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Procedimiento de Microbiología Clínica
Recomendaciones de la Sociedad Española de

Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica
1. FAGOTERAPIA, manejo
en el laboratorio
Editores Coordinador Autores
Miriam J. Álvarez-Martínez Mª del Mar Tomás Lucía Blasco

Patricia Ruiz Garbajosa Meritxell De Jesús García-Quintanilla
Jaime Esteban
José Ramon Paño
Jesús Oteo-Iglesias
María Del Mar Tomás
ISBN: 978-84-09-59439-9
EDITORES:
Miriam J. Álvarez-Martínez. Servicio de Microbiología, Hospital Clínic de Barcelona. Departamento de Funda-
mentos Clínicos, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Barcelona. Patricia Ruiz Garbajo-
sa, Jefa de Sección. Servicio de Microbiología Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid
SUGERENCIA DE CITACIÓN:
Tomás M., Blasco L., De Jesús M., Esteban J., Paño J. R.,Oteo-Iglesias J., V. 2023. 1. FAGOTERAPIA, manejo
en el laboratorio. Tomás M. (coordinadora). Procedimientos en Microbiología Clínica. Álvarez Martínez M.J, Ruiz
Carbajosa P. (editores). Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Micro-biología Clínica (SEIMC). 2023.
AVISO:
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macenados, trasmitidos, distribuidos, comunicados públicamente o transformados mediante ningún medio o sistema
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debe referenciarse incluyendo “Este documento ha sido elaborado por la SEIMC (Sociedad Española de Enferme-
dades Infecciosas y Microbiología Clínica) y su contenido puede encontrase en la página web www.seimc.org”
Procedimientos en Microbiología Clínica
Recomendaciones de la Sociedad Española de

Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica
Editores:
Miriam J. Álvarez-Martínez
Patricia Ruiz Garbajosa
1 . FAGOTERAPIA, manejo en el
laboratorio.2023
Coordinadora:
María Del Mar Tomás1,2,7
Autores:
Lucía Blasco1,2,
Meritxell De Jesús García-Quintanilla3,7,
Jaime Esteban3,6,7,
José Ramon Paño4,6,7*
Jesús Oteo-Iglesias2,5,6,7*
María Del Mar Tomás1,2,7 *
* Comparten última autoría
1
.Grupo de Microbiología Traslacional y Multidisciplinar (MicroTM)-Instituto de Investigación Biomédica de A Co-
ruña (INIBIC), Departamento de Microbiología-Hospital de A Coruña (CHUAC); Universidad de A Coruña (UDC),
A Coruña, España.
². Grupo de Estudio sobre Mecanismos de Acción y Resistencia a los Antimicrobianos (GEMARA) en representa-
ción de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC).
3
. Departamento de Microbiología Clínica-Instituto de Investigación Sanitaria Fundación Jiménez Díaz, Madrid,
España.
4
. Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa”. Instituto de Investigación Sanitaria Aragón. Zaragoza, España.
5
. Laboratorio de Referencia e Investigación de Resistencias Antibióticas e Infecciones Sanitarias, Centro Nacio-
nal de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.
6
.CIBER de Enfermedades Infecciosas (CIBERINFEC), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España.
7
. MePRAM, Proyecto de Medicina de Precisión contra las resistencias Antimicrobianas.
DOCUMENTO CIENTÍFICO
INDICE DE CONTENIDOS
1. Introducción...................................................................................................................................5
2. Consideraciones clínicas...............................................................................................................5
3. Recogida de Muestras. Fagos líticos ambientales....................................................................7
4. Transporte y conservación de los Fagos....................................,..................................................7
5. Caracterización de la actividad infectiva........................................................................................7
6. Caracterización genotípica..............................................................................................................9
7. Adaptación al huésped y desarrollo de cócteles............................................................................

.....................9
8. Sinergia con los antibióticos ...........................................................................................................10
9. Purificación y concentración...........................................................................................................10
10. Estudios preclínicos....................................................................................................................11
11. Bibliografía.................................................................................................................................11
DOCUMENTOS TÉCNICOS
8.
INDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS
PNT-FT-01. FAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio OBTENCIÓN DE FAGOS. AGUAS RESIDUALES

Y OTROS AMBIENTES
PNT-FT-02.FAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio AISLADOS AMBIENTALES y BANCOS de FA-

GOS
ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO

1.
4
1. INTRODUCCIÓN
Los bacteriófagos (también denominados fagos), son virus que infectan y se replican dentro de las bacte-
rias de forma específica. Son los microorganismos más abundantes y diversos del planeta, superando 10
veces en número a las bacterias ya que se estima un número total de más de 1030. Los fagos representan
una de las fuentes de depredación más habituales que actúan sobre las comunidades bacterianas (1).
Los dos sistemas de replicación de los virus más conocidos son el ciclo lítico y el ciclo lisogénico. Los fa-
gos que siguen un ciclo de vida lítico infectan y lisan rápidamente a la célula huésped, lo que los hace más
fiables para su uso en terapia fágica, ya que el resultado final es la erradicación de las células bacteria-
nas. Por el contrario, los fagos lisogénicos se integran en el genoma de su huésped bacteriano, llegando
a modificar su fenotipo mediante la expresión de genes virales, proceso que se conoce como conversión
lisogénica (2).
2.CONSIDERACIONES CLÍNICAS
Los bacteriófagos como terapia se han utilizado desde principios del siglo pasado, tanto en humanos como
en animales. Aunque su uso en humanos se abandonó en los países occidentales a favor de las terapias
con antibióticos, la terapia con fagos continuó practicándose en Europa del Este (3). En unos 62 países
(por ejemplo, Georgia), el uso de la terapia con fagos en humanos nunca se ha detenido y aún se aplica,
principalmente contra bacterias patógenas resistentes a los antimicrobianos (AMR). Dentro de la medicina
veterinaria, se ha utilizado la terapia con fagos en pollos, bovinos y cerdos (4) y se definen como nuevas
terapias (NT) en veterinaria por el Reglamento (UE) 2019/6 (5).
Actualmente, los bacteriófagos están reapareciendo en el arsenal terapéutico como una posible alternati-
va a la terapia con antibióticos (o para complementar esta última) como terapia de rescate en un callejón
sin salida terapéutico, debido a la creciente resistencia a los antibióticos. Algunos estudios muestran
sinergias entre fagos y antibióticos, a menudo caracterizadas por una menor aparición de resistencia a
antibióticos y/o fagos en bacterias (6).
La base de evidencia para el uso de los fagos como antimicrobiano es sólida en lo que respecta a segu-
ridad, suponiendo una preparación adecuada del material terapéutico, pero es débil en relación con la
eficacia en humanos, así como la farmacodinamia (PK/PD, dosis, vías de administración, etc....) (7), por lo
que todavía faltan ensayos clínicos.
Las ventajas del uso de los fagos como terapia son: i) especificidad (limitando así daños colaterales a la
microbiota humana); ii) capacidad de adaptación in vivo a la bacteria; iii) potencial de individualización de
la dosificación (es decir, replicación continua hasta que la bacteria objetivo son erradicados); iv) capacidad
para ser utilizados como sistemas de entrega (portadores de antibióticos, péptidos pequeños y similares);
v) acción sinérgica con los antibióticos; vi) y la posibilidad de tener actividad continua frente a las bacterias.
Sin embargo, entre las debilidades del uso de fagoterapia destacan: i) necesidad de disponer de una
gran colección de fagos; ii) laboratorios acreditados para la producción a gran escala; iii) adaptación (o
resistencia) bacteriana a la terapia fágica siendo necesario la monitorización de los genomas bacterianos
mediante técnicas de secuenciación, iv) incertidumbre con respecto a sus aplicaciones de mejor uso (tipo
de infecciones, vía de administración, combinación con antimicrobianos); v) y en último lugar, insuficien-
tes marcos normativos para su aplicación en el ámbito sanitario. Estos tres últimos aspectos, deben ser
gestionados eficazmente para la implementación de dicha terapia frente a bacterias responsables de la
infección.
En relación con las vías regulatorias no resueltas, se está trabajando en diferentes países como España,
5
Australia, UK y Bélgica entre otros, en un intento de proporcionar información para su uso clínico. Los
medicamentos de uso clínico deben seguir las prácticas correctas de fabricación (en inglés, GMP, Good
Manufacturing Practices) definidas como la garantía de calidad que asegura que dichos medicamentos
son elaborados y controlados de acuerdo con las normas de calidad apropiadas para el uso al que están
destinados siendo certificables. Todos los medicamentos, independientemente de la vía de autorización,
deben estar elaborados con los principios de GMP aplicables al producto.
En la actualidad, existe la oportunidad de establecer integración de la ciencia y la medicina al servicio

de la salud pública y en una amplia gama de otras áreas en las que las bacterias tienen el potencial de
causar problemas (por ejemplo, agricultura, acuicultura, producción de alimentos, contaminación biológica
industrial y biocontaminación).
Microbiólogos clínicos e infectólogos australianos detallan en una publicación reciente las inquietudes,
expectativas y prioridades de los profesionales sanitarios en relación con la fagoterapia y su avance en la
medicina moderna (8). Se detalla una mayor facilidad de uso de fagos a través de la terapia personalizada
mediante la vía de “Uso compasivo”, destacando los patógenos gramnegativos como principal objetivo
de tratamiento de la infección. Además, se considera clave el establecimiento de procedimientos de labo-
ratorios acreditados para la administración de la fagoterapia, así como la monitorización de la terapia de
fagos. En relación con las infecciones de mayor interés para la aplicación de la fagoterapia destacan las
relacionadas con la fibrosis quística y las infecciones de los pacientes trasplantados e inmunodeprimidos.
La principal barrera para la aplicación de la fagoterapia es la dificultad de accesibilidad y logística para la
obtención y administración de fago.
Finalmente, destacar el importante papel de la innovación en la terapia fágica permitiendo la disminución

de desarrollo de mecanismos de resistencia a la infección por fagos, así como un mayor rango de infec-
ción de cepa huésped , a través de fagos sintéticos desarrollados por ingeniería (9) o modificados genéti-
camente (10), así como la purificación de proteínas derivadas de los fagos como lisinas y depolimerasas,
las cuales podrían ser administradas en combinación con antimicrobianos (11).
En el momento actual la AEMPS considera que los fagos en terapéutica humana deben ser considerados
un medicamento, a pesar de todas sus particularidades.
Como tal, para su utilización en terapia humana los productos basados en fagos deben cumplir con las nor-
mas de correcta fabricación aplicables al producto https://www.aemps.gob.es/industria-farmaceutica/%20
guia-de-normas-de-correcta-fabricacion/?lang=gl , hacer un desarrollo preclínico, y ensayos clínicos. En
estos momentos, el proyecto MePRAM (“La Medicina de Precisión contra la Resistencia a Antimicrobia-
nos”, desarrollado en el contexto del “Protocolo de actuación conjunta CIBER-SEIMC) está trabajando en
la puesta en marcha de un ensayo clínico aleatorizado de descolonización intestinal mediante fagoterapia
en portadores intestinales de K. pneumoniae productoras de carbapenemasas.
No obstante, la AEMPS reconoce el papel que puede tener la fagoterapia en casos especiales en los que
no existan otras opciones terapéuticas, siempre y cuando la producción del fago o combinación de fagos
cumplan con los requisitos de calidad establecidos para su administración en humanos. La utilización de
fagoterapia para estos pacientes deberá ser solicitada de forma individualizada, aportando información
clínica del paciente, así como de la elaboración del fago o combinación de fagos.
Las solicitudes serán tramitadas a través de los Servicios de Farmacia Hospitalaria donde se trate al pa-
ciente y debe contactarse previamente con: medicamentosespeciales@aemps.es
6
3. RECOGIDA DE MUESTRAS. FAGOS LÍTICOS AMBIENTALES

Los fagos se pueden encontrar en cualquier ambiente, siendo el agua su hábitat habitual. Elevadas concen-
traciones de fagos pueden localizarse en agua dulce, agua de mar y en plantas de tratamientos de residuos.
Con menor frecuencia pueden encontrarse fagos en suelos o en material inanimado. Otra fuente de origen
de fagos, son los seres humanos, tanto sanos como infectados. Muestras de saliva, piel y heces han mostra-
do alta concentración de fagos. Finalmente, cabe destacar que en ambientes más hostiles se han detectado
fagos con un amplio espectro de acción frente a diversas especies bacterianas.
4. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LOS FAGOS

La muestra recogida se podrá transportar a temperatura ambiente, será conservada a 4ºC en el laboratorio
y usada como máximo hasta de una semana después de la recogida. Los fagos requieren que se tengan
en cuenta las condiciones en las que son estables, ya que al ser básicamente estructuras proteicas son
susceptibles a diversos factores que pueden alterar su estabilidad. Todo ello puede generar una reducción
del título de fagos durante el almacenaje o durante la producción. Los factores que pueden afectar negati-
vamente a la estabilidad de los fagos son las proteasas, los cambios de temperatura, los cambios en el pH
y fuerza iónica (12, 13). Estas medidas se deben establecer individualmente para cada fago o para cada
cóctel de fagos como consecuencia de la naturaleza de cada uno de ellos.
5. CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD INFECTIVA

Una vez aislados los fagos a partir de muestras ambientales es necesario establecer su valor como agentes
antimicrobianos, lo que condicionará su uso como terapia fágica. Para ello es necesario enfrentarlos en
primer lugar a las bacterias de interés y así establecer su capacidad infectiva.
El análisis de la capacidad infectiva frente a una cepa bacteriana se realiza en primer lugar mediante la téc-
nica del “spot test” (14, 15), que consiste en la preparación de placas de doble agar con la bacteria embebi-
da en la capa superior, el depósito de gotas con una solución con fagos sobre esta capa y la observación de
presencia de lisis tras un período de incubación. Se considerará que un fago es potencialmente útil frente
a una cepa bacteriana concreta cuando sea capaz de producir un punto de lisis transparente, sin ningún
tipo de turbidez que indique la aparición de resistencia. Es necesario también descartar el efecto de “lysis
from without” que consiste en la observación de puntos de lisis derivados de la actividad de las endolisinas
acumuladas en las soluciones de fagos (15).
Mediante la técnica de “spot test” también es posible establecer el rango de huésped o “host range”. Este
método consiste en enfrentar el fago con una colección de cepas de interés y hacer una valoración inicial
de su capacidad infectiva. Una vez seleccionado las cepas sobre las que tiene una mayor capacidad de
infección es necesario establecer la eficiencia de plaqueo o EOP. Esta técnica permite establecer la capa-
cidad de propagación de un fago en una cepa, comparando la capacidad de infección de un fago en una
cepa determinada frente a la capacidad de infección del mismo fago sobre su cepa huésped diana. Valores
iguales o mayores de 0,5 indican que tiene una buena capacidad para infectar a esa cepa, ya que es igual
o superior a la que presenta sobre la cepa huésped diana. De este modo, el fago se seleccionará para
continuar con la caracterización si tiene un valor de EOP igual o mayor a 0,5 en la cepa que nos interesa.
La capacidad de infección de los fagos se ve afectada por diversos factores entre los que se encuentran
las características de fago, el “fitness” de las bacterias y las propiedades del entorno en que ocurre la infec-
ción, como es la presencia de iones divalentes en forma de las sales CaCl2 o MgCl2. La determinación de la
capacidad infectiva del fago se debe confirmar mediante ensayos de infección en medio líquido, entre ellos
7
están la curva de adsorción, la “one step growth curve” y la curva de infección o de muerte que se realiza
con distintas titulaciones de fago/bacteria (16).
El primer paso en la infección es la absorción del fago a la superficie celular que ocurre en tres fases: la
fase de contacto en que los fagos interaccionan con la superficie bacteriana; la fase de unión reversible a
los receptores de la superficie celular y la que determina la eficacia de la infección, que es la fase de unión
irreversible a los receptores presentes en la superficie celular (17).
La curva de adsorción se realiza con el objetivo de seleccionar aquellos fagos que se unan en gran número
y en el menor tiempo posible a la bacteria. Para garantizar una buena eficiencia de la infección es recomen-
dable que al menos un 90% de los fagos se adhieran a la bacteria (17).
La “one step growth curve” permite establecer la duración de cada una de las fases de la infección y el
número de partículas virales generadas por cada célula infectada también conocida como “burst size”. La
infección por fagos tiene tres fases posteriores a la adsorción: i) fase de eclipse, período en el que no hay
viriones completamente formados y que se corresponde con la fase inicial del período de latencia; ii) fase
de latencia, en este período existen viriones completos en el citoplasma pero no todavía no han lisado las
células; iii) fase de crecimiento o lisis, se corresponde con el período en que los fagos formados dentro de
cada célula lisan esta bacteria y son liberados al medio para infectar nuevas bacterias (18).
La obtención de esta curva requiere que inicialmente el cultivo bacteriano se encuentre en fase logarítmica
y que esté en las mejores condiciones fisiológicas para que se produzca la replicación del fago. Un punto
crítico en esta técnica es la sincronización de la infección, es decir, que todos los fagos comiencen la infec-
ción al mismo tiempo. Para ello existen distintas estrategias, como ralentizar la infección justo después de
la adsorción del fago, mediante la dilución del cultivo para poner fin a la adsorción del fago o la detención
del metabolismo bacteriano durante la adsorción del fago. Cuando se realiza esta curva se asume que un
único fago infecta una única célula, para garantizar que esto sea así, se deben emplear multiplicidades de
la infección (MOI) lo más próximas a 1 (idealmente 0,1 o 0,001) que sea posible, de forma que la mayoría
de las células sean infectadas por un único fago, ya que en caso de emplear MOIs iguales o mayores a uno,
aumentaría la posibilidad de que más de un fago infectase una única célula (18).
Un fago ideal para fagoterapia debe ser capaz de propagarse y aumentar su número superando al de la
bacteria en el lugar de la infección (19). La velocidad de propagación de los fagos está relacionada con su
virulencia, los fagos empleados en terapia deben ser muy virulentos, de forma que un fago con un elevado
“burst size”, lo que se traduce en una elevada producción de fagos en cada ciclo de replicación, garantiza
que un gran número de partículas virales alcancen a las bacterias responsables de la infección sin darles
tiempo a dividirse, reduciendo de este modo la capacidad de la bacteria de generar resistencia a los fagos
(15).
Una vez conocidas estas características es necesario establecer in vitro la capacidad de infección de los
fagos en medio líquido, analizando la curva de lisis del cultivo a diferentes MOI del fago. Esto da una idea
de la cantidad de fago que habría que utilizar in vivo, además de la capacidad de la bacteria para generar
resistencia frente al fago.
En la actualidad, se está desarrollando la automatización o semiautomatización de los estudios de la capa-

cidad de infección de los fagos en medio líquido (20). Entre ellos destacan:
i) GKA (growth kinetics assays) usando PMA-qPCR. Dicha técnica se basa en el recuento de células bac-
terianas supervivientes a la exposición a fagos en un cultivo líquido utilizando monoazida de propidio y
mediante la detección de bacterias muertas a través de la amplificación por qPCR utilizando cebadores
específicos bacterianos (21).
8
ii) GKA (growth kinetics assays) usando citometría de flujo. Se desarrolla la enumeración y evaluación del
estado de viabilidad (células vivas, dañadas y muertas) de bacterias células expuestas a fagos en un cultivo
líquido, basado en dispersión de luz y fluorescencia usando tintes vivos/muertos (22).
iii) La medición en tiempo real de la densidad óptica de un cultivo bacteriano líquido ante la presencia de
fagos en una placa de 96 pocillos usando un sistema automatizado de lectura de la densidad óptica a lo
largo del tiempo en un ambiente de incubación aireado (23)
6. CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Una vez seleccionado el fago por su capacidad infectiva es necesario analizar su genoma a fin de detectar
la presencia de genes que los puedan invalidar para su uso en terapia, pero también la de otros genes que
los puedan favorecer como candidatos para la terapia fágica.
Los factores principales que se deben evaluar para considerar a un fago seguro para terapia son: que tenga
actividad antibacteriana, el estilo de vida (lítico o lisogénico) y que no posea genes deletéreos. El primero
de los factores solo se puede determinar de manera experimental, pero los otros dos se pueden establecer
mediante el análisis genómico del fago (24).
El ciclo de vida de los fagos se confirma mediante análisis del genoma en función de la presencia de genes
relacionados con la lisogenia, como son las integrasas, recombinasas, CI, CII y Cro; existen herramientas
bioinformáticas que permiten hacer este análisis como por ejemplo el Phage Classification Tool Set (PHA-
CTS) (25). En caso de detectar cualquier gen que relacione el fago de estudio con el ciclo lisogénico, el
fago debe ser descartado como candidato para terapia. Los fagos también serán descartados en el caso de
que se identifique cualquier gen relacionado con resistencia a antibióticos, factores de virulencia, toxinas o
elementos transductores (24).
El proceso para obtener el genoma de los fagos que se emplearán en terapia fágica incluye: i) obtener una
secuencia de genoma completo de alta calidad; ii) identificar los Open Reading Frames (ORF); iii) anotar
los genes cuyas funciones se hayan identificado con herramientas bioinformáticas; iv) búsqueda de marca-
dores genéticos deletéreos; v) verificar que la secuencia es representativa de la población y vi) confirmar la
ausencia de contaminaciones.
7. ADAPTACIÓN AL HUÉSPED Y DESARROLLO DE CÓCTELES

Generalmente, los fagos se caracterizan por su especificidad frente al huésped, por lo que una de las estra-
tegias para alcanzar un amplio rango de huésped es la combinación de distintos fagos en forma de “cócteles
de fagos”. Idealmente, un cóctel de fagos tiene que ser capaz de eliminar al menos el 70-80% de las cepas
clínicas diana. El uso de cócteles de fagos también reduce el desarrollo de resistencias bacterianas frente
a las infecciones por fagos.
Existen una serie de características deseables en los fagos para su inclusión en un cóctel, como que ten-
gan un efecto inmunomodulador en el paciente o que el desarrollo de la resistencia bacteriana que puedan
generar sea a costa de el “fitness” de la bacteria, de forma que se traduzca por ejemplo en la reducción de
la virulencia (19).
Los cócteles de fagos no deben ser mezclas aleatorias de fagos, ya que cada fago puede interferir con la
capacidad de infección del resto de los componentes del cóctel. Esta interferencia puede ser tanto sinérgica
como antagónica, por ello los efectos de las distintas combinaciones deben ser analizadas sobre las cepas
por el método Appelmans (20). Si un fago candidato demuestra una mayor eficiencia colectivamente que
individualmente, la interferencia positiva con los fagos del cóctel está garantizada (19).
9
Como consecuencia de la estructura poblacional de las bacterias, que puede ser clonal (o epidémica) y
panmíctica, el rango de actividad de los fagos depende mayoritariamente de la especie bacteriana. Así, para
analizar la actividad de los cócteles de fagos se debería disponer de una colección de aproximadamente
unas 50 cepas clínicas circulantes de la especie bacteriana a estudio (19).
Las bacterias tienen una alta capacidad de generar resistencia frente a los fagos. Una forma de vencer esta
resistencia es el uso de cócteles de fagos, ya que, aunque se genere resistencia frente a un fago del cóctel
la bacteria continúe siendo sensible al resto de fagos que constituyen el cóctel. Además de esto, otra forma
de superar la resistencia bacteriana frente a los fagos, consiste en la adaptación de los fagos a la bacteria,
ya que ambos microorganismos evolucionan conjuntamente en una “carrera armamentística”. El aprovecha-
miento de esta coevolución para la terapia fágica se conoce como adaptación de los fagos o entrenamiento
de fagos (26, 27). En la actualidad, se han descrito un importante número de mecanismos de adaptación o
resistencia de la bacteria al fago (28).
Mediante el proceso de adaptación, siguiendo el método Appelmans, los fagos se propagan en contacto con
la bacteria sobre la cual se desee incrementar la actividad infectiva, de forma que cada día se recupera el
fago y se vuelve a infectar la bacteria que se denomina ancestral. De esta forma se consigue que el fago
evolucione y consiga vencer la resistencia de la bacteria (29).
Los fagos se pueden adaptar de manera individual y luego ser combinados para la creación de un cóctel o
bien adaptar todo el cóctel de manera conjunta. El objetivo de la creación de un cóctel es que la capacidad
infectiva del cóctel sea mayor que la de los fagos que lo conforman si actuasen de manera independiente,
también se pretende con el uso de los cócteles reducir la capacidad de la bacteria para generar resistencia.
8. SINERGIA CON LOS ANTIBIÓTICOS

Múltiples trabajos han analizado la actividad sinérgica de los fagos con los antibióticos (30) mostrando varias
importantes conclusiones: i) Diferentes interacciones entre el fago y el antibiótico son fuertemente afectados
por la clase de antibióticos; ii) Los fagos generalmente reducen la concentración mínima inhibitoria (MIC) del
antibiótico; iii) La combinación de fagos y los antibióticos modulan la adaptación (resistencia) bacteriana; iv)
La resistencia bacteriana hacia los antibióticos impacta en la terapia de combinación; v) Factores del paciente
tales como el tipo de muestra, afecta a estos tipos de interacciones; y finalmente vi) Fagos similares pueden
producir resultados dramáticamente diferentes. Por todo ello, es necesario analizar la combinación de cada
cóctel de fagos con un antibiótico o un fago combinado con múltiples antibióticos. Además, determinar la efi-
cacia de un cóctel de fagos combinado con antibióticos en sistemas huésped complejos (pacientes), el efecto
de tratamiento simultáneo versus secuencial para reducir las interacciones antagónicas, y los mecanismos
reales que producen cada efecto sinérgico y antagónico en combinación (31).
9. PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN
Los procesos por los cuales se obtienen los fagos que posteriormente se aplicarán en terapia conllevan la
lisis de cultivos bacterianos, lo que supone la presencia de restos bacterianos en el medio. Entre otros com-
ponentes hay endotoxinas (lipopolisacáridos), peptidoglicano, exotoxinas, flagelos y ácidos nucleicos. Antes
de administrar los preparados de fagos es necesario que estos compuestos se hayan eliminado para evitar
reacciones adversas como inflamación, sepsis y shock séptico.
Hasta la fecha, las endotoxinas son las principales sustancias con posibles efectos deletéreos que deben ser
´
eliminadas mediante técnicas de purificación antes de su uso, evitando una dilución excesiva del preparado.
La técnica más utilizada es la cromatografía seguida de un proceso de concentración mediante ultrafiltración
para obtener concentraciones de fagos elevadas en volúmenes bajos (32).
10
La purificación y concentración de fagos es necesaria tanto para la aplicación en humanos como para su uso
en modelos animales.
10. ESTUDIOS PRECLÍNICOS

Previamente a la aplicación de lo preparados de fagos en humanos es recomendable hacer estudios pre-
clínicos para confirmar su eficacia y ausencia de toxicidad.
Estos estudios incluyen ensayos con fagos en cultivos celulares y estudios en modelos animales, que
pueden ser desde estudios en insectos, como la larva de la polilla de la miel, Galleria mellonella, hasta
estudios en modelos murinos.
Los estudios en células humanas se realizan para determinar si los medicamentos u otros productos tie-
nen efectos sobre la proliferación celular o si provocan citotoxicidad. En el caso de los estudios de fagos
en cultivos de células humanas se deben desarrollar para confirmar la ausencia de toxicidad de los prepa-
rados de fagos midiendo la viabilidad de las células (32, 33).
Los estudios in vivo se pueden realizar con insectos como G. mellonella, que permiten establecer si la
administración de preparados de fagos tiene un efecto tóxico en las larvas mediante estudios de supervi-
vencia de las larvas de estas polillas. Estos insectos presentan varias características que los hacen ade-
cuados como modelos de estudio de infecciones y tratamientos, ya que tienen un ciclo de vida corto, son
muy manejables, se incuban a 37ºC, se pueden aplicar dosis precisas y los costes de mantenimiento son
bajos. Además, tienen respuesta inmune innata celular y humoral (34,35).
En relación con los estudios animales, especialmente ratones, son múltiples los trabajos que se han lle-
vado a cabo confirmando la ausencia de toxicidad en el tratamiento de infecciones a través de fagos en
múltiples localizaciones (36) .
11. BIBLIOGRAFÍA
1. Elois MA, Silva RD, Pilati GVT, Rodríguez-Lázaro D, Fongaro G. Bacteriophages as Biotechnological Tools. Viruses.
2023;15(2).
2. Gordillo Altamirano FL, Barr JJ. Phage Therapy in the Postantibiotic Era. Clin Microbiol Rev. 2019;32(2).
3. Chanishvili N. Bacteriophages as Therapeutic and Prophylactic Means: Summary of the Soviet and Post Soviet
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16. Glonti T, Pirnay JP. In Vitro Techniques and Measurements of Phage Characteristics That Are Important for Phage
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17. Thanki AM, Taylor-Joyce G, Dowah A, Nale JY, Malik D, Clokie MRJ. Unravelling the Links between Phage Adsorp-
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-01
Servicio / Unidad de Microbiología FAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio
OBTENCIÓN DE FAGOS. AGUAS RESIDUALES Y
Hospital............................................ Edición Nº 01 Página 1 de 4
OTROS AMBIENTES
PNT-FT-01
FAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio
OBTENCIÓN DE FAGOS. AGUAS RESIDUALES Y OTROS
AMBIENTES
ELABORADO REVISADO Y APROBADO
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La información en él contenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Re-
sponsable de su elaboración. Las copias no registradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-01
Hospital............................................ OTROS AMBIENTES Edición Nº 02 Página 2 de 4
1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El propósito de este documento es la obtención de fagos líticos.
2. FUNDAMENTO
Los fagos líticos se pueden encontrar en múltiples ambientes, tanto en muestras clínicas, naturaleza y
aguas residuales.
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
Gutiérrez, D., Rodríguez, A., Fernández, L., García, P. (2020). Los bacteriófagos: Los virus que combaten
infecciones. España: Los Libros de La Catarata.
4. MUESTRAS
4.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
La muestra idealmente debe ser recogida en el medio natural donde se encuentra el patógeno de interés.
Esta muestra podría recogerse de aguas residuales, desagües, materia fecal o tipo ambiental como ríos,
tierra, esquejes de plantas, etc. El éxito en el aislamiento del fago depende en gran parte del conocimiento
de la ecología de la bacteria hospedadora del bacteriófago. Dependiendo del caso, la muestra será líquida,
siendo suficiente con tomar 50 ml de muestra, o sólida recogida en torundas o directamente en tubos para
diluir el contenido posteriormente. Si es posible, se recomienda utilizar recipientes estándar estériles de
laboratorio. Ya en el laboratorio, si el recipiente usado para la recogida no es estándar, sería conveniente
transferir el contenido recogido a recipientes estériles utilizados en el laboratorio para mayor facilidad de
manejo y etiquetado, así como para ocupar menos espacio
4.2. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN
La muestra recogida se podrá transportar a temperatura ambiente, será conservada a 4ºC en el laboratorio
y usada como máximo hasta de una semana después de la recogida. Lo más recomendable es que se
lleven cuanto antes al laboratorio para su procesamiento inmediato, por ejemplo, antes de 4 horas. Si no
es posible, las muestras deberán ser guardadas a 4ºC hasta el día siguiente que se lleven al laboratorio..
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS
-Agua estéril
-Tubos estériles cónicos (15 ml; Fisher Scientific, cat. no. 11317211)
-Tubos Microcentrífuga (1.7 ml; Sorenson, cat. no. 11500)
-Tubos Microcentrífuga (2.0 ml; Sorenson, cat. no. 12030)
-Tubos centrífuga cónicos (15 and 50 ml; VWR, cat. no. 430790 and 430828)
-MgSO4, Sulfato de Magnesio (Fisher Scientific, cat. no. 10 625871)
-CaCl2, Cloruro de Calcio (Fisher Scientific, cat. no.12664987)
-Agarosa (Ecogen, cat. no. BIO-41026)
-Placas de Petri (10 cm; Fisher Scientific, cat. no. 08-757-100D)
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-01
-LB, Luria Bertani

-Banco de cepas huésped dianas
-Buffer SM (Tris-HCl, 50 mM; NaCl, 0.1 M; MgSO4·7H2O, 8 mM)
6. APARATOS Y MATERIAL
- Micropipetas (Fisher Scientific, cat. no. 10236072)

- Puntas de micropipeta de con filtro (Fisher Scientific, cat. no.15743479)
- Gradillas para tubos sarstedt o similares (Starsted cat. no. 95.64.251)
- Agitador tipo vortex (Fisher Scientific, cat. no. 10287462)
- Tubos de reacción de 1,5 ml de “calidad molecular” (tipo sarstedt) (Starsted cat. no. 72.690.001)
- Contenedores de residuos (Praxisdients cat. no. 314115)
- Placas de Petri estériles (10 cm; Fisher Scientific, cat. no. 08-757-100D)
- Microcentrífugas (Fisher Scientific, cat. no.15344204)
- Balanza (Balsur, cat. no. FC-100)
- Matraces y probetas (Quercus Lab, cat. no. 45001094)
- Filtros de concentración jeringa Millipore (Merck, cat. no. 044450)
7. PROCEDIMIENTO
Las muestras líquidas serán centrifugadas para retirar los restos sólidos y el sobrenadante se filtrará con
filtros de tamaño de poro 0,22 µm. Para posibilitar la propagación del bacteriófago de interés, cinco mililitros
del sobrenadante filtrado serán incubados 16-18 horas con 100 µl de un cultivo crecido en fase estacionaria
de la bacteria o bacterias diana si la bacteria es de crecimiento rápido o serán incubadas más tiempo para
bacterias con tiempos de generación más largos, se añadirán cinco mililitros del medio de cultivo adecuado
al patógeno doblemente concentrado suplementado con MgSO4 y CaCl2 a concentración final de 10 mM.
La aireación dependerá del patógeno en cuestión.
Transcurrido el tiempo, de nuevo se centrifugará el contenido y se filtrará para obtener el “lisado” que va
a ser objeto de estudio de análisis para detectar posibles bacteriófagos de interés. Las muestras sólidas
requerirán un paso previo que consiste en añadir a un volumen de muestra (por ejemplo 10 mililitros) el mis-
mo volumen de medio de crecimiento de la bacteria doblemente concentrado, suplementado con MgSO4
y CaCl2, y 100 µl de un cultivo crecido en fase estacionaria para incubarlo de la misma manera que se ha
descrito para las muestras líquidas.
Posteriormente, se sembrarán en placa dos réplicas por cada lisado más un control sin lisado utilizando la
técnica de placa de doble agar (capa superior con 0,3 % de agarosa) (Ver documento técnico II. Fagotera-
pia) que permitirá visualizar calvas de lisis si las hubiera. En caso de tener varias bacterias huésped dianas,
se realizará este paso para cada bacteria individual. De nuevo, los medios de cultivo y las condiciones de
incubación (temperatura, tiempo y aireación) serán los adecuados para el crecimiento de la bacteria diana.
Sería recomendable tener un banco de cepas huésped diana que se utilizarán para el aislamiento de los
fagos y su propagación, que cumplan, en la medida de lo posible, los requisitos de no portar resistencias,
factores de virulencia ni profagos (1)
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-01
8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
En bacterias de crecimiento rápido, tras 16-18 horas se examinarán las placas comparándolas con la placa
control. Si el aspecto es similar al control se dejarán hasta las 24 horas de incubación y si se mantiene igual
y se interpretará que la siembra no contiene bacteriófagos. Sin embargo, si aparecen calvas de lisis o de
menor densidad de crecimiento se concluirá que existe al menos un tipo de bacteriófago capaz de infectar
al patógeno de interés. Para bacterias de crecimiento lento se ajustarán los tiempos según el tiempo de
generación.
Seguidamente, si hay calvas no solapantes, se procederá a aislar una única calva de cada morfología simi-
lar utilizando una pipeta Pasteur y se introducirá en un microtubo, añadiendo SM buffer (Sault-Magnesium),
mezclando con agitación y centrifugando para obtener un sobrenadante que se guardará a 4ºC, para su
posterior titulación y propagación con el fin de obtener un título elevado de un único bacteriófago.
Si en la placa hay tal concentración de calvas que no es posible aislar sólo una por solapamiento, se ras-
pará la capa de agarosa y se resuspenderá el contenido en medio SM mezclando con agitación; posterior-
mente se centrifugará para obtener un sobrenadante del que se sembrarán diluciones con el objetivo de
obtener calvas aisladas, luego se procederá tal y como se indica en el párrafo anterior.
9. RESPONSABILIDADES
El procedimiento deberá llevarse a cabo por personal técnico cualificado con un entrenamiento específico.
La supervisión de la técnica y de los resultados emitidos deberá realizarla el Facultativo Especialista res-
ponsable del laboratorio de Microbiología que los emite.
10. LIMITACIONES AL PROCEDIMIENTO
Para la obtención de un máximo rendimiento en relación con la obtención de fagos líticos, se requiere un
banco de cepas huésped dianas susceptibles de ser infectadas por los fagos a estudio.
11. BIBLIOGRAFÍA
1. Glonti T, Pirnay JP. In Vitro Techniques and Measurements of Phage Characteristics That Are Important
for Phage Therapy Success. Viruses. 2022;14(7).
2. Kropinski AM, Mazzocco A, Waddell TE, Lingohr E, Johnson RP. Enumeration of bacteriophages by dou-
ble agar overlay plaque assay. Methods Mol Biol. 2009;501:69-76.
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
AISLADOS AMBIENTALES y BANCOS de FAGOS
PNT-FT-02
ELABORADO REVISADO Y APROBADO
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
1. PROPÓSITO Y ALCANCE
-PASO 1. Caracterización de la actividad infectiva

-PASO 2. Caracterización genotípica
-PASO 3. Adaptación al huésped/desarrollo cócteles
-PASO 4/5. Producción, purificación y concentración
-PASO 6. Caracterización fisicoquímica y almacenamiento
2. FUNDAMENTO

• Método 01. Propagación y titulación de los fagos en técnica doble agar
• Método 02. Test de la gota o spot test
• Método 03- Host Range
• Método 04. Eficiencia de plaqueo (EOP)
• Método 05. Curva de adsorción (Opcional)
• Método 06- One Step Growth Curve (Opcional)
• Método 07. Curva de Infección en medio líquido (Estudios de cinética)
-PASO 2. Caracterización genotípica
• Método 01. Tipos de Secuenciación
• Método 02. Búsqueda de contaminaciones
• Método 03. Anotación funcional de proteínas
• Método 04. Identificación de genes de lisogenia, resistencia y virulencia
-PASO 3. Adaptación al huésped/desarrollo cócteles
• Método 01. Método Appelmans. Preparación de cócteles. Sinergia con los antibióticos
-PASO 4/5. Producción, purificación y concentración
• Método 01. Ampliación del proceso de purificación mediante ultracentrifugación en gradiente de den-
sidad
• Método 02. Aplicaciones de membranas de filtración en la producción de fagos
• Método 03. Desarrollo de cromatográfica de fago. Eliminación de endotoxinas
• Método 04. Titulación de fagos
-PASO 6. Caracterización fisicoquímica y almacenamiento
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
1. Oliver A (Coordinador). López Causapé C, González Candelas F, Tomás Carmona MM, Oliver A. Proce-
dimiento en Microbiología Clínica 71. Aplicaciones de las técnicas de secuenciación masiva en la Microbio-
logía Clínica. SEIMC 2021. Disponible en https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimien-
tosmicrobiologia/seimc-procedimiento71.pdf
2. Morosini Reilly MI (Coordinador). Canut Blasco A, Collazos Blanco A, Díez Aguilar M, Morosini Reilly
MI, Rodriguez Gascón A, Seral García C. Procedimiento en Microbiología Clínica 70. Métodos Microbio-
lógicos para la determinación in vitro de la actividad de combinaciones de antimicrobianos. SEIMC 2020.
Disponible en https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-pro-
cedimiento70.pdf
3. Farmacopea europea (EP2.6.12). Disponible en EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0. http://uspbpep.
com/ep50/2.6.12.%20Microbiological%20examination%20of%20non-sterile%20products%20(total%20via-
ble%20aerobic%20count).pdf
4. Farmacopea europea (EP 2.6.14). Disponible en EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0. https://gmpua.
com/Validation/Method/LAL/EUPHARMACOPOEIA.pdf
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
Hospital............................................ AISLADOS AMBIENTALES y BANCOS de FAGOS Edición Nº 01 Página 3 de 20
5. Farmacopea europea (EP 2.2.3). Disponible en EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.0.

http://www.fptl.ru/biblioteka/farmacop/EP-7.0-2.pdf
6. Farmacopea europea (EP 2.5.12). Disponible en EUROPEAN PHARMACOPOEIA 6.0.
http://www.uspbpep.com/ep60/2.5.12.%20water-%20semi-micro%20determination%2020512e.pdf
4. PROGRAMAS Y HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS
- EDGE Bioinformatics software https://github.com/LANL-Bioinformatics/EDGE/releases

- GOTTCHA web https://github.com/LANL-Bioinformatics/GOTTCHA
- Kraken tool https://ccb.jhu.edu/software/kraken/
- MetaPhlAn web https://github.com/biobakery/MetaPhlAn
- BWA-mem https://bio-bwa.sourceforge.net
- RefSeq tool https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
- RAST server https://rast.nmpdr.org
- FIGfam web http://www.theseed.org/wiki/FIGfams/
- GLIMMER-3 tool https://bio.tools/glimmer
- BLASTp web https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
- HMMER tool http://hmmer.org
- HHpred web https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred
- pVOGs tool http://dmk-brain.ecn.uiowa.edu/pVOGs
- tRNAscan-SE web http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/ç
- ARAGORN web https://www.ansikte.se/ARAGORN/
- PHASTER tool https://phaster.ca
- RAST server https://rast.nmpdr.org
- PHANOTATE web https://github.com/deprekate/PHANOTATE
- PHACTS server http://www.phantome.org/PHACTS/
- VirulenceFinder2.0 https://cge.food.dtu.dk/services/VirulenceFinder/
- ResFinder 4.1 https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/
- Aribav2-6.2 https://github.com/sanger-pathogens/ariba
5. MUESTRAS
Fagos líticos
6. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS
- Agua estéril
- Tubos estériles cónicos (15 ml; Fisher Scientific, cat. no. 11317211)
- Tubos Microcentrífuga (1.7 ml; Sorenson, cat. no. 11500)
- Tubos Microcentrífuga (2.0 ml; Sorenson, cat. no. 12030)
- Tubos centrífuga cónicos (15 and 50 ml; VWR, cat. no. 430790 and 430828)
- MgSO4, Sulfato de Magnesio (Fisher Scientific, cat. no. 10 625871)
- CaCl2, Cloruro de Calcio (Fisher Scientific, cat. no.12664987)
- Agarosa (Ecogen, cat. no. BIO-41026)
-Placas de Petri (10 cm; Fisher Scientific, cat. no. 08-757-100D)
- LB, Luria Bertani
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
- Banco de cepas huésped dianas

- Buffer SM (Tris-HCl, 50 mM; NaCl, 0.1 M;. MgSO4·7H2O, 8 mM; gelatina, 0.002 %)
- Triptona (Fisher Scientific, cat. no. BP1421-2)
- Extracto de levadura (Fisher Scientific, cat. no. BP1422-2)
- NaCl, Cloruro de sodio (Fisher Scientific, cat. no. 7647-14-5)
- Agar (CulGenes, cat. no. C6002)
- PBS (BioPioneer, cat. No. MB1001)
- Base Tris (Fisher Scientific cat. no. 77-86-1)
- Glicina (Millipore Sigma, cat. no. G4392)
- SDS (Fisher Scientific, cat. no. BP166-500)
- Etanol, absoluto (Millipore Sigma, cat. no. E7023-500 ml)
- Kit Nanobind CBB Big DNA (Circulomics, cat. no. NB-900-001-01)
- ADNasa I (Life Technologies, cat. no. 90083)
- RNasa A (Life Technologies, cat. no. EN0531)
- PEG-8000 (Fisher Scientific, cat. no. BP233-100)
- Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4; Fisher Scientific, cat. no. M63-500)
- Ácido acético (Fisher Scientific, cat. no. A38S 500)
- Columnas de centrifugación de eliminación de endotoxinas de alta capacidad Pierce, 1 ml (Thermo-
Fisher Scientific, cat. no. 88277)
- Kit de cuantificación de endotoxina cromogénica Pierce LAL (ThermoFisher Scientific, cat. no. 88282)
7. APARATOS Y MATERIAL
- Cabina de bioseguridad (ESCO, cat. no. AC2-4S9-NS)

- Lector de placas de microtitulación (BMG, modelo: Clariostar, cat. no. 0430-100)
- Mezclador vórtex (VWR, cat. no. 12620-838)
- Espectrofotómetro (Denovix, cat. no. DS-11 FX+)
- Centrífuga de alta velocidad (Beckman Coulter, modelo: Avanti JXN-26 IVD, cat. no. B38623)
- Rotor de centrífuga de ángulo fijo para 1 L (Beckman Coulter, modelo: JLA-8.1000, cat. no. 969328)
- Ultracentrífuga (Beckmann Coulter, Optima-L-90K, cat. no. 365672)
- Rotor SW41 (Beckman Coulter, cat. no. 331336)
- Microcentrífuga (Sartorius, cat. no. A-14C)
- Sistema de electroforesis tetravertical Mini-PROTEAN (Bio-Rad, cat. no. 1658028FC)
- Gel imager ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad, cat. no. 1708265)
- Mechero Bunsen (VWR, cat. no. 89038-530)
- Pipeta (1000, 200, 20 y 10 μL; Sartorius, cat. no. UX-24505-33, -34, -35 y -36, respectivamente)
- Pipeta multicanal (8 × 10 μL; Sartorius, cat. no. UX-24505-44)
- Controlador electrónico de pipetas (Argos, modelo: OmegaZen, cat. no. 25300-96)
- Baño de agua (10 L; Cole Parmer, cat. no. WE-14576-08)
- Bomba peristáltica (Cole Parmer, modelo: Masterflex, cat. no. EW-07522-20)
- Cabezal de bomba (Cole Parmer, cat. no. EW-77253-00)
- Tubos (ThermoFisher Scientific, n.° de cat. 8060-3015; Cole-Parmer, cat. no. ZX-06422-01)
- Incubadora/agitador microbiológico (Eppendorf, modelo: S44i, cat. no. S44I200005)
- Incubadora de células (Eppendorf, modelo: C170i, cat. no. 6731010015)
- Incubadora (VWR, modelo: 5420, cat. no. 97005-252)
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DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
- ThermoMixer (Eppendorf, cat. no. 2231000574)

- Placa de agitación (Heathrow, cat. no. HP8885794)
- Hemocitómetro (Hauser Scientific, cat. no. 3110V)
- Sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore Sigma, cat. no. ZRXQ010T0)
- Gradilla para tubos magnéticos (ThermoFisher Scientific, modelo: DynaMag-2, cat. no. 12321D)
- Espectofotómetro BioTek Epoch 2 microplaca (Fisher Scientific,, cat. no. 17217809)
- Secuenciador de ADN (Oxford Nanopore, modelo: MinION, cat. no. SQK-RAD004)/ Illumina Platform
- Ordenador con sistema Linux o Apple Macintosh
8. PROCEDIMIENTOS-INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
• Método 01. Propagación y titulación de los fagos en técnica doble agar
- Propagación en medio líquido: Se prepara un cultivo de la cepa huésped diana (que es aquella en la que
se ha aislado el fago, idealmente cepas que no porten profagos ni genes de resistencia) a partir de una
dilución 1/100 de un cultivo overnight de la misma, en 10 ml de medio de cultivo suplementado con MgCl2
y/o CaCl2 si es necesario. Incubar a temperatura y aireación óptimas para el crecimiento bacteriano, por
ejemplo, en gramnegativas aerobias a 37ºC en agitación a 180 rpm. Cuando el cultivo alcanza una den-
sidad óptica entre 0,3-0,5 DO (600 nm) este se infecta con 100 µl de fagos concentrados (≥ 10⁸ UFP/ml).
Incubar a 37ºC durante unas 5h o hasta que el cultivo esté completamente lisado.
Finalmente se recupera el lisado en el sobrenadante y se incuba en presencia de cloroformo al 1% (si es

tolerado por el fago) durante 20 min a temperatura ambiente. Centrifugar y filtrar por filtros de 0,45 µm.
Guardar a 4º C.
- Propagación en medio sólido: Inocular 5 ml de medio de cultivo con una dilución 1/100 de un cultivo
“overnight” de la cepa huésped. Incubar a la temperatura y agitación adecuada para la bacteria hasta que
alcance una densidad óptica de 0,5 DO (600 nm). Preparar tantas alícuotas de entre 150-250 µl del cultivo
e infectar con 20-50 µl de un stock de fagos con título alto (≥ 10⁸ UPF/ml). Incubar durante 10 min a tempe-
ratura ambiente y preparar placas de doble agar como se ha descrito anteriormente. Incubar toda la noche
a la temperatura adecuada para la bacteria.
Al día siguiente añadir 3-4 ml de buffer SM y poner en una placa de agitación a 100 rpm durante 3-4 horas.
Recuperar el SM buffer, añadir cloroformo al 1% (siempre y cuando el fago lo tolere) e incubar a tempera-
tura ambiente durante 20 min. Centrifugar y filtrar el sobrenadante por un filtro de 0,45 µm. Guardar a 4º C.
La técnica doble agar es una técnica empleada tanto para hacer recuento de fagos como para la propaga-
ción de los mismos. Consiste en la preparación de placas tipo Petri del tamaño que se desee con medio
de cultivo sólido en dos capas, la inferior con mayor concentración de agar y la superior con menor. El
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medio de cultivo debe ser un medio en el que la bacteria de elección crezca adecuadamente, generalmente
se emplea LB o TA, este último es más claro y facilita la observación de las placas de lisis. En primer lugar,
se preparan las placas con la capa inferior de medio a una concentración de agar de 1,5 % (P/V), una vez
solidificadas se dejan secar unos 15 min, de modo que queden ligeramente húmedas.
En la capa superior es donde ocurre la infección, para ello en primer lugar se añaden 150-250 ml de un cul-
tivo bacteriano a una DO (600 nm) de 0,5-0,6. Posteriormente se añade el volumen adecuado de stock de
fagos y se incuban a temperatura ambiente. Transcurridos 10 minutos, a la mezcla de bacteria y fago se le
añaden 3-4 ml de medio de cultivo “soft” con agar al 0,4 % (P/V), aunque esta concentración puede variar en
función de la capacidad de difusión del fago. Inmediatamente esta mezcla se añade sobre la capa inferior de
medio para formar la capa superior y se mantiene a temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente,
las placas se incuban en una estufa durante 18 horas a la temperatura adecuada para la bacteria.
Para la titulación de los fagos en primer lugar, se debe preparar un cultivo de la cepa bacteriana huésped.
Para ello se inoculan 5 ml de medio de cultivo adecuado con una dilución 1/100 de un cultivo “overnight” de
la cepa. Se incuba en las condiciones idóneas para la bacteria hasta que se alcanza 0,5 DO (600 nm).
Se prepara una dilución seriada del stock de fagos en tampón SM o en suero salino. Se prepararán al menos
diluciones hasta la – 7.
Se toman 150-250 µl del cultivo a 0,5 DO (600 nm) y se depositan en tantos tubos como diluciones de fa-
gos se vayan a preparar. Cada uno es infectado con 10 µl correspondientes a cada una de las diluciones
de fagos y se preparan placas de doble agar. Se incuban en una estufa a la temperatura adecuada para la
bacteria durante toda la noche. Al día siguiente se cuentan las UFP (Unidades Formadoras de Placas) en las
placas en las que se puedan contar 30-300. El título se calcula con la fórmula:
UFP/ml = (Nº de UFP X Dilución)/Volumen de fago inoculado
• Método 02. Test de la gota o spot test
Este test se realiza para determinar la capacidad del fago de infectar y lisar las cepas bacterianas que se
desee estudiar. Se realiza en placas de doble capa de agar. En este caso, la capa superior de agar se pre-
para mezclando el cultivo bacteriano con el agar soft. Una vez solidificada la capa superior de agar se añade
una gota de 1 µl de solución de fagos. Se espera a que la gota se absorba en el agar y se incuba durante 18
horas en una estufa a la temperatura ideal de crecimiento de la bacteria.
El spot test se realiza a partir de una dilución seriada de los fagos para diferenciar la lisis debida a la acti-
vidad del fago de la lisis from without. Para llevar a cabo este protocolo se debe hacer una dilución seriada
del stock de fago que se desea testar y se hará un spot como se ha descrito anteriormente con cada una de
las diluciones. Se considerará que la lisis es producida por el fago si en alguna de las placas se observan
placas de lisis individuales.
• Método 03. Host Range
Este método consiste en enfrentar el fago con una colección de cepas de interés y hacer una valoración
inicial de su capacidad infectiva. Para conocer el rango de huésped de un fago, se debe realizar la técnica
del “spot test” descrita en el Método 02, a través de diluciones seriadas enfrentando un fago a las cepas
bacterianas que se desee (2). Se deben considerar como huéspedes del fago aquellas cepas en las que el
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“spot test” produce un “spot” completamente lisado correspondiente a las concentraciones más altas de fago
y placas de lisis individuales en los “spot” más diluidos.
• Método 04. Eficiencia de plaqueo (EOP)
Esta técnica permite establecer la capacidad de propagación de un fago en una cepa, comparando la capa-
cidad de infección de un fago en una cepa determinada frente a la capacidad de infección del mismo fago
sobre su cepa huésped. Los recuentos que determinan la eficiencia de plaqueo (EOP) se deben obtener
para todas las cepas que se quieran analizar y para la cepa huésped original del fago.
El cálculo de la EOP se realiza mediante recuento de placas de lisis en placa de doble agar siguiendo el
mismo protocolo que en el caso de la titulación.
Una vez obtenidos los recuentos se aplica la siguiente fórmula:
EOP = UFP obtenidos para la cepa de análisis/UFP obtenidos para la cepa huésped diana
Los valores de EOP son específicos de cada cepa y fago, cuando el EOP es ≥ 0,5 indica que una alta capaci-
dad de infección, por lo que el fago se considerará un buen candidato para tratar las infecciones provocadas
por esa cepa. Se considera que la infección es moderada si el valor de EOP está entre 0,1-0,5, por lo que
estos deberían descartarse como candidatos para tratar la infección, aunque podría valorarse según las
circunstancias. Cuando se obtiene un valor ≤ 0,1 se considera que no hay infección y se descartaría el fago
como candidato.
• Método 05. Curva de adsorción (Opcional)
La determinación de la tasa de adsorción de los fagos se realiza en base al número de fagos libres en el
sobrenadante.
Antes de iniciar el análisis es necesario añadir 10 µl de cloroformo en tubos de 1,5 ml. Se prepararán tantos
tubos como muestras se vayan a tomar durante el ensayo. Una vez preparados se mantendrán en hielo.
En primer lugar, se debe diluir un cultivo bacteriano en fase logarítmica media hasta una concentración apro-
ximada de 10⁷ UFC/ml en 20 ml de medio de cultivo suplementado con CaCl2 y/o MgCl2 (dependiente del
tipo de fago). Los fagos previamente cuantificados deben estar a temperatura ambiente y se utilizarán a una
concentración aproximada de 10⁵ UFP/ml.
En el matraz con los 20 ml de cultivo a temperatura ambiente se añadirán los fagos a MOI 0,01 (10⁵ UFP/ml).
El matraz se mantendrá a temperatura ambiente sin agitación durante la duración de la curva, de 10 a 15
min. A intervalos de 1 min se debe tomar una alícuota de 1 ml que se deposita en los tubos con cloroformo,
se agita y se mantiene en hielo durante 15 min. Transcurrido este tiempo se centrifuga y se recupera el so-
brenadante. De cada uno de los tubos se realizan diluciones seriadas hasta la dilución -6 y se preparan pla-
cas de doble agar, empleando la cepa huésped de plaqueo, que será la cepa huésped original para ese fago,
previamente crecida hasta 0,5 DO (600nm). Las placas se incubarán durante toda la noche a la temperatura
adecuada para la cepa y al día siguiente se harán los recuentos de las UFP para cada punto de la curva.
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Se considerará el tiempo de adsorción de un fago, el punto en el que la curva se estabiliza.
• Método 06. One Step Growth Curve (Opcional)
Antes de realizar esta curva es necesario tener en cuenta una serie de consideraciones, así, para el co-
rrecto desarrollo de esta curva es necesario utilizar un fago que tenga una tasa de adsorción ≥ 90% en
5 minutos, de forma que la infección ocurra de manera simultánea en todas las células. Además, será
necesario hacer varias replicas para poder establecer con exactitud el tiempo de latencia del fago. En el
caso de que el fago tenga un período de latencia demasiado corto a 37º C se podría optimizar bajando la
temperatura de 30ºC siempre que sea posible.
En primer lugar, se prepara un cultivo de la cepa en las condiciones óptimas para la bacteria. Tras incu-
barlo toda la noche, se prepara una dilución 1/100 en un matraz con el medio de cultivo suplementado
con CaCl2 1mM, y se incuba en agitación hasta que alcance la fase logarítmica. En este momento 1 ml
del cultivo bacteriano se infecta con el fago a MOI 0,01 o 0,001, y se mantiene a temperatura ambiente
durante el período de adsorción. Posteriormente, se centrifuga a 6000 rpm durante 10 min y el precipitado
se suspende en 1 ml de medio de cultivo. Este paso se debe repetir 3 veces. Posteriormente, un matraz
conteniendo 20 ml de medio de cultivo suplementado con CaCl2 ser inocula con 20 µl del cultivo infectado,
y se incuba a la temperatura y velocidad de agitación óptimas para la bacteria. Se deben tomar alícuotas
cada 2 min hasta que acabe la fase de latencia y luego cada 5 min hasta que finalice la fase de lisis.
• Método 07. Curva de Infección en medio líquido (Estudios de cinética)
La curva en medio líquido se debe realizar a distintas MOI para determinar la relación de fago-célula a la
que la infección es mayor y se genera menor resistencia al fago.
Se prepara un cultivo de la cepa de interés que se incuba toda la noche en medio de cultivo líquido en
las condiciones idóneas para la bacteria. Al día siguiente, el cultivo se diluye 100 veces y se incuba hasta
alcanzar la fase logarítmica. En este momento se añade el fago a la concentración correspondiente a la
MOI que se quiera analizar, generalmente 0,1, 1 y 10, aunque esto valores pueden variar en función del
fago y la cepa bacteriana. Posteriormente, el cultivo infectado se incuba en las condiciones idóneas para
la bacteria durante al menos 6 h, aunque es recomendable hacerlo durante 24h. Se tomarán muestras a
intervalos de 1h y se medirán en un espectrofotómetro a λ 600nm.
Existe la posibilidad de llevar a cabo métodos automatizados de medición de la curva de infección (estu-
dios cinéticos) en medio líquido utilizando tecnologías como qPCR, citometría de flujo y/o lector de densi-
dad óptica siguiendo las indicaciones del fabricante.
Los fagos ideales serán aquellos que muestren un adecuado resultado por spot test, una buena eficiencia
en el EOP junto con una fuerte inhibición en el crecimiento bacteriano mediante los ensayos de cinética.
Dichos fagos serán seleccionados para su secuenciación genómica y posterior producción y purificación.
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PASO 2. CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Previamente a la secuenciación del genoma es necesario obtener una cantidad suficiente de ADN del fago
escogido, para ello es necesario propagarlo y obtener un lisado a una concentración de fago ≥ 10⁹ PFU ml-¹.
Este lisado se tratará en primer lugar con DNAsa y con RNAsa para eliminar los ácidos nucleicos bacteria-
nos y posteriormente se romperán las cápsides mediante el tratamiento con proteinasa K. Finalmente, el
DNA se puede extraer mediante el uso de un kit comercial (Promega Wizard® DNA Clean-Up) o bien por el
método del fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, precipitándolo finalmente con alcohol absoluto y lavándolo
con alcohol al 70 % antes de resuspenderlo en agua destilada. La calidad del ADN extraído y la presencia
de potenciales contaminantes puede evaluarse utilizando la absorbancia diferencial de luz UV: una ratio de
absorbancia 260/280 nm comprendido entre 1,8-2 es indicativo de que el extracto únicamente contiene ADN
y una ratio 260/230 nm entre 2,0-2,2 es indicativo de la ausencia de contaminantes.
• Método 01. Tipos de Secuenciación
En este paso se podrá utilizar cualquier método de secuenciación de los empleados en la secuenciación
de microorganismos. A partir del ADN extraído y purificado se prepararán las librerías genómicas mediante
el uso de un kit comercial (Tecnologías Illumina y/o Nanopore). El método para la preparación de las libre-
rías va a depender de la tecnología de secuenciación que se vaya a utilizar, aunque la fragmentación y el
multiplexado son procesos comunes a todas. Para mayor información sobre la secuenciación consultar el
Procedimiento 71 de la SEIMC.
• Método 02. Búsqueda de contaminaciones
Una vez secuenciado el genoma es necesario descartar la presencia de secuencias de ADN que no se
correspondan con el genoma de los fagos. Para ello es necesario emplear aplicaciones informáticas como
EDGE Bioinformatics software (https://github.com/LANL-Bioinformatics/EDGE/releases), que entre otras ca-
racterísticas permite detectar secuencias de la cepa.
La confirmación de que el genoma pertenece exclusivamente a un fago y no a la cepa huésped se realiza

también mediante la clasificación taxonómica del genoma con herramientas como: i) GOTTCHA (https://
github.com/LANL-Bioinformatics/GOTTCHA); ii) Kraken (https://ccb.jhu.edu/software/kraken/); y finalmente
iii) MetaPhlAn (https://github.com/biobakery/MetaPhlAn). En relación a los estudios de alineamiento de se-
cuencias y mapeo, destacan las herramientas informáticas, BWA-mem (https://bio-bwa.sourceforge.net), y
RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) que se usan para procesar las lecturas obtenidas en la se-
cuenciación. Se considera que las secuencias están libres de contaminantes si el tamaño de las secuencias
ensambladas está dentro del rango del tamaño de genoma de una familia de virus y si menos del 5% de las
secuencias coinciden con las secuencias del huésped.
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Servicio / Unidad de Microbiología IFAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio
• Método 03. Anotación funcional de proteínas
Una vez conocido el genoma del fago es necesario anotar las proteínas que porta, para ello existen diver-
sas herramientas: i) RAST (https://rast.nmpdr.org); ii) FIGfam (http://www.theseed.org/wiki/FIGfams/); y iii)
GLIMMER-3 (https://bio.tools/glimmer). Una vez anotado se puede realizar una confirmación manual de
estas proteínas o de las que de una función hipotética utilizando otras herramientas: i) BLASTp (https://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi); ii) HMMER (http://hmmer.org); iii) HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/
hhpred); y iv) pVOGs (http://dmk-brain.ecn.uiowa.edu/pVOGs). En muchos casos los fagos son portadores
de ARN de transferencia, que se pueden anotar con: tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)
y ARAGORN (https://www.ansikte.se/ARAGORN/).
• Método 04. Identificación de genes de lisogenia, resistencia y virulencia
Antes de seleccionar un fago para su uso en terapia es necesario descartar que sea portador de genes
de lisogenia, resistencia y virulencia. Para identificar proteínas implicadas en el ciclo lisogénico se pueden
utilizar distintas herramientas bioinformáticas como: i) PHASTER (https://phaster.ca); ii) RAST (https://rast.
nmpdr.org); iii) PHANOTATE (https://github.com/deprekate/PHANOTATE) iv) PHACTS (http://www.phanto-
me.org/PHACTS/) . Los genes de virulencia y resistencia bacteriana se pueden identificar con herramientas
como: i) VirulenceFinder2.0 (https://cge.food.dtu.dk/services/VirulenceFinder/), ii) ResFinder 4.1 (https://
cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/) y iii) Aribav2-6.2 (https://github.com/sanger-pathogens/ariba) , res-
pectivamente.
PASO 3. ADAPTACIÓN AL HUÉSPED/DESARROLLO DE CÓCTELES
• Método 01. Método Appelmans. Preparación de cócteles. Sinergia con antibióticos
Este método se puede realizar con un único fago o bien utilizando todos los fagos que van a componer un
cóctel. El fin último de este método es la adaptación del fago o del cóctel de fagos a la cepa bacteriana que
queramos eliminar.
Para iniciar este protocolo se realizan diluciones seriadas del fago o de la mezcla de fagos hasta la dilución
más alta que se quiera probar. Posteriormente los fagos a cada una de las diluciones se mezclan con un
cultivo de la bacteria diana que se habrá diluido hasta una concentración de 10⁶ UFC/ml. Se cultiva en las
condiciones óptimas para la bacteria durante 48 h o más si la bacteria es de crecimiento lento. Se hará una
valoración del crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica a O.D. 600 nm cada 24 h y comparándolo
con los controles.
Se selecciona el tubo con la mayor dilución de fagos y la densidad óptica similar al control, se le añade clo-
roformo (1%), y se agita a 4º C durante 2 h. Tras este período, se recupera la fase superior y se filtra con un
filtro de 0,45 µm o 0,22 µm.
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Este proceso se repetirá de 3 a 4 veces con cada cepa.

En el caso de querer hacer un cóctel de fagos se deben comparar los valores de densidad óptica a 600 nm
de los fagos individuales con los valores obtenidos con la mezcla de fagos. Para considerar un cóctel como
válido los valores obtenidos con la mezcla deben ser menores que los valores obtenidos con los fagos solos.
Para los estudios de sinergia del cóctel de fagos (o fagos concretos) con antibióticos, se realizan pruebas de
sinergia de fagos y antibióticos mediante dos técnicas principalmente: i) Estudios de curvas de muerte bac-
teriana (manual o automatizada) a partir de diluciones bacterianas en medio líquido a OD600 en intervalos
de 1 h durante 6 h, la cual permite medir la actividad bactericida de la combinación si esta está presente;
ii) Método de tablero o Checkerboard test, que aporta datos de inhibición en combinación. El desarrollo de
ambas técnicas se especifica en el Procedimiento Seimc sobre los “Métodos microbiológicos para la deter-
minación in vitro de la actividad de combinaciones de antimicrobianos.2020.
PASO 4/5. PRODUCCIÓN, PURIFICACIÓN Y CONCENTRACIÓN
• Método 01. Ampliación del proceso de purificación mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad
La ultracentrifugación en gradiente de densidad es una técnica común utilizada para aislar y purificar una am-
plia gama de fagos únicamente en función de su densidad. En este caso se realizará la técnica de separación
mediante ultracentrífuga isopícnica de gradiente de densidad que aprovecha las diferencias de densidad entre
impurezas gruesas y fagos autoformación gradientes, la solución de fago se coloca en capas sobre el medio de
gradiente y se centrifuga, y, a medida que las moléculas de soluto sedimentan para formar el gradiente, fagos
idénticos forman bandas en sus puntos isopícnicos.
Para realizar la ultracentrifugación de fagos en primer lugar se debe preparar un gradiente de densidad esca-
lonada de ClCs (Cloruro (Cl) de cesio (Cs)) en un tubo transparente de fondo redondo para ultracentrífuga. El
gradiente se preparará por capas de 2 ml de d = 1,6, 3 ml de d = 1,5 y 3 ml de d = 1,3 de abajo hacia arriba. El
volumen sobrante del tubo se llenará con el lisado del fago previamente filtrado. Los tubos se deben colocar y
equilibrar en los soportes del rotor y mantener a 4ºC. Los tubos se ultracentrifugarán a 28.000 g durante 4h a
4ºC. Al finalizar se pinchará el tubo con una aguja de calibre 26 y una jeringa en la zona donde está la banda
visible que contiene los fagos. Con esta técnica se logra la eliminación de otras cepas de fagos no deseadas y
macro impurezas. Es decir, diferentes fagos serán separados en función de su densidad.
Además, grandes agregados de endotoxinas permanecerán cerca de la parte superior del gradiente, mientras
que los microsolutos pasarán al fondo del gradiente.
Tras la ultracentrifugación se debe utilizar la diálisis para eliminar residuos de ClCs de las partículas de fago en
solución por difusión selectiva y pasiva a través de una membrana semipermeable. Las partículas de fago que
son más grandes que los poros de la membrana de 100 kDa se retienen, pero las moléculas pequeñas y las
sales del tampón pasan libremente a través de la membrana, reduciendo la concentración de esas moléculas
en la preparación de fagos. La diálisis también logra la eliminación de pequeñas bacterias y el intercambio de
tampones de almacenamiento para productos de fagos, pero diluye la preparación de fagos.
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• Método 02. Aplicaciones de membranas de filtración en la producción de fagos
Se pueden utilizar dos tipos de filtración para recuperar fagos la microfiltración sin salida y la ultrafiltración de
flujo cruzado. La microfiltración sin salida se utiliza para retener tanto las células bacterianas como las partícu-
las que se recogen en la superficie de la membrana formando una capa de filtración que mejora la eficiencia
de separación. La principal desventaja de este método es la suciedad que se acumula en la membrana. Para
evitar que la membrana se ensucie se recomienda evitar el uso de cloroformo para esterilizar los derivados
de la lisis final de las células bacterianas resistentes a los fagos, que normalmente se desarrollan con cultivo.
También se deben realizar dos rondas de centrifugación para los lisados, con un cambio de botella estéril en el
medio. Además, se debe utilizar un diseño de filtro de cartucho plisado, que proporciona una mayor superficie.
Por último, se utilizan dos filtros de cartucho plisados para medir el tamaño de los poros de la membrana en
dos pasos.
A continuación, se debe ultra-filtrar por membrana los lisados con un alto concentración de fagos. Dicho
sistema funciona mediante la introducción de lisado filtrado sin salida bajo presión a través de la superficie
de la membrana, en lugar de directamente sobre el microfiltro. Durante la filtración, cualquier material más
pequeño que el poro de la membrana de flujo cruzado de 100 kDa pasa a través de la membrana, mientras
que las partículas de fago suspendidas más grandes permanecen en la corriente retenida. Un tamaño de
poro de membrana de 100 kDa proporciona el equivalente a una partícula esférica con un diámetro de 3 nm
y, por lo tanto, es suficiente retener todos los fagos conocidos. Por otro lado, se debe emplear tampón recién
esterilizado en autoclave para aumentar la pureza y mejorar la separación de los fagos de los desechos
bacterianos y el medio de crecimiento. Simultáneamente, para enjuagar los micro-solutos de la solución de
fago se debe extraer el permeado a la misma velocidad a la que se agrega el tampón.
• Método 03. Desarrollo de cromatográfica de fago. Eliminación de endotoxinas
La eliminación de endotoxinas es fundamental cuando se producen fagos terapéuticos en sistemas bac-

terianos. La eliminación de las endotoxinas se debe realizar mediante cromatografía de afinidad, que es
probablemente el método más fiable y el más empleado. Posteriormente se recomienda el uso del ensayo
LAL (Ensayo del lisado de amebocitos del Limulus) debido a su sensibilidad, reproducibilidad y simplicidad
para detección de endotoxinas, que utiliza el sistema de coagulación de la sangre del cangrejo herradura y
los coágulos exposición a endotoxinas. Dicho método (ensayo LAL), se fundamenta en la coagulación de la
hemolinfa por medio de la interacción de la endotoxina con los amebocitos contenidos en esta, lo que causa
la liberación de una cascada de reacciones que hacen que se forme un gel visible y consistente.
Es importante tener en cuenta que para realizar una prueba de LAL todo el material de vidrio debe ser api-
rógeno y la preparación de la muestra debe ser de modo aséptico, para evitar contaminación. Un aspecto
crítico a tener en cuenta es la validación del ensayo. Es válido puntualizar que lo que se valida es la muestra
o su dilución y no se realizan ensayos de linealidad, exactitud o precisión como se describe para la mayoría
de los métodos analíticos. El método empleado es semicuantitativo. La prueba consiste en la adición de 0,1
ml de lisado y 0,1 ml de producto a evaluar en tubos despirogenizados, que se colocan al baño María a 37 °C
y luego se invierte el tubo con cuidado a 180 °C. Si la solución ha formado un gel y permanece en el fondo
del tubo la prueba es positiva; de lo contrario, si la solución permanece líquida la prueba es negativa (http://
scielo.sld.cu/pdf/vac/v21n3/vac06312.pdf ).
• Método 04. Titulación de fagos
La técnica de doble capa de agar descrita en el paso 1 se utiliza habitualmente para cuantificar el número de
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partículas de fagos en las preparaciones. Una alternativa a la técnica de la doble capa consiste en realizar
varias diluciones en serie de diez veces de un fago stock en una microplaca y aplicar estas diluciones en una
placa Petri de agar sembrada con bacterias. La titulación de placas convencional también se puede sustituir
o complementar con el uso de pruebas en tiempo real. PCR cuantitativa (qPCR) si se dispone de cebadores
para la cepa del fago.
-PASO 6. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA Y ALMACENAMIENTO
La preparación de los fagos para su aplicación será distinta en función de la vía de administración, pero en
todos los casos es necesario en primer lugar la identificación de la cepa huésped bacteriana y la producción
de los preparados de fagos siguiendo los procesos anteriormente descritos.
Los preparados de fagos empleados en terapia son “ingredientes farmacéuticos activos de fagos” o Phage
active pharmaceutical ingredients (APIs). Cada API contiene un único tipo de fagos y varios API se pueden
combinar en una preparación magistral ampliando el espectro de acción del medicamento.
Los API se preparan a partir de lotes de fagos de calidad controlada, previamente caracterizados y purifica-
dos. Una vez obtenidos los lotes de fagos se debe garantizar que cumplan los criterios de calidad estable-
cidos en la normativa como por ejemplo ISO17025.
Los criterios de calidad que se deben establecer son los siguientes:

- Identidad del fago: se establecerá que cepas de fagos compone el API mediante técnicas de identi-
ficación genómica como la secuenciación descrita en el paso 2 o si es posible mediante técnicas de
amplificación del ADN como la PCR.
- Evaluación cuantitativa de los fagos: la cantidad de fago que compone el API se realizará mediante la
técnica de titulación descrita en el paso 1 o bien mediante qPCR.
- Determinación cuantitativa de la carga biológica: la cuantificación de la carga microbiológica europea
se realizará siguiendo la metodología descrita en la farmacopea europea (EP2.6.12) (http://uspbpep.
com/ep50/2.6.12.%20Microbiological%20examination%20of%20non-sterile%20products%20(total%20
viable%20aerobic%20count).pdf).
Los APIs deben tener una carga ≤ 10 UFC/100 ml o g.
- Endotoxinas bacterianas: se determinará la presencia de endotoxinas siguiendo la metodología des-
crita en la farmacopea europea (EP 2.6.14) (https://gmpua.com/Validation/Method/LAL/EUPHARMACO-
POEIA.pdf). El límite de endotoxinas depende del producto terapéutico final y de la vía de administra-
ción. La dosis máxima administrada por la vía prevista por hora no debe contener endotoxina suficiente
para provocar una reacción tóxica, por ejemplo, como se describe en el EP5.1.10 la dosis máxima por
vía intravenosa es de 5 unidades de endotoxina UE/Kg/h.
- pH: Se determina en base a la metodología descrita en la farmacopea europea (EP 2.2.3) (http://www.
fptl.ru/biblioteka/farmacop/EP-7.0-2.pdf). Los preparados de fagos se diluyen en tampón SM a diferentes
pHs. Los fagos se cuantifican en placas de doble agar como se ha descrito en el método 01. Los prepa-
rados para la formulación deben estar a pH 6-8.
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- Contenido en agua: se realiza según la farmacopea europea (EP 2.5.12) http://www.uspbpep.com/

ep60/2.5.12.%20water%20semi-micro%20determination%2020512e.pdf
- El contenido en agua máximo permitido en un API es de 3% m/m excepto en para fórmulas como los
liofilizados.
- Impurezas: cuando se en la obtención de los fagos para el API se empleen reactivos como el clorofor-
mo se debe emplear un protocolo adecuado para la cuantificación de los reactivos residuales y estable-
cer cuáles son las cantidades seguras.
El almacenamiento de los APIs se debe realizar en condiciones que no alteren la titulación ni la viabilidad
de los fagos. Así previamente será necesario determinar el pH y la temperatura en que los fagos perma-
necen estables más tiempo. La solución de almacenamiento debe presentar un pH estable y neutro y bajo
contenido iónico (por ejemplo, DPBS sin Ca²+ y Mg²+) para la producción de API y preparaciones magis-
trales, mantenidas a 4ºC en vidrio. La liofilización con estabilizadores, como sacarosa y thehalosa, podría
mantener la capacidad infectiva de los fagos durante 8 años y hasta 126 días después de la resuspensión
en solución salina (CaCl2 y/o MgCl2) para su administración. Sin embargo, la variabilidad entre los fagos
es importante, por lo que las concentraciones del estabilizador, la influencia del pH y la osmolaridad son
parámetros importantes que necesitan ser optimizados individualmente para cada fago y/o cóctel de fagos.
9. RESPONSABILIDADES
El procedimiento deberá llevarse a cabo por personal técnico cualificado con un entrenamiento específico.
La supervisión de la técnica y de los resultados emitidos deberá realizarla el Facultativo Especialista res-
ponsable del laboratorio de Microbiología que los emite.
10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Este procedimiento está desarrollado especialmente para fagos que infectan bacterias Gram-negativas
cultivadas aeróbicamente a 37 Cº. Además, los protocolos deben adaptarse a los fagos líticos a estudio,
titulación de fagos, así como las bacterias huésped diana y clínicas a estudio. Recientes investigaciones
en relación a los fagos están siendo potenciadas, por lo que no se descarta una actualización este proce-
dimiento de fagoterapia en los próximos meses.
12. BIBLIOGRAFÍA
1. Kropinski AM, Mazzocco A, Waddell TE, Lingohr E, Johnson RP. Enumeration of bacteriophages by dou-
ble agar overlay plaque assay. Methods Mol Biol. 2009;501:69-76.
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for Therapeutic Applications. Viruses. 2018;10(4).
6, Hunt M, Mather AE, Sanchez-Buso L, Page AJ, Parkhill J, Keane JA, et al. ARIBA: rapid antimicrobial
resistance genotyping directly from sequencing reads. Microb Genom. 2017;3(10):e000131.
7. Merabishvili M, Pirnay JP, De Vos D. Guidelines to Compose an Ideal Bacteriophage Cocktail. Methods
30
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
9. Luong T, Salabarria AC, Edwards RA, Roach DR. Standardized bacteriophage purification for personali-
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10. Pasqua S, Niotta MC, Di Martino G, Sottile D, Douradinha B, Miele M, et al. Complete intra-laboratory
validation of a LAL assay for bacterial endotoxin determination in EBV-specific cytotoxic T lymphocytes. Mol
Ther Methods Clin Dev. 2021;22:320-9.
11. Pirnay JP, Verbeken G, Ceyssens PJ, Huys I, De Vos D, Ameloot C, et al. The Magistral Phage. Viruses.
2018;10(2).
12. Duyvejonck H, Merabishvili M, Vaneechoutte M, de Soir S, Wright R, Friman VP, et al. Evaluation of the
Stability of Bacteriophages in Different Solutions Suitable for the Production of Magistral Preparations in
Belgium. Viruses. 2021;13(5).
31
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
ANEXO
PROTOCOLO 1
Aislados ambientales y Banco de Fagos
CARACTERIZACIÓN PRODUCCIÓN CARACTERIZACIÓN

DE LA ACTIVIDAD DE FAGOS FÍSICOQUÍMICA Y
INFECTIVA Y • Pequeña escala ALMACENAMIENTO
SELECCIÓN • Gran escala • pH
PASO PASO PASO
01 03 05
• ADN • Temperatura
• Análisis bioinformático
PASO PASO PASO

CARACTERIZACIÓN ADAPTACIÓN AL PURIFICACIÓN Y
FENOTÍPICA Y 02 HUÉSPED Y 04 CONCENTRACIÓN 06
SELECCIÓN DESARROLLO DE • Ultracentrifugación
• Propagación y titulación en
CÓCTELES • Filtración
placas de doble agar • Método Appelmans • Cromatografía
• Spot test • Cóctel • Eliminación de
• Curva adsorción y “one step” endotoxinas
• Host range • Titulación
• Eficiencia de plaqueo (EOP)
• Cultivo en líquido
32
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
ANEXO
PROTOCOLO 1
Aislados ambientales
PASO 1
y Banco de Fagos Caracterización de la actividad infectiva y selección
MÉTODO 01 MÉTODO 03 MÉTODO 05 MÉTODO 07

Propagación Preparación Preparación Preparación de
y titulación en de Host range. curva adsorción. infección en
placas de líquido y curva
doble agar. de infección.
MÉTODO 02 MÉTODO 04 MÉTODO 06

Preparación Cálculo de la Preparación
del spot test. eficiencia de One Step
plaqueo (EOP). Growth Curve.
33
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
ANEXO
PROTOCOLO 1
PASO 2
y Banco de Fagos Caracterización genotípica
MÉTODO 01 MÉTODO 03
Esquema de secuenciación. Anotación funcional proteínas:
Tipos de secuenciación: RAST, FIGfam, GLIMMER-3, THEA.
Illumina, Minion, Ion Torrent. Anotación manual ORFs: PHASTER,
BLASTp, HMMER, Hhpred, PhAnTOME, pVOGs.
Anotación tRNAs: tRNAscan-SE, ARAGORN.
Búsqueda de contaminaciones. Identificación de genes lisogenia:
• Contaminación por secuencias del PHASTER, RAST, THEA, PHACTS.
huésped: EDGE Bioinformatics software. Genes de virulencia:
• Clasificación taxonómica: GOTTCHA, Virulence Finder.
Kraken, MetaPhlAn y BWA-mem
mappeado para RefSeq.
Genes de resistencia:
Resistance Finder.
34
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
ANEXO
PROTOCOLO 1
PASO 3
y Banco de Fagos Adaptación al huésped y desarrollo de cócteles
Desarrollo del Preparación de
método Appelmans. un cóctel de
fagos obtenidos
por Appelmans.
35
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-FT-02
ANEXO
PROTOCOLO 1
PASO 4
y Banco de Fagos Purificación y concentración
MÉTODO 01 MÉTODO 03 MÉTODO 05

Ultracentrífuga, fagos Desarrollo de Estudios de Investigación
centrifugados y cromatografía de fagos. (Pequeña escala).
recuperación de los Eliminacion de Tratamientos Medicina
fagos desde el tubo. endotoxinas. Personalizada (Gran escala).
Formula magistral.
024
5
Preparación de Dilución seriada de
los protocolos fagos y técnica de
de filtración. doble agar con placas
de lisis para recuentos.
36
PROCEDIMIENTOS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (número 1, 2023)

Editores: Miriam Álvarez-Martínez y Patricia Ruiz Garbajosa
Coordinadora: María del Mar Tomás*
Autores: Lucía Blasco1,2, Meritxell de Jesús García Quintanilla3,7, Jaime Esteban3,6,7, José Ramon
Paño4,6,7*, Jesús Oteo-Iglesias2,5,6,7* y María del Mar Tomás1,2,7 *
1. Grupo de Microbiología Traslacional y Multidisciplinar (MicroTM)-Instituto de Investigación Biomédica

de A Coruña (INIBIC), Departamento de Microbiología-Hospital de A Coruña (CHUAC); Universidad de A
Coruña (UDC), A Coruña, España; 2. Grupo de Estudio sobre Mecanismos de Acción y Resistencia a los
Antimicrobianos (GEMARA) en representación de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica (SEIMC); 3. Departamento de Microbiología Clínica-Instituto de Investigación Sanita-
ria Fundación Jiménez Díaz, Madrid, España; 4. Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa”. Instituto de
Investigación Sanitaria Aragón. Zaragoza, España; 5. Laboratorio de Referencia e Investigación de Resis-
tencias Antibióticas e Infecciones Sanitarias, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos
III, Majadahonda, Madrid, España; 6. CIBER de Enfermedades Infecciosas (CIBERINFEC), Instituto de
Salud Carlos III, Madrid, España; 7. MePRAM, Proyecto de Medicina de Precisión contra las resistencias
Antimicrobianas.
*Autor de correspondencia: María Tomás; Email: MA.del.Mar.Tomas.Carmona@sergas.es
La terapia con fagos líticos (también llamada fagoterapia) es una forma médica de control biológico de in-
fecciones bacterianas, que utiliza virus naturales, llamados bacteriófagos o fagos, así como virus sintéticos
(o modificados genéticamente) y proteínas derivadas de los fagos, como agentes antibacterianos. Hace
más de 100 años desde el inicio de la aplicación de la fagoterapia, sin embargo, en la actualidad está expe-
rimentando un resurgimiento en interés, con un número creciente de estudios de casos clínicos publicados
debido a la crisis de la resistencia a los antimicrobianos. Por todo ello, la terapia con fagos, se enfrenta a
desafíos médicos, biológicos, normativos y económicos. En este procedimiento, analizamos estos desafíos
y desarrollamos las diversas líneas de protocolización en el manejo de los fagos líticos en el laboratorio.
Nos centramos en la obtención de fagos líticos naturales ambientales y/o en muestras clínicas, así como
en los pasos a seguir para el desarrollo de un banco de fagos mediante la caracterización de la actividad
infectiva y genómica de los fagos líticos, la adaptación al huésped/desarrollo cócteles (o combinaciones)
de fagos junto la producción, purificación y concentración de dichos cócteles de fagos, y finalmente, la
caracterización fisicoquímica y almacenamiento de los mismos. Además, es necesario el soporte de las
agencias regulatorias, en el caso de España, la AEMPS (Agencia Española de Medicamentos y Productos
Sanitarios) para su uso clínico.
El éxito terapéutico de la fagoterapia frente a las bacterias resistentes a los antimicrobianos dependerá de
su aplicación a través de ensayos clínicos, así como a través del “uso compasivo” frente a determinadas
infecciones mediante una medicina personalizada. Por ello, es clave la estandarización de protocolos en
laboratorios clínicos y servicios para obtener resultados que permitan avalar dicha terapia en el tratamiento
de enfermedades infecciosas.
37

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Procedimiento de Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de

Editores Coordinador Autores

Miriam J. Álvarez-Martínez Mª del Mar Tomás Lucía Blasco

Miriam J. Álvarez-Martínez. Servicio de Microbiología, Hospital Clínic de Barcelona. Departamento de Funda-

Recomendaciones de la Sociedad Española de

* Comparten última autoría

3. Recogida de Muestras. Fagos líticos ambientales....................................................................7

4. Transporte y conservación de los Fagos....................................,..................................................7

5. Caracterización de la actividad infectiva........................................................................................7

7. Adaptación al huésped y desarrollo de cócteles............................................................................

8. Sinergia con los antibióticos ...........................................................................................................10

10. Estudios preclínicos....................................................................................................................11

INDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS

PNT-FT-01. FAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio OBTENCIÓN DE FAGOS. AGUAS RESIDUALES

PNT-FT-02.FAGOTERAPIA, manejo en el laboratorio AISLADOS AMBIENTALES y BANCOS de FA-

ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO

En la actualidad, existe la oportunidad de establecer integración de la ciencia y la medicina al servicio

Finalmente, destacar el importante papel de la innovación en la terapia fágica permitiendo la disminución

3. RECOGIDA DE MUESTRAS. FAGOS LÍTICOS AMBIENTALES

4. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LOS FAGOS

5. CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD INFECTIVA

En la actualidad, se está desarrollando la automatización o semiautomatización de los estudios de la capa-

7. ADAPTACIÓN AL HUÉSPED Y DESARROLLO DE CÓCTELES

8. SINERGIA CON LOS ANTIBIÓTICOS

10. ESTUDIOS PRECLÍNICOS

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Nombre / Firma Fecha Nombre / Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

COPIA REGISTRADA Nº............................ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital/Centro…………………………..........….

El propósito de este documento es la obtención de fagos líticos.

4.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

4.2. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

-LB, Luria Bertani

- Micropipetas (Fisher Scientific, cat. no. 10236072)

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

10. LIMITACIONES AL PROCEDIMIENTO

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Nombre / Firma Fecha Nombre / Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

COPIA REGISTRADA Nº............................ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital/Centro…………………………..........….

-PASO 1. Caracterización de la actividad infectiva

-PASO 1. Caracterización de la actividad infectiva

5. Farmacopea europea (EP 2.2.3). Disponible en EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.0.

4. PROGRAMAS Y HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS

- EDGE Bioinformatics software https://github.com/LANL-Bioinformatics/EDGE/releases

6. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

- Banco de cepas huésped dianas

- Cabina de bioseguridad (ESCO, cat. no. AC2-4S9-NS)

- ThermoMixer (Eppendorf, cat. no. 2231000574)

-PASO 1. Caracterización de la actividad infectiva

• Método 01. Propagación y titulación de los fagos en técnica doble agar

Finalmente se recupera el lisado en el sobrenadante y se incuba en presencia de cloroformo al 1% (si es

UFP/ml = (Nº de UFP X Dilución)/Volumen de fago inoculado

• Método 02. Test de la gota o spot test

• Método 03. Host Range

• Método 04. Eficiencia de plaqueo (EOP)