprobado 0,01 6,1 99 8,0 -8,0 0,0 1,7 -1,8 -0,3
0,2 % Aprobado 0,00 6,1 99 0,0 0,1 -0,1 -0,2 0,1 -0,2
a Informado como un cambio relativo en la pureza con respecto al material de partida. El material de partida
(sin incubación) contiene ≥ el 98,5 % del pico de monómero por SE-UPLC y ≥52,8 % del pico principal por CEX
5 UPLC en las cinco formulaciones.
CEX, intercambio catiónico; SF, sustancia farmacéutica; HMW, alto peso molecular; LMW, bajo peso molecular;
ND, no disponible; DO, densidad óptica; RP, fase inversa; SE, exclusión por tamaño; UPLC, cromatografía
líquida de ultrarrendimiento
10 Basándose en estos resultados, se seleccionó polisorbato 80 al 0,2 % (p/v) como tensioactivo porque proporcionó
suficiente estabilización para impedir la formación de especies de HMW en estrés por agitación.
Ejemplo 11: Estabilidad en el almacenamiento y en estrés de formulaciones ilustrativas
15 La estabilidad en el almacenamiento de las formulaciones de mAb1 50 mg/ml y 175 mg/ml en viales de vidrio se
muestra en la Tabla 11 y la Tabla 12, y los datos de estabilidad acelerada y de estrés de las dos formulaciones se
muestran respectivamente en la Tabla 13 y la Tabla 14. Los estudios de estabilidad de investigación demostraron que
la formulación de mAb1 50 mg/ml y 175 mg/ml en viales de vidrio es estable durante al menos 24 meses cuando se
almacena a 2 °C a 8 °C. Además, la formulación de mAb1 50 mg/ml también presentó una excelente estabilidad en
20 condiciones aceleradas y de estrés. La formulación es estable cuando se almacena a 25 °C durante al menos 3 meses
y a 40 °C durante al menos 7 días, demostrando la compatibilidad de la formulación de 50 mg/ml con los componentes
del cierre del recipiente principal. No se observaron cambios apreciables en el color o el aspecto, la turbidez, la materia
particulada, al pH, la concentración de proteínas, la pureza medida por SE-UPLC o CEX-UPLC e iCIEF, y la potencia
se mantuvo en estas condiciones.
25
Tabla 11: Estabilidad de investigación de la formulación de 50 mg/ml almacenada a 2 - 8 °C
mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 % (p/v) y polisorbato
Formulación
80 0,2 % (p/v),
Viales de vidrio tipo 1 de 3 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50 recubierto de FluroTec® de

Recipiente/cierre
13 mm
Duración del almacenamiento a 2-8 °C (meses)

Ensayo
0 1 3 6 9 12 18 24 36
Color y aspecto Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
DO a 405 nm)
Turbidez (UNT por
7,41 6,01 6,15 6,61 6,03 6,48 6,29 5,83
nefelometría)
30
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
pH 6,0 6,0 6,0 6,1 6,0 6,0 6,0 6,0
Análisis de ≥ 10 µm 2 NN 21 8 NN 11 15 21
partículas
subvisibles
por HIAC ≥ 25 µm 0 NN 2 0 NN 1 1 1
(N/ml)
Análisis de 2 a 10 µm 248 NN 887 187 NN 607 125 776
partículas
subvisibles ≥ 10 µm 15 NN 26 44 NN 15 19 8
por MFI
(N/ml) ≥ 25 µm 4 NN 3 17 NN 1 3 1
% de proteína
recuperada por RP- 100 100 98 103 101 105 98 98
UPLC
No
reducida;
99,2 NN NN 98,7 NN 98,9 99,2 99,2
% de pico
principal
Pureza por
MCE-SDS Reducida;
% de
cadena 100 NN NN 100 NN 99,6 99,8 99,9
ligera +
pesada
% de HMW 0,5 0,3 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5
Pureza por % de
99,2 99,1 99,2 99,2 99,1 99,2 99,2 99,1
SE-UPLC monómero
% de LMW 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,3 0,4 0,4
Análisis de % de ácida 18,9 19,0 18,7 19,1 19,4 19,1 20,7 20,5
variantes % de
de carga 53,9 53,5 54,5 53,7 53,6 55,8 53,8 53,4
principal
por CEX-
% de
UPLC 27,3 27,6 26,8 27,2 27,1 25,1 25,5 26,0
básica
% de ácida 31,9 NN NN 32,3 NN 33,9 33,1 34,0
Análisis de
variantes % de
54,7 NN NN 54,2 NN 54,0 54,0 53,9
de carga principal
por iCIEF % de
13,5 NN NN 13,5 NN 12,1 12,9 12,1
básica
% de potencia relativa
126 NN NN 127 NN 125 110 104
(bioensayo)
CEX, intercambio catiónico; SF, Sustancia farmacéutica; HMW, Alto peso molecular; iCIEF, isoelectroenfoque capilar con
obtención de imágenes, LMW, Bajo peso molecular; MFI, Obtención de imágenes de microflujo; Monómero, anticuerpo intacto;
NN, No es necesario; DO, Densidad óptica; RP, Fase inversa; SE, Exclusión por tamaño; UPLC, Cromatografía líquida de
ultrarrendimiento
Tabla 12: Estabilidad de investigación de la formulación de 175 mg/ml almacenada a 2 - 8 °C

mAb1 175 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 % (p/v) y
Formulación
polisorbato 80 0,2 % (p/v), pH 6,0
Viales de vidrio tipo 1 de 3 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50 recubierto de

Recipiente/cierre
FluroTec® de 13 mm
Duración del almacenamiento a 5 °C (meses)

Ensayo
0 1 3 6 9 12 18 24 36
Color y aspecto Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado
Turbidez (aumento de la DO a
0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
405 nm)
Turbidez (UNT por
6,72 6,95 6,57 6,54 6,62 7,01 6,67 6,87
nefelometría)
pH 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,1
31
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
Análisis de ≥ 10 µm 10 NN 28 131 NN 30 35 55
partículas
subvisibles por
≥ 25 µm 0 NN 11 56 NN 1 2 3
HIAC (N/ml)
Análisis de 2 a 10 µm 144 NN 441 244 NN 265 319 117

partículas
≥ 10 µm 22 NN 36 22 NN 29 28 8
subvisibles por MFI
(N/ml) ≥ 25 µm 1 NN 11 7 NN 3 10 1
% de proteína recuperada por
100 95 97 98 97 99 104 101
RP-UPLC
No
reducida;
97,9 NN 98,1 98,0 NN 97,9 98,0 97,9
% de pico
principal
Pureza por MCE-
SDS Reducida;
% de
cadena 100 NN 99,6 100 NN 99,8 99,8 99,8
ligera +
pesada
% de
0,6 0,6 0,7 0,7 0,8 0,9 1,0 1,0
HMW
Pureza por SE- % de
99,1 98,9 99,1 98,7 98,7 98,7 98,6 98,6
UPLC monómero
% de
0,4 0,5 0,3 0,5 0,5 0,5 0,4 0,4
LMW
% de
18,7 18,3 18,1 18,7 19,1 19,0 19,0 20,3
ácida
Análisis de
% de
variantes de carga 53,6 55,0 54,6 53,3 53,6 55,5 54,3 53,8
principal
por CEX-UPLC
% de
27,8 26,7 27,4 28,1 27,3 25,5 26,8 25,9
básica
% de
31,8 NN 32,4 31,9 NN 33,9 32,3 32,0
ácida
Análisis de
% de
variantes de carga 54,6 NN 54,6 54,9 NN 54,8 54,6 54,3
principal
por iCIEF
% de
13,6 NN 13,1 13,2 NN 11,3 13,1 13,7
básica
102 NN NN 118 NN 110 91 107
(bioensayo)
CEX, intercambio catiónico; SF, Sustancia farmacéutica; HMW, Alto peso molecular; iCIEF, isoelectroenfoque capilar con
obtención de imágenes, LMW, Bajo peso molecular; MFI, Obtención de imágenes de microflujo; Monómero, anticuerpo intacto;
NN, No es necesario; DO, Densidad óptica; RP, Fase inversa; SE, Exclusión por tamaño; UPLC, Cromatografía líquida de
ultrarrendimiento
Tabla 13: Estabilidad de investigación de la formulación a 50 mg/ml almacenada en condiciones aceleradas y

de estrés
mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al
Formulación
1,5 % (p/v), polisorbato 80 al 0,2 % (p/v), pH 6,0
Viales de vidrio tipo 1 de 3 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50,

Recipiente/cierre
recubierto con FluroTec® de 13 mm
Almacenamiento a 25 °C/HR Almacenamiento a 40 °C

del 60 % (meses) (días)
Ensayo 0 1 3 6 7 14 28
Color y aspecto Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado
Turbidez (aumento de la DO a 405
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
nm)
Turbidez (UNT por nefelometría) 7,41 6,05 6,54 6,90 6,10 6,60 6,93
pH 6,0 6,0 6,0 6,1 6,0 6,0 6,0
32
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
Análisis de ≥ 10 µm 2 NN 17 21 NN NN 18
partículas
subvisibles por ≥ 25 µm 0 NN 0 1 NN NN 1
HIAC (n.º/ml)
Análisis de 2-10 µm 248 NN 1618 1531 NN NN 1543
partículas
≥ 10 µm 15 NN 29 47 NN NN 41
subvisibles por MFI
(n.º/ml) ≥ 25 µm 4 NN 2 15 NN NN 15
% de proteína recuperada por RP-
100 100 100 103 103 102 98
UPLC
No
reducida; %
99,2 NN 99,1 98,8 NN NN 98,9
de pico
principal
Pureza por MCE-
Reducida;
SDS
% de
cadena 100 NN 99,5 100 NN NN 99,5
ligera +
pesada
% de HMW 0,5 0,4 0,6 0,7 0,7 0,9 1,4
Pureza por SE- % de
99,2 99,0 99,1 98,8 98,9 98,5 97,9
UPLC monómero
% de LMW 0,4 0,5 0,3 0,5 0,5 0,6 0,7
% de ácida 18,9 19,3 21,8 27,0 19,9 22,5 27,2
Análisis de variantes
% de
de carga por CEX- 53,9 53,4 52,1 48,3 52,3 50,1 46,8
principal
UPLC
% de básica 27,3 27,4 26,1 24,8 27,8 27,4 26,0
% de ácida 31,9 NN 38,1 43,7 NN NN 45,4
Análisis de variantes % de
54,7 NN 48,6 44,3 NN NN 42,1
de carga por iCIEF principal
% de básica 13,5 NN 13,3 12,0 NN NN 12,5
% de potencia relativa por
126 NN NN 120 NN NN 99
bioensayo
CEX, intercambio catiónico; SF, Sustancia farmacéutica; HMW, Alto peso molecular; iCIEF, isoelectroenfoque
capilar con obtención de imágenes, LMW, Bajo peso molecular; MFI, Obtención de imágenes de microflujo;
Monómero, anticuerpo intacto; NN, No es necesario; DO, Densidad óptica; RP, Fase inversa; SE, Exclusión por
tamaño; UPLC, Cromatografía líquida de ultrarrendimiento
Tabla 14: Estabilidad de investigación de la formulación a 175 mg/ml almacenada en condiciones aceleradas
y de estrés
Formulación
1,5 % (p/v), polisorbato 80 al 0,2 % (p/v), pH 6,0
Viales de vidrio tipo 1 de 3 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50,

Recipiente/cierre

Ensayo 0 1 3 6 7 14 28
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01
nm)
Turbidez (UNT por nefelometría) 6,72 6,77 6,82 6,99 6,90 7,30 7,56
pH 6,0 6,0 6,0 6,1 6,0 5,9 6,0
33
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
partículas
HIAC (n.º/ml)
partículas
≥ 10 µm 22 NN 25 8 NN NN 531
subvisibles por MFI
(n.º/ml) ≥ 25 µm 1 NN 3 2 NN NN 3
100 95 97 99 98 99 95
UPLC
No reducida;
% de pico 97,9 NN NN 97,4 NN NN 97,5
principal
Pureza por MCE-
Reducida; %
SDS
de cadena
100 NN NN 99,7 NN NN 99,4
ligera +
pesada
% de HMW 0,6 0,9 1,2 1,5 1,7 2,6 3,9
Pureza por SE- % de
99,1 98,6 98,5 98,0 97,7 96,8 95,5
UPLC monómero
% de LMW 0,4 0,5 0,3 0,6 0,6 0,7 0,6
% de ácida 18,7 18,9 21,3 26,2 19,7 22,0 23,9
Análisis de
% de
variantes de carga 53,6 54,4 52,3 48,3 51,7 50,1 49,4
principal
por CEX-UPLC
% de básica 27,8 26,7 26,4 25,5 28,6 27,9 26,7
% de ácida 31,8 NN 37,0 45,0 NN NN 47,3
Análisis de
% de
variantes de carga 54,6 NN 50,3 43,3 NN NN 39,2
principal
por iCIEF
% de básica 13,6 NN 12,7 11,7 NN NN 13,5
102 NN NN 123 NN NN 86
bioensayo
capilar con obtención de imágenes, LMW, Bajo peso molecular; MFI, Obtención de imágenes de microflujo;
Monómero, anticuerpo intacto; NN, No es necesario; DO, Densidad óptica; RP, Fase inversa; SE, Exclusión por
tamaño; UPLC, Cromatografía líquida de ultrarrendimiento
Ejemplo 12: Estabilidad de las formulaciones de mAb1 que comprenden tampón de histidina, sacarosa y
polisorbato
5
Las tablas 15 - 24 resumen la estabilidad en almacenamiento de las formulaciones de mAb1 ilustrativas que
comprenden tampón de histidina 10 mM, a pH 6,0, sacarosa y polisorbato.
Tabla 15: Estabilidad de investigación de la formulación del mAb1 almacenada a -80 °C

mAb1 72,2 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 5 %
Formulación (p/v)
Vial de policarbonato de 5 ml con tapón de rosca de

Recipiente/cierre
polipropileno revestido de silicona
Duración del almacenamiento a -80 °C (meses)

Ensayo 0 1 3 6 9 12
Color y aspecto Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado
Turbidez (aumento de la DO a 405 nm) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
pH 6,2 6,3 6,2 6,1 6,2 6,1
34
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de proteína recuperada por RP-UPLC 100 94 95 98 95 94
No reducida; % de
99,5 NN NN 99,5 NN 99,2
pico principal
Pureza por MCE-SDS Reducida; % de
cadena ligera + 100 NN NN 100 NN 99,8
pesada
% de HMW 0,7 0,7 0,6 0,6 0,7 0,6
Pureza por SE-UPLC % de nativo 98,7 98,8 98,9 98,7 98,9 98,8
% de LMW 0,6 0,6 0,5 0,6 0,4 0,6
% de ácida 22,2 22,2 22,6 23,2 24,1 23,5
Análisis de variantes de
% de principal 49,7 49,8 48,9 46,8 45,2 44,1
carga por CEX-UPLC
% de básica 28,1 28,0 28,5 30,0 30,7 32,4
% de ácida 38,9 NN NN 39,1 NN 37,5
% de principal 56,5 NN NN 56,2 NN 57,2
carga por iCIEF
% de básica 4,6 NN NN 4,7 NN 5,3
% de potencia relativa (bioensayo) 95 NN NN 81 NN 120
CEX = intercambio catiónico; HMW = alto peso molecular; iCIEF = isoelectroenfoque capilar con obtención de
imágenes; LMW = bajo peso molecular; MCE-SDS = electroforesis capilar de microchip-dodecil sulfato de sodio;
MFI = obtención de imágenes de microflujo; NN = No necesario; DO = Densidad óptica; HR = Humedad relativa;
RP = fase inversa; SE = exclusión por tamaño; UPLC = cromatografía líquida de ultrarrendimiento

Formulación (p/v)

Recipiente/cierre

Ensayo 0 1 3 6 9 12
pH 6,2 6,3 6,2 6,1 6,2 6,1
No reducida; % de
99,5 NN NN 99,1 NN 99,2
pico principal
pesada
% de HMW 0,7 0,7 0,6 0,7 0,7 0,6
% de LMW 0,6 0,5 0,4 0,6 0,4 0,6
Análisis de variantes de % de ácida 22,2 22,5 22,5 23,4 24,2 23,4

carga por CEX-UPLC % de principal 49,7 49,6 48,9 46,6 45,6 44,1
35
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de básica 28,1 28,0 28,6 30,0 30,2 32,5
% de ácida 38,9 NN NN 38,2 NN 37,8
carga por iCIEF

Formulación
(p/v)

Recipiente/cierre

Ensayo 0 1 3 6 9 12
pH 6,2 6,3 6,2 6,1 6,1 6,2
No reducida; % de
99,5 NN NN 99,5 NN 99,3
pico principal
pesada
% de HMW 0,7 0,7 0,7 0,7 0,8 0,7
% de LMW 0,6 0,5 0,5 0,7 0,4 0,6
% de ácida 22,2 22,4 22,3 22,4 24,6 23,4
% de principal 49,7 49,7 49,2 47,6 45,5 44,2
carga por CEX-UPLC
% de básica 28,1 27,9 28,5 30,0 30,0 32,5
% de ácida 38,9 NN NN 38,6 NN 38,6
carga por iCIEF
5 Tabla 18: Estabilidad de investigación de la formulación del mAb1 - Efecto de condiciones aceleradas
Formulación mAb1 72,2 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 5 % (p/v)
Vial de policarbonato de 5 ml con tapón de rosca de polipropileno
Recipiente/cierre
revestido de silicona
Almacenamiento a Almacenamiento a
Almacenamiento a
25 °C/HR del 60 % 40 °C/HR del 75 %
5 °C (días)
(días) (días)
Ensayo T=0 28 56 14 28 14 28
0,00 0,01 0,01 0,02 0,01 0,03 0,05
nm)
36
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
pH 6,2 6,2 6,1 6,2 6,2 6,2 6,1
100 96 100 97 100 105 113
UPLC
No
reducida; %
99,5 NN 99,1 NN 99,5 NN 99,1
de pico
principal
Pureza por MCE-
Reducida;
SDS
% de
cadena 100 NN 100 NN 99,2 NN 98,7
ligera +
pesada
% de HMW 0,7 0,9 1,1 1,4 1,7 3,1 4,6
Pureza por SE-
% de nativo 98,7 98,5 98,4 98,0 97,7 96,1 94,6
UPLC
% de LMW 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,8 0,9
% de ácida 22,2 22,2 22,3 22,0 22,6 25,6 30,8
% de
de carga por CEX- 49,7 49,8 48,9 49,6 49,1 46,0 41,7
principal
UPLC
% de básica 28,1 28,1 28,8 28,4 28,3 28,3 27,5
% de ácida 38,9 NN 39,0 NN 41,1 NN 58,2
Análisis de variantes % de
56,5 NN 56,8 NN 53,8 NN 36,3
de carga por iCIEF principal
% de básica 4,6 NN 4,2 NN 5,1 NN 5,5
% de potencia relativa (bioensayo) 95 NN 95 NN 84 NN 87

mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 10 % (p/v),
Formulación
polisorbato 80 al 0,1 %

Recipiente/cierre

Ensayo 0 1 3 6 9 12
pH 6,1 6,1 6,1 6,0 6,0 6,0
No reducida; %
99,5 NN NN 99,4 NN 99,5
de pico principal
cadena ligera + 100 NN NN 100 NN 100
pesada
% de HMW 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

% de LMW 0,6 0,5 0,6 0,6 0,5 0,5
37
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de ácida 22,8 23,0 23,3 23,5 23,9 25,4
% de principal 47,3 47,3 46,2 45,3 44,2 44,2
carga por CEX-UPLC
% de básica 30,0 29,8 30,6 31,2 31,9 30,4
% de ácida 40,1 NN NN 38,1 NN 41,3
carga por iCIEF

mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 10 % (p/v),
Formulación

Recipiente/cierre

Ensayo 0 1 3 6 9 12
pH 6,1 6,1 6,1 6,0 6,1 6,0
No reducida;
% de pico 99,5 NN NN 99,1 NN 99,5
principal
Pureza por MCE-SDS
Reducida; % de
pesada
Pureza por % de HMW 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

% de nativo 98,6 98,7 98,6 98,7 98,8 98,7
SE-UPLC
% de LMW 0,6 0,5 0,6 0,6 0,4 0,6
% de ácida 22,8 23,1 22,9 23,5 23,7 25,1
% de principal 47,3 47,1 46,5 45,3 44,4 44,4
carga por CEX-UPLC
% de básica 30,0 29,8 30,6 31,2 31,9 30,5
% de ácida 40,1 NN NN 38,0 NN 41,3
carga por iCIEF
5 Tabla 21: Estabilidad de investigación de la formulación del mAb1 almacenada a -20 °C

Formulación mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 10 % (p/v),

Recipiente/cierre Vial de policarbonato de 5 ml con tapón de rosca de
38
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
Ensayo 0 1 3 6 9 12
pH 6,1 6,1 6,1 6,0 6,1 6,0
No reducida; %
99,5 NN NN 99,4 NN 99,4
de pico principal
pesada
% de HMW 0,8 0,8 0,8 0,8 0,7 0,8

% de LMW 0,6 0,5 0,6 0,6 0,4 0,6
% de ácida 22,8 22,9 23,5 23,6 24,3 25,2
% de principal 47,3 47,3 46,0 45,2 43,8 43,9
carga por CEX-UPLC
% de básica 30,0 29,8 30,6 31,2 31,9 30,8
% de ácida 40,1 NN NN 38,4 NN 41,6
carga por iCIEF
Tabla 22: Estabilidad de investigación de la formulación del mAb1 - Efecto de condiciones aceleradas
Formulación mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 10 % (p/v), polisorbato 80
al 0,1 %

Recipiente/cierre Vial de policarbonato de 5 ml con tapón de rosca de polipropileno revestido de
silicona
Almacenamiento a Almacenamiento a
Sin Almacenamiento a
25 °C/HR del 60 % 40 °C/HR del 75 %
almacenamiento 5 °C (días)
(días) (días)
Ensayo T=0 28 56 14 28 14 28
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,03
DO a 405 nm)
pH 6,1 6,1 6,0 6,1 6,1 6,0 6,0
% de proteína recuperada
100 101 102 106 107 113 114
por RP-UPLC
No
reducida;
99,5 NN 99,1 NN 99,5 NN 99,3
% de pico
principal
Pureza por
Reducida;
MCE-SDS
% de
cadena 100 NN 100 NN 100 NN 99,1
ligera +
pesada
39
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de
0,8 0,7 0,7 0,9 0,9 3,4 5,0
HMW
Pureza por SE- % de
98,6 98,8 98,7 98,6 98,6 95,7 93,7
UPLC nativo
% de
0,6 0,5 0,6 0,5 0,6 0,9 1,3
LMW
% de
22,8 22,8 23,3 22,6 22,8 29,6 32,5
Análisis de ácida
variantes de % de
47,3 47,3 46,1 47,2 47,0 39,5 36,4
carga por principal
CEX-UPLC % de
30,0 29,9 30,6 30,2 30,2 30,9 31,1
básica
% de
40,1 NN 39,8 NN 40,2 NN 53,7
Análisis de ácida
variantes de % de
56,1 NN 57,0 NN 55,9 NN 42,2
carga por principal
iCIEF % de
3,8 NN 3,2 NN 3,9 NN 4,0
básica
112 NN 103 NN 91 NN 79
(bioensayo)
Tabla 23: Estabilidad de investigación de la formulación del mAb1 almacenada a 5 °C

Formulación mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 10 % (p/v),
polisorbato 80 al 0,1 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Viales de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapones West
S2-451 4432/50 GRY B2-40 de 13 mm recubiertos con FluroTec®

Ensayo 0 1 3 6 9 12
pH 6,2 6,1 6,1 6,1 6,0 6,1

2 a 10 µm 823 NN NN 2169 NN 293 31
Análisis de partículas
≥ 10 µm 15 NN NN 10 NN 56
por MFI (partículas/ml)
≥ 25 µm 0 NN NN 3 NN 5
% de proteína recuperada por RP-UPLC 100 1009) 98 101 102 90
No reducida; %
99,4 NN NN 99,5 NN 99,2
de pico principal
pesada
% de HMW 0,7 0,7 0,7 0,8 0,9 0,9

% de LMW 0,6 0,5 0,6 0,6 0,5 0,6
% de ácida 23,0 22,8 23,5 22,4 24,1 22,4
% de principal 48,5 48,6 46,2 47,2 44,4 45,5
carga por CEX-UPLC
% de básica 28,6 28,6 30,4 30,4 31,5 32,1
40
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de ácida 39,8 NN NN 39,2 NN 40,1
carga por iCIEF
Tabla 24: Estabilidad de investigación de la formulación del mAb1 almacenada en condiciones aceleradas
Formulación mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 10 % (p/v), polisorbato 80
al 0,1 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Viales de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapones West S2-451
4432/50 GRY B2-40 de 13 mm recubiertos con FluroTec®

Ensayo 0 0,5 1 3 7 14 28
0,00 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,02
nm)
pH 6,2 6,1 6,1 6,1 6,2 6,1 6,1
2 a 10 µm 823 NN NN 1056 NN NN 521
Análisis de
partículas por MFI ≥ 10 µm 15 NN NN 23 NN NN 83
(partículas/ml)
≥ 25 µm 0 NN NN 3 NN NN 4
100 99 100 99 99 100 99
UPLC
No reducida;
% de pico 99,4 NN NN 99,4 NN NN 99,2
principal
Pureza por MCE-
Reducida; %
SDS
de cadena
100 NN NN 100 NN NN 98,6
ligera +
pesada
% de HMW 0,7 0,8 0,9 1,1 1,6 3,2 8,5
Pureza por SE-
% de nativo 98,7 98,6 98,5 98,1 97,6 95,9 89,7
UPLC
% de LMW 0,6 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,8
% de ácida 23,0 22,6 23,1 25,8 24,7 27,3 34,0
Análisis de
% de
principal
por CEX-UPLC
% de básica 28,6 28,8 28,9 29,8 29,1 28,6 30,2
% de ácida 39,8 NN NN 47,1 NN NN 66,9
Análisis de
% de
variantes de carga 56,7 NN NN 49,5 NN NN 30,2
principal
por iCIEF
% de básica 3,4 NN NN 3,5 NN NN 3,0
111 NN NN 94 NN NN 63
bioensayo
5 Las tablas 25 - 27 resumen la estabilidad en estrés de las formulaciones ilustrativas.
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Tabla 25: Estabilidad de investigación de la formulación de mAb1 - Efecto de las condiciones de estrés
Formulación mAb1 72,2 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 5 %
(p/v)
Congelación/Descongelación
Agitación (min)
(ciclos)
Ensayo T=0 10 15 4 8
Color y aspecto Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado Aprobado
Turbidez (aumento de la DO a 405 nm) 0,00 0,00 0,09 0,01 0,00
pH 6,2 6,2 6,2 6,3 6,3
% de proteína recuperada por RP-UPLC 100 100 99 95 95
No reducida; % de
99,5 NN 99,2 NN 99,4
pico principal
cadena ligera + 100 NN 100 NN 100
pesada
% de HMW 0,7 0,8 4,6 0,6 0,7
Pureza por SE-UPLC % de nativo 98,7 98,7 94,9 98,9 98,8
% de LMW 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5
Análisis de variantes % de ácida 22,2 22,2 21,9 22,0 22,2

de carga por % de principal 49,7 49,6 49,9 49,7 49,6
CEX-UPLC % de básica 28,1 28,2 28,2 28,3 28,2
% de ácida 38,9 NN 40,8 NN 39,0
% de principal 56,5 NN 54,7 NN 56,5
de carga por iCIEF
% de básica 4,6 NN 4,6 NN 4,5
% de potencia relativa (bioensayo) 95 NN 87 NN 89
Formulación mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0, sacarosa al 10 % (p/v),
polisorbato 80 al 0,1 % (p/v)

Sin Congelación/Descongelación
Agitación (minutos)
estrés (ciclos)
Ensayo T=0 60 120 4 8

pH 6,1 6,1 6,1 6,1 6,1
No reducida; % de
Pureza por MCE-SDS 99,5 NN 99,5 NN 99,6
pico principal
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(continuación)
Reducida; % de
pesada
% de HMW 0,8 0,8 0,7 0,8 0,8
% de LMW 0,6 0,6 0,6 0,5 0,6
% de ácida 22,8 22,8 22,8 22,9 22,7
de carga por CEX- % de principal 47,3 47,2 47,3 47,1 47,2
UPLC
% de básica 30,0 30,0 29,2 30,1 30,1
% de ácida 40,1 NN 39,6 NN 40,0
de carga por iCIEF
% de potencia relativa (bioensayo) 112 NN 106 NN 137
Formulación mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 10 % (p/v),
polisorbato 80 al 0,1 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Viales de vidrio de borosilicato tipo 1 de 2 ml con tapones West S2-
451 4432/50 GRY B2-40 de 13 mm recubiertos con FluroTec®
Congelación/Descongelación
Agitación (min)
(ciclos)
Ensayo 0 60 120 4 8
pH 6,2 6,2 6,2 6,2 6,2
2 a 10 µm 823 NN 1170 NN 1404
por MFI ≥ 10 µm 15 NN 38 NN 67
(partículas/ml)
≥ 25 µm 0 NN 0 NN 2
No reducida; %
99,4 NN 99,4 NN 99,3
de pico principal
Pureza por MCE-SDS
Reducida; % de
pesada
% de HMW 0,7 0,6 0,7 0,7 0,7

% de LMW 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7
% de ácida 23,0 22,9 22,8 22,8 22,7
UPLC
% de básica 28,6 28,8 28,8 28,8 28,8
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(continuación)
% de ácida 39,8 NN 39,6 NN 39,6
de carga por iCIEF
% de potencia relativa por bioensayo 111 NN 90 NN 129
Tabla 28: Estabilidad acelerada y al estrés de formulaciones de 50 mg/ml y 25 mg/ml de mAb1

Formulación mAb1 50 mg/ml, histidina 10 mM, mAb1 25 mg/ml, histidina 10 mM,
sacarosa al 10 % (p/v), polisorbato 80 sacarosa al 10 % (p/v), polisorbato 80
al 0,1 % (p/v), pH 6,0 al 0,1 % (p/v), pH 6,0
Volumen de llenado 1,0 ml 1,0 ml

Recipiente/cierre Viales de vidrio de borosilicato tipo 1 Viales de vidrio de borosilicato tipo 1
de 2 ml con tapones West S2-451 de 2 ml con tapones West S2-451
4432/50 GRY B2-40 de 13 mm 4432/50 GRY B2-40 de 13 mm
recubiertos con FluroTec® recubiertos con FluroTec®
25 °C/HR 25 °C/HR
del 60 % 45 °C 28 del 60 % 45 °C 28
Ensayo T=0 T=0
1 mes días 1 mes días
0,00 0,01 0,02 0,00 0,01 0,02
DO a 405 nm)
pH 6,0 6,0 6,1 6,2 6,1 6,1
% de proteína recuperada
100 103 113 100 100 99
por RP-UPLC
% de HMW 1,9 4,0 10,8 0,7 0,9 8,5
Pureza por % de
97,5 95,2 88,0 98,7 98,5 89,7
SE-UPLC monómero
% de LMW 0,6 0,8 1,2 0,6 0,6 1,8

% de ácida 24,6 29,0 37,1 23,0 23,1 34,0
Análisis de
variantes de % de
49,9 42,5 33,2 48,5 48,1 35,9
carga por principal
CEX-UPLC % de
25,6 28,5 29,7 28,6 28,9 30,2
básica
5 Ejemplo 13: Estudio de intervalo aceptable probado (PAR)
Durante la fabricación de la especialidad farmacéutica (EF) de mAb1, pueden producirse variaciones en la composición
de la EF. Estas variaciones pueden incluir la concentración del principio activo, la concentración de los excipientes y/o
el pH de la formulación. Debido a que los cambios en cualquiera de estos parámetros podrían posiblemente afectar la
10 estabilidad o la potencia de la especialidad farmacéutica, se realizaron estudios de intervalo aceptable probado (PAR)
para evaluar si las variaciones de la composición de la EF, dentro de los intervalos definidos, afectarían la estabilidad
o la potencia de la EF de mAb1.
Se utilizaron dos estudios de diseño de experimento (DE) para evaluar el efecto de cada parámetro de formulación,
15 así como las interacciones sobre la estabilidad de la formulación:
• Un estudio Pre-PAR de diseño factorial parcial con evaluación de estabilidad acelerada y en estrés para identificar
parámetros de formulación críticos que pueden afectar a la estabilidad de mAb1 EF;
20 • Un estudio de PAR de diseño factorial completo que incluye parámetros de formulación críticos identificados a
partir del estudio Pre-PAR, con estabilidad de vida útil a largo plazo para demostrar los intervalos aceptables de
los parámetros de formulación.
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Diseño de estudio de prePAR

Para evaluar los parámetros de formulación críticos y/o interactivos en la composición de la EF que podrían ser
importantes para la calidad del producto, se aplicó un DE factorial parcial para examinar la estabilidad acelerada y de
estrés de las formulaciones variando todos los parámetros de la formulación, incluyendo la concentración de proteína
5 (± 10 %), las concentraciones de tampón y de estabilizante (± 20 %), la concentración de tensioactivo (± 50 %) y el pH
(± 0,3 unidades). Los intervalos de parámetros de formulación probados se definieron como iguales o más amplios
que los criterios de aceptación de las especificaciones y la experiencia de fabricación. El estudio se diseñó con un
programa informático estadístico usando un experimento factorial parcial de resolución IV 2 ^(6-2). Junto con cuatro
formulaciones diana como puntos centrales, el estudio incluyó 20 ejecuciones, como se muestra en la Tabla 29.
10
Tabla 29: Formulaciones probadas en el estudio de Pre-PAR
[mAb1] [histidina] % de sacarosa % de L-prolina % de polisorbato 80
Formulación pH
mg/ml mM (p/v) (p/v) (p/v)
1 45 12 4 1,2 0,3 6,3

2 45 12 4 1,8 0,3 5,7
3 45 8 6 1,8 0,3 6,3
4 50 10 5 1,5 0,2 6,0
5 45 8 4 1,8 0,1 6,3
6 55 8 6 1,2 0,1 6,3
7 55 8 4 1,2 0,3 6,3
8 50 10 5 1,5 0,2 6,0
9 55 12 6 1,8 0,3 6,3
10 45 12 6 1,2 0,1 6,3
11 55 8 4 1,8 0,3 5,7
12 55 8 6 1,8 0,1 5,7
13 45 12 6 1,8 0,1 5,7
14 55 12 6 1,2 0,3 5,7
15 50 10 5 1,5 0,2 6,0
16 45 8 6 1,2 0,3 5,7
17 55 12 4 1,8 0,1 6,3
18 45 8 4 1,2 0,1 5,7
19 50 10 5 1,5 0,2 6,0
20 55 12 4 1,2 0,1 5,7
Las 20 formulaciones en condiciones aceleradas y condiciones de estrés (25 °C, 37 °C, congelación/descongelación
[C/D] y agitación) se caracterizaron y evaluaron en cuanto a las propiedades físicas/químicas y la estabilidad, incluida
15 la inspección visual, el pH, la turbidez, la osmolalidad, la conductividad, la pureza, la concentración y la recuperación
de proteínas, el análisis de variantes de carga y el análisis de partículas subvisibles.
Resultados del estudio de Pre-PAR
20 Las 20 formulaciones no mostraron cambios después de la agitación o el estrés de C/D. Los resultados de la
incubación a 25 °C y 37 °C se analizaron mediante un modelo de regresión (modelo de ajuste de JMP con personalidad
de mínimos cuadrados convencional y énfasis en el efecto palanca). El análisis estadístico de las variables principales
e interactivas de todas las formulaciones experimentales frente a los atributos críticos de calidad reveló que el pH, la
concentración de proteínas y la concentración de sacarosa fueron importantes para la calidad del producto. Los dos
25 atributos de calidad del producto afectados fueron las especies de HMW y las variantes de carga ácida. Se comprobó
que otros parámetros de la formulación, incluidas las concentraciones de histidina, prolina o polisorbato 80 dentro de
los intervalos probados, no tuvieron un impacto estadísticamente significativo en la calidad del producto. En
condiciones aceleradas, no hubo interacciones secundarias o superiores que afectaran la estabilidad de la formulación.
Los resultados del estudio de pre-PAR indicaron que el pH, la concentración de mAb1 y la concentración de sacarosa
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fueron cruciales para la estabilidad de la formulación de mAb1 y se consideraron como los parámetros de formulación
cruciales para la formulación de mAb1 50 mg/ml.
Aunque el pH, la concentración de mAb1 y la concentración de sacarosa se identificaron como los parámetros cruciales
5 de formulación, el efecto de estos tres factores sobre los atributos de calidad fue mínimo. Basándose en el análisis
estadístico, el cambio en el intervalo de pH de 5,7-6,3, mAb1 45-55 mg/ml y/o sacarosa al 4-6 % probablemente tuvo
un impacto <15 % en la formación de especies de HMW y de variantes de carga ácidas.
Para confirmar el efecto sobre la estabilidad de almacenamiento a largo plazo en la condición de almacenamiento del
10 EF recomendada, los siguientes tres parámetros críticos de formulación: pH, concentración de mAb1 y concentración
de sacarosa, se evaluaron adicionalmente en un estudio de PAR con estabilidad de almacenamiento a largo plazo.
Diseño del estudio de PAR
15 Se aplicó un diseño DE factorial completo para examinar la estabilidad en el almacenamiento a largo plazo de las
formulaciones con pH (± 0,3 unidades), concentración de proteína (± 10 %) y concentración de sacarosa (± 20 %)
variables, dando como resultado ocho ejecuciones experimentales (Tabla 30); se incluyó una formulación de referencia
(formulación 3, la formulación diana de la Tabla 30) como la formulación central.
20 Tabla 30: Formulaciones probadas en estudios de PAR

[histidina] % de sacarosa % de L-prolina % de polisorbato 80
Formulación [mAb1] mg/ml pH
mM (p/v) (p/v) (p/v)
1 55 10 6 1,5 0,2 5,7
2 45 10 6 1,5 0,2 5,7
3 50 10 5 1,5 0,2 6,0
4 55 10 6 1,5 0,2 6,3
5 55 10 4 1,5 0,2 6,3
6 55 10 4 1,5 0,2 5,7
7 45 10 4 1,5 0,2 6,3
8 45 10 4 1,5 0,2 5,7
9 45 10 6 1,5 0,2 6,3
El diseño del estudio factorial completo permite la estimación de todos los términos de efecto principal, así como los
términos de interacción. Los intervalos de parámetros de formulación probados, definidos para ser iguales o más
amplios que los criterios de aceptación de las especificaciones, y la experiencia de fabricación, permanecieron iguales
25 que en el estudio de Pre-PAR.
La estabilidad de las formulaciones experimentales se comparó con la estabilidad de una formulación de referencia a
pH 6,0 que contenía todos los componentes de la formulación en sus concentraciones nominales (F3). Los estudios
de PAR utilizaron un lote de SF de mAb1 fabricado con el procedimiento de fabricación comercial representativo. Las
30 formulaciones de EF se rellenaron en viales de vidrio de borosilicato Schott tipo 1 de 10 ml, con tapones West S2-451
4432/50 GRY B2-40 de 20 mm recubiertos con FluroTec® (representación comercial de la EF) y se evaluó su
estabilidad en el almacenamiento a largo plazo a 2-8 °C. Las formulaciones se estudiaron de acuerdo con el plan de
análisis de la Tabla 31.
35 Tabla 31: Plan de análisis para estudio de PAR

Prueba Muestras analizadas Atributos de calidad
Aspecto Todas Color, partículas visibles

Turbidez (aumento de la Todas Color, partículas, transparencia
DO a 405 nm)
Turbidez por t = 0, 6, 12, 18, 24 y 36 Claridad (precipitación de la solución, partículas,

nefelometría meses a 5 °C opalescencia)
pH Todas pH
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(continuación)
Prueba Muestras analizadas Atributos de calidad
Contenido de proteína t=0 Concentración de proteínas

total por RP-UPLC
Osmolalidad t=0 Concentración de solutos

Conductividad t=0 Propiedad conductiva
Pureza por SE-UPLC Todas Variantes de peso molecular: % de HMW, % de monómero,
% de LWM
Análisis de variantes de t = 0, 6, 12, 18, 24 y 36 Isoformas de carga: % de ácida, % principal, % de básica
carga por cIEF meses a 5 °C
Materia particulada t = 0, 6, 12, 18, 24 y 36 Partículas subvisibles.

(oscurecimiento de la meses a 5 °C Criterios de aceptación expuestos en USP <788> (< 6000
luz) partículas/recipiente para partículas ≥ 10 □ m y < 600
partículas/recipiente para partículas ≥ 25 □ m)
Partículas (obtención de t = 0, 6, 12, 18, 24 y 36 Partículas subvisibles (solo para información)

imágenes de microflujo, meses a 5 °C
MFI)
Bioensayo t = 0, 6, 12, 18, 24 y 36 Potencia

meses a 5 °C Criterios de aceptación: 50-150 % del patrón de referencia
Resultados del estudio de PAR
5 Efecto sobre la formación de especies de HMW
No hubo un aumento significativo en el % de HMW medido por SE-UPLC hasta 12 meses a 2-8 °C para las 9
formulaciones. Todos los valores estaban muy por debajo de la especificación superior y no se observó un aumento
significativo en el % de HMW con el tiempo.
10
Se encontró que la formación de especies de HMW para la EF de mAb1 50 mg/ml a 2-8 °C era extremadamente lenta.
Durante hasta 12 meses, el cambio máximo de la cantidad relativa en el % de HMW en la formulación 9 fue ~ 0,2 %.
Dado que el cambio en el % de HMW fue mínimo y la concentración de monómero podría considerarse como una
constante, la agregación de monómeros a especies de HMW podría simplificarse como una reacción de orden cero.
15 Por lo tanto, se utilizó un modelo lineal simplificado para analizar los datos de estabilidad del % de HMW. Al ajustar
linealmente el % de HMW a lo largo del tiempo, se derivó la tasa de formación de especies de HMW para cada
formulación.
La tasa se analizó frente a los factores principales, así como todos los términos de interacción utilizando un modelo
20 de regresión (modelo de ajuste de JMP con personalidad de mínimos cuadrados convencional y énfasis en el efecto
palanca). El modelo de regresión resultante fue estadísticamente significativo con un R 2 de 0,74. La concentración de
mAb1, el pH y el tiempo fueron estadísticamente significativos, pero el efecto sobre el % de formación de especies
HMW fue estadísticamente no significativo, solo contribuye hasta el 0,1 %.
25 Por lo tanto, estos factores, pH a 5,7 - 6,3, concentración de mAb1 a 45-55 mg/ml y concentración de sacarosa al 4-
6 %, no tuvieron importancia práctica para la estabilidad del % de HMW a 2-8 °C.
El % de HMW en las 9 formulaciones hasta el punto de tiempo de 12 meses estuvo muy por debajo del límite del
criterio de aceptación definido del 4 % y, por tanto, dentro de las especificaciones de liberación y final de la vida útil.
30 Además, los modelos lineales predijeron que después de 24 meses de vida útil de almacenamiento a 2 °C - 8 °C, el %
de HMW, que variaba del 0,6 % al 0,8 %, también estaría muy por debajo del límite de especificación.
Basándose en los datos de estabilidad de almacenamiento a largo plazo, se descubrió que las variaciones de los
parámetros críticos de formulación dentro de los intervalos estudiados no tienen un impacto significativo sobre la
35 estabilidad de la formulación de mAb1. La formulación de mAb1 50 mg/ml fue robusta con respecto a la formación de
especies de HMW dentro del intervalo de composiciones de la formulación probados.
Efecto sobre la formación de variantes de carga ácida
40 No hubo un aumento significativo en el % de las variantes de carga ácidas medidas hasta 12 meses a 2-8 °C para las
9 formulaciones. Todos los valores estuvieron por debajo de la especificación superior y no se observó un aumento
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significativo en el % de variantes de carga ácidas a lo largo del tiempo.
Se consideró que la formulación de mAb1 era robusta con respecto a la formación de variantes de carga ácida dentro
del intervalo de composiciones de la formulación probada.
5
Efecto sobre los atributos generales de calidad
Se estudió el efecto del pH, la concentración de mAb1 y la sacarosa, así como el tiempo de almacenamiento en otros
atributos de calidad general de la EF, incluido el aspecto, el pH, la turbidez, las partículas subvisibles, la recuperación
10 de proteínas, el % de monómero y el % de LMW por SEC, % de variantes de carga principal y % de básicas por iCIEF,
y la bioactividad. Todos los valores estuvieron dentro de las especificaciones y no se observaron cambios significativos
con el tiempo ni diferencias entre las formulaciones de PAR:
• No se detectaron precipitados ni partículas visibles ni por inspección visual ni por mediciones de turbidez (DO a
15 405 nm y nefelometría);
• No se observaron cambios estadísticamente significativos en la recuperación de proteínas (RP-UPLC);
• El pH de las formulaciones fue estable;
• No se observaron aumentos significativos en las partículas subvisibles y no se observaron diferencias significativas
en los recuentos de partículas subvisibles entre las formulaciones del estudio de PAR.
20
◦ Para partículas subvisibles medidas por HIAC, todos los valores estuvieron por debajo de los límites
aceptables establecidos por USP <788>, y no se observó ninguna variación significativa en las partículas
subvisibles entre las formulaciones.
◦ Además, las partículas subvisibles también se midieron por MFI. No se observó ninguna variación significativa
25 en las partículas subvisibles entre las formulaciones.
• Los resultados del bioensayo estuvieron dentro del límite de las especificaciones para todas las formulaciones
durante el almacenamiento.
30 Los resultados demuestran que las variaciones de los parámetros cruciales de formulación (pH, concentración de
mAb1 y concentración de sacarosa) dentro de los intervalos estudiados no tienen un efecto significativo sobre la
estabilidad de la formulación de mAb1. La formulación de mAb1 50 mg/ml es sólida con respecto a los atributos de
calidad generales dentro del intervalo de composiciones de formulación probado.
35 Efecto de la congelación y la descongelación sobre la estabilidad de las formulaciones de PAR
La estabilidad física y química de la formulación de mAb1 50 mg/ml, examinada después de dos ciclos de congelación
y descongelación, no se vio afectada por la variación en los parámetros críticos de formulación, es decir, un cambio
de unidad de pH de ± 0,3 en relación con el mAb1 de referencia, una variación de ±10 % en la concentración de mAb1
40 y/o una variación de ±20 % en la sacarosa.
Se observaron los siguientes efectos:
• No se detectó precipitado ni por inspección visual ni por mediciones de turbidez (DO a 405 nm);
45 • No se observó pérdida de proteínas (RP-UPLC);
• El pH de las formulaciones permaneció constante;
• No se observaron diferencias significativas en los recuentos de partículas subvisibles, determinado por
oscurecimiento de la luz (HIAC) o imágenes de microflujo (MFI) entre las formulaciones del estudio. Hubo un ligero
aumento de las partículas subvisibles después de 2 ciclos de C/D, que podría eliminarse filtrando a través de un
50 filtro de 0,22 µm antes de rellenar el EF.
• No se observaron cambios apreciables en la pureza, determinada por SE-UPLC, en ninguna de las formulaciones
tras dos ciclos de congelación y descongelación;
• No se observó ningún cambio apreciable en la distribución de las variantes de carga, determinado por iCIEF, en
ninguna de las formulaciones tras dos ciclos de congelación y descongelación.
55 • Los resultados del bioensayo demostraron que la actividad de mAb1 se mantuvo en todas las formulaciones
sometidas a 2 ciclos de congelación y descongelación.
Conclusiones
60 Se utilizaron estudios de pre-PAR y PAR basados en diseño de experimento (DE) para evaluar el efecto de los
parámetros de formulación, así como las interacciones sobre la estabilidad de la formulación. El estudio de pre-PAR
con estabilidad acelerada y en estrés identificó al pH, la concentración de mAb1 y concentración de sacarosa como
parámetros críticos de formulación. Un estudio de PAR factorial completo con estabilidad de vida útil a largo plazo
demostró que la variación en los parámetros críticos de formulación, dentro de los estudios de intervalo, no afectó la
65 calidad de la EF de mAb1.
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Específicamente, la estabilidad y la potencia de la EF de mAb1 50 mg/ml almacenado a 5 °C durante 12 meses no se

vieron afectadas por una variación de ±10 % en la concentración de proteínas, una variación de ± 20 % en la sacarosa,
la concentración de L-prolina y/o histidina, y/o una variación de ± 50 % en la concentración de polisorbato 80, y/o una
variación de unidad de pH de ± 0,3.
5
El estudio de PAR demostró la solidez de la formulación de mAb1. En conjunto, los resultados del estudio de pre-PAR
y PAR respaldaron que la variabilidad en las composiciones de la formulación de mAb1 dentro de los intervalos
estudiados no afectaría negativamente la estabilidad del de la EF de mAb1 en las condiciones de almacenamiento
recomendadas (2 a 8 °C).
10
Las muestras de SFF de mAb1 50 mg/ml se mantuvieron estables después de dos ciclos de congelación y
descongelación (congelación a -30 °C y descongelación a temperatura ambiente). La estabilidad de la SFF de mAb1
frente al estrés por congelación/descongelación no se vio afectada por un cambio de ±10 % en la concentración de
mAb1, un cambio de ± 20 % en la sacarosa y/o un cambio de unidad de pH de ± 0,3 con respecto al control de SFF
15 de mAb1 (50 mg/ml). Los resultados de estos estudios de congelación/descongelación respaldan que se puede
congelar y descongelar una SFF de mAb1 50 mg/ml durante la fabricación de la EF de mAb1 sin afectar negativamente
a la estabilidad de la SFF.
Ejemplo 14: Recipientes

20
Las formulaciones de mAb1 se desarrollaron en viales de vidrio (para el suministro por infusión intravenosa). El
recipiente del producto farmacéutico de mAb1 destinado al desarrollo clínico posterior y la comercialización del
producto también es una jeringa precargada, que se presenta como una jeringa independiente para autoinyección o
incorporada en un dispositivo de autoinyección para autoadministración.
25
Ejemplo 15: Estabilidad de la formulación de mAb1 en viales de vidrio
Las Tablas 32 - 35 resumen la estabilidad de las formulaciones de mAb1 ilustrativas en viales de vidrio de 10 ml.
30 Tabla 32: Estabilidad de investigación de la formulación de mAb1 almacenada a 2 - 8 °C

mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 %
Formulación
(p/v) y, al 0,2 % (p/v)
Viales de vidrio tipo 1 de 10 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50

Recipiente/cierre

Ensayo
0 1 3 6 9 12 18 24
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
405 nm)
pH 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0
Análisis de 2 a 10 µm 175 NN 62 772 NN 1730 NN

partículas
≥ 10 µm 8 NN 3 144 NN 18 NN
subvisibles por
MFI (N/ml) ≥ 25 µm 0 NN 1 19 NN 4 NN
100 102 103 101 105 103 104
SE-UPLC
No
reducida;
99,1 NN NN 99,1 NN 99,2 NN
% de pico
principal
Pureza por MCE-
Reducida;
SDS
% de
cadena 100 NN NN 100 NN 100 NN
ligera +
pesada
49
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de
0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,4
HMW
Pureza por SE- % de
99,1 99,3 99,3 99,3 99,2 99,2 99,2
UPLC monómero
% de
0,6 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
LMW
% de
18,9 18,9 18,9 19,8 20,5 19,8 18,9
Análisis de ácida
variantes de % de
53,5 53,3 53,4 54,7 54,3 54,0 52,9
carga por CEX- principal
UPLC % de
27,5 27,8 27,7 25,6 25,2 26,2 28,2
básica
% de
33,8 NN 34,3 34,2 NN 34,9 NN
ácida
Análisis de
% de
variantes de 54,8 NN 54,2 54,3 NN 54,3 NN
principal
carga por iCIEF
% de
11,4 NN 11,4 11,4 NN 10,8 NN
básica
92 NN NN 122 NN 112 NN
(bioensayo)
capilar con obtención de imágenes, LMW, Bajo peso molecular; MFI, Obtención de imágenes de microflujo; NN, No
es necesario; DO, Densidad óptica; RP, Fase inversa; SE, Exclusión por tamaño; UPLC, Cromatografía líquida de
ultrarrendimiento
Tabla 33: Estabilidad de investigación de la formulación de mAb1 en condiciones aceleradas y de estrés

Formulación mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al
1,5 % (p/v) y polisorbato 80 0,2 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Viales de vidrio tipo 1 de 10 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50

Ensayo 0 1 3 6 7 14 28
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
nm)
pH 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0

partículas ≥ 10 µm 8 NN 4 109 NN NN 14
subvisibles por
MFI (n.º/ml) ≥ 25 µm 0 NN 3 3 NN NN 1
% de proteína recuperada por SE-
100 102 104 101 100 101 102
UPLC
No reducida;
% de pico 99,1 NN NN 98,8 NN NN 98,6
principal
Pureza por MCE-
Reducida; %
SDS
de cadena
100 NN NN 99,7 NN NN 99,7
ligera +
pesada
% de HMW 0,3 0,4 0,5 0,6 0,5 0,8 1,2
Pureza por SE- % de
99,1 99,1 99,1 99,0 98,7 98,5 98,1
UPLC monómero
% de LMW 0,6 0,5 0,4 0,4 0,7 0,7 0,7
50
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de ácida 18,9 19,4 22,1 28,3 20,0 22,0 27,1
Análisis de
variantes de carga % de principal 53,5 52,7 51,2 48,6 51,9 50,2 46,7
por CEX-UPLC
% de básica 27,5 27,9 26,8 23,2 27,1 27,7 26,2
% de ácida 33,8 NN NN 41,9 NN NN 46,4
Análisis de
variantes de carga % de principal 54,8 NN NN 46,5 NN NN 40,9
por iCIEF
% de básica 11,4 NN NN 11,6 NN NN 12,7
92 NN NN 91 NN NN 83
bioensayo
ultrarrendimiento
Tabla 34: Estabilidad de investigación de la formulación de mAb1 almacenada a 2 - 8 °C

Formulación
Viales de vidrio tipo 1 de 10 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50

Recipiente/cierre
Duración del almacenamiento a 2-8 °C (meses)

Ensayo
0 1 3 6 9 12 18 24
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
nm)
pH 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0
Análisis de partículas ≥ 10 µm 3 NN 2 4 NN
subvisibles por HIAC
(N/ml) ≥ 25 µm 0 NN 0 1 NN
2 a 10 µm 183 NN 207 1044 NN

subvisibles por MFI ≥ 10 µm 3 NN 7 19 NN
(N/ml)
≥ 25 µm 1 NN 3 5 NN
100 99 102 102 94
UPLC
No reducida;
% de pico 99,2 NN 99,4 99,2 NN
principal
Pureza por MCE-SDS Reducida; %
de cadena
100 NN 100 100 NN
ligera +
pesada
% de HMW 0,7 0,6 0,5 0,5 0,6
% de
Pureza por SE-UPLC 98,8 98,8 98,9 99,0 98,9
monómero
% de LMW 0,6 0,6 0,5 0,4 0,5
% de ácida 21,2 21,2 22,3 19,6 21,5
UPLC
% de básica 26,8 26,8 25,7 28,6 26,6
51
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de ácida 34,3 NN 34,7 34,6 NN
% de principal 52,1 NN 51,9 51,9 NN
de carga por iCIEF
% de básica 13,7 NN 13,4 13,4 NN
% de potencia relativa (bioensayo) 113 NN 105 128 NN
ultrarrendimiento
Tabla 35: Estabilidad de investigación de la formulación de mAb1 en condiciones aceleradas y de estrés

Formulación mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al

Recipiente/cierre Viales de vidrio tipo 1 de 10 ml con un tapón de clorobutilo 4432/50

Ensayo 0 1 3 6 7 14 28
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
nm)
pH 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0
partículas
HIAC (N/ml)
partículas
≥ 10 µm 3 NN 18 16 NN NN 92
subvisibles por MFI
(n.º/ml) ≥ 25 µm 1 NN 1 1 NN NN 1
% de proteína recuperada por SE-
100 100 101 101 101 99 100
UPLC
No reducida;
% de pico 99,2 NN 99,3 98,7 NN NN 98,6
principal
Pureza por MCE-
Reducida; %
SDS
de cadena
100 NN 100 100 NN NN 99,5
ligera +
pesada
% de HMW 0,7 0,6 0,7 0,8 0,6 0,8 1,3
Pureza por SE- % de
98,8 98,8 98,8 98,7 98,7 98,5 97,9
UPLC monómero
% de LMW 0,6 0,7 0,6 0,6 0,7 0,8 0,8
% de ácida 21,2 21,7 25,3 24,4 20,5 23,2 25,8
Análisis de
% de
principal
por CEX-UPLC
% de básica 26,8 26,2 23,3 25,1 27,0 25,9 24,6
% de ácida 34,3 NN 40,0 45,4 NN NN 46,9
Análisis de
% de
variantes de carga 52,1 NN 47,1 43,7 NN NN 39,7
principal
por iCIEF
% de básica 13,7 NN 12,9 11,0 NN NN 13,3
52
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
113 NN 143 99 NN NN 88
bioensayo
ultrarrendimiento
Se descubrió que las dos formulaciones a distintos volúmenes de llenado eran estables en estrés (40 °C/HR del 75 %)
(datos no mostrados).
5
Ejemplo 16: Estabilidad de la formulación de mAb1 en jeringas precargadas
Las Tablas 36 - 38 resumen la estabilidad de las formulaciones de mAb1 de alta concentración en jeringas
precargadas.
10
Tabla 36: Estabilidad de investigación de la especialidad farmacéutica de mAb1 en jeringa precargada (JPC)
almacenado a 5 °C
Formulación mAb1 175 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 %
(p/v), polisorbato 80 al 0,2 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Jeringa de vidrio Nuova Ompi EZ Fill de 2,25 ml con una aguja de pared
fina 27G 1/2 y un protector de aguja FM30 cerrado con un émbolo de goma
4023/50 recubierto con FluroTec®

Ensayo 0 1 3 6 9 12
0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
405 nm)
pH 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0
Análisis de ≥ 10 µm 35 NN 17 59 NN 13
partículas
subvisibles por ≥ 25 µm 0 NN 4 1 NN 1
HIAC (n.º/ml)
2 a 10 µm 21326 NN 8613 NA NN NA
Análisis de
partículas por MFI ≥ 10 µm 82 NN 303 NA NN NA
(partículas/ml)
≥ 25 µm 3 NN 2 NA NN NA

100 96 97 100 98 100
RP-UPLC
No
reducido;
97,6 NN NN 97,7 97,1 NA
% de pico
principal
Pureza por MCE-
SDS Reducida;
% de
cadena 99,6 NN NN 99,8 99,8 NA
ligera +
pesada
% de HMW 0,6 0,6 0,7 0,7 0,8 0,9
Pureza por SE- % de
99,1 98,9 99,1 98,7 98,7 98,6
UPLC nativo
% de LMW 0,3 0,5 0,2 0,5 0,5 0,5
53
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de ácida 18,6 18,5 18,2 18,6 19,3 18,8
Análisis de % de
variantes de carga 53,4 54,8 54,3 53,2 53,5 55,5
principal
por CEX-UPLC % de
27,9 26,8 27,5 25,3 25,6 24,3
básica
% de ácida 30,2 NN 30,2 32,9 NN NA
Análisis de % de
variantes de carga 55,9 NN 55,9 53,4 NN NA
principal
por iCIEF % de
13,9 NN 13,9 13,7 NN NA
básica
87 NN NN 141 NN NA
(bioensayo)
almacenado en condiciones aceleradas
Formulación mAb1 175 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-prolina al 1,5 %
(p/v), polisorbato 80 al 0,2 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Jeringa de vidrio Nuova Ompi EZ Fill de 2,25 ml con una aguja de pared
fina 27G 1/2 y un protector de aguja FM30 cerrado con un émbolo de goma
4023/50 recubierto con FluroTec®
Almacenamiento a 25 °C/HR
Almacenamiento a 40 °C (días)
del 60 % (meses)
Ensayo 0 1 3 6 7 14 28
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
405 nm)
pH 6,0 6,0 6,0 6,1 6,0 6,0 6,0
partículas
HIAC (n.º/ml)
Análisis de 2-10 µm 21326 NN 4605 NA NN NN 3717

partículas por
≥ 10 µm 82 NN 225 NA NN NN 51
MFI
(partículas/ml) ≥ 25 µm 3 NN 2 NA NN NN 8

100 98 98 100 100 100 98
RP-UPLC
No reducida; %
de pico 97,6 NN 97,7 96,5 NN NN 96,8
principal
Pureza por
MCE-SDS Reducida; %
de cadena 99,6 NN 99,2 99,7 NN NN 99,4
ligera + pesada
% de HMW 0,6 0,9 1,2 1,6 1,6 2,5 3,9

Pureza por SE-
% de nativo 99,1 98,6 98,5 97,7 97,8 96,9 95,5
UPLC
% de LMW 0,3 0,5 0,3 0,6 0,6 0,7 0,6
54
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
Análisis de % de ácida 18,6 19,0 21,3 25,5 20,0 22,1 24,3
variantes de
% de principal 53,4 54,3 52,0 46,5 51,8 49,8 48,9
carga por CEX-
UPLC % de básica 27,9 26,8 26,6 28,1 28,3 28,1 26,8
% de ácida 30,2 NN 36,8 44,9 NN NN 45,6
Análisis de
variantes de % de principal 55,9 NN 49,6 42,8 NN NN 40,5
carga por iCIEF
% de básica 13,9 NN 13,6 12,3 NN NN 13,9
87 NN NN 137 NN NN 83
bioensayo
- Efecto de las condiciones de estrés
Formulación mAb1 175 mg/ml, histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (p/v), L-
prolina al 1,5 % (p/v), polisorbato 80 al 0,2 % (p/v), pH 6,0

Recipiente/cierre Jeringa de vidrio Nuova Ompi EZ Fill de 2,25 ml con una aguja
de pared fina 27G 1/2 y un protector de aguja FM30 cerrado
con un émbolo de goma 4023/50 recubierto con FluroTec®
Agitación (min)
Ensayo 0 60 120
Color y aspecto Aprobado Aprobado Aprobado
Turbidez (aumento de la DO a 405 nm) 0,00 0,00 0,00
pH 6,0 6,0 6,0
Análisis de partículas ≥ 10 µm 3 NN 5
subvisibles por HIAC
(n.º/ml) ≥ 25 µm 1 NN 5
2 a 10 µm 21326 NN 13896
≥ 10 µm 82 NN 55
por MFI (partículas/ml)
≥ 25 µm 3 NN 3
% de proteína recuperada por RP-UPLC 100 100 100
No reducida; % de
97,6 NN 97,9
pico principal
cadena ligera + 99,6 NN 99,5
pesada
% de HMW 0,6 0,6 0,6
Pureza por SE-UPLC % de nativo 99,1 98,9 98,8
% de LMW 0,3 0,6 0,6
% de ácida 18,6 18,8 19,0
% de principal 53,4 53,2 53,5
carga por CEX-UPLC
% de básica 27,9 28,1 27,5
% de ácida 30,2 NN 30,4
% de principal 55,9 NN 55,5
carga por iCIEF
% de básica 13,9 NN 14,1
55
E18719338
ES 2 955 062 T3 08-09-2023
(continuación)
% de potencia relativa por bioensayo 87 NN 100
Ejemplo 17: Compatibilidad de formulaciones de mAb1 en dispositivos de suministro intravenoso (i.v.)
5 Para la evaluación de la compatibilidad, se añadió una formulación de mAb1 50 mg/ml a una bolsa i.v. de 100 ml, que
contenía una inyección de cloruro de sodio al 0,9 % o una inyección de dextrosa al 5 %, para evaluar si mAb1 es
estable cuando se suministra por vía intravenosa. Para hacer frente a la variabilidad del peso de los pacientes, en este
estudio se examinaron dos concentraciones de mezcla, mAb1 1,0 mg/ml y mAb1 25 mg/ml, para reflejar las
condiciones de dosificación baja y alta. Durante los estudios de compatibilidad se utilizaron los siguientes componentes
10 de mezcla i.v.:
• Especialidad farmacéutica
◦ EF de mAb1 50 mg/ml mAb1

15
• Diluyentes
◦ Inyección de cloruro de sodio al 0,9 %

◦ Inyección de dextrosa al 5 %
20
• Bolsas i.v.
◦ Bolsas i.v. hechas de cloruro de polivinilo (PVC) con di-(2-etilhexil)ftalato (DEHP) precargadas con una
inyección de cloruro de sodio al 0,9 %
25 ◦ Bolsas i.v. hechas de cloruro de polivinilo (PVC) con DEHP precargadas con una inyección de dextrosa al
5%
◦ Bolsas i.v. de poliolefina (PO) prellenadas con una inyección de cloruro de sodio al 0,9 %
◦ Bolsas i.v. de poliolefina (PO) prellenadas con una inyección de dextrosa al 5 %
◦ Bolsas i.v. de polipropileno precargadas con una inyección de cloruro de sodio al 0,9 %
30 ◦ Botellas i.v. de polipropileno precargadas con una inyección de cloruro de sodio al 0,9 %
• Bombas i.v.
◦ Bomba peristáltica
35 ◦ Bomba de desplazamiento de líquidos
• Equipo de infusión i.v.
◦ Equipo intravenoso de PVC con DEHP

40 ◦ Equipo intravenoso de PVC con tereftalato de dioctilo (DEHT)
◦ Equipo intravenoso de PVC con trimelitato de trioctilo (TOTM)
◦ Equipo intravenoso de PVC revestido de polietileno
◦ Equipo intravenoso de poliuretano
45 • Filtros
◦ Filtro en línea de polietersulfona de 0,2 µm

◦ Filtro en línea de polietersulfona de 1,2 µm
◦ Filtro en línea de polietersulfona de 5 µm
50 ◦ Filtro en línea de polietersulfona de 15 µm.
Las EF utilizadas en este estudio fueron fabricados según las BPF mediante un proceso de fabricación comercial
representativo de una EF. Las bolsas i.v. que contenían la mezcla se mantuvieron inicialmente durante 24 horas a
5 °C; luego, las bolsas se incubaron durante al menos 8 horas a 25 °C. Después de estas incubaciones, cada uno de
55 los equipos de infusión se conectó a la bolsa i.v., se cebó con la mezcla y se mantuvo durante 1 hora a temperatura
ambiente. A continuación, cada mezcla se bombeó a través de los equipos de infusión respectivos a velocidades de
25 ml/h y 500 ml/h.
Métodos utilizados para evaluar la compatibilidad de las mezclas: La compatibilidad de la mezcla de mAb1 con los
60 materiales utilizados en el dispositivo de suministro i.v. se evaluó utilizando los siguientes ensayos:
• Color y aspecto por inspección visual

• pH
• Turbidez medida por aumento de la densidad óptica (DO) a 405 nm
56
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• Análisis de partículas subvisibles en la mezcla por oscurecimiento de la luz (HIAC)

• Concentración de proteína de mAb1 mediante cromatografía líquida de ultrarrendimiento de fase inversa (RP-
UPLC)
• Pureza por SE-UPLC
5 • Análisis de variantes de carga por CEX-UPLC
• Potencia, por bioensayo: La potencia relativa de cada muestra se determina mediante el bioensayo y se define
como: (CI50 de la muestra de referencia/CI50 de la muestra)* 100 %. La potencia medida de las muestras de
estabilidad en el almacenamiento debe estar entre el 50-150 % de la potencia medida del patrón de referencia.
10 Resultados y conclusiones: La formulación de mAb1 50 mg/ml, diluida en inyección de cloruro de sodio al 0,9 % o
inyección de dextrosa al 5 % a concentraciones de 1,0 mg/ml o 25 mg/ml fue física y químicamente estable en todas
las condiciones probadas dentro de los intervalos de dosis y condiciones de administración propuestos. Estos datos
respaldan las siguientes conclusiones relacionadas con la preparación de dosis y la administración i.v. la EF de mAb1:
15 • Las bolsas i.v. de inyección de cloruro de sodio al 0,9% y de inyección de dextrosa al 5% fabricadas en PVC con
DEHP, PO y polipropileno son compatibles con la administración i.v. de mAb1.
• La EF de mAb1 se puede diluir a concentraciones tan bajas como 1,0 mg/ml en bolsas i.v. de PVC, PO o
polipropileno que contienen cloruro de sodio al 0,9 % o dextrosa al 5 % para administración i.v.
• La EF de mAb1 se puede diluir a concentraciones tan altas como 25,0 mg/ml en bolsas i.v. de PVC, PO o
20 polipropileno que contienen cloruro de sodio al 0,9 % o dextrosa al 5 % para administración i.v.
• La mezcla de mAb1 en cloruro de sodio al 0,9 % o dextrosa al 5 % se mantuvo estable después de la incubación
en una bolsa i.v. de PVC, PO o polipropileno durante periodos de hasta 24 horas a 5 °C y 8 horas a 25 °C. La EF
de mAb1 diluido se puede administrar dentro de las 6 horas posteriores a la preparación.
• El mAb1 diluido se puede administrar utilizando una bomba de infusión convencional.
25 • El mAb1 diluido puede administrarse con un equipo de infusión compuesto de PVC que contiene DEHP, PVC que
contiene TOTM, polietileno o poliuretano.
• mAb1 es compatible con el uso de un filtro de polietersulfona en línea de 0,2 µm - 5 µm.
• El mAb1 diluido se puede administrar a una velocidad que varía de 25 y 500 ml/hora.
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REIVINDICACIONES
1. Una formulación farmacéutica líquida estable que comprende:
5 (a) un anticuerpo que se une específicamente a muerte programada 1 (PD-1) humana, en donde el anticuerpo
comprende tres regiones determinantes de complementariedad (las CDR) de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y
HCDR3) contenidas en una región variable de cadena pesada (HCVR) y tres CDR de cadena ligera (LCDR1,
LCDR2 y LCDR3) contenidas en una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde HCDR1 comprende la
SEQ ID NO: 3, HCDR2 comprende la SEQ ID NO: 4, HCDR3 comprende la SEQ ID NO: 5, LCDR1 comprende la
10 SEQ ID NO: 6, LCDR2 comprende la SEQ ID NO: 7 y LCDR3 comprende la SEQ ID NO: 8;
(b) un tampón que comprende histidina;
(c) un disolvente orgánico que comprende polisorbato;
(d) sacarosa como estabilizante; y
(e) prolina como modificador de la viscosidad;
15
en donde la formulación farmacéutica líquida estable tiene un pH de 6,0 ± 0,3.
2. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la concentración de anticuerpo es:
20 (a) de desde 5 mg/ml ± 0,75 mg/ml a 250 mg/ml ± 37,5 mg/ml;

(b) de 25 mg/ml ± 3,75 mg/ml;
(c) de 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml;
(d) de 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml; o
(e) de 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml.
25
3. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en donde la concentración de tampón de histidina es de
desde 5 mM ± 1 mM a 20 mM ± 4 mM, opcionalmente en donde:
(a) la concentración de tampón de histidina es de 10 mM ± 2 mM; y/o

30 (b) el tampón de histidina se prepara a partir de L-histidina y monoclorhidrato de L-histidina monohidrato,
opcionalmente además en donde el tampón de histidina se prepara a partir de L-histidina 4,8 mM ± 0,96 mM y
monoclorhidrato de L-histidina 5,2 mM ± 1,04 mM.
4. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la concentración de polisorbato
35 es de desde el 0,01 % ± 0,005 % al 0,5 % ± 0,25 % p/v, opcionalmente en donde:
(a) la concentración de polisorbato es del 0,1 % ± 0,05 % p/v o el 0,2 % ± 0,1 % p/v; y/o
(b) el polisorbato es polisorbato 80.
40 5. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la concentración de sacarosa
es de desde el 1 % ± 0,2 % al 20 % ± 4 % p/v, opcionalmente en donde la concentración de sacarosa es de desde el
1 % ± 0,2 % al 10 % ± 2 % p/v, tal como del 5 % ± 1 % p/v.
6. La formulación farmacéutica de la reivindicación 5, en donde la concentración de sacarosa es del 5 % ± 1 % p/v y

45 la concentración de prolina es de desde el 1 % ± 0,2 % al 5 % ± 1 % p/v, tal como del 1,5 % ± 0,3 % p/v.
7. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, que comprende:
(a) anticuerpo 5 mg/ml ± 0,75 mg/ml a 250 mg/ml ± 37,5 mg/ml,

50 (b) tampón de histidina 10 mM ± 2 mM,
(c) polisorbato al 0,2 % ± 0,1 % p/v,
(d) sacarosa al 5 % ± 1 % p/v, y
(e) prolina al 1,5 % ± 0,3 % p/v; a pH 6,0 ± 0,3;
opcionalmente, en donde la concentración de anticuerpo es: (i) anticuerpo 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (ii) anticuerpo
55 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml; (iii) anticuerpo 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml; o (iv) anticuerpo 25 mg/ml ± 3,75 mg/ml.
(a) anticuerpo 5 mg/ml ± 0,75 mg/ml a 250 mg/ml ± 37,5 mg/ml,

60 (b) L-histidina 0,74 mg/ml,
(c) monoclorhidrato de L-histidina monohidrato 1,1 mg/ml,
(d) polisorbato 2 mg/ml,
(e) sacarosa 50 mg/ml y
(f) prolina 15 mg/ml; a pH 6,0 ± 0,3;
65 opcionalmente, en donde la concentración de anticuerpo es: (i) anticuerpo 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (ii) anticuerpo
150 mg/ml ± 22,5 mg/ml; (iii) anticuerpo 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml; o (iv) anticuerpo 25 mg/ml ± 3,75 mg/ml.
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9. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:
(a) al menos el 90 % del anticuerpo tiene una conformación nativa después de 28 días a 45 °C; y/o
5 (b) al menos el 35 % del anticuerpo es la variante de carga principal del anticuerpo después de 28 días a 45 °C;
y/o
(c) al menos el 94 % del anticuerpo tiene una conformación nativa después de tres meses a 25 °C; y/o
(d) al menos el 44 % del anticuerpo es la variante de carga principal del anticuerpo después de tres meses a 25 °C;
y/o
10 (e) al menos el 96 % del anticuerpo tiene una conformación nativa después de 12 meses a 5 °C; y/o
(f) al menos el 45 % del anticuerpo es la variante de carga principal del anticuerpo después de 12 meses a 5 °C;
y/o
(g) al menos el 96 % del anticuerpo tiene una conformación nativa después de 12 meses a - 20 °C, -30 °C y/o -
80 °C; y/o
15 (h) al menos el 40 % del anticuerpo es la variante de carga principal del anticuerpo después de 12 meses a -20 °C,
-30 °C y/o -80 °C.
10. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo comprende una
HCVR de la SEQ ID NO: 1 y una LCVR de la SEQ ID NO: 2.
20
11. La formulación farmacéutica de la reivindicación 10, en donde la concentración de anticuerpo es: (i) anticuerpo
175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (ii) anticuerpo 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml; (iii) anticuerpo 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml; o (iv) anticuerpo
25 mg/ml ± 3,75 mg/ml.
25 12. La formulación farmacéutica de la reivindicación 11, en donde:
(a) ≥ 90 % de los anticuerpos tienen un peso molecular de 143 kDa ± 1 kDa; y/o
(b) la formulación farmacéutica tiene una viscosidad de menos de 20 mPa-s a 25 °C, opcionalmente de menos de
15 mPas a 25 °C.
30
13. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el anticuerpo comprende
una cadena pesada y una cadena ligera, en donde:
(a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9;

35 (b) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11;
(c) la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10;
(d) el anticuerpo comprende una cadena pesada/cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos de las
SEQ ID NO: 9/10; o
(e) el anticuerpo comprende una cadena pesada/cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos de las
40 SEQ ID NO: 11/10.
14. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la formulación es adecuada
para administración subcutánea o intravenosa.
45 15. Una formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dicha composición está
contenida en un recipiente, opcionalmente en donde:
(a) el recipiente es un vial;

(b) el recipiente es un vial y el vial es un vial de vidrio transparente tipo 1 de 10 ml;
50 (c) el recipiente es una jeringa;
(d) el recipiente es una jeringa y la jeringa es de vidrio con bajo contenido de tungsteno;
(e) el recipiente es una jeringa precargada; o
(f) el recipiente es un autoinyector.
55 16. Un kit que comprende una formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, un recipiente
e instrucciones, opcionalmente en donde:
(a) el recipiente es un vial de vidrio;

(b) el recipiente es una jeringa precargada; o
60 (c) el recipiente es un autoinyector.
(a) anticuerpo 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml,

65 (b) L-histidina 0,74 mg/ml,
(c) monoclorhidrato de L-histidina monohidrato 1,1 mg/ml,
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(d) polisorbato 80 2 mg/ml,

(e) sacarosa 50 mg/ml y
(f) prolina 15 mg/ml;
5 en agua a pH 6,0 ± 0,3.
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19 OFICINA ESPAÑOLA DE

A61K 39/00 (2006.01)

A61K 47/18 (2007.01)

A61K 47/26 (2006.01)

C07K 16/28 (2006.01)

12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86 Fecha de presentación y número de la solicitud internacional: 23.03.2018 PCT/US2018/024032

54 Título: Formulación estable de anticuerpos

Formulación estable de anticuerpos

Breve sumario de la invención

55 En diversas realizaciones, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 5 ± 0,75 mg/ml a

20 El pH de la formulación líquida es de aproximadamente pH 6,0 ± 0,3.

En una realización, el modificador de la viscosidad es L-prolina. En determinadas realizaciones, el modificador de la

En determinadas realizaciones, la viscosidad de la formulación farmacéutica líquida a 25 °C es de menos o igual a

farmacéutica líquida es ≤ 20 cPoise. En determinadas realizaciones, la viscosidad de la formulación farmacéutica

Otras realizaciones serán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

En las publicaciones de solicitud de patente US20150203579 y WO2015112800 se exponen anticuerpos anti-PD-1

En determinadas realizaciones, la formulación farmacéutica de la invención comprende al menos un codisolvente

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención tienen un pH de 6.0 + 0.3.

55 ESTABILIDAD Y VISCOSIDAD DE LAS FORMULACIONES FARMACÉUTICAS

y L-prolina al 1,5 % (p/v) ± 0,3 %.

20 RECIPIENTES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN

USOS TERAPÉUTICOS DE LAS FORMULACIONES FARMACÉUTICAS

hemáticos y cánceres de endometrio.

Ejemplo 1: Desarrollo de una formulación de anticuerpo anti-PD-1

e incluyeron la selección de codisolventes orgánicos, de estabilizantes térmicos y de tampones en formulaciones

◦ La osmolalidad de la formulación de 50 mg/ml es de aproximadamente 318 mOsm/kg;

Ejemplo 2: Formulaciones ilustrativas

60 Las formulaciones ilustrativas incluyen:

p/v, a pH 6,0 ± 0,3.

Ejemplo 3: Métodos utilizados para evaluar la estabilidad de la formulación

• Color y aspecto por inspección visual

Ejemplo 4: Efecto de distintos tampones y pH

Formulación mAb1 5 mg/ml, tampón 10 mM

Ejemplo 5: Selección del pH en tampones de histidina

pH 5.8/ninguno Desaprobado 0,40 95 46,2 -46,4 0,3 6,4 -10,2 3,9

Ejemplo 7: Selección de protectores frente a la sobrecarga térmica

Formulación mAb1 5 mg/ml, histidina 10 mM, pH 6,0

recuperada por RP-

Ejemplo 8: Optimización de los estabilizantes

procedimiento de fabricación actual.

Variantes cargadas por

El efecto de la L-prolina en la estabilización de mAb1 se examinó con la formulación de 50 mg/ml. Después de la

Formulación mAb1 50 mg/ml, L-histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, pH 6,0, polisorbato 80 al 0,2 %

recuperada por RP-

Tabla 7: Efecto de los estabilizantes sobre la estabilidad de mAb1 después de la incubación a 25 °C y 40 °C

Volumen de llenado 0,5 ml

pH Cambio de pureza por SE- Cambio de variantes de

UPLC carga por CEX-UPLCa

Incubación 40 °C durante 28 días

recuperada por RP-

Después de la incubación a 40 °C durante 28 días, la sacarosa al 9 % proporcionó la mejor estabilización y tuvo la

20 Ejemplo 9: Selección de modificadores de viscosidad

Ejemplo 10: Optimización de la concentración de polisorbato (PS)

Formulación [PS 80] pH recuperado

0,00 Desaprobado 0,38 6,0 No aplicable

0,20 Aprobado 0,00 6,1 98 0,0

Conc. Cambio en la pureza por de carga por CEX-

recuperada por RP-