El documento describe el diseño de primers para PCR, destacando la importancia de un buen diseño para evitar amplificaciones inespecíficas. Se detallan criterios de selección de primers, especificidad, y el uso de herramientas bioinformáticas como Primer3plus para su creación. Además, se menciona la aplicación de primers en la identificación de hongos, específicamente en el género Ganoderma, y se discuten diversas técnicas moleculares utilizadas en su análisis.
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El documento describe el diseño de primers para PCR, destacando la importancia de un buen diseño para evitar amplificaciones inespecíficas. Se detallan criterios de selección de primers, especificidad, y el uso de herramientas bioinformáticas como Primer3plus para su creación. Además, se menciona la aplicación de primers en la identificación de hongos, específicamente en el género Ganoderma, y se discuten diversas técnicas moleculares utilizadas en su análisis.
El documento describe el diseño de primers para PCR, destacando la importancia de un buen diseño para evitar amplificaciones inespecíficas. Se detallan criterios de selección de primers, especificidad, y el uso de herramientas bioinformáticas como Primer3plus para su creación. Además, se menciona la aplicación de primers en la identificación de hongos, específicamente en el género Ganoderma, y se discuten diversas técnicas moleculares utilizadas en su análisis.
El documento describe el diseño de primers para PCR, destacando la importancia de un buen diseño para evitar amplificaciones inespecíficas. Se detallan criterios de selección de primers, especificidad, y el uso de herramientas bioinformáticas como Primer3plus para su creación. Además, se menciona la aplicación de primers en la identificación de hongos, específicamente en el género Ganoderma, y se discuten diversas técnicas moleculares utilizadas en su análisis.
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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
Facultad de ciencias y educación
Licenciatura en biología Genética molecular Diseño de primers o cebadores para PCR Stefania Oliveros Londoño - 20162140457; Paula Camila Paipilla Garzón - 20162140459
Un iniciador o cebador es una secuencia corta de ADN de cadena simple que se utiliza en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el método PCR se emplea un par de cebadores para hibridar con el ADN de la muestra y definir la región del ADN que será amplificada. También se les conoce como oligonucleótidos. Los primers se añaden en un vasto exceso comparado con el ADN blanco a ser amplificado. Estos se hibridan a las cadenas opuestas del blanco y se orientan enfrentándose con sus respectivos terminales 3’, de manera tal que la síntesis llevada a cabo por la ADN polimerasa se extiende a través de todo el segmento del ADN blanco situado entre ellos. Recordemos que la enzima ADN polimerasa cataliza el crecimiento de cadenas de ADN nuevas en la dirección 5’ > 3’.
Para que la PCR sea exitosa se necesita de un buen diseño de primer o cebadores siendo uno de los aspectos más importantes, Primers mal diseñados pueden amplificar otros fragmentos de ADN distintos a los buscados (amplificación inespecífica).
Criterios de selección de primers
● Cada primer individual debe contar con una longitud de 18-24 bases. ● Se debe mantener un contenido de G:C (Guanina:Citosina) entre 40 y 60 %. ● Los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión “Tm” cercanos, dentro de los 2-3 °C máximo. ● La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases púricas. ● Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas. ● Evitar poli X. ● Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5’ del primer (no incluir cuando se estima la Tm del primer). ● Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer: a - Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica. b - Se disminuye la concentración en la mezcla de cada uno de los primers posibles c - No se recomienda utilizar más de 64 primers diferentes en la mezcla.
Especificidad La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primers deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será amplificado. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a productos no deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genómica. Secuencias Complementarias del primer Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología entre ellos. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de doble cadena que interferirá con el alineamiento. Si la homología ocurre en el extremo 3' de cualquier primer, ocurrirá la formación de dímeros de primer que, a menudo, prevendrá la formación del producto deseado por competición. Contenido de G/C La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no específico. Las regiones poliA y poliT deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto puede bajar la eficacia de la amplificación. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y ~20 bases de largo. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C - 62°C. Secuencia de los extremos 3' Es establecido que la posición terminal 3' en primers de PCR es esencial para el control del “mispriming”. La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de hidrógeno más fuerte de los residuos G/C. También ayuda a mejorar la eficacia de la reacción reduciendo al mínimo la respiración que pudo ocurrir. Temperatura de Asociación La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores más determinantes de la reacción. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociación la temperatura de fusión -5ºC, aproximadamente. Existen muchos métodos para calcular la temperatura de fusión, pero siempre, después de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción. (Giorgio,2009)
Diseño de primer
Para el diseño de nuestro cebador utilizamos una herramienta bioinformatica llamada
Primer3plus la cual es de libre uso y fácil acceso en la web. Este software permite especificar un gran número de variables y obtener primers según las indicaciones solicitadas. Además permite agregar el número de acceso de la secuencia, que se halla en las bases de datos internacionales. También permite discriminar las regiones de la secuencia que se deben incluir, las que se deben excluir y el rango de tamaños del producto. Por otra parte, el software incluye la posibilidad de especificar las características mínimas de los primers deseados, como Tm, porcentaje de GC, máxima autocomplementariedad, y otros parámetros. También presenta las mismas facilidades si se está buscando y analizando una sonda, por ejemplo, para utilizarse en trabajos de hibridación. Procedimiento 1. Inicialmente buscamos la secuencia de nuestro organismo en GenBank en la base de datos NCBI, en este caso se trata del basidiomycete Ganoderma , posteriormente seleccionamos la secuencia en formato FASTA.
2. Despues de ello nos dirigimos a la pagina Primer3plus
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi y en el recuadro en blanco copiamos nuestra secuencia en formato FASTA , debajo de este recuadro se encuentra 3 opciones que nos indican el primer izquierdo,central y derecho , para nuestro caso marcamos la primera y tercera opcion y creamos el primer. 3. Los resultados se obtienen en pocos segundos y se presentan en una tabla, cuyo título es “Primer3 Output”. Estos incluyen un mapa de los mejores pares de oligonucleótidos (leftizquierdo, right-derecho) de acuerdo a las especificaciones dadas en el formulario. Además, y por defecto, Primer3 muestra 4 opciones de primers opcionales (en la sección “Additional Oligos”). 4. Por último seleccionamos los primers y observamos en blast. Una vez se obtienen los primers se observan algunas siglas las cuales se explican a continuación: “any”: significa la Máxima Complementariedad (o denominada Autocomplementariedad Local): refleja el máximo alineamiento local permisible. Se toma como predictora de la tendencia de los primers a hibridar entre ellos y “3’“: Máxima Complementariedad 3’ (ó denominado Alineamiento Global Anclado en 3’) es un puntaje máximo permisible cuando se testea la complementariedad entre los primers izquierdo y derecho. Se toma para predecir la probabilidad de generación de dímeros de primers durante la reacción de PCR.
Analizando los cebadores obtenidos se puede decir que cumplen los requisitos. Pues en primer lugar debe contar con una longitud mínima de 18 pb y máxima de 28, nuestros dos primers tienen una longitud de 20pb, el contenido de G-C debe ser máximo del 60% , en los primers obtenidos el contenido es del 50% , la diferencia de ™ entre los primers debe ser máximo entre 2- 3°C en este caso la diferencia es del 0,1 % , esto nos indica que los primers son confiables
Primers para hongos
Los análisis moleculares más usados para la caracterización e identificación taxonómica y
filogenética de los hongos consisten en el análisis de un gen o una región del genoma, en general, el ITS (Goméz et al.,2012). Los ITS generalmente corresponden a secuencias altamente conservadas entre las especies fúngicas filogenéticamente próximas, en tanto que los IGS presentan una variabilidad muy elevada, incluso a nivel intraespecífico. Otra característica que determina la amplia utilización de estos genes, es el hecho de encontrarse en un número elevado de copias (hasta 200 copias), facilitando su amplificación mediante la PCR (Perdomo, 2011). El ITS es una región que se encuentra repetidamente entre los genes del ARN ribosomal de la subunidad mayor (28S) y menor (18S) del ADN nuclear. El ITS contiene dos regiones separadas por el gen 5,8S, obteniendo la región ITS1 e ITS2. Ambas regiones pueden ser amplificadas mediante el uso de pares de primers (Guevara, Garza y Cázares, 2004).
Para el caso del artículo que se tomó como ejemplo para la extracción de ADN y posterior PCR, los fragmentos de interés, en este caso las regiones 16S y 18S, sin embargo esto depende del autor y de en qué fase se encuentre el espécimen puesto que en artículo escogido hubo problemas en la electroforesis relacionados con la fase del espécimen, el cómo se extrajo y la calibración de equipos.
Para el género Ganoderma en los últimos años ha tenido malas identificaciones por el uso y manipulación de primers y técnicas. Las secuencias de genes de ARN ribosómico (ARNr) tienen una amplia variedad sido utilizado para discriminar taxones fúngicos en la familia (Hibbett y Donoghue, 1995), genéricos y sub genéricos niveles (Vilgalys y Sun, 1994; Crawford et al., 1996; Anderson y col., 1998; Chillali et al., 1998). Bae y col. (1995) y Moncalvo et al. (1995a, b) utilizaron el gen rRNA secuencias espaciadoras transcritas internas (ITS) para distinguir entre aislamientos de Ganodermataceae. Entre genes codificantes de proteínas con metabolismo básico o estructural funciones, los genes de β-tubulina reciben cada vez más atención como marcadores Los estudios han utilizado la β-tubulina genes para investigar las relaciones entre hongos niveles, y también se encontró que eran útiles en estudios filogenéticos de nivel profundo (Thon y Royse, 1999). Aparte del análisis de diversidad genética como los mencionados, también se utilizan varias técnicas en basidiomicetos, como el polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP) (Qi et al., 2003), los AFLP consisten en la digestión completa del ADN genómico total con enzimas de restricción, seguida de la amplificación selectiva de los fragmentos obtenidos para detectar polimorfismos debidos a mutaciones en la secuencia de ADN en, o cerca de, los sitios de restricción (Serrato & Ramos, 2010). Los polimorfismos se detectan por electroforesis como un patrón de fragmentos de ADN amplificados (bandas) que difieren en número y tamaño, este patrón es altamente específico y debido a las restricciones de la técnica es altamente reproducible (Simpson 1997b, Simpson et al. 1999)., Longitud del fragmento de restricción Polimorfismo (RFLP) (Park y Ryu, 1996), los RFLPs se han utilizado y han sido muy útiles como marcadores de localización en el ADN genómico, ya sea en humanos como en otros animales. Sigue la secuencia de ADN, hay sitios particulares, de una serie de cuatro a ocho ácidos nucleicos, que son un sitio donde una enzima de restricción de bacteria puede unirse y cortar el ADN (NHGRI, 2008) . Se puede utilizar esta característica de la secuencia del ADN donde se une la enzima de restricción o no, para observar las diferencias entre las personas, es decir, si tienen ese sitio o no. Las diferencias que produce el cambio de una sola base entre dos personas, podría resultar en la presencia o ausencia de ese sitio de corte. Entonces, si se aísla ese pedazo de ADN que rodea a ese sitio en dos personas y en una de ellas la enzima cortada y en la otra no, eso refleja un polimorfismo, o diferencia entre esas dos personas (NHGRI, 2008). Podemos observar esto aislando el ADN, cortándolo con la enzima de restricción bacteriana, y corriendo en un gel de electroforesis. Se trata de un polimorfismo que podemos utilizar para estudiar la herencia del ADN. , y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) (Wang et al. al., 2003). Entre estas técnicas, RAPD sigue siendo uno de los métodos más baratos y rápidos para acceder a la variabilidad a nivel de ADN y es especialmente útil para el análisis intraespecie. Puesto que los RAPDs son una técnica que consiste en la amplificación de segmentos de ADN con iniciadores pequeños (generalmente de 10 nucleótidos de longitud) de secuencias aleatorias no-palindrómicas, con un contenido de G + C entre 50 y 80%, (Lynch y Milligan 1994). La secuencia del iniciador es elegida a priori de manera arbitraria y sólo se utiliza un iniciador por reacción, que actuará al mismo tiempo como iniciador sentido y antisentido. Los fragmentos obtenidos se visualizan como un patrón de bandeo característico del individuo y cada banda observada se considera un locus (Rocha et al., 2010). La presencia o la ausencia de las bandas entre individuos se deben a cambios en la secuencia (o a la pérdida) de los sitios a los que se alinea el iniciador (Navarro 1999). La inserción o eliminación de nucleótidos en la secuencia intermedia entre los dos sitios de acoplamiento, aumentará o disminuirá el tamaño de la molécula amplificada.
Pares de primers usados usualmente para amplificación de la región ITS en hongos,
(Higgins, 2012) Bibliografía
1. Giorgio, M. (2009). Curso: Introdccion a la bioinformatica. Recuperado de;
